"Avatar", zmodyfikowane eksperymenty w pętli roboczej ex vivo z wykorzystaniem szczepu in vivo i aktywacji

Summary

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię emulacji produkcji siły mięśniowej in vivo podczas eksperymentów w pętli roboczej ex vivo przy użyciu mięśnia "awatara" od gryzonia laboratoryjnego do oceny wpływu stanów przejściowych szczepu i aktywacji na reakcję siły mięśniowej.

Abstract

Zachowania ruchowe to wyłaniające się cechy systemów dynamicznych, które wynikają z produkcji siły mięśniowej i wydajności pracy. Wzajemne oddziaływanie między systemami neuronalnymi i mechanicznymi zachodzi jednocześnie na wszystkich poziomach organizacji biologicznej, od dostrajania właściwości mięśni nóg podczas biegu po dynamikę kończyn wchodzących w interakcję z podłożem. Zrozumienie warunków, w jakich zwierzęta zmieniają swoje strategie kontroli neuronalnej w kierunku wewnętrznej mechaniki mięśni ("prefleksji") w hierarchii kontroli, umożliwiłoby modelom mięśniowym przewidywanie siły mięśniowej in vivo i dokładniejszą pracę. Aby zrozumieć mechanikę mięśni in vivo, konieczne jest zbadanie ex vivo siły mięśni i pracy w dynamicznie zmieniających się warunkach obciążenia i obciążenia podobnych do lokomocji in vivo. Trajektorie odkształceń in vivo zazwyczaj wykazują nagłe zmiany (tj. stany przejściowe odkształcenia i prędkości), które wynikają z interakcji między aktywacją neuronalną, kinematyką układu mięśniowo-szkieletowego i obciążeniami wywieranymi przez środowisko. Głównym celem naszej techniki "awatara" jest zbadanie, jak mięśnie funkcjonują podczas nagłych zmian szybkości odkształcania i obciążenia, kiedy udział wewnętrznych właściwości mechanicznych w produkcji siły mięśniowej może być najwyższy. W technice "awatara" tradycyjne podejście oparte na pętli roboczej jest modyfikowane przy użyciu zmierzonych trajektorii odkształceń in vivo i sygnałów elektromiograficznych (EMG) od zwierząt podczas ruchów dynamicznych, aby napędzać mięśnie ex vivo przez wiele cykli rozciągania i skracania. Podejście to jest podobne do techniki pętli roboczej, z tą różnicą, że trajektorie odkształceń in vivo są odpowiednio skalowane i nakładane na mięśnie myszy ex vivo przymocowane do serwomotoru. Technika ta pozwala na: (1) naśladować szczep in vivo, aktywację, częstotliwość kroku i wzorce pętli roboczej; (2) zmieniać te wzorce, aby jak najdokładniej dopasować reakcje sił in vivo; oraz (3) różnicować specyficzne cechy szczepu i/lub aktywacji w kontrolowanych kombinacjach w celu przetestowania hipotez mechanistycznych.

Introduction

Poruszające się zwierzęta osiągają imponujące sportowe wyczyny wytrzymałości, szybkości i zwinności w skomplikowanych środowiskach. Lokomocja zwierząt jest szczególnie imponująca w przeciwieństwie do maszyn zaprojektowanych przez ludzi - stabilność i zwinność robotów, protez i egzoszkieletów o obecnych nogach pozostaje słaba w porównaniu ze zwierzętami. Poruszanie się na nogach w naturalnym terenie wymaga precyzyjnej kontroli i szybkich korekt w celu zmiany prędkości i manewrowania cechami otoczenia, które działają jak nieoczekiwane perturbacje^1,2,3,4. Jednak zrozumienie niestabilnej lokomocji jest z natury trudne, ponieważ dynamika zależy od złożonych interakcji między środowiskiem fizycznym, mechaniką mięśniowo-szkieletową i kontrolą sensomotoryczną^1,2. Poruszanie się na nogach wymaga reagowania na nieoczekiwane zakłócenia za pomocą szybkiego, multimodalnego przetwarzania informacji sensorycznych oraz skoordynowanego uruchamiania kończyn i stawów^1,5. Ostatecznie ruch jest możliwy dzięki mięśniom wytwarzającym siłę dzięki wewnętrznym właściwościom mechanicznym układu mięśniowo-szkieletowego, a także dzięki kontroli neuronalnej^1,5,6,7. Nierozstrzygniętą kwestią neuromechaniki jest to, w jaki sposób te czynniki oddziałują na siebie, wytwarzając skoordynowany ruch w odpowiedzi na nieoczekiwane zakłócenia. Poniższa technika wykorzystuje wewnętrzną mechaniczną reakcję mięśni na deformację przy użyciu trajektorii odkształceń in vivo podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo z mięśniem "awatara".

