Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

"Avatar", zmodyfikowane eksperymenty w pętli roboczej ex vivo z wykorzystaniem szczepu in vivo i aktywacji

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65610

⸱

18 sierpnia 2023

 , 
1Northern Arizona University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię emulacji produkcji siły mięśniowej in vivo podczas eksperymentów w pętli roboczej ex vivo przy użyciu mięśnia "awatara" od gryzonia laboratoryjnego do oceny wpływu stanów przejściowych szczepu i aktywacji na reakcję siły mięśniowej.

Streszczenie

Zachowania ruchowe to wyłaniające się cechy systemów dynamicznych, które wynikają z produkcji siły mięśniowej i wydajności pracy. Wzajemne oddziaływanie między systemami neuronalnymi i mechanicznymi zachodzi jednocześnie na wszystkich poziomach organizacji biologicznej, od dostrajania właściwości mięśni nóg podczas biegu po dynamikę kończyn wchodzących w interakcję z podłożem. Zrozumienie warunków, w jakich zwierzęta zmieniają swoje strategie kontroli neuronalnej w kierunku wewnętrznej mechaniki mięśni ("prefleksji") w hierarchii kontroli, umożliwiłoby modelom mięśniowym przewidywanie siły mięśniowej in vivo i dokładniejszą pracę. Aby zrozumieć mechanikę mięśni in vivo, konieczne jest zbadanie ex vivo siły mięśni i pracy w dynamicznie zmieniających się warunkach obciążenia i obciążenia podobnych do lokomocji in vivo. Trajektorie odkształceń in vivo zazwyczaj wykazują nagłe zmiany (tj. stany przejściowe odkształcenia i prędkości), które wynikają z interakcji między aktywacją neuronalną, kinematyką układu mięśniowo-szkieletowego i obciążeniami wywieranymi przez środowisko. Głównym celem naszej techniki "awatara" jest zbadanie, jak mięśnie funkcjonują podczas nagłych zmian szybkości odkształcania i obciążenia, kiedy udział wewnętrznych właściwości mechanicznych w produkcji siły mięśniowej może być najwyższy. W technice "awatara" tradycyjne podejście oparte na pętli roboczej jest modyfikowane przy użyciu zmierzonych trajektorii odkształceń in vivo i sygnałów elektromiograficznych (EMG) od zwierząt podczas ruchów dynamicznych, aby napędzać mięśnie ex vivo przez wiele cykli rozciągania i skracania. Podejście to jest podobne do techniki pętli roboczej, z tą różnicą, że trajektorie odkształceń in vivo są odpowiednio skalowane i nakładane na mięśnie myszy ex vivo przymocowane do serwomotoru. Technika ta pozwala na: (1) naśladować szczep in vivo, aktywację, częstotliwość kroku i wzorce pętli roboczej; (2) zmieniać te wzorce, aby jak najdokładniej dopasować reakcje sił in vivo; oraz (3) różnicować specyficzne cechy szczepu i/lub aktywacji w kontrolowanych kombinacjach w celu przetestowania hipotez mechanistycznych.

Wprowadzenie

Poruszające się zwierzęta osiągają imponujące sportowe wyczyny wytrzymałości, szybkości i zwinności w skomplikowanych środowiskach. Lokomocja zwierząt jest szczególnie imponująca w przeciwieństwie do maszyn zaprojektowanych przez ludzi - stabilność i zwinność robotów, protez i egzoszkieletów o obecnych nogach pozostaje słaba w porównaniu ze zwierzętami. Poruszanie się na nogach w naturalnym terenie wymaga precyzyjnej kontroli i szybkich korekt w celu zmiany prędkości i manewrowania cechami otoczenia, które działają jak nieoczekiwane perturbacje1,2,3,4. Jednak zrozumienie niestabilnej lokomocji jest z natury trudne, ponieważ dynamika zależy od złożonych interakcji między środowiskiem fizycznym, mechaniką mięśniowo-szkieletową i kontrolą sensomotoryczną1,2. Poruszanie się na nogach wymaga reagowania na nieoczekiwane zakłócenia za pomocą szybkiego, multimodalnego przetwarzania informacji sensorycznych oraz skoordynowanego uruchamiania kończyn i stawów1,5. Ostatecznie ruch jest możliwy dzięki mięśniom wytwarzającym siłę dzięki wewnętrznym właściwościom mechanicznym układu mięśniowo-szkieletowego, a także dzięki kontroli neuronalnej1,5,6,7. Nierozstrzygniętą kwestią neuromechaniki jest to, w jaki sposób te czynniki oddziałują na siebie, wytwarzając skoordynowany ruch w odpowiedzi na nieoczekiwane zakłócenia. Poniższa technika wykorzystuje wewnętrzną mechaniczną reakcję mięśni na deformację przy użyciu trajektorii odkształceń in vivo podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo z mięśniem "awatara".

