Method Article

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

DOI:

10.3791/65611

⸱

July 28th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Roche Pharma Research and Early Development, Pharmaceutical Sciences, Roche Innovation Centre Basel

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra stało się powszechnym zastosowaniem laboratoryjnym ze względu na bogactwo informacji transkryptomicznej, które dostarczają. Sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra jest szczególnie przydatne do badania ekspresji genów w trudnych do dysocjacji tkankach. Co więcej, podejście to jest również kompatybilne z materiałami zamrożonymi (archiwalnymi). W tym miejscu opisujemy protokół izolowania wysokiej jakości pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra w sposób częściowo zautomatyzowany przy użyciu dostępnych na rynku instrumentów i odczynników. W szczególności zrobotyzowany dysocjator służy do automatyzacji i standaryzacji homogenizacji tkanek, a następnie zoptymalizowanego gradientu chemicznego do filtrowania jąder. Na koniec dokładnie i automatycznie liczymy jądra za pomocą automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych. Działanie tego protokołu wykazano na mózgu myszy, nerce szczura oraz tkance wątroby i śledziony cynomolgus. Protokół ten jest prosty, szybki i łatwo adaptowalny do różnych tkanek ssaków bez konieczności rozległej optymalizacji i zapewnia dobrej jakości jądra do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (sc) i pojedynczego jądra (sn) stało się powszechnie stosowanymi protokołami w biologii molekularnej i komórkowej ze względu na zwiększoną rozdzielczość ekspresji genów w porównaniu do sekwencjonowania masowego RNA. Jednak izolacja dobrej jakości preparatów pojedynczych komórek i pojedynczych jąder z tkanek stałych pozostaje wyzwaniem i często stanowi etap ograniczający szybkość w eksperymentach sc/sn-RNAseq. Rzeczywiście, opracowano mnóstwo protokołów, które wykorzystują różne procedury chemiczne i mechaniczne w celu uzyskania zawiesin komórek/jąder1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15. Co więcej, strategie oczyszczania takich preparatów z gruzu/grudek itp. obejmują sortowanie przepływowe, filtrację i mycie. Takie protokoły są często ręczne (co prowadzi do zmienności związanej z użytkownikiem), mogą być czasochłonne (prowadzą do zmniejszenia żywotności komórki/jądra) i/lub mogą wymagać dostępu do cytometru przepływowego w celu sortowania komórek/jąder. Badanie to koncentrowało się na opracowaniu prostego, szybkiego i częściowo zautomatyzowanego protokołu izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków do dalszych zastosowań sekwencjonowania RNA. Skupiliśmy się w szczególności na izolacji jąder, a nie na izolacji komórek, ponieważ jest ona kompatybilna z wykorzystaniem zamrożonych tkanek, co sprawia, że pobieranie/przetwarzanie próbek jest bardziej praktyczne i umożliwia bezstronne grupowanie próbek, zwłaszcza w eksperymentach z przebiegiem czasu. Ponadto, chociaż transkryptom jądrowy nie odzwierciedla w pełni transkryptomu komórkowego, kilka badań wykazało, że dane sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder są porównywalne z danymi sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki w celu identyfikacji typu komórki, mimo że proporcje typów komórek mogą się różnić6,16,17,18,19.

Izolacja jąder składa się z kilku etapów: 1) mechanicznego lub chemicznego rozerwania tkanki w celu uwolnienia jąder, 2) oczyszczenia z resztek i grudek, oraz 3) dokładnego zliczania jąder w celu przygotowania do dalszych zastosowań. W wielu protokołach krok 1 często wiąże się z użyciem homogenizatora Dounce w celu zakłócenia tkanki3,20. Alternatywnie można zastosować metody chemiczne, chociaż często muszą one być zoptymalizowane pod kątem różnych tkanek2,5,6. Z doświadczenia wynika, że ręczna procedura rozbioru tkanek jest podatna na zmienność związaną z operatorem, co prowadzi do zmiennej jakości i wydajności jąder. W celu zminimalizowania zmienności technicznej oraz uzyskania bardziej spójnego i powtarzalnego protokołu, który działa w różnych tkankach, opracowano protokół wykorzystujący dostępny na rynku robotyczny dysocjator tkanek 21. W kroku 2, chociaż wymiana buforu jest zwykle najprostszym sposobem mycia jąder, przyjęliśmy zastosowanie stosunkowo krótkiego etapu wirowania w gradionym poziomie sacharozy, aby uzyskać dokładniejsze usunięcie zanieczyszczeń. W szczególności w przypadku tkanki mózgowej używamy gradientu koloidu krzemionki zamiast gradientu sacharozy, aby uzyskać bardziej skuteczne usuwanie mieliny. Wreszcie, do liczenia, użycie hemocytometru jest złotym standardem w liczeniu i wizualnej kontroli jąder. W naszym protokole ten krok można niezawodnie zautomatyzować za pomocą dostępnego na rynku automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych22. Protokół ten został przetestowany i jest kompatybilny z kilkoma zamrożonymi tkankami ssaków, w tym mózgu, nerek, śledziony i wątroby, z różnych gatunków ssaków (szczurów, myszy i naczelnych) i zapewnia dobrej jakości jądra do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder za pomocą platformy komercyjnej opartej na kropelkach. Protokół trwa około 75 minut od przygotowania tkanki do rozpoczęcia procesu sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą kantonalnego urzędu weterynaryjnego Bazylei-Stadt w ścisłym przestrzeganiu szwajcarskich przepisów federalnych dotyczących ochrony zwierząt lub za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt.

