Metoda immobilizacji pionowej do analizy mikroskopii poklatkowej u sinic nitkowatych

Summary

Prezentujemy prostą i przystępną metodę wizualizacji nitkowatych sinic w płaszczyźnie XY. Zastosowano matrycę agarozową o niskiej temperaturze topnienia, która pozwoliła na uzyskanie obrazów białek biorących udział w podziale, w orientacji pionowej. Dlatego metodologię tę można zastosować do dowolnego organizmu nitkowatego i różnych rodzajów białek.

Abstract

Głównym wydarzeniem w podziale komórek bakteryjnych jest proces septacji, w którym kluczowym elementem jest białko FtsZ. FtsZ polimeryzuje, tworząc strukturę podobną do pierścienia (pierścień Z) w środku komórki, która służy jako rusztowanie dla innych białek podziałowych. Mikroskopia superrozdzielcza w modelach bakteryjnych Escherichia coli i Bacillus subtilis wykazała, że pierścień Z jest nieciągły, podczas gdy badania obrazowania żywych komórek wykazały, że FtsZ porusza się wzdłuż pierścienia za pomocą mechanizmu znanego jako bieżnia. Aby zbadać dynamikę FtsZ in vivo, konieczne jest specjalne umieszczenie komórek w pozycji pionowej do zobrazowania całej struktury pierścienia w płaszczyźnie XY. W przypadku obrazowania FtsZ u wielokomórkowych sinic, takich jak Anabaena sp. PCC7120, utrzymanie włókien w pozycji pionowej jest trudne ze względu na rozmiar komórek i długość włókien. W tym artykule opisujemy metodę, która pozwala na pionową immobilizację filamentów Anabaena sp. PCC 7120 za pomocą agarozy o niskiej temperaturze topnienia i strzykawek, w celu zarejestrowania pierścienia Z w mutancie wykazującym ekspresję białka fuzyjnego FtsZ-sfGFP. Metoda ta jest szybkim i niedrogim sposobem rejestrowania dynamiki białka w miejscu podziału za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Introduction

Podział komórek bakteryjnych to proces, w którym komórka macierzysta generuje dwie komórki potomne, w większości przypadków za pomocą mechanizmu znanego jako rozszczepienie binarne. Jednym z najwcześniejszych zdarzeń w procesie septacji jest lokalizacja FtsZ w środku komórki¹. To białko, które jest strukturalnie homologiczne do tubuliny², jest konserwatywne i szeroko rozpowszechnione u większości bakterii, a jego polimeryzacja generuje strukturę kurczliwą znaną jako Z-ring³. Pierścień ten służy jako rusztowanie dla innych białek podziałowych i razem tworzą maszynerię molekularną zwaną diwsomem. Kilka badań wykazało, że pierścień Z jest bardzo dynamiczny i że protofilamenty FtsZ poruszają się podczas bieżni^4,5,6. Aby zbadać pierścień Z w eksperymentach poklatkowych, zaleca się zarejestrowanie miejsca podziału w płaszczyźnie XY w celu uzyskania lepszej rozdzielczości i szybkiego próbkowania. Aby to osiągnąć, konieczne jest opracowanie metod pionowej immobilizacji komórek, które zwykle obejmują nanowytwarzanie pułapek na komórki z mikrootworami i złożonych urządzeń mikroprzepływowych⁷.

Cyjanobakterie to mikroorganizmy fotosyntetyzujące, które są klasyfikowane jako Gram-ujemne ze względu na ich morfologię komórkową. Jednak filogenetycznie bliżej im do bakterii Gram-dodatnich⁸. Organizmy te mają geny podziału komórek, które są powszechne u bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, ale ich divisom zawiera również unikalne elementy⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (zwana dalej Anabaena sp.) jest sinicą nitkowatą z jedną płaszczyzną podziału i stanowi model do badania podziału komórek u sinic wielokomórkowych. W tym szczepie udało się określić położenie FtsZ w środku komórek¹⁰. Niemniej jednak nie ma badań pokazujących dynamikę in vivo FtsZ w tym modelu. W naszym laboratorium, poprzez kojarzenie trirodzicielskie i rekombinację homologiczną, uzyskaliśmy całkowicie wyseparowany mutant Anabaena sp., który wykazuje ekspresję białka FtsZ połączonego z sfGFP, które zastąpiło cały endogenny gen ftsZ. Opracowaliśmy szybką i prostą metodę immobilizacji komórek, która faworyzuje pionową orientację włókien zmutowanego szczepu do eksperymentów poklatkowych w celu wizualizacji białek podziałowych w nitkowatych cyjanobakteriach. Ta metoda nie wymaga urządzeń mikroprzepływowych, które mogą być drogie i trudne do opracowania. Jako przykład użyliśmy tego protokołu do wizualizacji pierścienia Z w mutancie FtsZ-sfGFP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protocol

1. Rozważania i wybór modelu komórkowego

UWAGA: Sinice mają silną autofluorescencję ze względu na obecność pigmentów fotosyntetycznych. Sygnał ten znajduje się w czerwonej części widma, dlatego białka fluorescencyjne odpowiednie do obrazowania w sinicach to te, które są daleko od emisji czerwonej. Na przykład GFP, YFP, Venus, Turkus i BFP.