Technika pętli pracy mięśni dostarczyła ważnych ram do zrozumienia wewnętrznej mechaniki mięśni podczas cyklicznych ruchów8,9,10. Tradycyjna technika pętli roboczej kieruje mięśniami przez predefiniowane, zazwyczaj sinusoidalne, trajektorie naprężeń przy użyciu częstotliwości i wzorców aktywacji mierzonych podczas eksperymentów in vivo2,8,9,11. Korzystając z trajektorii długości sinusoidalnej, można realistycznie oszacować pracę i moc wyjściową podczas lotu12 i swimming2 w warunkach, w których zwierzęta nie przechodzą gwałtownych zmian trajektorii naprężeń z powodu interakcji ze środowiskiem i kinematyką układu mięśniowo-szkieletowego. Jednak in vivo trajektorie naprężeń mięśni podczas lokomocji nóg powstają dynamicznie w wyniku interakcji między aktywacją neuronalną, kinematyką mięśniowo-szkieletową i obciążeniami wywieranymi przez środowisko5,7,13,14. Potrzebna jest bardziej realistyczna technika pętli roboczej do emulacji obciążeń, trajektorii odkształceń i wytwarzania siły, która odpowiada dynamice mięśni-ścięgno in vivo i zapewnia wgląd w to, jak wewnętrzna mechanika mięśni i kontrola neuronalna współdziałają, aby wytworzyć skoordynowany ruch w obliczu zakłóceń.

Tutaj prezentujemy nowatorski sposób na emulację sił mięśniowych in vivo podczas lokomocji na bieżni za pomocą mięśnia "awatara" od gryzonia laboratoryjnego podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo z trajektoriami szczepów in vivo, które reprezentują zmieniające się w czasie obciążenia in vivo. Wykorzystanie zmierzonych in vivo trajektorii szczepów z mięśnia docelowego na mięśniach zwierzęcia laboratoryjnego podczas kontrolowanych eksperymentów ex vivo pozwoli naśladować obciążenia doświadczane podczas lokomocji. W opisanych tutaj eksperymentach mięsień prostownika długiego myszy ex vivo (EDL) jest używany jako "awatar" dla mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego (MG) szczura in vivo podczas chodzenia, kłusowania i galopu na bieżni13. Podejście to jest podobne do techniki pętli roboczej, z tą różnicą, że trajektorie odkształceń in vivo są odpowiednio skalowane i nakładane na mięśnie myszy ex vivo przymocowane do serwomotoru. Podczas gdy mięśnie EDL myszy różnią się rozmiarem, rodzajem włókien i architekturą w porównaniu z MG szczura, możliwe jest kontrolowanie tych różnic. Technika "awatara" pozwala na: (1) emulację in vivo napięcia, aktywacji, częstotliwości kroku i wzorców pętli roboczej; (2) zmieniać te wzorce, aby jak najdokładniej dopasować reakcje sił in vivo; oraz (3) różnicować specyficzne cechy szczepu i/lub aktywacji w kontrolowanych kombinacjach w celu przetestowania hipotez mechanistycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Northern Arizona University. W niniejszym badaniu wykorzystano mięśnie prostownika długiego palców (EDL) od samców i samic myszy typu dzikiego (szczep B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) w wieku od 60 do 280 dni. Zwierzęta pozyskano z komercyjnego źródła (patrz Tabela materiałów) i utrzymywano w kolonii na Northern Arizona University.