1. Przygotowanie tkanek i odczynników/narzędzi

  1. Czyszczenie i przygotowanie narzędzi
    1. Wyczyść blaty stołowe i pęsety 70% etanolem i roztworem do odkażania RNazy. Wstępnie schłodzić wirówki do temperatury 4 °C.
    2. Wstępnie schłodzić wkłady do izolacji jąder w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut.
    3. Uruchom zrobotyzowany dysocjator i włącz chłodzenie, ustawiając suwak w prawym górnym rogu ekranu na chłodzenie i klikając go, aby rozpocząć chłodzenie, aby suwak zmienił kolor na pomarańczowy. Sprawdzić, czy w dołączonej butelce z odczynnikiem do przechowywania jąder (NSR) i w butelce z buforem do izolacji jąder (NIB) pozostała wystarczająca ilość płynu i czy są one odpowiednio schłodzone.
    4. Przygotuj pudełko z pianki polistyrenowej wypełnione suchym lodem i wstępnie ostudź szalki Petriego i ostrza skalpela na suchym lodzie.
  2. Przygotowanie buforu
    1. Przygotować 1,5 M roztwór poduszki sacharozowej (SCS), jak pokazano w Tabeli 1. Rozprowadzić SCS do 500 μl podwielokrotności w 2 ml probówek DNazy/RNazy, aby uzyskać cztery podwielokrotności SCS po 500 μl na próbkę. Porcje należy przechowywać na lodzie do czasu dalszego użycia.
    2. W przypadku przetwarzania tkanki mózgowej należy zamiast tego przygotować 18% roztwór koloidu krzemionki, jak opisano w Tabeli 2, rozcieńczając roztwór podstawowy koloidu krzemionki w NSR i dodając inhibitor RNazy. Przygotuj 3 ml 18% roztworu koloidu krzemionki na próbkę i trzymaj go na lodzie.

2. Homogenizacja tkanek i izolacja jąder

  1. Wyjąć próbkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i natychmiast umieścić ją na suchym lodzie.
  2. Pokrój próbkę na wstępnie schłodzonej szalce Petriego lub metalowej płytce na suchym lodzie za pomocą wstępnie schłodzonego skalpela na kawałek 15-50 mg (jeśli nie ma jeszcze odpowiedniego rozmiaru). Upewnij się, że próbka jest cięta we właściwym kierunku, tak aby próbka była nadal reprezentatywna dla interesujących struktur narządów.
    UWAGA: Zgodnie z tym protokołem 15-50 mg jest optymalną wielkością próbki do ekstrakcji jądrowej. Aby osiągnąć dobrą wydajność po oczyszczeniu, zalecana jest wielkość próbki co najmniej 25 mg. W przypadku mniejszych próbek dostępne są specjalne wkłady, które są zoptymalizowane pod kątem przetwarzania małych danych wejściowych za pomocą zrobotyzowanego dysocjatora. Małe wkłady do izolacji jąder wejściowych zastosowano do dysocjacji próbek tkanek o masie zaledwie 4 mg z wydajnością wystarczającą do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w dalszej kolejności. Przykład uzysku jąder przy użyciu wkładu o niskim wkładzie z tkanki wątroby szczura przedstawiono w tabeli 3.
  3. Wyjmij wkład do izolacji jąder z lodówki, rozpakuj go, wyjmij młynek i odpipetuj 15 μl inhibitora RNazy (40 U/μL) na dno wkładu.
    UWAGA: Podczas ekstrakcji jąder zrobotyzowany dysocjator doda NIB i NSR do wkładu do całkowitej objętości 3 ml (z protokołem ekstrakcji jąder o małej objętości). Dodając 15 μl inhibitora RNazy (40 U/μL) do wkładu przed ekstrakcją, zawiesina będzie miała pożądane stężenie inhibitora RNAzy wynoszące 0,2 U/μL.
  4. Umieść próbkę tkanki na dnie wkładu za pomocą pęsety. Nie należy umieszczać próbki dokładnie na środku wkładu, aby uzyskać optymalną skuteczność zakłócania.
  5. Wybierz opcję Uruchom protokół na instrumencie i kliknij opcję Nuclei w lewym górnym rogu.
    1. Z menu wybierz protokół Low Volume Nuclei Isolation i sprawdź, czy prędkość zakłóceń jest ustawiona na szybką, klikając Modyfikuj. Załaduj wkładkę do instrumentu, otwierając drzwi i wysuwając stage poprzez podniesienie czerwonego pokrętła.
    2. Włóż wkład w wyznaczone miejsce, obróć blokadę wkładu i wsuń stage, aż czerwone pokrętło zatrzaśnie się na swoim miejscu. Zamknij drzwiczki i rozpocznij ekstrakcję jąder w urządzeniu, klikając przycisk Dalej. Bieg trwa około 7 minut.
  6. Po zakończeniu pracy wyjmij wkładkę z instrumentu, podnosząc czerwone pokrętło i wyciągając stage. Natychmiast umieść wkład na lodzie.
  7. Dla wszystkich tkanek z wyjątkiem mózgu przejdź do kroku 3.1. W przypadku próbek mózgu przejdź bezpośrednio do kroku 3.2.