1. Należy wybrać składnik diosomowy obecny w docelowym nitkowatym szczepie sinic. Do eksperymentów konieczne jest skonstruowanie nitkowatego mutanta sinicowego, który wyraża wybrany składnik diwisomowy połączony z białkiem fluorescencyjnym. W tym protokole jako przykład mutant Anabaena sp., który wyraża FstZ-sfGFP. Szczep ten uzyskano przez krzyżowanie trójrodzicielskie z E. coli¹¹.
2. Sprawdź poziom segregacji mutanta, który będzie używany. W tym przykładzie segregację określono przez amplifikację PCR docelowego genu. Mutant FtsZ-sfGFP zastosowany w tym protokole jest w pełni segregowanym szczepem, który nie ma genu ftsZ typu dzikiego.

2. Warunki wzrostu

1. Wykonać nową subkulturę mutanta, używając 10 ml kultury w fazie stacjonarnej (hodowanej przez około 14 dni w ciągłym świetle, w temperaturze 25°C, dla Anabaena sp.) i dodając do 90 ml pożywki BG11 uzupełnionej antybiotykami (spektynomycyna i streptomycyna 10 μl ^ml-1 dla mutanta FtsZ-sfGFP).
2. Hoduj nową kulturę komórkową w stałym świetle i w optymalnej temperaturze, aż do osiągnięcia fazy wykładniczej. Mutant FtsZ-sfGFP Anabaena sp. jest hodowany w temperaturze 25 °C przez 7 dni przed przygotowaniem próbki.

3. Przygotowanie próbki w matrycy agarozowej

1. Weź 2 ml homogenizowanej kultury wzrostu.
2. Wirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. W międzyczasie w kolbie o pojemności 50 ml podgrzej 30 ml 3% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w płynnym podłożu BG11. Użyj kuchenki mikrofalowej ustawionej na średni poziom mocy i sprawdzaj roztwór co 15 sekund, aż do całkowitego rozpuszczenia. Odstawić do ostygnięcia do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Roztwór agarozy należy sterylizować w autoklawie, aby uniknąć zanieczyszczenia.
4. Po zakończeniu wirowania należy wyrzucić 1,9 ml supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałej objętości, pipetując co najmniej trzy razy w górę i w dół.
5. Wymieszać zawieszone komórki z 900 μl 3% roztworu agarozy, pipetując w górę i w dół co najmniej trzy razy.
   UWAGA: Roztwór agarozy musi być płynny, ale nie za gorący, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Następny krok należy wykonać szybko i zanim roztwór agarozy utworzy żelową konsystencję =.
6. Ostrożnie odessać matrycę agarozy do strzykawki o pojemności 1 ml. Ważne jest, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas zasysania próbki za pomocą strzykawki.
   UWAGA: Przed tym krokiem upewnij się, że końcówka strzykawki jest przecięta, aby wyeliminować wąski otwór wejściowy.
7. Pozostawić mieszaninę próbki i agarozy do zestalenia, umieszczając strzykawkę w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej na 2 godziny.
8. Ostrożnie usunąć matrycę agarozową za pomocą tłoka i umieścić ją na czystej i płaskiej powierzchni.
9. Zestaloną próbkę pokroić w plastry w zakresie grubości 0,5 - 1 mm, zachowując integralność matrycy.
   UWAGA: Aby uzyskać lepsze rezultaty, przetnij matrycę agarozy za pomocą skalpela lub cienkich żyletek.
10. Ułóż plastry obok siebie na szkiełku nakrywkowym. Liczba krążków na szkiełku nakrywkowym zależy od jego wymiarów.
    UWAGA: Do mikroskopii poklatkowej zaleca się stosowanie komory komórkowej przeznaczonej do analizy mikroskopowej (np. komory Attofluor lub Chamlide Magnetic). Komory te umożliwiają pobranie próbki bez odwodnienia. W tym przykładzie próbki są przygotowywane na zaokrąglonych szkiełkach nakrywkowych (25 mm) przy użyciu komory Attofluor.
11. Dodać 2 ml stopionego 3% roztworu agarozy do próbki umieszczonej w komorze, aby zapobiec odwodnieniu.
12. Poczekaj, aż roztwór agarozy całkowicie zestali się, aby utworzyć żel.

