Szybka konfiguracja obrazowania mikromacierzy tkankowej i obszaru kafelkowego w mikroskopie obrazowania z multipleksowaną wiązką jonów za pomocą interfejsu Tile/SED/Array

Summary

Obrazowanie wiązką jonów (MIBI) jest często używane do obrazowania mikromacierzy tkanek i sąsiadujących, sąsiadujących ze sobą obszarów tkanek, ale obecne oprogramowanie do konfiguracji tych eksperymentów jest kłopotliwe. Interfejs kafelków/SED/tablicy to intuicyjne, interaktywne narzędzie graficzne opracowane w celu znacznego uproszczenia i przyspieszenia konfiguracji uruchamiania MIBI.

Abstract

Multiplexed ion beam imaging (MIBI) to technika mikroskopii nowej generacji oparta na spektrometrii mas, która generuje 40+ pleksów obrazów ekspresji białek w tkankach histologicznych, umożliwiając szczegółową analizę fenotypów komórkowych i organizacji histoarchitektonicznej. Kluczowe wąskie gardło w działaniu występuje, gdy użytkownicy wybierają fizyczne lokalizacje na tkance do obrazowania. Wraz ze wzrostem skali i złożoności eksperymentów MIBI, interfejs dostarczony przez producenta i narzędzia innych firm stają się coraz bardziej nieporęczne do obrazowania dużych mikromacierzy tkankowych i kafelkowych obszarów tkanek. W związku z tym opracowano internetową, interaktywną warstwę interfejsu graficznego typu "what-you-see-is-what-you-get" (WYSIWYG) - interfejs kafelka/SED/tablicy (TSAI) - dla użytkowników do ustawiania lokalizacji obrazowania za pomocą znanych i intuicyjnych gestów myszy, takich jak przeciąganie i upuszczanie, klikanie i przeciąganie oraz rysowanie wielokątów. Napisany zgodnie ze standardami internetowymi już wbudowanymi w nowoczesne przeglądarki internetowe, nie wymaga instalacji zewnętrznych programów, rozszerzeń ani kompilatorów. Interfejs ten, interesujący dla setek obecnych użytkowników MIBI, znacznie upraszcza i przyspiesza konfigurację dużych, złożonych przebiegów MIBI.

Introduction

Multipleksowane obrazowanie wiązką jonów (MIBI) to technika obrazowania 40+ białek jednocześnie na histologicznych przekrojach tkanek w rozdzielczości do 250 nm^1,2,3. Po wybarwieniu histologicznego wycinka tkanki przy użyciu przeciwciał znakowanych izotopowo czystymi metalami elementarnymi, instrument MIBI przeprowadza spektrometrię mas jonów wtórnych, aby jednocześnie określić ilościowo wszystkie izotopy - a tym samym ekspresję wszystkich antygenów 40+ - w poszczególnych miejscach na tkance. Wykonane na siatkach milionów plamek, wynikowe 40+ pleksowych obrazów ekspresji białek umożliwia wytyczenie granic komórek i identyfikację określonych typów komórek przy jednoczesnym zachowaniu kontekstu przestrzennego1^,2,3,4. Technika ta została wykorzystana przez setki użytkowników w około 20 miejscach do badania składu komórkowego, profili metabolicznych i/lub architektury dziesiątek typów tkanek w ramach badania odpowiedzi immunologicznej na nowotwory, zapalenie tkanek wywołane przez czynniki zakaźne, neuropatologię demencji i tolerancję immunologiczną w ciąży5^{,6,7,8,9,10,11}.