Technika pętli pracy mięśni dostarczyła ważnych ram do zrozumienia wewnętrznej mechaniki mięśni podczas cyklicznych ruchów^8,9,10. Tradycyjna technika pętli roboczej kieruje mięśniami przez predefiniowane, zazwyczaj sinusoidalne, trajektorie naprężeń przy użyciu częstotliwości i wzorców aktywacji mierzonych podczas eksperymentów in vivo^2,8,9,11. Korzystając z trajektorii długości sinusoidalnej, można realistycznie oszacować pracę i moc wyjściową podczas lotu¹² i swimming² w warunkach, w których zwierzęta nie przechodzą gwałtownych zmian trajektorii naprężeń z powodu interakcji ze środowiskiem i kinematyką układu mięśniowo-szkieletowego. Jednak in vivo trajektorie naprężeń mięśni podczas lokomocji nóg powstają dynamicznie w wyniku interakcji między aktywacją neuronalną, kinematyką mięśniowo-szkieletową i obciążeniami wywieranymi przez środowisko^5,7,13,14. Potrzebna jest bardziej realistyczna technika pętli roboczej do emulacji obciążeń, trajektorii odkształceń i wytwarzania siły, która odpowiada dynamice mięśni-ścięgno in vivo i zapewnia wgląd w to, jak wewnętrzna mechanika mięśni i kontrola neuronalna współdziałają, aby wytworzyć skoordynowany ruch w obliczu zakłóceń.

Tutaj prezentujemy nowatorski sposób na emulację sił mięśniowych in vivo podczas lokomocji na bieżni za pomocą mięśnia "awatara" od gryzonia laboratoryjnego podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo z trajektoriami szczepów in vivo, które reprezentują zmieniające się w czasie obciążenia in vivo. Wykorzystanie zmierzonych in vivo trajektorii szczepów z mięśnia docelowego na mięśniach zwierzęcia laboratoryjnego podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo pozwoli naśladować obciążenia doświadczane podczas lokomocji. W opisanych tutaj eksperymentach mięsień prostownika długiego myszy ex vivo (EDL) jest używany jako "awatar" dla mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego (MG) szczura in vivo podczas chodzenia, kłusowania i galopu na bieżni¹³. Podejście to jest podobne do techniki pętli roboczej, z tą różnicą, że trajektorie odkształceń in vivo są odpowiednio skalowane i nakładane na mięśnie myszy ex vivo przymocowane do serwomotoru. Podczas gdy mięśnie EDL myszy różnią się rozmiarem, rodzajem włókien i architekturą w porównaniu z MG szczura, możliwe jest kontrolowanie tych różnic. Technika "awatara" pozwala na: (1) emulację in vivo napięcia, aktywacji, częstotliwości kroku i wzorców pętli roboczej; (2) zmieniać te wzorce, aby jak najdokładniej dopasować reakcje sił in vivo; oraz (3) różnicować specyficzne cechy szczepu i/lub aktywacji w kontrolowanych kombinacjach w celu przetestowania hipotez mechanistycznych.