3. Oczyszczanie jąder

  1. Oczyszczanie gradientu sacharozy
    UWAGA: W przypadku tkanki mózgowej pomiń ten krok i przejdź bezpośrednio do kroku 3.2. Wszystkie etapy oczyszczania są wykonywane na lodzie w celu zminimalizowania degradacji RNA. i probówki, a także wirówki muszą być wstępnie schłodzone. Wszystkie etapy ponownego zawieszania i mieszania są wykonywane wyłącznie przez staranne pipetowanie, ponieważ wirowanie może zagrozić jakości i integralności jąder.
    1. Ostrożnie przebić okrągłą folię na kartridżu dysocjatora końcówką pipety.
      UWAGA: Po dysocjacji otrzymana zawiesina jąder ma przybliżoną objętość 2 ml. Aby ułatwić oczyszczanie z gradientu sacharozy, należy podzielić zawiesinę jąder na dwie podwielokrotności o pojemności 900 μl, co daje całkowitą objętość 1,8 ml zawiesiny jąder podczas oczyszczania.
    2. Usunąć z wkładu pierwszą porcję 900 μl zawiesiny jąder i dodać ją do podwielokrotności SCS o objętości 500 μl przygotowanej uprzednio w probówce o pojemności 2 ml. Dobrze wymieszać, pipetując, aż mieszanina stanie się jednorodna.
    3. Usunąć 1400 μl zawiesiny jąder - mieszaniny SCS i ostrożnie nałożyć ją na nową porcję SCS o pojemności 500 μl, trzymając probówkę pod kątem i dodając mieszaninę kroplami, tworząc wyraźnie widoczną separację faz (patrz Rysunek 1A).
    4. Ostrożnie zamknij rurkę i umieść ją z powrotem na lodzie, nie zakłócając separacji faz.
    5. Powtórzyć kroki 3.1.2-3.1.4 z drugą podwielokrotnością zawiesiny o stężeniu 900 μl i nową podwielokrotnością SCS, aby uzyskać dwie probówki o pojemności 2 ml na próbkę z wyraźnie widocznym rozdzielaniem faz do wirowania gradientowego.
    6. Ostrożnie dodać probówki do wstępnie schłodzonej wirówki i wirować z prędkością 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    7. W międzyczasie należy przygotować NSR opisany w Tabeli 4, dodając inhibitor RNazy do podwielokrotności NSR. Przygotować 1 ml NSR na próbkę.
      UWAGA: W tym momencie kulki żelowe odczynnika do ekspresji genów pojedynczej komórki można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C, umożliwiając im zrównoważenie do temperatury pokojowej (RT), a oligo przełącznika matrycy można ponownie zawiesić w buforze o niskiej temperaturze TE.
    8. Po odwirowaniu usunąć supernatant z obu probówek, nie naruszając osadu i ostrożnie ponownie zawiesić osad w 50 μl lodowatego NSR zgodnie z zaleceniami producenta. Zebrać dwie granulki tej samej próbki w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i dodać 900 μl lodowatego NSR do całkowitej objętości 1 ml. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    9. Odwirować próbkę przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem z wahliwym wirnikiem.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie wirnika z wahliwym wiadrem w celu zminimalizowania utraty jąder, zwłaszcza gdy oczekuje się, że wydajność jąder będzie niska lub gdy zaczynasz od małych ilości tkanki.
    10. W międzyczasie należy przygotować 500 μl na próbkę 1x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) z 0,04% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2 U/μL inhibitorem RNazy, jak opisano w Tabeli 5.
    11. Ostrożnie usunąć supernatant bez wyrzucania osadu i ponownie zawiesić osad w 100 μl roztworu PBS, jak przygotowano powyżej (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy w stężeniu 0,2 U/μL).
      UWAGA: W przypadku małych próbek tkanek stężenie jąder może być niskie, dlatego zaleca się ponowne zawieszenie osadu tylko w 50 μl roztworu PBS, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.
    12. Przejdź bezpośrednio do kroku 4.
  2. Oczyszczanie gradientu koloidu krzemionkowego
    UWAGA: W przypadku tkanki mózgowej gradient koloidu krzemionki jest bardziej odpowiedni niż gradient sacharozy w celu usunięcia mieliny i zanieczyszczeń z zawiesiny jąder. Wszystkie etapy oczyszczania są wykonywane na lodzie, aby zminimalizować degradację RNA. i probówki, a także wirówki muszą być wstępnie schłodzone. Wszystkie etapy ponownego zawieszania i mieszania są wykonywane wyłącznie przez staranne pipetowanie, ponieważ wirowanie może zagrozić jakości i integralności jąder.
    1. Ostrożnie przekłuć okrągłą folię na kartridżu dysocjatora końcówką pipety.
    2. Usunąć zawiesinę jąder z wkładu i dodać ją do probówki o pojemności 5 ml.
    3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C we wstępnie schłodzonej wirówce.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego 18% roztworu koloidu krzemionkowego.
    5. Dodać dodatkowe 2 ml 18% roztworu koloidu krzemionki, aby uzyskać całkowitą objętość 3 ml i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    6. Odwirować próbkę o masie 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirniku z wahliwym kubełkiem z wyłączonym hamulcem.
    7. W międzyczasie należy przygotować NSR opisany w Tabeli 4, dodając inhibitor RNazy do podwielokrotności NSR. Przygotować 1 ml NSR na próbkę.
      UWAGA: W tym momencie kulki żelowe odczynnika do ekspresji genów pojedynczej komórki można wyjąć z zamrażarki o temperaturze -80 °C, co pozwala na zrównoważenie do RT, a oligo przełącznika matrycy można ponownie zawiesić w buforze o niskiej temperaturze TE.
    8. Ostrożnie wyjmij próbkę z wirówki, nie naruszając warstwy mieliny unoszącej się na wierzchu.
    9. Najpierw usuń warstwę mieliny z wierzchu i wyrzuć, a następnie ostrożnie usuń cały supernatant, nie naruszając osadu.
      UWAGA: Warstwę mieliny można łatwo usunąć, owijając sterylną, niestrzępiącą się chusteczką wokół końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby zassać warstwę mieliny wraz z 1-2 ml supernatantu.
    10. Zawiesić granulkę w 1 ml lodowatego NSR zgodnie z zaleceniami producenta.
    11. Odwirować próbkę o masie 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z wirnikiem z obracanym wiadrem.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie wirnika z wahliwym wiadrem w celu zminimalizowania utraty jąder, zwłaszcza gdy oczekuje się, że wydajność jąder będzie niska lub gdy zaczynasz od małych ilości tkanki.
    12. W międzyczasie należy przygotować 500 μl na próbkę 1x PBS (bez Ca2+ i Mg2+) z 0,04% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,2 U/μL inhibitorem RNazy, jak opisano w Tabeli 5.
    13. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić próbkę w 100 μl roztworu PBS, jak przygotowano powyżej (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy przy 0,2 U/μL).
      UWAGA: W przypadku małych próbek tkanek stężenie jąder może być niskie, dlatego zaleca się ponowne zawieszenie osadu tylko w 50 μl roztworu PBS, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