Kluczowym wąskim gardłem w działaniu instrumentu MIBI jest ustawienie pól widzenia (FOV) - od 200 x 200 μm² do 800 x 800 μm² obszarów tkanki - do obrazowania. Obrazy MIBI po jednym polu widzenia na raz, do 800 x 800 μm², dlatego obrazowanie większych obszarów wymaga zszycia ze sobą wielu pól widzenia. Obrazowanie mikromacierzy tkankowej (np. osiem okrągłych tkanek w Rysunek 1A) polega na umieszczeniu wielu pól widzenia w odstępach od siebie. Aby skonfigurować pola widzenia, interfejs producenta dostarcza 1) obraz slajdu z kamery optycznej z krzyżem nitkowym, który w przybliżeniu odpowiada określonej współrzędnej obrazowania (Rysunek 1A) oraz 2) obraz wtórnego detektora elektronów (SED), który pokazuje dokładny obszar na współrzędnej, podobno z dokładnością do 0,1 μm (Rysunek 1B). Po pierwsze, użytkownik z grubsza pozycjonuje pojedyncze pole widzenia za pomocą obrazu optycznego. Ponieważ rozdzielczość obrazu wynosi tylko około 60 μm na piksel, jeśli rozmieszczenie jest przesunięte o dwa piksele (2 piksele x 60 μm na piksel), standardowe pole widzenia 400 μm będzie odchylone o 30%. W związku z tym użytkownik musi użyć obrazu SED, aby dostroić pozycję - żmudna sekwencja kilkunastu kroków obejmująca wiele wyskakujących okienek, wpisywanie współrzędnych w polach tekstowych, powolne popychanie SED za pomocą przycisków sterujących kierunkowych, a często nawet zapisywanie współrzędnych na papierze (rysunek uzupełniający 1). Proces ten należy powtórzyć dla każdego miejsca 100+ mikromacierzy tkanek rdzeniowych (TMA). Niektóre narzędzia innych firm mogą pomóc w początkowym zgrubnym pozycjonowaniu¹². Jednak nadal wymagają one pewnej wiedzy programistycznej, a ostateczne pozycjonowanie nadal odbywa się w procesie dwunastu kroków. Bardzo kłopotliwe jest również umieszczanie siatek sąsiednich pól widzenia, które zostaną później zszyte w kafelkowy obraz panoramiczny.

Tak więc, interfejs kafelka/SED/tablicy (TSAI) został opracowany w celu umożliwienia użytkownikom szybkiego pozycjonowania dużej liczby pól widzenia za pomocą intuicyjnego, interaktywnego interfejsu graficznego. TSAI składa się z dwóch głównych komponentów: 1) internetowego graficznego interfejsu użytkownika (web UI) do szybkiego umieszczania punktów TMA i kafelków tkanek oraz 2) integracji z interfejsem sterowania użytkownika MIBI w celu generowania kafelkowego obrazu SED i dostosowywania pozycji FOV. Jeśli tylko korzysta się z obrazu optycznego, wiele pól widzenia można z grubsza ustawić, a następnie szybko dostosować za pomocą narzędzi do nawigacji/regulacji pola widzenia (Rysunek 2, TSAI, lewe odgałęzienie). Jeśli jednak zostanie wykonane kafelkowanie SED, pola widzenia mogą być dokładnie rozmieszczone na kafelkowym obrazie SED bez konieczności dalszych regulacji w trybie SED (Rysunek 2, TSAI, prawa gałąź). Narzędzia te, które cieszą się ogólnym zainteresowaniem setek obecnych użytkowników MIBI, sprawiają, że kafelkowanie i pozycjonowanie TMA jest bardzo proste nawet dla nowicjuszy i redukują skomplikowane ustawienia MIBI z kilku godzin do kilkudziesięciu minut.

Protocol

1. Ładowanie TSAI

1. Uruchom TSAI, otwierając https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai w przeglądarce internetowej komputera sterującego użytkownikiem MIBI.
   1. Ta instancja TSAI zawiera niestandardowe ustawienia wstępne, które nie mają zastosowania do wszystkich instrumentów. Korzystając z niego, twórz kafelki tylko z pól widzenia szablonu, jak wygenerowano poniżej w kroku 2.6. TSAI działa lokalnie w przeglądarce internetowej i żadne dane obrazu, .json lub nazwy pliku nie są wysyłane ani przechowywane na serwerze.
2. Alternatywnie, skonfiguruj TSAI na dowolnej stronie internetowej z niestandardowymi ustawieniami wstępnymi dla dowolnego instrumentu.
   1. Przejdź do https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai i pobierz katalog mibi_tsai_standalone. Możesz też pobrać plik .zip Supplementary Coding File 1 i rozpakować jego zawartość do katalogu o nazwie mibi_tsai_standalone.
   2. Otwórz mibi_tsai_standalone/_resources/index.js w dowolnym edytorze tekstu.
   3. W razie potrzeby edytuj rozmiar pola widzenia, wybrany czas zatrzymania/czas, rozmiar rastra, JSON pola widzenia i zalecane ustawienia wstępne w index.js, aby dopasować go do ustawień instrumentu. Dotyczy to głównie instrumentów niestandardowych, ale niezależnie od tego należy sprawdzić pary wyboru czasu przebywania / czasu. Oszczędzaj index.js.
   4. Prześlij mibi_tsai_standalone na dowolny serwer WWW dostępny przez Internet, np. witrynę internetową laboratorium lub witrynę internetową hostowaną przez uniwersytet.
   5. Otwórz mibi_tsai_standalone/index.html w przeglądarce internetowej komputera sterującego użytkownikami MIBI.