Protocol

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Północnej Arizony. W niniejszym badaniu wykorzystano mięśnie prostownika długiego palca (EDL) samców i samic myszy typu dzikiego (szczep B6C3Fe a/a-Ttn^mdm/J) w wieku 60-280 dni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz Tabela Materiałów) i założone w kolonii na Uniwersytecie Północnej Arizony.

1. Wybór trajektorii szczepu in vivo i przygotowanie do użycia podczas eksperymentów z pętlą roboczą ex vivo

UWAGA: W tym protokole, wcześniejsze pomiary z dynamicznej lokomocji in vivo, dostarczone bezpośrednio do autorów (Nicolai Konow, UMass Lowell, komunikacja osobista), zostały wykorzystane w eksperymentach ex vivo. Oryginalne dane zostały zebrane dla Wakeling et al.¹⁵. Do odtworzenia protokołu wymagane są dane dotyczące czasu, długości lub obciążenia, EMG/aktywacji i siły.

1. Podziel całe badanie in vivo na poszczególne etapy przy użyciu dowolnej platformy programistycznej (kod MATLab dostarczony w Dodatkowym pliku kodowania 1).
   1. Wykreśl zmiany długości w funkcji czasu dla całego badania in vivo. Służy to do wizualizacji poszczególnych kroków (od postawy do pozycji) oraz do oceny zmienności między krokami (Rysunek 1).
   2. Obliczyć odkształcenie dla całej próby (długość (L) / Maksymalna siła izometryczna przy optymalnej długości L₀).
   3. Wybierz krok z całej próby, który jest reprezentatywny dla wszystkich kroków i który zaczyna się i kończy na podobnej długości. Można to zrobić wizualnie, rysując długości jeden na drugim, aby porównać każdy krok.
   4. Po wybraniu reprezentatywnego kroku, należy wydzielić dane dotyczące odkształcenia, EMG/aktywacji i siły z całego badania przy użyciu dowolnej platformy programistycznej (zobacz Dodatkowy plik kodowania 1 dla kodów używanych w MATLab¹⁶).
   5. Jeśli częstotliwość próbkowania różni się w zależności od szczepu, EMG/aktywacji lub siły, należy interpolować punkty danych tak, aby wszystkie próbki były pobierane z tą samą częstotliwością.
      UWAGA: Badacze mogą określić częstotliwość przechwytywania na podstawie odstępów czasu między każdym punktem pobranym w całym badaniu. Jeśli zmienne są przechwytywane z tą samą częstotliwością, czasy próbkowania będą takie same.
2. Oblicz częstotliwość kroków podzielonych na segmenty.
   1. Oblicz częstotliwość, określając czas trwania kroku podzielonego na segmenty w sekundach i dzieląc 1 (sekundę) przez czas trwania (1/czas trwania = # kroków na sekundę).
   2. Ręcznie określ, ile punktów danych należy uzyskać w eksperymentach ex vivo, aby dopasować częstotliwość.