1. Wybór trajektorii szczepu in vivo i przygotowanie do użycia podczas eksperymentów w pętli badawczej ex vivo

UWAGA: W niniejszym protokole w eksperymentach ex vivo wykorzystano wcześniejsze pomiary dynamicznej lokomocji in vivo, udostępnione autorom bezpośrednio (Nicolai Konow, UMass Lowell, komunikacja osobista). Oryginalne dane zostały zebrane na potrzeby pracy Wakeling i wsp.15. Do replikacji protokołu wymagane są dane dotyczące czasu, długości lub odkształcenia, EMG/aktywacji oraz siły.

  1. Segmentuj całość in vivo próba analizy poszczególnych kroków za pomocą dowolnej platformy programistycznej (kod MATLab dostarczony w Uzupełniający plik z kodem 1).
    1. Wykreśl zmiany długości kontraczas dla całości in vivo próba. Wykorzystuje się ją do wizualizacji poszczególnych kroków (od fazy podporu do fazy podporu) oraz do oceny zmienności międzykrokowej (Rysunek 1).
    2. Oblicz odkształcenie dla całej próby (Długość (L) / Maksymalna siła izometryczna przy optymalnej długości L)0).
    3. Wybierz z całego badania krok reprezentatywny dla wszystkich pozostałych kroków, który rozpoczyna się i kończy na podobnych długościach. Można to zrobić wizualnie, nakładając na siebie wykresy długości w celu porównania każdego kroku.
    4. Po wybraniu reprezentatywnego kroku należy wyodrębnić dane dotyczące odkształcenia, EMG/aktywacji oraz siły z całego badania, korzystając z dowolnej platformy programistycznej (patrz Uzupełniający plik z kodem 1 dla kodów używanych w programie MATLab16).
    5. Jeśli częstotliwość próbkowania różni się dla odkształcenia, EMG/aktywacji lub siły, należy przeprowadzić interpolację punktów danych tak, aby wszystkie były próbkowane z tą samą częstotliwością.
      UWAGA: Badacze mogą określić częstotliwość pomiaru na podstawie odstępów czasowych między każdym punktem próbkowania w całym badaniu. Jeśli zmienne są rejestrowane z tą samą częstotliwością, czasy próbkowania będą takie same.
  2. Oblicz częstotliwość kroków segmentowanych.
    1. Oblicz częstotliwość, wyznaczając czas trwania pojedynczego kroku w sekundach, a następnie dzieląc 1 (sekundę) przez ten czas (1/czas trwania = liczba kroków na sekundę).
    2. Ręcznie wyznacz liczbę punktów danych, które należy pozyskać w ex vivo eksperymenty w celu dopasowania częstotliwości.
    3. Oblicz czas potrzebny na wykonanie dwóch kroków. Powtórz sekwencję kroków co najmniej raz w celu oszacowania pomiaru w granicach błędu pomiarowego mięśnia, co będzie wymagane w późniejszej analizie statystycznej.