4. Liczenie

  1. Dla każdej próbki, która ma być policzona, rozcieńczyć 10 μl zawiesiny jąder w 20 μl roztworu PBS w celu uzyskania rozcieńczenia 1:3.
  2. Do liczenia dodać 25 μl roztworu barwiącego jodek propidyny (PI) do studzienki mieszającej płytki zliczającej z licznikiem fluorescencyjnym. Dodać 25 μl zawiesiny rozcieńczonych jąder i dobrze wymieszać pipetując. Przenieść 50 μl barwionej próbki z dołka mieszalnika do dołka załadowczego.
  3. Załaduj płytkę liczącą na licznik komórek i rozpocznij liczenie.
    UWAGA: Liczba jąder jest pobierana z czerwonego kanału fluorescencyjnego o czasie ekspozycji 700 ms. Kanał ten został zoptymalizowany w celu uzyskania dokładnego zliczania jąder poprzez porównanie z liczeniem ręcznym z komorą Neubauera i barwieniem błękitem trypanowym pod mikroskopem. Przy wysokich stężeniach jądra znajdują się bardzo blisko siebie, co utrudnia oprogramowaniu ich rozdzielenie. W takim przypadku zaleca się ponowne przeliczenie próbki w odpowiednim rozcieńczeniu. Integralność jąder, jak również czystość, można ocenić na podstawie obrazu w jasnym polu lub pod mikroskopem.
  4. Rozcieńczyć próbki PBS (1x PBS + 0,04% BSA + inhibitor RNazy w stężeniu 0,2 U/μL) do pożądanego stężenia do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.
    UWAGA: Stężenia między 700-1,200 jąder/μl są uważane za optymalne do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Niższe stężenia w komórkach, takie jak 700 jąder/μl, mogą skutkować zmniejszonym zanieczyszczeniem tła przez otaczające RNA.

5. Przygotowanie biblioteki

  1. Wykonaj sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder za pomocą odczynników do ekspresji genów pojedynczej komórki przy użyciu protokołu producenta, którego celem jest odzysk jąder na poziomie 8000-10 000 jąder na próbkę.

6. Sekwencjonowanie

  1. Sekwencjonuj biblioteki z żądaną głębokością sekwencjonowania z sparowanym końcem, podwójnym indeksowaniem i następującymi odczytami sekwencjonowania: Odczyt 1: 28 cykli, Indeks i7: 10 cykli, Indeks i5: 10 cykli i Odczyt 2: 90 cykli.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajność i wszechstronność tego protokołu są demonstrowane poprzez sekwencjonowanie pojedynczych jąder RNA na świeżo zamrożonej tkance kory potylicznej mózgu od trzech myszy B6, świeżo zamrożonej poprzecznie przeciętej tkance nerkowej od trzech szczurów Wistar, archiwalnej (11-letniej) tkance wątroby i śledziony od trzech makaków Mauritian Cynomolgus. Wszystkie zwierzęta nie były perfekowane.