   3. Oblicz czas potrzebny na dwa kroki. Powtórz kroki co najmniej raz, aby oszacować błąd pomiaru mięśni, który będzie wymagany do późniejszej analizy statystycznej.
3. Określ fazę stymulacji w stosunku do wejścia szczepu, korzystając ze zmierzonej aktywności EMG, aby określić początek i czas trwania stymulacji dla pętli roboczych ex vivo. Można użyć dowolnej platformy programistycznej (patrz Dodatkowy plik kodowania 1 dla kodu użytego w tym badaniu).
   1. Wyświetlanie sygnału EMG w tym samym zakresie osi x (czasie) co zmiana odkształcenia (Rysunek 1). Powiększ sygnał EMG, aby był widoczny; można to zrobić, mnożąc sygnał EMG przez dowolną liczbę, przeskalowując odkształcenie i EMG tak, aby były na tej samej skali i/lub dodając sygnał EMG do szczepu.
      UWAGA: Autorzy przeskalowali szczep i EMG tak, aby znajdowały się na tej samej skali za pomocą funkcji "przeskalowania" w MATLab (patrz rysunek uzupełniający 1).
   2. Znajdź miejsce, w którym zaczyna się i kończy aktywność EMG, na co wskazuje zmiana intensywności dwóch odchyleń standardowych^17,18.
      UWAGA: W zależności od zwierzęcia i mięśni, początek EMG może, ale nie musi, odpowiadać kontaktowi stopy (Monica Daley, UC Irvine, komunikacja osobista) (patrz sekcja Dyskusja).
   3. Oblicz procent cyklu odkształcenia (np. 40%), w którym następuje początek aktywacji EMG i jak długo będzie trwała stymulacja (np. 222 ms).
      UWAGA: Naukowcy będą musieli wziąć pod uwagę opóźnienie sprzężenia wzbudzenia-skurczu (ECC), które różni się między ruchem in vivo a pętlami roboczymi ex vivo i może być różne dla każdego zwierzęcia i mięśnia (np. ECC in vivo wynosi 24,5 ms dla MG szczura, ECC ex vivo wynosi ~5 ms dla EDL myszy).
4. Przygotuj reprezentatywne wejścia odkształceń dla programu sterownika pętli roboczej. Każdy program, który może przechwytywać siłę wyjściową z danymi wejściowymi dla naprężenia i stymulacji, może być użyty w programie sterownika pętli roboczej (patrz sekcja Dyskusja).
   1. Wykonać wybrany krok i przeprowadzić interpolację do odpowiedniej liczby punktów niezbędnej do uchwycenia kroku z częstotliwością in vivo przez dwa cykle (patrz krok 1.2).
   2. Przeskaluj krok, aby rozpocząć i zatrzymać się na "zerowym obciążeniu" (np. L₀ lub 95% L₀) po rozciągnięciu o z góry określoną długość skoku (patrz krok 3.3).
   3. "Skala" wybranego kroku, jeśli to konieczne, do użycia jako dane wejściowe dla zmian odkształcenia w EDL myszy (patrz sekcja Dyskusja). Aby przeskalować, wybierz długość, do której EDL myszy może zostać rozciągnięta bez uszkodzenia (np. zazwyczaj rozciągamy EDL myszy o 10% L₀ niezależnie od gatunku in vivo). Może to wymagać zmiany na podstawie wstępnych wyników (patrz krok 3.3).