  3. Wyznaczyć fazę stymulacji względem przyłożonego odkształcenia, wykorzystując zmierzoną aktywność EMG w celu określenia momentu rozpoczęcia i czasu trwania stymulacji dla ex vivo pętle robocze. Można użyć dowolnej platformy programistycznej (patrz Uzupełniający plik z kodem 1 dla kodu użytego w niniejszym badaniu).
    1. Wyświetl sygnał EMG w tym samym zakresie osi x (czas), co zmianę odkształcenia (Rycina 1). Powiększ sygnał EMG, aby był widoczny; można to osiągnąć poprzez pomnożenie sygnału EMG przez dowolną liczbę, przeskalowanie odkształcenia i sygnału EMG do tej samej skali i/lub dodanie sygnału EMG do odkształcenia.
      UWAGA: Autorzy przeskalowali odkształcenie i EMG do tej samej skali, korzystając z funkcji „rescale” w programie MATLab (patrz Rysunek uzupełniający 1).
    2. Wyznacz moment rozpoczęcia i zakończenia aktywności EMG, określony przez zmianę intensywności o dwa odchylenia standardowe17,18.
      UWAGA: W zależności od gatunku zwierzęcia i rodzaju mięśnia, początek zapisu EMG może lub nie może odpowiadać momentowi kontaktu stopy z podłożem (Monica Daley, UC Irvine, komunikacja osobista) (patrz sekcja Dyskusja).
    3. Oblicz procent cyklu odkształcenia (np. 40%), w którym następuje początek aktywacji EMG, oraz czas trwania stymulacji (np. 222 ms).
      UWAGA: Badacze będą musieli uwzględnić opóźnienie sprzężenia wzbudzenie-skurcz (ECC), które różni się pomiędzy in vivo ruch i ex vivo pętle robocze i mogą być różne dla każdego zwierzęcia i mięśnia (np. in vivo ECC dla mięśnia żwaczowego (MG) szczura wynosi 24,5 ms, ex vivo ECC wynosi ok. 5 ms dla mięśnia EDL myszy).
  4. Przygotuj reprezentatywne dane wejściowe dotyczące odkształcenia dla programu kontrolera pętli pracy. Do realizacji programu kontrolera pętli pracy można wykorzystać dowolny program umożliwiający rejestrację siły wyjściowej przy jednoczesnym wprowadzaniu danych o odkształceniu i stymulacji (patrz sekcja Dyskusja).
    1. Należy wybrać odpowiedni krok i przeprowadzić interpolację do liczby punktów niezbędnej do uchwycenia kroku w zakresie in vivo częstotliwość dla dwóch cykli (patrz krok 1.2).
    2. Przeskaluj krok tak, aby rozpoczynał się i kończył na wartości „zero odkształcenia” (np. L0 lub 95% L0) po rozciągnięciu o wcześniej określony zakres przemieszczenia (patrz krok 3.3).
    3. W razie potrzeby należy przeskalować wybrany krok, aby wykorzystać go jako dane wejściowe dla zmian odkształcenia w mięśniu EDL myszy (patrz sekcja Dyskusja). Aby przeskalować, należy wybrać zakres długości, do którego mięsień EDL myszy może zostać rozciągnięty bez uszkodzenia (np. zazwyczaj rozciągamy mięsień EDL myszy o 10% L0 niezależnie od in vivo gatunków). Może to wymagać zmiany w zależności od wyników wstępnych (patrz krok 3.3).