2. Wczytywanie slajdu MIBI i tworzenie pliku szablonu

1. Zaloguj się do MIBI experiment tracker (dostarczony przez producenta interfejs sieciowy do zarządzania metadanymi związanymi ze skanowaniem) w przeglądarce internetowej.
2. Na karcie Slajdy dodaj nowy slajd i dodaj nową sekcję (Rysunek uzupełniający 2A-B). Na karcie Zasoby wybierz lub utwórz panel znaczników (Rysunek uzupełniający 2C).
3. Na karcie Sekcje dodaj nowy przekrój do panelu (Rysunek uzupełniający 2D).
4. Zaloguj się do interfejsu sterowania użytkownika MIBI w przeglądarce internetowej. Załaduj slajd MIBI, klikając opcję Exchange Sample (Wymień próbkę) i wybierając nowy slajd (Rysunek uzupełniający 3A).
5. Utwórz szablon pola widzenia, klikając Dodaj pole widzenia (rysunek uzupełniający 3B) i ustawiając wymiary ramy, rozmiar pola widzenia, czas zatrzymania, tryb obrazowania i identyfikator sekcji.
6. Eksportuj (pobierz) listę FOV do pliku .json (Rysunek uzupełniający 3C). Pobierz obraz optyczny jako plik .png (rysunek uzupełniający 3D).

3. Optyczna korejestracja silnika na etapie obrazu

1. Otwórz interfejs sieciowy TSAI w przeglądarce internetowej. Jeśli korejestracja nie została wcześniej wykonana, menu korejestracji optycznej powinno otworzyć się automatycznie. Jeśli został wykonany i jest odpowiedni, nie powtarzaj tych kroków.
2. Otwórz menu Optical Coregistration (Współrejestracja optyczna). Kliknij opcję Kopiuj kod automatycznej rejestracji do schowka (Rysunek uzupełniający 4A).
3. Otwórz interfejs sterowania użytkownika MIBI w przeglądarce internetowej. Naciśnij Ctrl+Shift+J, aby otworzyć konsolę przeglądarki, lub kliknij stronę prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Sprawdź, a następnie otwórz kartę Konsola (Rysunek uzupełniający 4B).
4. Wklej kod do konsoli i naciśnij Enter. Kliknij łącze wygenerowane w konsoli (Rysunek uzupełniający 4C). Spowoduje to załadowanie korejestracji do interfejsu internetowego TSAI i zapisanie jej jako pliku cookie, dzięki czemu będzie trwała i nie będzie musiała być powtarzana, chyba że nastąpi zmiana w sprzęcie instrumentu.