Rysunek 1: Długość w czasie całego badania in vivo. Długość (mm) wykreślona w funkcji czasu MG szczura. Kroki są wyznaczone okręgami, od najkrótszej długości do najkrótszej długości, uważanej za pojedynczy krok. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ocena maksymalnej siły izometrycznej mięśni myszy ex vivo

1. Konfiguracja sprzętu i gabinetu.
   UWAGA: Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby uzyskać wyjaśnienie sprzętu potrzebnego do pętli roboczej ex vivo.
   1. Przygotować kąpiel tkankowo-narządową, wkładając zawór iglicowy z rurką tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym (patrz Tabela Materiałów). Podłącz rurkę tlenową do butli gazowej o stężeniu 95%_{0 2-5}% CO₂. Pozostawić 20 psi do napełnienia kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym.
   2. Przygotować obszar operacyjny, prowadząc dodatkową rurkę tlenową z przewodu gazowego do naczynia krystalizującego wypełnionego roztworem Krebsa-Henseleita (krok 2.1.3) w pobliżu obszaru operacyjnego. Zostanie to wykorzystane do utrzymania napowietrzenia i nawodnienia mięśni podczas i po operacjach.
      UWAGA: Mięśnie mogą być również przechowywane w tym napowietrzonym roztworze do 4 godzin, jeśli jednocześnie z myszy zostanie pobrany więcej niż jeden mięsień.
   3. Przygotować 1 l roztworu Krebsa-Henseleita zawierającego (w mmol ^l-1): NaCl (118); KCl (4,75); _MgSO4 (1,18); KH₂PO₄ (1.18); CaCl₂ (2,54); i glukozy (10,0) w temperaturze pokojowej i pH do 7,4 przy użyciu HCl i NaOH (patrz tabela materiałów). Podczas obchodzenia się z HCl i NaOH należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej w postaci okularów i rękawic.
   4. Napełnij kąpiel roztworem Krebsa-Henseleita o temperaturze pokojowej i pH 7,4. Zanurz mięsień i hak całkowicie w roztworze.
   5. Włącz wszystkie urządzenia; dwutrybowy system dźwigni mięśniowych, stymulator i interfejs sygnałowy (tablica DAQ) (patrz tabela materiałów).
2. Rozwarstwienie mięśni EDL.
   1. Głęboko znieczulij mysz, a następnie wykonaj eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Połóż mysz w prawej lub lewej bocznej pozycji leżącej z rozciągniętą górną tylną kończyną i palcami dotykającymi deski sekcyjnej. Usuń sierść od kostki do powyżej stawu kolanowego.
   2. Owiń skórę kleszczami i przetnij od stawu skokowego do okolicy bioder. Po odsłonięciu mięśnia przeciąć wokół kostki jak "rąbek" spodni. Podciągnij skórę do góry, aby wyraźniej odsłonić mięśnie nóg
   .
   3. Zlokalizuj linię powięzi, która oddziela piszczel przedni (TA) i mięsień brzuchaty łydki, oddziel za pomocą nożyczek preparacyjnych, aby odsłonić ścięgna kolana. Umieść nożyczki preparacyjne między dwoma odsłoniętymi ścięgnami kolana. Nożyczki "zaczepią się" o kieszeń tuż pod odsłoniętymi ścięgnami kolana. Blunt przeciąć "kieszeń", jednocześnie odciągając nożyczki od nogi, aż nożyczki dosięgną kostki, aby odsłonić EDL.
   4. Używając wstępnie zawiązanego węzła pętelkowego w jedwabnym szwie chirurgicznym w rozmiarze 4-0 (patrz Tabela materiałów), zasznuruj jeden koniec szwu pod ścięgnem najbliżej kolana. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł powyżej bliższego połączenia mięśniowo-ścięgnistego, nie umieszczając go na mięśniu ani nie obejmując ścięgna. Wyciąć nad węzłem. Delikatnie pociągnij za pętlę przywiązaną do ścięgna, a EDL wyłoni się z "kieszeni".