Dane dotyczące skurczu mięśnia sercowego; wykres zależności długości od czasu pokazujący cykliczne wzorce ruchu.
Rycina 1: Zależność długości od czasu podczas całej próby in vivo. Wykres długości (mm) w funkcji czasu dla MG szczura. Kroki są oznaczone okręgami; pojedynczy krok definiowano jako odcinek od najkrótszej do najkrótszej długości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Ocena maksymalnej siły izometrycznej mięśnia mysiego ex vivo

  1. Przygotowanie sprzętu i operacji.
    UWAGA: Wyjaśnienie dotyczące sprzętu niezbędnego do utworzenia pętli roboczej ex vivo znajduje się w sekcji Dyskusja.
    1. Przygotować kąpiel tkankową, wkładając zawór iglicowy oxytube do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym (patrz Tabela materiałów). Podłączyć oxytube do butli z gazem 95% O2-5% CO2. Wypełnić kąpiel tkankową z płaszczem wodnym pod ciśnieniem 20 psi.
    2. Przygotować obszar operacyjny, prowadząc dodatkowy oxytube z linii gazowej do naczynia krystalizacyjnego wypełnionego roztworem Krebsa-Henseleita (krok 2.1.3) w pobliżu obszaru operacyjnego. Będzie on służył do napowietrzania i nawilżania mięśni w trakcie i po operacjach.
      UWAGA: Mięśnie można przechowywać w tym napowietrzonym roztworze do 4 h, jeśli z myszy pobieranych jest jednocześnie więcej niż jeden mięsień.
    3. Przygotować 1 L roztworu Krebsa-Henseleita zawierającego (w mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl2 (2,54) oraz glukozę (10,0) w temperaturze pokojowej, dostosowując pH do 7,4 za pomocą HCl i NaOH (patrz Tabela materiałów). Podczas pracy z HCl i NaOH należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej w postaci gogli i rękawiczek.
    4. Napełnić kąpiel roztworem Krebsa-Henseleita w temperaturze pokojowej i pH 7,4. Całkowicie zanurzyć mięsień i haczyk w roztworze.
    5. Włączyć całe wyposażenie: dwutrybowy system dźwigni mięśniowych, stymulator oraz interfejs sygnałowy (płytka DAQ) (patrz Tabela materiałów).
  2. Disekcja mięśnia EDL.
    1. Głęboko znieczulić mysz, a następnie przeprowadzić eutanazję poprzez zwichnięcie stawu szyjnego. Położyć mysz w pozycji bocznej prawej lub lewej, z wyciągniętą górną kończyną tylną i palcami dotykającymi deski do disekcji. Usunąć futro od kostki powyżej stawu kolanowego.
    2. Unieść skórę pęsetą i naciąć od stawu skokowego do obszaru biodra. Po odsłonięciu mięśnia naciąć skórę wokół kostki na wzór „dolnej krawędzi” spodni. Odciągnąć skórę do góry, aby wyraźniej odsłonić mięśnie nogi.
    3. Zlokalizować linię powięzi oddzielającą mięsień piszczelowy przedni (TA) od mięśnia brzuchatego łydki, rozdzielić je za pomocą nożyczek do disekcji, aby odsłonić ścięgna kolanowe. Umieścić nożyczki do disekcji pomiędzy dwoma odsłoniętymi ścięgnami kolanowymi. Nożyczki „zatrzasną się” w kieszonce tuż poniżej odsłoniętych ścięgien kolanowych. Wykonać tupą disekcję „kieszonki”, odsuwając nożyczki od nogi, aż dotrą one do kostki, aby odsłonić EDL.
    4. Używając wcześniej zawiązanego węzła pętlowego z jedwabnej nici chirurgicznej rozmiaru 4-0 (patrz Tabela materiałów), przeciągnąć jeden koniec nici pod ścięgnem najbliższym kolanu. Zawiązać podwójny węzeł kwadratowy powyżej proksymalnego połączenia mięśnia ze ścięgnem, nie umieszczając go na mięśniu i nie obejmując ścięgna. Odciąć nić powyżej węzła. Delikatnie pociągnąć pętlę zawiązaną na ścięgnie, aby EDL wysunął się z „kieszonki”.
    5. Przykleić pętlę taśmą do obszaru disekcji, aby stworzyć napięcie w EDL. Zawiązać podwójny węzeł kwadratowy za pomocą drugiej pętli w miejscu dystalnego połączenia mięśnia ze ścięgnem, nie umieszczając go na mięśniu i nie obejmując ścięgna. Przeciąć węzeł po stronie bliższej nodze, aby usunąć cały EDL z myszy. Odciąć nadmiar nici od podwójnych węzłów kwadratowych po stronie proksymalnej i dystalnej mięśnia i umieścić mięsień w napowietrzonej kąpieli przy obszarze operacyjnym.