Jak pokazano na rysunkach 1B,C, uzyskano dobrej jakości jądra, które były wolne od śladów pęcherzyków, gruzów i zbrylań. Filtracja oparta na gradiencie sacharozy została zoptymalizowana w celu usunięcia większości zanieczyszczeń poprzez testowanie różnych gęstości, prędkości wirowania i czasów oraz ocenę czystości/integralności jądrowej pod mikroskopem, a także ocenę rozkładu wielkości jąder i wydajności (Rysunek 1D). Pozwoliło nam to wybrać gęstość gradientu sacharozy wynoszącą 1,5 m i zastosować krótki czas wirowania wynoszący 15 minut. Następnie, aby dalej ocenić jakość jąder, dane zostały wstępnie przetworzone za pomocą 10X Cell Ranger, a dalsza analiza danych została przeprowadzona przy użyciu Besca23. Jądra z >5% procentową zawartością mitochondriów (ponieważ są to zwykle jądra uszkodzone/zestresowane) zostały odfiltrowane, a jądra z 500-7000 genów (aby zminimalizować puste kropelki i wielokrotności) zostały zachowane. Uwzględniliśmy tylko geny, które były obecne w co najmniej 30 jądrach. Skupiliśmy się na 8 000 jąder na próbkę kory mózgowej i 10 000 jąder na próbkę nerki, wątroby i śledziony. Po filtracji uzyskano 10 644 wysokiej jakości jądra z trzech próbek mózgu, 14 960 wysokiej jakości jąder z trzech próbek nerek, 18 795 wysokiej jakości jąder z trzech próbek wątroby i 13 882 wysokiej jakości jąder z trzech próbek śledziony. Rysunek 2A,D,G,J przedstawia wykresy skrzypiec reprezentujące rozkład liczby UMI, liczby genów i zawartości mitochondriów w każdej próbce. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach mózgu wynosiła 7 563 UMI/jądro i 3 208 genów/jądro. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach nerek wynosiła 3 841 UMI/jądro i 1 915 genów/jądro. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach wątroby wynosiła 2 649 UMI/jądra i 1 676 genów/jądra. Mediana liczby zliczeń we wszystkich próbkach śledziony wynosiła 1 609 UMI/jądra i 1 138 genów/jąder. Następnie wygenerowaliśmy klastry przy użyciu wysoce zmiennych genów i oznaczyliśmy je za pomocą znanych genów markerowych17,24,25,26. Jak widać w Rysunek 2B,E,H,K, byliśmy w stanie zidentyfikować oczekiwane typy komórek z każdej tkanki. Ponadto, jak widać w Rysunek 2B,E,H,K, wszystkie zwierzęta przyczyniły się do powstania wszystkich klastrów, co wskazuje na ogólną niską zmienność techniczną wprowadzoną przez protokół. Co więcej, proporcje komórkowe były porównywalne we wszystkich trzech próbkach według typu tkanki, podobnie jak UMI i liczba genów (Rysunek 2A, C, D, F, G, I, J, L). Godnym uwagi wyjątkiem jest wątroba, gdzie populacje hepatocytów w trzech próbkach wątroby różniły się proporcjami i profilem. Jest to najprawdopodobniej spowodowane różnicami biologicznymi między zwierzętami (płeć, wiek, stan metaboliczny).

figure-results-1
Rysunek 1: Ocena jakości jąder i optymalizacja gradientu sacharozy. (A) Oczekiwana separacja faz podczas wirowania sacharozy w gradikulacji jest pokazana strzałką. (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne jąder nerki szczura (u góry) i śledziony szczura barwione jodkiem propidyny (u dołu) uzyskane za pomocą protokołu. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopowe w jasnym polu jąder wyizolowanych z wątroby myszy (na górze) i mózgu myszy (na dole), podziałka 500 μm. Zwróć uwagę na regularną gładką powierzchnię jąder, co wskazuje na dobrą jakość jądrową. (D) Optymalizacja gradientu sacharozy. Przetestowano kilka gęstości sacharozy, prędkości wirowania i czasy wirowania. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu jąder, rozkładu wielkości jąder i wydajności jąder są pokazane dla każdego warunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne dane z snRNAseq dotyczące kory potylicznej mózgu myszy, nerki szczura (kora i rdzeń) oraz wątroby i śledziony makaka cynomolgus. (A) Wykresy skrzypcowe pokazujące rozkład genów/jądra, UMIs/jądra i procentową zawartość mitochondriów w próbce mózgu. (B) Lewy panel: wykres UMAP pokazujący udział każdej próbki w klastrach zidentyfikowanych w mózgu. Prawy panel: UMAP pokazujący tożsamość klastrów opatrzonych adnotacjami na podstawie genów markerowych w tkance mózgowej. (C) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach mózgu. (D) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozkład genów/jądra, UMI/jądra i procentową zawartość mitochondriów w próbce nerki. (E) Lewy panel: wykres UMAP przedstawiający udział każdej próbki w skupiskach zidentyfikowanych w nerce. Prawy panel: UMAP pokazujący tożsamość klastrów opatrzonych adnotacjami na podstawie genów markerowych w tkance nerkowej. (F) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach nerek. (G) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozmieszczenie genów/jądra, UMIs/jądra i procentową zawartość mitochondriów w próbce wątroby. (H) Lewy panel: wykres UMAP przedstawiający udział każdej próbki w skupiskach zidentyfikowanych w wątrobie. Prawy panel: UMAP pokazujący tożsamość klastrów opatrzonych adnotacjami na podstawie genów markerowych w tkance wątroby. (I) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach wątroby. (J) Wykresy skrzypcowe przedstawiające rozmieszczenie genów/jądra, UMI/jądra i procentową zawartość mitochondriów w próbce śledziony. (K) Lewy panel: wykres UMAP przedstawiający udział każdej próbki w skupiskach zidentyfikowanych w śledzionie. Prawy panel: UMAP pokazujący tożsamość klastrów opatrzonych adnotacjami na podstawie genów markerowych w tkance śledziony. (L) Proporcje komórkowe zaobserwowane w 3 próbkach śledziony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SkładnikiKoncentracja zapasówObjętość na próbkęStężenie końcowe
Roztwór poduszki sacharozy2 mln1500 μL1,5 mln
Bufor poduszki sacharozy-500 μL-
Ditiotreitol (DTT)1 mln2 μl1 mM
Inhibitor RNAzy 40 U/μL10 μL0,2 U/μL