   5. Przyklej pętlę do obszaru rozwarstwienia, aby wytworzyć naprężenie w EDL. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł za pomocą innego wstępnie zawiązanego węzła pętlowego na dystalnym połączeniu mięśniowo-ścięgnistym, nie umieszczając go na mięśniu ani nie obejmując ścięgna. Odetnij węzeł z boku bliżej nogi, aby usunąć cały EDL z myszy. Odetnij dodatkowy szew od podwójnych kwadratowych węzłów po bliższej i dalszej stronie mięśnia i umieść mięsień w napowietrzonej kąpieli przy obszarze operacyjnym.
      UWAGA: Upewnij się, że zwracasz uwagę, która strona jest bliższa i/lub dystalna, jeśli umieszczasz mięsień w napowietrzonej kąpieli.
   6. Aby umieścić na dźwigni serwomotoru, przymocuj EDL pionowo między zawieszonymi elektrodami platynowymi. Przymocuj dystalny węzeł pętlowy do nieruchomego haka i przymocuj proksymalny węzeł pętlowy do haka przymocowanego do ramienia serwomotoru. Podnieś kąpiel tkankową, aby zanurzyć mięsień w napowietrzonym roztworze Krebsa-Henseleit.
      UWAGA: Napowietrzanie nie powinno przeszkadzać mięśniom, gdy są zanurzone. Jeśli tak, obniż ciśnienie gazu. Pozwól mięśniom zrównoważyć się przez 10 minut przed rozpoczęciem stymulacji.
3. Zmierz maksymalną siłę izometryczną mięśnia EDL.
   UWAGA: Zapoznaj się z tabelą 1, aby zapoznać się z protokołem pomiaru maksymalnej siły izometrycznej za pomocą drgawek i tężca. Rysunek uzupełniający 1 przedstawia ilustrację programu używanego przez autorów.
   1. Stymuluj mięsień za pomocą skurczu supramaksymalnego, aby upewnić się, że mięsień nie został uszkodzony podczas operacji (80 V, 1 pps, 1ms; Tabela 1; zob. rysunek uzupełniający 2). Jeśli nie doszło do uszkodzenia, użyj pokrętła długości na systemie dźwigni mięśni, aby znaleźć długość mięśnia za pomocą stymulacji drgającej, przy której aktywne napięcie wynosi ~1 V / 0,1271 N przy napięciu pasywnym mniejszym niż ~ 0,1 V / 0,01271 N.
   2. Zapisz początkową długość mięśnia od węzła szwu do węzła szwu w woltach i milimetrach. Wprowadź pomiary do części kalibracyjnej programu dla długości początkowej (patrz rysunek uzupełniający 1).
   3. Znajdź supramaksymalną maksymalną siłę izometryczną drgania przy optymalnej długości (L₀) EDL (Tabela 1). Z technicznego punktu widzenia nie jest wymagany okres odpoczynku, ale odczekanie 1 minuty między stymulacjami ustabilizuje napięcie bierne. Zapisz długość (w woltach), przy której skurcz supramaksymalny jest maksymalny. Jest to optymalna długość mięśnia (L₀) dla skurczu.
   4. Zmierz mięsień suwmiarką na tej długości. Zmierz mięsień od węzła do węzła szwu. Po znalezieniu L₀ skróć mięsień z powrotem do długości początkowej (aktywne napięcie ~1V / 0,1271 N).
   5. Znajdź supramaksymalną maksymalną siłę izometryczną tężca EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabela 1). Zapisz długość (w woltach i milimetrach) supramaksymalnej siły tężcowej przy L₀ i zmierz włókna od węzła szwu do węzła szwu ponownie za pomocą suwmiarki.
      UWAGA: Zwiększanie długości mięśni w krokach co 0,5 V/0,65 mm spowoduje dokładniejsze L₀ zarówno w przypadku drgawek, jak i tężca.
   6. Znajdź submaksymalną siłę izometryczną EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabela 1) przy L₀ przed i po eksperymencie, aby upewnić się, że nie wystąpiło zmęczenie w wyniku protokołu stymulacji. Spadek siły o 10% jest uważany za "zmęczony" mięsień.