      UWAGA: Należy zaznaczyć, która strona jest proksymalna, a która dystalna, jeśli mięsień jest umieszczany w napowietrzonej kąpieli.
    6. Aby umieścić mięsień na aparacie z dźwignią serwomotorową, przymocować EDL pionowo pomiędzy zawieszonymi elektrodami platynowymi. Przymocować dystalny węzeł pętlowy do nieruchomego haczyka, a proksymalny węzeł pętlowy do haczyka przymocowanego do ramienia serwomotoru. Podnieść kąpiel tkankową, aby zanurzyć mięsień w napowietrzonym roztworze Krebsa-Henseleita.
      UWAGA: Napowietrzanie nie powinno zakłócać stanu mięśnia po jego zanurzeniu. Jeśli tak się dzieje, należy obniżyć ciśnienie gazu. Pozostawić mięsień do równowagi na 10 minut przed rozpoczęciem stymulacji.
  3. Pomiar maksymalnej siły izometrycznej mięśnia EDL.
    UWAGA: Protokół pomiaru maksymalnej siły izometrycznej z wykorzystaniem skurczu pojedynczego i tężca znajduje się w Tabeli 1. Ilustrację programu użytego przez autorów przedstawiono na Ryc. uzupełniającej 1.
    1. Stymulować mięsień supramaksymalnym skurczem pojedynczym, aby upewnić się, że mięsień nie został uszkodzony podczas operacji (80 V, 1 pps, 1ms; Tabela 1; patrz Ryc. uzupełniająca 2). Jeśli nie doszło do uszkodzenia, użyć pokrętła długości w systemie dźwigni mięśniowych, aby znaleźć długość mięśnia przy stymulacji pojedynczej, przy której napięcie aktywne wynosi ~1V / 0,1271 N, a napięcie pasywne mniej niż ~0,1V / 0,01271N.
    2. Zarejestrować długość początkową mięśnia od węzła nici do węzła nici w woltach i milimetrach. Wprowadzić pomiary długości początkowej do części kalibracyjnej programu (patrz Ryc. uzupełniająca 1).
    3. Wyznaczyć maksymalną siłę izometryczną supramaksymalnego skurczu pojedynczego przy optymalnej długości (L0) EDL (Tabela 1). Technicznie nie jest wymagany okres odpoczynku, ale odczekanie 1 min między stymulacjami ustabilizuje napięcie pasywne. Zarejestrować długość (w woltach), przy której skurcz supramaksymalny jest maksymalny. Jest to optymalna długość mięśnia (L0) dla skurczu pojedynczego.
    4. Zmierzyć mięsień suwmiarką przy tej długości. Zmierzyć mięsień od węzła nici do węzła nici. Po znalezieniu L0 skrócić mięsień z powrotem do długości początkowej (napięcie aktywne ~1V / 0,1271 N).
    5. Wyznaczyć maksymalną siłę izometryczną supramaksymalnego tężca EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabela 1). Zarejestrować długość (w woltach i milimetrach) supramaksymalnej siły tężcowej przy L0 i ponownie zmierzyć włókna suwmiarką od węzła nici do węzła nici.
      ​UWAGA: Zwiększanie długości mięśnia w krokach 0,5 V / 0,65 mm pozwoli na dokładniejsze wyznaczenie L0 zarówno dla skurczu pojedynczego, jak i tężca.
    6. Wyznaczyć submaksymalną siłę izometryczną EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabela 1) przy L0 przed i po eksperymencie, aby upewnić się, że nie wystąpiło zmęczenie wynikające z protokołu stymulacji. Spadek siły o 10% uznaje się za objaw „zmęczenia” mięśnia.
EksperymentIntensywność symulacji (V)Częstotliwość impulsów (pps / Hz)Czas trwania stymulacji (ms)Komentarze
1. „Rozgrzewka”8011Zwiększyć lub zmniejszyć długość o 0,50 V, aby wyznaczyć napięcie pasywne przy 1 V
2. Optymalna długość mięśnia podczas drgania (L0)8011Zwiększ lub zmniejsz długość o 0,50 V, aby uzyskać napięcie pasywne rzędu ~1 V
3. Optymalna długość mięśnia przy tężcu (L0)80180500Odpoczynek przez 3 min po każdej zmianie napięcia o 0,50 V
4. Przedeksperymentalny podmaksymalny L045110500Przy długości L0
6. Eksperymenty z wykorzystaniem awatarów45110Cykliczne wykorzystanie reprezentatywnych zmian długości dla mięśnia EDL myszy
7. Pozadoświadczalne obciążenie podmaksymalne L045110500Po zakończeniu eksperymentu powróć do L0 i zmierz L0