4. Kafelkowy skan SED

1. Załaduj obraz optyczny .png i .json pliki z kroku 2.6, przeciągając je i upuszczając na internetowy interfejs użytkownika TSAI.
2. Otwórz menu SED Tiler i kliknij pole tekstowe w górnym rzędzie (Rysunek uzupełniający 5A).
3. Kliknij (± przeciągnij) na obrazie optycznym, aby wybrać lewy górny róg skanowania SED (rysunek uzupełniający 5B).
4. Naciśnij D lub kliknij pole tekstowe w drugim wierszu w menu SED Tiler.
5. Kliknij (± przeciągnij) obraz optyczny, aby wybrać prawy dolny róg skanu SED.
6. W menu SED Tiler (Płytkowce SED) kliknij opcję Copy SED Scan and Shift Correction Code to Clipboard (Rysunek uzupełniający 5C).
7. Otwórz interfejs sterowania użytkownika MIBI w przeglądarce internetowej. Wklej kod do konsoli i naciśnij Enter (rysunek uzupełniający 5D).
8. Przełącz MIBI w tryb SED przy ustawieniu QC - 300 μm, przejdź do obszaru, który nie zostanie uzyskany, i dostosuj wzmocnienie, ostrość i stygmatyzację.
   1. Dostosuj jasność i kontrast obrazu SED bez zmiany wzmocnienia. Naciśnij B, aby zwiększyć jasność lub Shift+B, aby ją zmniejszyć. Naciśnij C, aby zwiększyć kontrast lub Shift+C, aby go zmniejszyć. Naciśnij Shift+V, aby zresetować zarówno jasność, jak i kontrast.
9. Naciśnij Shift+T, aby rozpocząć kafelkowe skanowanie SED.
10. Po zakończeniu powinien automatycznie zapisać nowy plik .png kafelkowego obrazu SED (Rysunek 3). Znaki mogą być dodawane na początku nazwy pliku, ale nie modyfikują żadnej innej części nazwy pliku.
11. Jeśli określone kafelki są nieostre lub w inny sposób nieprawidłowo zeskanowane, zeskanuj je ponownie.
    1. Naciśnij Shift+R, aby dodać kafelek do kolejki ponownego skanowania. Otworzy się okno dialogowe z monitem o wiersz i kolumnę kafelka. Liczby są indeksowane zerem, co oznacza, że wpisywanie 8,0 kolejkuje do dziewiątego wiersza, pierwszej kolumny.
    2. Po dodaniu wszystkich odpowiednich kafelków do kolejki naciśnij Shift+T, aby ponownie zeskanować. Po zakończeniu powinien automatycznie zapisać nowy plik .png kafelkowego obrazu SED.
12. Krok krytyczny: Sprawdź kafelkowy skan SED pod kątem dużych niewspółosiowości ( Rysunek 3C-D). Jeśli jest dostępny, skontaktuj się z pomocą techniczną producenta, aby wyregulować silnik i wiązkę obrazowania lub spróbuj ręcznie skorygować oprogramowanie za pomocą elementów sterujących za pomocą klawiatury w krokach od 4.12.1 do 4.12.9 (Rysunek uzupełniający 6A).
    1. Aby sprawdzić wyrównanie silnika SED stage, przejdź do obszaru szkiełka bez tkanki. Naciśnij Shift+5, aby nagrać pięć pól widzenia 400 μm w szachownicę (rysunek uzupełniający 6B-C) lub Shift+9, aby nagrać wzór 3 x 3 pól widzenia 400 μm (rysunek uzupełniający 6D-E).
    2. Jeśli kolumny FOV są zbyt daleko od siebie, naciśnij 1 i ustaw wartość x f(x) na ujemną liczbę dziesiętną, zwykle z zakresu od -0,0025 do -0,1.
    3. Jeśli pola widzenia w trzecim wierszu są przesunięte w lewo w stosunku do pól widzenia w pierwszym wierszu, naciśnij 2 i ustaw wartość x f(y) na dodatni ułamek dziesiętny, zwykle z zakresu od 0,0025 do 0,1.
    4. Jeśli pola widzenia w trzeciej kolumnie są przesunięte w dół w stosunku do pól widzenia w pierwszej kolumnie, naciśnij 3 i ustaw wartość y f(x) na ujemny ułamek dziesiętny, zwykle z zakresu od -0,0025 do -0,1.
    5. Jeśli wiersze pola widzenia są zbyt daleko od siebie, naciśnij 4 i ustaw wartość y f(y) na ujemny ułamek dziesiętny, zwykle z zakresu od -0,0025 do -0,1.
    6. Iteracyjnie powtarzaj kroki od 4.12.1 do 4.12.5, aż szachownica i wzory 3 x 3 utworzą z grubsza prostą siatkę (Rysunek uzupełniający 6C, E).
    7. Naciśnij S, aby zapisać .png obraz wzoru z wartościami korekcji w nazwie pliku.
    8. Przeciągnij i upuść ten .png plik do interfejsu internetowego TSAI, aby załadować wartości i zapisać je w pliku cookie przeglądarki.
    9. Wykonaj kafelkowe skany SED, aby sprawdzić współczynniki. Opierając się na tych samych zasadach, co w krokach od 4.12.2 do 4.12.5, dokonaj dalszych korekt współczynników, aby skorygować wszelkie niewspółosiowości w kafelkowych obrazach SED.
13. Jeśli kafelkowy SED jest odpowiedni, naciśnij Escape. Wróć do internetowego interfejsu użytkownika TSAI.
14. Przeciągnij i upuść kafelkowy plik SED .png na internetowy interfejs użytkownika TSAI (Rysunek uzupełniający 5E).
15. Kliknij zakładkę SED i dostosuj powiększenie (rysunek uzupełniający 5F).
16. Aby dostosować jasność i kontrast obrazu i/lub opcje rysowania, takie jak grubość linii i rozmiar kursora, użyj menu opcji slajdów nad obrazem SED.
17. Skróty klawiaturowe są dostępne i najczęściej wyświetlane obok narzędzi obrazu: Naciśnij Z, aby powiększyć, lub Shift+Z, aby pomniejszyć. Naciśnij B, aby zwiększyć jasność lub Shift+B, aby ją zmniejszyć. Naciśnij C, aby zwiększyć kontrast lub Shift+C, aby go zmniejszyć. Naciśnij Shift+V, aby zresetować zarówno jasność, jak i kontrast. Naciśnij L, aby przełączyć etykiety nad kafelkami. Naciśnij O, aby przełączyć okręgi o promieniu 5 mm narysowane wokół miejsc ostrości.