Tabela 1: Przygotowanie 1,5 M roztworu poduszki sacharozowej (SCS). Roztwór ten jest używany do wirowania sacharozy w gradionym przepływie podczas oczyszczania w kroku 3.1 i powinien być przygotowywany na świeżo za każdym razem przed rozpoczęciem protokołu. Zawsze trzymaj SCS na lodzie podczas protokołu. Rozwiązania wymienione w tej tabeli są wymienione w Tabeli materiałów.

SkładnikiKoncentracja zapasówObjętość na próbkęStężenie końcowe
Roztwór podstawowy koloidu krzemionkowego90%600 μL18%
Odczynnik do przechowywania jąder (S2 Genomics)-2400 μL-
Inhibitor RNAzy 40 U/μL15 μL0,2 U/μL

Tabela 2: Przygotowanie 18% roztworu koloidu krzemionkowego. Roztwór ten jest używany do wirowania w gradiencie koloidu krzemionki podczas oczyszczania w kroku 3.2 i powinien być świeżo przygotowany za każdym razem przed rozpoczęciem protokołu. Zawsze trzymaj 18% roztwór koloidu krzemionki na lodzie podczas protokołu.

tkankaMasa próbkinabójplon
Wątroba szczura25 mg tabletki powlekaniaWkład izolacyjny jąder65 000 jąder na mg tkanki
Wątroba szczura4 mg tabletki powlekaneMały wkład izolacyjny jąder wejściowych32 000 jąder na mg tkanki

Tabela 3: Wydajność jąder z wkładu do izolacji jąder o niskim poziomie wejściowym w porównaniu z wkładem do izolacji jąder po oczyszczeniu gradientu sacharozy.

SkładnikiKoncentracja zapasówObjętość na próbkęStężenie końcowe
Odczynnik do przechowywania jąder-1000 μL-
Inhibitor RNAzy 40 U/μL5 μL0,2 U/μL

Tabela 4: Przygotowanie odczynnika do przechowywania jąder (NSR). Roztwór ten jest stosowany podczas izolacji jąder w krokach 3-5, a także podczas oczyszczania w kroku 3.1.8. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 4 miesięcy. Przygotować świeżą porcję z inhibitorem RNazy podczas etapu wirowania w kroku oczyszczania 6. Rozwiązania wymienione w tej tabeli są wymienione w Tabeli materiałów.

1x PBS + 0,04% roztwór podstawowy BSA
SkładnikiKoncentracja zapasówObjętość dla zapasówStężenie końcowe
PBS (bez Ca2+, bez Mg2+)1x30 ml-
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)30%40 μL0,04%
1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/μL inhibitor RNAzy
SkładnikiKoncentracja zapasówObjętość na próbkęStężenie końcowe
1x PBS + 0,04% roztwór podstawowy BSA-500 μL-
Inhibitor RNAzy 40 U/μL2,5 μl0,2 U/μL

Tabela 5: Przygotowanie PBS + 0,04% BSA. Roztwór ten stosuje się na końcu oczyszczania w kroku 3.1.10 i po zliczeniu w celu rozcieńczenia zawiesiny jąder do pożądanego stężenia w celu sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder 10X (krok liczenia 4.4). Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Przygotować świeżą porcję z inhibitorem RNazy podczas etapu wirowania w kroku oczyszczania 6.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy wszechstronny i częściowo zautomatyzowany protokół uzyskiwania wysokiej jakości pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków i zademonstrowaliśmy protokół na mózgu myszy, nerce szczura oraz tkance wątroby i śledziony.