4. Akwizycja obrazu

1. Standaryzacja parametrów w celu wizualizacji białka fluorescencyjnego będącego przedmiotem zainteresowania w zmutowanym szczepie w mikroskopie konfokalnym. Upewnij się, że mikroskop może wykryć zarówno autofluorescencję, jak i wybrany marker fluorescencyjny.
2. Wizualizuj próbkę w konformacji jasnego pola z maksymalnym powiększeniem i wyszukaj pionowo zorientowany filament, jak pokazano na Rysunek 1.
3. Znajdź interesujące Cię miejsce podziału za pomocą wstępnego skanowania przy użyciu sygnału autofluorescencji wzdłuż płaszczyzny Z.
4. Wykorzystaj parametry markera białka fluorescencyjnego, aby zobrazować sygnał białka będącego przedmiotem zainteresowania w miejscu podziału.
5. Wykonuj eksperymenty poklatkowe zgodnie z modelem biologicznym i białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Na przykład, w tym przypadku przeprowadzono eksperymenty poklatkowe trwające 10 s na 50 s, aby zarejestrować dynamikę FtsZ wzdłuż pierścienia Z w Anabaena sp. (Rysunek 2).

Results

Wizualizacja pierścienia Z w Anabaena sp. przy użyciu metody unieruchomienia pionowego
Aby zbadać dynamikę składników pierścienia Z u bakterii, konieczne jest uzyskanie obrazów w komórkach zorientowanych pionowo. W tej pozycji możliwe jest uwidocznienie pierścienia Z i głównych białek divisomu w celu monitorowania dynamiki białek za pomocą mikroskopii poklatkowej. Klasyczne przygotowanie próbki dla bakterii nie działa w przypadku sinic nitkowatych. W przypadku Anabaena sp. filamenty...

Discussion

Badanie dynamiki białek divisome'owych jest bez wątpienia wyzwaniem. Szczególnie w przypadku sinic nitkowatych jednym z wyzwań jest wizualizacja pierścienia Z w płaszczyźnie poziomej, dla której komórki muszą być zorientowane pionowo. Opisana przez nas metoda pozwala na pozycjonowanie pierścienia Z w płaszczyźnie XY w celu przeprowadzenia różnych analiz. Jest to pierwsza prosta metoda dla sinic nitkowatych, która pozwala na pełną wizualizację pierścienia Z.

Chociaż protokół ten jest prosty i ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawka 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	Jednorazowa medyczna plastikowa strzykawka z igłą o pojemności 1 ml zwykle używana do pompowania płynu lub płynu do wstrzykiwań, w tym eksperymencie służy do zasysania próbki i polimeryzacji.
Komora komórkowa Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	Kamera komórkowa Attofluor to trwały i praktyczny uchwyt na szkiełko nakrywkowe przeznaczony do oglądania żywych próbek komórek w mikroskopach pionowych lub odwróconych.
Termocykler Axygen MaxyGene II z blokiem 96 dołków	CORNING	THERM-1001	Nowy termocykler MaxyGene II zwiększył prędkość i zaawansowane funkcje, zapewniając najwyższą wydajność, której oczekujesz od produktów marki Axygen. Unikalne, elastyczne programowanie. Szybki czas pracy. Ulepszony przepływ pracy w porównaniu z tradycyjnymi cyklerami gradientowymi. Prędkości narastania do 5° C/sek. Regulowana podgrzewana pokrywa mieści paski, rurki i mikropłytki.
Okulary nakrywkowe Fisherbrand: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Wykonane z najlepszego optycznego szkła borokrzemianowego, o jednolitej grubości i rozmiarze. Okrągły kształt. Odporny na korozję.
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Promega	V3841	Agaroza, niska temperatura topnienia, klasa analityczna, jest idealna do zastosowań, które wymagają odzyskania nienaruszonych fragmentów DNA po elektroforezie żelowej.
Mikroskop LSM 880 firmy Zeiss Airyscan	Mikroskop		Zeiss-Mikroskop Zeiss Airyscan LSM 880 to laserowy skaningowy mikroskop ogniskowy, który może uzyskiwać obrazy w granicach rozdzielczości (rozdzielczość boczna ~ 120 nm i rozdzielczość osiowa ~ 350 nm). Detektory są bardzo czułe, co umożliwia pozyskiwanie obrazów w superrozdzielczości z dużą prędkością.
Mikrocentr i iacute; fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific 75002402		Przyspiesz rutynowe procesy przygotowywania próbek do 17 000 i razy; g dzięki naszej standardowej mikrowirówce, dostępnej z chłodzeniem. Te mikrowirówki oferują wydajność, wszechstronność, bezpieczeństwo i wygodę w łatwym w użyciu, kompaktowym przyrządzie laboratoryjnym.
Mikroskop poklatkowy Nikon	Nikon-Laserowy		skaningowy mikroskop konfokalny Nikon C2 jest idealnym mikroskopem do długotrwałego timelapse, ponieważ dzięki komorze inkubacyjnej możliwe jest utrzymanie próbek w optymalnych warunkach przez ponad 8 godzin.
Cienkie żyletki Schick Super Chromium		SKU: 401146	Cienkie żyletki służą do cięcia matrycy agarozowej, co pozwala nam uzyskać krążki z próbką przy zachowaniu integralności matrycy.