Eksperyment			Intensywność symulacji (V)		Częstotliwość impulsów (pps / Hz)		Czas trwania stymulacji (ms)		Komentarze
1. "Rozgrzewka"			80		1		1		Zwiększ lub zmniejsz długość o 0,50 V, aby uzyskać napięcie pasywne 1 V
2. Optymalna długość mięśnia skurczowego (L0)			80		1		1		Zwiększ lub zmniejsz długość o 0,50 V, aby znaleźć napięcie pasywne ~1 V
3. Optymalna długość mięśni tężec (L0)			80		180		500		Odpocznij 3 minuty między zmianą długości o 0,50 V
4. Submaksymalny L0 przed eksperymentem			45		110		500		Na długości L0
6. Eksperymenty z awatarem			45		110				Cyklicznie używaj reprezentatywnych zmian długości dla EDL myszy
7. Submaksymalny L0 po eksperymencie			45		110		500		Wróć do L0 po eksperymencie i zmierz L0

Tabela 1: Protokół stymulacji. Protokół stymulacji w celu znalezienia optymalnej długości drgawek i tężca w supramaksymalnych i submaksymalnych rozmiarach. Protokół różni się w zależności od intensywności stymulacji, czasu i impulsów na sekundę.

3. Wykonywanie techniki pętli roboczej "awatara" przy użyciu wybranych trajektorii szczepów in vivo

1. Zainstaluj oprogramowanie niezbędne do wykonania technik pętli roboczej "awatara" (patrz Spis materiałów).
   UWAGA: Plik wejściowy (.csv lub podobny), który określa długość mięśnia za każdym razem, gdy potrzebny jest krok (patrz krok 1.4). Konieczne są dane wejściowe dotyczące procentu cyklu, w którym rozpoczyna się stymulacja, oraz czasu trwania stymulacji (zob. na przykład rysunek uzupełniający 3).
2. Kompletna technika pętli roboczej "awatara".
   UWAGA: Podczas gdy używamy niestandardowego programu LabView, badacze mogą korzystać z dowolnego programu, który umożliwia kontrolę zmian długości EDL myszy na dźwigni serwomotoru, kontrolę początku (% cyklu) i czasu trwania (ms) stymulacji w określonych momentach oraz pomiar siły mięśniowej. Rysunek 3 ilustruje program używany przez autorów.
   1. Prześlij do programu skalowane zmiany odkształcenia ze skalowanym przechyleniem długości od kroku 1.4. Zobacz kroki 1.4, 3.3 i sekcję Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat "skalowanych zmian odkształcenia".
   2. W razie potrzeby dostosować początkową długość mięśnia (patrz punkt 3.3). Wprowadź długość początkową w V i mm, aby skalibrować wyniki (patrz rysunek uzupełniający 3).
   3. Początek i czas trwania stymulacji obliczone w kroku 1.3.
   4. Przeprowadź mięsień przez skalowane zmiany długości z określonym wychyleniem długości przez dwa cykle.
   5. Zapisywanie danych. Jeśli na tym samym mięśniu pobieranych jest kilka protokołów stymulacji, odczekaj 3 minuty między każdą stymulacją.
   6. Stymulować na optymalnej długości (L₀) za pomocą submaksymalnej aktywacji, aby określić, czy wystąpiło zmęczenie. Jeśli siła zmniejsza się o więcej niż 10%, mięśnie uważa się za zmęczone. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z protokołami stymulacji.
   7. Usuń mięsień z kąpieli. Odetnij węzły pętelkowe z mięśnia i zetrzyj nadmiar roztworu z mięśnia. Zważ mięsień. Określ fizjologiczne pole przekroju poprzecznego za pomocą standardowego wzoru: masa mięśniowa/(L₀*1,06)¹⁹.
3. Dostosuj parametry dla techniki pętli roboczej "awatara" (patrz sekcja Dyskusja).
   1. Określ początkową długość i wydłużenie skoku, dopasowując pasywny wzrost napięcia ex vivo do pasywnego wzrostu napięcia obserwowanego in vivo (Rysunek 2).
      UWAGA: W tym badaniu użyto procentu L₀ do skalowania długości początkowej (mm) i wychylenia (% L₀; patrz krok 1.4 i sekcja Dyskusja). Aby dopasować wzrost napięcia w EDL myszy ex vivo do wzrostu MG szczura in vivo, autorzy stwierdzili, że długość początkowa przy L₀ dawała najlepsze dopasowanie (Rysunek 2).
   2. Wybierz trzy długości początkowe (np. -5% L₀, L₀ i +5% L₀). Wykonaj pętlę roboczą "awatara" na każdej z tych początkowych długości z określonym odchyleniem długości (np. 10% L₀).
      UWAGA: W obecnych eksperymentach z "awatarem" z użyciem mysiego EDL użyto wychylenia długości 10% L₀.
   3. Powtarzaj z nowymi długościami początkowymi i/lub przechylaniem, aż szybkość pasywnego wzrostu napięcia ex vivo będzie podobna do szybkości pasywnego wzrostu napięcia in vivo (patrz Rysunek 2B).
   4. W zależności od rodzaju włókien i dynamiki aktywacji używanych mięśni, wydłuż lub zmniejsz czas trwania stymulacji, aby zoptymalizować dopasowanie między siłą ex vivo i in vivo. W związku z tym może być konieczna zmiana początku i/lub czasu trwania stymulacji, aby jak najlepiej dopasować produkcję siły in vivo podczas eksperymentów "awatar".
   5. Aby zdecydować, czy jest to konieczne (patrz sekcja Dyskusja), należy wykreślić siłę w czasie "awatara" i mięśnia in vivo (Rysunek 3) i obliczyć współczynnik determinacji R², podnosząc do kwadratu skalowaną korelację między siłą mięśni celu i "awatara" (patrz Wyniki reprezentatywne).