Porównując wydajność tego protokołu z innymi opublikowanymi protokołami sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra w tkance mózgu, nerek, śledziony i wątroby 6,7,20,24,25,26, zauważamy, że jesteśmy w stanie wykryć podobną liczbę genów i liczby UMI na jądro i jesteśmy w stanie odzyskać oczekiwane typy komórek. W porównaniu z istniejącymi metodami, protokół ten ma kilka zalet. Po pierwsze, protokół w tym badaniu automatyzuje homogenizację tkanek i izolację pojedynczych jąder. Osiąga się to za pomocą robotycznego urządzenia do zaburzania tkanek21. W większości protokołów tkanka jest homogenizowana homogenizatorem Dounce w celu uwolnienia pojedynczych jąder 3,20. Zauważyliśmy jednak, że ten ręczny krok może prowadzić do eksperymentalnej zmienności w wydajności i integralności jąder w zależności od siły wywieranej podczas homogenizacji, co pogarsza odtwarzalność eksperymentów. W tym przypadku, dzięki zastosowaniu zautomatyzowanej rozdrabniarki do tkanek ze stałymi ustawieniami, uzyskano dobrą jakość jąder i wydajność z większą spójnością we wszystkich eksperymentach. Co więcej, automatyzacja tego kroku skraca również czas pracy nad protokołem (etap rozerwania tkanki trwa około 7 minut), pozwalając użytkownikowi przygotować się do kolejnych kroków. Po drugie, protokół opisany w tym badaniu jest wszechstronny, tj. jest kompatybilny z różnymi tkankami różnych gatunków. Dzięki temu możemy uniknąć długotrwałej optymalizacji protokołu, np. w celu identyfikacji/detergentów homogenizacyjnych dla różnych tkanek 2,5,6. Po trzecie, protokół ten nie jest uzależniony od dostępu do sortownika przepływowego w celu uzyskania czystych jąder, co czyni go bardziej dostępnym dla laboratoriów, które nie dysponują wymaganym sprzętem/wiedzą specjalistyczną w zakresie sortowania przepływowego. Zamiast tego zoptymalizowaliśmy filtrację opartą na gradiencie sacharozy, aby usunąć większość zanieczyszczeń. Jednak w szczególności w przypadku tkanki mózgowej zaleca się stosowanie gradientu koloidu krzemionki zamiast gradientu sacharozy w celu skuteczniejszego usuwania mieliny. Odkryliśmy również, że zastosowanie wirnika z wahliwym kubełkiem na końcu etapu wirowania w gradiencie koloidu sacharozy/krzemionki minimalizuje utratę jąder. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie takiego wirnika. Po czwarte, po przetestowaniu wielu metod liczenia jąder (ręczne liczenie pod mikroskopem, użycie kilku automatycznych liczników), zaleca się użycie automatycznego licznika komórek fluorescencyjnych22. Zastosowanie barwnika interkalacyjnego DNA, takiego jak jodek propidyny, zwiększa dokładność zliczania jądra. Po piąte, protokół ten zajmuje około 75 minut od uruchomienia do załadowania chipa mikroprzepływowego. Pomaga to zapewnić, że integralność jąder pozostaje wysoka podczas przetwarzania wielu próbek. Wreszcie, stwierdziliśmy, że protokół jest również kompatybilny z tkanką osadzoną w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). W przypadku stosowania takiego materiału tkankę można usunąć z bloku OCT za pomocą skalpela przed homogenizacją.

Jednym z częstych wyzwań w zestawach danych sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder jest obecność RNA w otoczeniu, które może być niejądrowe (np. mitochondrialne), a także pochodzenia jądrowego 27,28. W naszym protokole mitochondrialne RNA (wskaźnik zastępczy dla niejądrowego RNA otoczenia) jest niskie nawet przed filtrowaniem (0,1-1,6% dla pokazanych tkanek). Jednak, podobnie jak w przypadku innych protokołów i zestawów danych, zanieczyszczenie otaczającego RNA przez geny o wysokiej ekspresji w jądrach licznych typów komórek (takich jak hepatocyty w wątrobie, neurony w mózgach itp.) jestnadal obecne. Istnieje kilka narzędzi bioinformatycznych, takich jak CellBender, SoupX itp., które mogą usunąć takie zanieczyszczenie RNA w otoczeniu przed adnotacją jąder 29,30,31. Innym ograniczeniem tego protokołu jest to, że chociaż etapy rozerwania tkanki i izolacji jąder są zautomatyzowane, przepustowość tego etapu jest nadal ograniczona, ponieważ jednocześnie można przetwarzać tylko jedną próbkę. Ponieważ jednak ten etap zajmuje tylko około 7 minut na kawałek tkanki, wiele próbek może być nadal przetwarzanych w partii. Zazwyczaj przetwarzamy cztery próbki na partię, ale z dobrymi wynikami wykonaliśmy do sześciu próbek na partię. Ostatnie ulepszenia w zrobotyzowanym dysocjatorze, które umożliwiają równoległe przetwarzanie dwóch próbek jednocześnie, umożliwią przetwarzanie 8-12 próbek na partię, co jest zgodne z przepustowością chipa mikroprzepływowego, który jest używany do enkapsulacji pojedynczych jąder.

Chociaż nie używaliśmy jąder wyizolowanych przez ten protokół do innych zastosowań końcowych, takich jak ATAC-seq lub snRNAseq przy użyciu innych platform, w oparciu o jakość danych uzyskanych za pomocą zastosowanych tutaj odczynników do ekspresji genów, uważamy, że nasz protokół powinien być kompatybilny z dodatkowymi dalszymi aplikacjami. Jednak przyszłe prace będą obejmowały testowanie tego protokołu z innymi aplikacjami podrzędnymi, takimi jak ATAC-seq.