5. Mikromacierz tkankowa (TMA)

1. Jeśli ustawiasz pola widzenia dla siatki punktów TMA, najpierw ustaw wzorzec pól widzenia, które mają być replikowane. Na odpowiednim kafelku kolumny Kafelki dostosuj kolumny i wiersze (Rysunek 4A) i zaznacz/odznacz pola na mapie (Rysunek 4B), a także w razie potrzeby dostosuj inne ustawienia FOV.
2. Na odpowiednim kafelku kliknij TMA, aby otworzyć menu opcji TMA (Rysunek 4C). Ustaw liczbę wierszy i kolumn miejsc TMA (Rysunek 4D). W razie potrzeby dodaj prefiks nazewnictwa (Rysunek 4E) i edytuj początkową numerację wierszy i kolumn (Rysunek 4F).
3. Na obrazie slajdu kliknij na cztery rogi TMA (Rysunek 4G-J). Kliknij i przeciągnij zakreślone rogi, aby dostosować położenie krzyża nitkowego tak, aby jak najlepiej pasowały do miejsc TMA.
4. Kliknij Build TMA w menu opcji TMA (Rysunek 4K).
5. Najedź kursorem na każdy kafelek w kolumnie kafelków, aby sprawdzić jego położenie. Aby dostosować, kliknij przycisk Przenieś (Rysunek 4L). Następnie kliknij i przeciągnij obraz slajdu lub naciśnij strzałek na klawiaturze.
   1. Przytrzymaj Shift, naciskając strzałek, aby przesunąć się na większą odległość. Przytrzymaj Alt (Windows) lub Opt (Mac) i naciskaj strzałek, aby przesunąć się na krótszą odległość.
   2. Po wybraniu opcji przenoszenia naciśnij T, aby odznaczyć pole wyboru obok nazwy kafelka, usunąć go z widoku i pominąć we wszystkich później wygenerowanych plikach .json. Możesz też odznaczyć pole wyboru bezpośrednio za pomocą myszy (Rysunek 4M) lub usunąć je całkowicie, klikając przycisk Usuń.
   3. Po wybraniu opcji Przesuń naciśnij 2, 4 lub 8, aby ustawić rozmiar pola widzenia odpowiednio na 200 μm, 400 μm lub 800 μm, a wymiary rastra zostaną przeskalowane proporcjonalnie, tak aby rozdzielczość obrazowania pozostała niezmieniona.
   4. Po wybraniu opcji przesuń naciśnij A, aby przejść do poprzedniego kafelka, lub naciśnij D, aby przejść do następnego kafelka
   .
   5. Aby dostosować inne ustawienia kafelków, kliknij przycisk ≡, aby rozwinąć menu ustawień, jeśli nie jest widoczne.