Tabela 1: Protokół stymulacji. Protokół stymulacji służący do wyznaczenia optymalnej długości dla nadmaksymalnego i podmaksymalnego skurczu pojedynczego oraz tężca. Protokół różni się w zależności od natężenia stymulacji, czasu trwania oraz liczby impulsów na sekundę.

3. Uzupełnienie pętli pracy techniką „awatara” z wykorzystaniem wybranych trajektorii szczepów in vivo

  1. Skonfiguruj oprogramowanie niezbędne do przeprowadzenia technik pętli pracy typu „avatar” (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Wymagany jest plik wejściowy (.csv lub podobny), który określa długość mięśnia w każdym kroku czasowym (patrz krok 1.4). Niezbędne jest wprowadzenie danych dotyczących procentu cyklu, w którym rozpoczyna się stymulacja, oraz czasu trwania stymulacji (przykład znajduje się na Rysunku uzupełniającym 3).
  2. Przeprowadź technikę pętli pracy typu „avatar”.
    UWAGA: Chociaż w pracy wykorzystano niestandardowy program LabView, badacze mogą użyć dowolnego programu umożliwiającego kontrolę zmian długości mięśnia EDL myszy za pomocą dźwigni serwomotorowej, kontrolę momentu rozpoczęcia (% cyklu) i czasu trwania (ms) stymulacji w określonych momentach oraz pomiar siły mięśnia. Ilustrację programu używanego przez autorów przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 3.
    1. Prześlij do programu przeskalowane zmiany odkształcenia wraz z przeskalowanym zakresem zmian długości zgodnie z krokiem 1.4. Więcej informacji na temat „przeskalowanych zmian odkształcenia” znajduje się w krokach 1.4, 3.3 oraz w sekcji Dyskusja.
    2. W razie potrzeby dostosuj długość początkową mięśnia (patrz sekcja 3.3). Wprowadź długość początkową w V oraz mm, aby skalibrować wyniki (patrz Rysunek uzupełniający 3).
    3. Zastosuj moment rozpoczęcia i czas trwania stymulacji obliczone w kroku 1.3.
    4. Poddaj mięsień przeskalowanym zmianom długości z określonym zakresem zmian długości przez dwa cykle.
    5. Zapisz dane. Jeśli z tego samego mięśnia zbieranych jest kilka protokołów stymulacji, zachowaj 3 min odstępu między każdą stymulacją.
    6. Przeprowadź stymulację przy optymalnej długości (L0) przy użyciu aktywacji submaksymalnej, aby ustalić, czy wystąpiło zmęczenie. Jeśli siła spadnie o więcej niż 10%, mięśnie uznaje się za zmęczone. Protokoły stymulacji przedstawiono w Tabeli 1.
    7. Wyjmij mięsień z kąpieli. Odetnij węzły pętli od mięśnia i osusz nadmiar roztworu z powierzchni mięśnia. Zważ mięsień. Wyznacz fizjologiczną powierzchnię przekroju poprzecznego, korzystając ze standardowego wzoru: masa mięśnia/(L0*1.06)19.
  3. Dostrój parametry techniki pętli pracy typu „avatar” (patrz sekcja Dyskusja).
    1. Wyznacz długość początkową i zakres zmian długości poprzez dopasowanie wzrostu napięcia biernego ex vivo do wzrostu napięcia biernego zaobserwowanego in vivo (Rysunek 2).
      UWAGA: W niniejszym badaniu do skalowania długości początkowej (mm) i zakresu zmian (% L0) wykorzystano procent L0 (patrz krok 1.4 i sekcja Dyskusja). W przypadku dopasowania wzrostu napięcia w mięśniu EDL myszy ex vivo do wzrostu w mięśniu MG szczura in vivo, autorzy stwierdzili, że najlepsze dopasowanie uzyskano przy długości początkowej L0 (Rysunek 2).
    2. Wybierz trzy długości początkowe (np. -5% L0, L0 oraz +5% L0). Wykonaj pętlę pracy typu „avatar” dla każdej z tych długości początkowych przy określonym zakresie zmian długości (np. 10% L0).
      UWAGA: W obecnych eksperymentach typu „avatar” z użyciem mięśnia EDL myszy zastosowano zakres zmian długości wynoszący 10% L0.
    3. Powtarzaj procedurę z nowymi długościami początkowymi i/lub nowym zakresem zmian, aż tempo wzrostu napięcia biernego ex vivo będzie zbliżone do tempa wzrostu napięcia biernego in vivo (patrz Rysunek 2B).
    4. W zależności od typów włókien i dynamiki aktywacji użytych mięśni, zwiększ lub zmniejsz czas trwania stymulacji, aby zoptymalizować dopasowanie siły ex vivo do siły in vivo. W związku z tym podczas eksperymentów typu „avatar” może być konieczna zmiana momentu rozpoczęcia i/lub czasu trwania stymulacji, aby jak najlepiej odwzorować generowanie siły in vivo.
    5. Aby zdecydować, czy jest to konieczne (patrz sekcja Dyskusja), nanieś na wykres siłę w funkcji czasu dla mięśnia typu „avatar” i mięśnia in vivo (Rysunek 3) i oblicz współczynnik determinacji R2 , podnosząc do kwadratu przeskalowaną korelację między siłą mięśnia docelowego a siłą mięśnia typu „avatar” (patrz Reprezentatywne wyniki).