Podsumowując, opracowaliśmy szybki, prosty i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji jąder do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra, który, jak wykazano, jest kompatybilny z różnymi typami zamrożonych tkanek ssaków.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są/byli pracownikami firmy F. Hoffmann-La Roche w czasie prowadzenia badania.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Filipowi Bochnerowi, Marion Richardson, Petrze Staeuble i Matthiasowi Selhausenowi za dostarczenie tkanek zwierzęcych, które były analizowane w tym manuskrypcie. Chcielibyśmy również podziękować Petrze Schwalie, Klasowi Hatje, Rolandowi Schmuckiemu i Martinowi Ebelingowi za ich wsparcie bioinformatyczne.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 M DTTThermo Fisher ScientificP2325
10% Tween 20Bio-Rad1662404
10x Separator magnetyczny10x genomikaPN-120250
10x Adapter Vortex10x genomikaPN-120251
1x DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14190144przechowywany w temperaturze 4& C
30% Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9576_50ML
400 mM Tris-HCl, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15568025
40U/μ l RNaseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazyThermo Fisher Scientific10777019przechowywany w temperaturze -20 stopni; C
Agilent Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Cellaca MX Automatyczny licznik komórek o wysokiej przepustowościNexcelom BioscienceCELMXSYSF2Automatyczny licznik komórek fluorescencyjnych
Chromium Next GEM Chip G Zestaw pojedynczych komórek, 16 rxns10x genomikaPN-1000127Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze pokojowej
Chromium Next GEM Secondary Holder10x genomikaPN-1000195
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns10x genomikaPN-1000129Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -80 ° C
Chromium Next GEM Pojedyncza komórka 3' GEM, biblioteka i Zestaw kulek żelowych v3.1, 4 rxns10x genomikaPN-1000128Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns10x genomicsPN-1000158Odczynnik do ekspresji genów w pojedynczej komórce, przechowywany w temperaturze -20 ° C
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns10x genomicsPN-1000130Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -20 & deg;
C Dzielone zbiorniki polistyrenoweVWR41428-958
Probówki DNA LoBind 1,5 ml EppendorfSigma-AldrichEP0030108051
DNA Probówki LoBind 2 ml EppendorfSigma-AldrichEP0030108078
Suchy lód-
Dynabeads MyOne SILANE10x genomicsPN-2000048Odczynnik do ekspresji genów w pojedynczej komórce, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C
Etanol CzystaSigma-AldrichE7023
Gliceryna (glicerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-16
Blok
Wysokowydajne płytki liczące NexcelomNexcelom BioscienceCHM24-A100-001Płytka zliczająca liczniki komórek
Bufor o niskiej zawartości TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA)Thermo Fisher Mini
-
zestaw odczynników NovaSeq 6000 SP v1.5 (100 cykli)Illumina2002840
Bufor do izolacji jąderS2 Genomics100-063-396Przechowywany w 4 & stopniach; C
Wkład izolacyjny jąderS2 Genomics100-063-287Wstępnie schłodzony w temperaturze 4 & stopni; C przed użyciem
Nuclei PURE 2 M Sacharoza Poduszka RoztwórSigma-AldrichNUC201-1KTRoztwór poduszki sacharozy 
Nuclei PURE Sacharoza Cushion BufferSigma-AldrichNUC201-1KT
Odczynnik do przechowywania jąderS2 Genomics100-063-405Przechowywany w temperaturze 4 & stopni;
C Probówki do PCR 0,2 ml 8-probówkowepaski Eppendorf30124359
PercollGE Healthcare17-0891-02Roztwór koloidu krzemionki
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Wirówka z chłodzeniem (Eppendorf 5804R)Eppendorf 
Wirówka z chłodzeniem z wirnikiem wahliwym (Eppendorf 5810R)Eppendorf 
RNAseZapAmbionAM9780Roztwór do dekontaminacji RNAzy
Okrągła szalka Petriego do hodowli komórkowychSPL330005
Skalpel jednorazowyAesculap AGBA210wstępnie schłodzony na suchym lodzie przed użyciem
Zestaw Single Index T Zestaw A, 96 rxns10x genomikaPN-1000213Odczynnik do ekspresji genów jednokomórkowych, przechowywany w temperaturze -20 ° C
Singulator 100 SystemS2 Genomics-Komercyjniedostępny zrobotyzowany dysocjator tkanek
Wodorotlenek sodu 1MSigma-Aldrich72068
Zestaw odczynników SPRIselect BeckmanCoulterb23318
Sterylna pęseta-
UltraPure DNase/RNazo-Free Woda destylowanaThermo Fisher Scientific
ViaStain PI Roztwór do barwieniaNexcelom BioscienceCS1-0109-5mLRoztwór do barwienia jodku propidyny
Vortex Mixer+A2:D44VWR-
ciepła wirówka 12090015 naukowej5805000010581100001510977049

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burja, B., et al. An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  2. Kimbley, L. M., et al. Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue. Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).
  3. Maitra, M., et al. Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications. Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).
  4. Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Current Protocols. 1 (5), e132(2021).
  5. Rousselle, T. V., et al. An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq. Scientific Reports. 12, 9851(2022).
  6. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  7. Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901(2021).
  8. Alvarez, M., et al. Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing. Bio-Protocol. 13 (3), e4601(2023).
  9. Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).
  10. Joshi, N., Misharin, A. Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).
  11. Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. 'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).
  12. Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100. Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).
  13. Matson, K. J. E., et al. Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413(2018).
  14. Mendelev, N., et al. Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue. STAR Protocols. 3 (2), 101446(2022).
  15. Soule, T. G., et al. A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle. Life Science Alliance. 6 (5), e202201806(2023).
  16. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  17. Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).
  18. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  19. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, 6031(2017).
  20. Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542(2020).
  21. Jovanovich, S., et al. Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).
  22. Bell, J., et al. Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method. Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).
  23. Madler, S. C., et al. Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research. NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102(2021).
  24. Wu, H., et al. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).
  25. Han, L., et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis. Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).
  26. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), 1(2019).
  27. Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets. Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).
  28. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746(2019).
  29. Fleming, S. J., et al. Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender. bioRxiv. , (2022).
  30. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biology. 21 (1), 57(2020).
  31. Young, M. D., Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data. Gigascience. 9 (12), giaa151(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Nucleus SequencingNuclei IsolationFrozen TissueRobotic DissociatorSucrose GradientFluorescent Cell CounterRNA SequencingMammalian TissuesNuclei ExtractionAutomated Protocol

Related Articles