6. Kafelek obszaru/wielokąta

1. Jeśli ustawiasz pola widzenia tak, aby pokrywały ciągły obszar tkanki, najpierw dostosuj ustawienia pola widzenia zgodnie z potrzebami na odpowiednim kafelku kolumny Kafelki.
2. Na odpowiednim kafelku kliknij pozycję Wielokąt (Rysunek 5A). Kliknij na obraz slajdu, aby ustawić wierzchołki/rogi obszaru, który ma być podzielony na kafelki (Rysunek 5B-C). Kliknij dwukrotnie, aby zamknąć wielokąt i pokryć obszar polami widzenia ( Rysunek 5D).
3. Przewiń do dołu kolumny Kafelki i kliknij przycisk ≡ (^ po rozwinięciu, Rysunek 5E) w nowym kafelku wielokąta, aby wyświetlić mapę kafelków.
4. Włączaj lub wyłączaj poszczególne kafelki, klikając mapę kafelków (Rysunek 5F) lub klikając Clicker (Rysunek 5G) i klikając kafelki FOV na obrazie slajdu.
5. Aby wyłączyć wiele pól widzenia, kliknij gumkę, a następnie kliknij i przeciągnij kafelkowe pola widzenia na obrazie slajdu (Rysunek 5H).
6. Aby włączyć wiele pól widzenia, kliknij Clicker (Rysunek 5G), a następnie kliknij i przeciągnij puste obszary na obrazie slajdu zakryte mapą kafelków.
7. Aby wstawić powyższe wiersze, kliknij przycisk ▲ (Rysunek 5I). Aby wstawić kolumny po lewej stronie, kliknij przycisk ◄ (Rysunek 5J).
8. Aby dostosować położenie kafelków, kliknij Przenieś (Rysunek 5K). Następnie kliknij i przeciągnij obraz slajdu, naciśnij strzałek na klawiaturze lub użyj innych elementów sterujących opisanych w krokach od 5.5.1 do 5.5.5.

7. Nawigacja i regulacja pola widzenia

1. Jeśli kafelkowanie SED jest nieprawidłowo wyrównane lub celownik obrazu optycznego nie odzwierciedla rzeczywistego położenia silnika stage, dostosuj pozycje FOV w trybie SED w interfejsie sterowania użytkownika MIBI za pomocą poniższych elementów sterujących klawiatury.
2. Otwórz menu nawigacji/regulacji pola widzenia poniżej obrazu slajdu (optycznego lub SED). Kliknij opcję Kopiuj kod nawigacyjny FOV do schowka.
3. Otwórz interfejs sterowania użytkownika MIBI w przeglądarce internetowej. Przełącz MIBI w tryb SED i dostosuj wzmocnienie, ostrość i stygmatyzację.
4. Naciśnij Ctrl+Shift+J, aby otworzyć konsolę przeglądarki, lub kliknij stronę prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Sprawdź, a następnie otwórz kartę Konsola.
5. Wklej kod do konsoli i naciśnij Enter. Kod automatycznie przejdzie do pierwszego pola widzenia i dokładnego położenia pola widzenia wyświetlanego na obrazie SED interfejsu sterowania użytkownika MIBI.
6. Dostosuj jasność i kontrast obrazu SED bez zmiany wzmocnienia. Naciśnij B, aby zwiększyć jasność lub Shift+B, aby ją zmniejszyć. Naciśnij C, aby zwiększyć kontrast lub Shift+C, aby go zmniejszyć. Naciśnij Shift+V, aby zresetować zarówno jasność, jak i kontrast.
7. Aby wyregulować powiększenie SED, naciśnij M (200 μm), , (400 μm), . (800 μm) lub / (maksimum).
8. Aby przesunąć pole widzenia, naciśnij strzałek na klawiaturze. Zapisz pozycję, naciskając W. Przytrzymaj Shift, naciskając strzałek, aby przesunąć się na większą odległość. Przytrzymaj Alt (Windows) lub Opt (Mac) i naciskaj strzałek, aby przesunąć się na krótszą odległość. Zauważ, że tylko R1C1 z danego kafelka może zostać przesunięty.
9. Aby włączyć lub wyłączyć pole widzenia, naciśnij T. Aby zmienić rozmiar pola widzenia, naciśnij 2 (200 μm), 4 (400 μm) lub 8 (800 μm). Wymiary rastra zostaną przeskalowane proporcjonalnie, tak aby rozdzielczość obrazowania pozostała taka sama.
10. Aby zapisać plik obrazu z obrazem SED i nałożonym krzyżykiem, naciśnij S. Aby zapisać wersję roboczą dopasowań w pliku .txt, naciśnij X.
11. Gdy będziesz zadowolony, naciśnij D, aby przejść do następnego pola widzenia, lub A, aby wrócić do poprzedniego pola widzenia. Powtórz kroki od 7.6 do 7.11 dla wszystkich pól widzenia.
12. Po zakończeniu ze wszystkimi polami widzenia naciśnij X lub Escape. Dopasowania zostaną zapisane w pliku .txt i skopiowane do schowka.
13. Wróć do internetowego interfejsu użytkownika TSAI. Przeciągnij i upuść plik .txt na web UI TSAI lub wklej korekty w polu tekstowym w menu nawigacji/regulacji FOV.
14. Kliknij przycisk Dopasuj, aby zastosować dopasowania do kafelków w kolumnie Kafelki.