Rysunek 2: Dopasowany wzrost napięcia pasywnego. Pętle robocze pokazujące wzrost napięcia biernego in vivo i ex vivo (strzałki). Pętla robocza w skali in vivo od szczura MG (czarnego) chodzącego z częstotliwością 2,9 Hz (dane z Wakeling et al.¹⁵). Pętle robocze skalowane ex vivo z mysiego EDL (zielone) przy 2,9 Hz. (A) Początkowa długość mięśnia EDL myszy wynosi +5% L₀. (B) Początkowa długość mięśnia EDL myszy wynosi L₀. Należy zauważyć, że pasywny wzrost napięcia ex vivo odpowiada wzrostowi napięcia in vivo w A, ale nie w B. Grubsze linie wskazują na stymulację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optymalizacja czasu stymulacji mysiego EDL w celu dopasowania do siły in vivo MG szczura (linia). Siła generowana przez EDL myszy przy użyciu stymulacji opartej na EMG (zielona przerywana linia) zmniejsza się wcześniej niż siła in vivo, prawdopodobnie z powodu szybszej dezaktywacji EDL myszy w porównaniu z MG u szczurów. Aby zoptymalizować dopasowanie między siłami in vivo i ex vivo, EDL myszy stymulowano przez dłuższy czas (ciągła zielona linia). Stymulacja oparta na EMG R² = 0,55, Zoptymalizowana stymulacja R² = 0,91. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Celem eksperymentów "awatara" jest jak najdokładniejsze odtworzenie produkcji sił in vivo i wyników pracy podczas eksperymentów w pętli roboczej ex vivo. W tym badaniu zdecydowano się na użycie mysiego EDL jako "awatara" dla szczurzego MG, ponieważ mysz EDL i szczurzy MG składają się głównie z szybkokurczliwych mięśni^20,21. Oba mięśnie są głównymi ruchami stawu skokowego (zginacz grzbietowy stawu skokowego EDL, zginacz podeszwowy kostki MG) o po...

Discussion

Podczas gdy organizmy płynnie poruszają się po krajobrazach, podstawowe obciążenia i napięcia, których doświadczają mięśnie, różnią się drastycznie ^1,6,23. Zarówno w eksperymentach z lokomocją in vivo ^1,24, jak i w eksperymentach "awatarowych", mięśnie są stymulowane submaksymalnie w cyklicznych, niestabilnych warunkach. Izometryczne zależności siła-długość i iz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pleciony niewchłanialny jedwabny szew 4-0	Mersilk	734H
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)	Sigma-Aldrich	1086436	Krebs-Henseleit  roztwór
Dekstroza	Sigma-Aldrich	D9434	Krebs-Henseleit  rozwiązanie
HEPES	Sigma-Aldrich	PHR1428	Krebs-Henseleit  roztwór
Kwas hydorchlorowy (HCl)	Sigma-Aldrich	1.37055	Krebs-Henseleit  rozwiązanie
Gromadzenie danych LabView	Lab-View
Siarczan magnezu (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506	Krebs-Henseleit  roztwór
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911	Krebs-Henseleit  roztwór
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	5.43841	Krebs-Henseleit  rozwiązanie
S88 Stymulator	trawy	M643H05	Dostępne do kupienia w serwisie eBay
System dźwigni serii 300B	Aurora	1200A	zawiera kąpiel tkankową z płaszczem wodnym
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Krebs-Henseleit  roztwór
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Krebs-Henseleit  roztwór
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Krebs-Henseleit  rozwiązanie
Myszy typu dzikiego	Jackson Laboratory	B6C3Fe a/a Ttn mdm/J