Wykres równowagi statycznej, ΣFx=0, przedstawiający analizę pętli pracy; skalowany diagram naprężenia i odkształcenia.
Rycina 2: Dopasowanie wzrostu napięcia biernego.Pętle pracy pokazujące wzrost napięcia biernego in vivo oraz ex vivo (strzałki). Skalowana pętla pracy in vivo z mięśnia MG szczura (czarna) podczas chodzenia przy 2,9 Hz (dane z Wakeling et al.15). Skalowane pętle pracy ex vivo z mięśnia EDL myszy (zielona) przy 2,9 Hz. (A) Długość początkowa mięśnia EDL myszy wynosi +5% L0. (B) Długość początkowa mięśnia EDL myszy wynosi L0. Należy zauważyć, że wzrost napięcia biernego ex vivo odpowiada wzrostowi napięcia in vivo w przypadku A, ale nie w przypadku B. Grubsze linie oznaczają stymulację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres naprężenia w funkcji czasu pokazujący krzywe odpowiedzi dynamicznej w analizie badania materiałowego.
Rysunek 3: Optymalizacja czasu stymulacji mięśnia EDL myszy w celu dopasowania do siły in vivo mięśnia MG szczura (linia czarna). Siła generowana przez mięsień EDL myszy przy użyciu stymulacji opartej na EMG (zielona linia przerywana) spada wcześniej niż siła in vivo, co prawdopodobnie wynika z szybszej deaktywacji mięśnia EDL myszy w porównaniu do mięśnia MG szczura. Aby zoptymalizować dopasowanie między siłą in vivo a ex vivo, mięsień EDL myszy stymulowano przez dłuższy czas (zielona linia ciągła). Stymulacja oparta na EMG R2 = 0,55, stymulacja zoptymalizowana R2 = 0,91. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem eksperymentów z użyciem „awatara” jest jak najdokładniejsze odwzorowanie produkcji siły i wykonanej pracy in vivo podczas eksperymentów z pętlą pracy ex vivo . W niniejszym badaniu zdecydowano się wykorzystać mięsień EDL myszy jako „awatar” dla mięśnia MG szczura, ponieważ zarówno mięsień EDL myszy, jak i MG szczura składają się głównie z włókien szybkokurczliwych20,21. Oba mięśnie są głównymi poruszaczami stawu skokowego (EDL jest zginac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy organizmy płynnie poruszają się po krajobrazach, podstawowe obciążenia i napięcia, których doświadczają mięśnie, różnią się drastycznie 1,6,23. Zarówno w eksperymentach z lokomocją in vivo 1,24, jak i w eksperymentach "awatarowych", mięśnie są stymulowane submaksymalnie w cyklicznych, niestabilnych warunkach. Izometryczne zależności siła-długość i iz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy przyznają, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy dr Nicolai Konow za dostarczenie danych wykorzystanych w tym badaniu. Finansowane przez NSF IOS-2016049 i NSF DBI-2021832.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pleciony niewchłanialny jedwabny szew 4-0 Mersilk 734H
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)Sigma-Aldrich1086436Krebs-Henseleit  roztwór
Dekstroza Sigma-AldrichD9434Krebs-Henseleit  rozwiązanie
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  roztwór
Kwas hydorchlorowy (HCl) Sigma-Aldrich1.37055Krebs-Henseleit  rozwiązanie
Gromadzenie danych LabView Lab-View
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  roztwór
Chlorek potasu (KCl) Sigma-AldrichP3911Krebs-Henseleit  roztwór
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  rozwiązanie
S88 StymulatortrawyM643H05Dostępne do kupienia w serwisie eBay
System dźwigni serii 300BAurora1200Azawiera kąpiel tkankową z płaszczem wodnym
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  roztwór
Chlorek sodu (NaCl) Sigma-AldrichS9888Krebs-Henseleit  roztwór
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-AldrichS5881Krebs-Henseleit  rozwiązanie
Myszy typu dzikiegoJackson LaboratoryB6C3Fe a/a Ttn mdm/J

Bibliografia

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561(2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242(2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312(2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721(2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669(2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019(2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mi sie in vivogenerowanie si y mi niowejtrajektorie odkszta ceniaaktywacja neuronalnamechanika mi nicykle rozci gania i skracaniasygna y elektromiograficzneserwomotordynamika lokomocji
"Avatar", zmodyfikowane eksperymenty w pętli roboczej ex vivo z wykorzystaniem szczepu in vivo i aktywacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.