8. JSON generowanie i importowanie plików

1. Poniżej kolumny Kafelki w obszarze Dane wyjściowe sprawdź listę kafelków i szacowany czas wykonywania (Rysunek uzupełniający 7A).
2. W obszarze Grupuj wybierz opcję grupowania FOV (Rysunek uzupełniający 7B). Grupowanie nie ma wpływu na sekwencyjnie uporządkowany plik .json.
   1. W przypadku losowego pliku .json grupowanie pól widzenia według kafelków spowoduje uporządkowanie pól widzenia w taki sposób, że wszystkie pola widzenia na danym kafelku pozostaną razem, nawet jeśli kafelki są w kolejności losowej.
   2. W przypadku losowego pliku .json nie grupuj FOV będzie losowo porządkować FOV w taki sposób, że FOV z różnych kafelków są mieszane.
   3. Jeśli określono uruchomiony autofokus, pola widzenia zostaną automatycznie pogrupowane według najbliższego miejsca autofokusa.
3. W obszarze Podziel wybierz opcję podziału na wiele plików .json (Rysunek uzupełniający 7C).
   1. Nie dziel spowoduje zachowanie wszystkich FOV tylko w jednym pliku .json.
   2. Podział przez każde # FOV podzieli FOV na wiele plików .json, gdzie każdy plik zawiera określoną liczbę FOV.
   3. Podział co # godziny # minuty spowoduje rozdzielenie FOV na wiele plików .json, gdzie szacowany czas wykonywania każdego pliku to w przybliżeniu określony czas.
4. Przeglądaj i zmieniaj kolejność pól widzenia w plikach .json, otwierając menu Zmień kolejność (Rysunek uzupełniający 7D). Aby przesunąć pole widzenia, kliknij i przeciągnij je w żądane miejsce. Pozostałe pola widzenia będą interaktywnie przestawiane wokół przeciągniętego pola widzenia.
5. Aby zapisać .json pliki, kliknij przycisk (przyciski) FOV poniżej menu zmiany kolejności. Sekwencyjny .json porządkuje pola widzenia według kafelka, następnie wiersza, a następnie kolumny (rysunek uzupełniający 7E). Losowy .json losowo definiuje pola widzenia w grupach, jak wybrano w kroku 8.2 (rysunek uzupełniający 7F).
6. Aby zapisać obraz tkanki z polami widzenia i zastosowanymi opcjami wyświetlania (etykiety kafelków, jasność, kontrast itp.), kliknij przycisk Zapisz obraz kafelkowy (rysunek uzupełniający 7G). Jest to często przydatne do prowadzenia dokumentacji i udostępniania współpracownikom.
7. Wróć do interfejsu sterowania użytkownika MIBI. Kliknij Importuj FOV i wybierz wygenerowany plik .json. W razie potrzeby dostosuj ostrość, stygmatyzację i prąd, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij bieg.

Results

TSAI udostępnia dwie metody ustawiania FOV (Rysunek 2). Używa się tylko obrazu optycznego (Rysunek 2, TSAI, lewe rozgałęzienie), podobnie jak w innych istniejących metodach. Druga metoda - generowanie kafelkowego obrazu SED - jest unikalna dla TSAI (Rysunek 2, TSAI, prawa gałąź). TSAI dokładnie rysuje pola widzenia na tym obrazie, eliminując potrzebę spędzania godzin na wpychaniu pól widzenia na miejsce w trybie SED interfejsu producenta. Jed...

Discussion

Multipleksowane obrazowanie wiązką jonów (MIBI) jest potężną techniką analizowania szczegółowych fenotypów komórkowych i histoarchitektury tkanek 5,6,7,8,9,10,11. Wysiłki obliczeniowe związane z MIBI w dużej mierze koncentrowały się na przetwarzaniu danych po obrazowaniu, ale niewiele zrobio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komputer MIBI	Ionpath
MIBIcontrol (oprogramowanie)	Ionpath
MIBIscope	Mikroskop		obrazowania wiązką jonów (MIBI
) Ionpath Ionpath		567001	Szkiełko przewodzące do interfejsu MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (oprogramowanie)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/