Method Article

Zastosowanie analizy cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w organoidach mózgowych 3D

DOI:

10.3791/65621

⸱

August 4th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 4Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 5Department of Neurology, Haukeland University Hospital, 6National Advisory Unit for Congenital Metabolic Diseases, Oslo University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół informuje o unikalnej metodzie użycia cytometru strumieniowego i wielu przeciwciał do jednoczesnej oceny wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów, w tym zmian w objętości mitochondriów, ilości podjednostek kompleksu mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC) i replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja mitochondriów jest częstym pierwotnym lub wtórnym czynnikiem przyczyniającym się do wielu rodzajów neurodegeneracji, a zmiany w masie mitochondrialnej, kompleksach mitochondrialnego łańcucha oddechowego (MRC) i liczbie kopii mitochondrialnego DNA (mtDNA) często występują w tych procesach. Organoidy ludzkiego mózgu pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) podsumowują trójwymiarowy (3D) układ cytoarchitektury mózgu i oferują możliwość badania mechanizmów chorobowych i badań przesiewowych nowych terapii w złożonym systemie ludzkim. W tym miejscu przedstawiamy unikalne podejście oparte na cytometrii przepływowej do pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych w organoidach korowych pochodzących z iPSC. Raport ten szczegółowo opisuje protokół generowania organoidów korowych mózgu z iPSC, dysocjacji generowanych organoidów przez pojedyncze komórki, utrwalania, barwienia i późniejszej analizy cytometrii przepływowej w celu oceny wielu parametrów mitochondrialnych. Podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko podjednostce kompleksu MRC NADH: podjednostce B10 (NDUFB10 oksydoreduktazy ubichinonu lub mitochondrialnemu czynnikowi transkrypcyjnemu A (TFAM) wraz z zależnym od napięcia kanałem selektywnym anionem 1 (VDAC 1) pozwala na ocenę ilości tych białek w mitochondrium. Ponieważ ilość TFAM odpowiada ilości mtDNA, zapewnia pośrednie oszacowanie liczby kopii mtDNA na zawartość mitochondriów. Cała ta procedura może zostać wykonana w ciągu 2-3 godzin. Co najważniejsze, pozwala na jednoczesną kwantyfikację wielu parametrów mitochondrialnych, w tym zarówno całkowitych, jak i specyficznych poziomów w stosunku do masy mitochondrialnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórkowymi i głównym miejscem produkcji trifosforanu adenozyny (ATP). Oprócz dostarczania energii komórkom, mitochondria uczestniczą również w wielu procesach komórkowych, w tym w przekazywaniu informacji komórkowych, różnicowaniu komórek i apoptozie, a także mają zdolność regulowania wzrostu komórek i cyklu komórkowego. Zmiany w funkcji mitochondriów zostały zidentyfikowane w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, w tym w chorobie Parkinsona (PD)1,2, chorobie Alzheimera (AD)3 i stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS)4. Dysfunkcja mitochondriów odgrywa rolę w procesie starzenia, gromadząc somatyczne mutacje mtDNA i pogarszając funkcję łańcucha oddechowego5.

Różne rodzaje dysfunkcji mitochondriów występują w neurodegeneracji, a możliwość mierzenia takich zmian jest niezwykle przydatna podczas badania mechanizmów chorobowych i testowania potencjalnych metod leczenia. Co więcej, stworzenie odpowiednich systemów modelowych in vitro, które rekapitulują chorobę w ludzkich komórkach mózgowych, ma zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów chorobowych i opracowania nowych terapii. Komórki iPS od pacjentów z chorobami neurodegeneracyjnymi zostały wykorzystane do wygenerowania różnych komórek mózgowych, które wykazują uszkodzenie mitochondriów6,7,8,9. Opracowanie trójwymiarowych organoidów mózgowych pochodzących z iPSC jest ważnym krokiem w modelowaniu chorób. Te organoidy mózgowe pochodzące z iPSC zapewniają złożoność i zawierają własne tło genetyczne pacjenta, zapewniając w ten sposób model choroby, który dokładniej odzwierciedla patologię w mózgu pacjenta.

Chociaż przeprowadzono pewne badania nad badaniami mitochondrialnymi z wykorzystaniem organoidów mózgowych pochodzących z iPSC10,11,12, wygodne i niezawodne techniki określania wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów w organoidach mózgowych pochodzących z iPSC pozostają ograniczone. Cytometria przepływowa stanowi potężne narzędzie do pomiaru parametrów mitochondriów na poziomie pojedynczej komórki, jak wykazaliśmy wcześniej13. Badanie to zapewnia szczegółowy protokół generowania organoidów korowych z iPSC, w połączeniu z nowatorskim podejściem opartym na cytometrii przepływowej do jednoczesnego pomiaru wielu parametrów mitochondrialnych, w tym masy mitochondriów, podjednostek kompleksu łańcucha oddechowego i liczby kopii mtDNA (Rysunek 1). Co ważne, wykorzystując masę mitochondrialną jako mianownik, protokoły te pozwalają na pomiar zarówno całkowitych, jak i określonych poziomów na jednostkę mitochondrialną.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Różnicowanie iPSC na organoidy korowe

  1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
    1. Rozmrozić fiolkę z dostępną w handlu matrycą błony podstawnej na lodzie przez noc. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w zimnym Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (1% stężenie końcowe). Sporządzić porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C (patrz tabela materiałów).
    2. Rozmrozić roztwór matrycy membranowej w temperaturze 4 °C (utrzymywać w niskiej temperaturze) i pokryć wymaganą liczbę studzienek (1 ml na jedno dołek w płytce 6-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Wyjmij płytkę z inkubatora i pozwól jej osiągnąć temperaturę pokojową (RT) (pozostaw na godzinę).
      UWAGA: Talerze można przechowywać do 2 tygodni w lodówce (pamiętaj, aby przed użyciem wyjąć je i podgrzać wymagane tego dnia powlekane studzienki w temperaturze RT, aż przestaną być chłodne w dotyku). Zaleca się zużyć płytki w ciągu 3 dni. W przypadku długiego przechowywania dodaj 1 ml Essential 8 Medium (patrz Tabela materiałów) do powlekanej płytki, aby uniknąć wysychania żelu.

2. Preparat Essential 8 (E8) do hodowli iPSC

  1. W sterylnym środowisku przygotuj pożywkę E8, łącząc podłoże podstawowe E8 z suplementem E8 (patrz tabela materiałów). Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
    UWAGA: Zamrożony suplement E8 rozmrozić w temperaturze 4 °C przez noc przed przygotowaniem kompletnego podłoża. Nie zaleca się rozmrażania zamrożonego suplementu w temperaturze 37 °C; stosować E8 Medium przez 2 tygodnie. Przed użyciem należy podtrzymać ciepły E8 Medium na ten dzień w temperaturze pokojowej, aż przestanie być chłodny w dotyku.

3. Hodowla iPSC

  1. Wstępnie podgrzej płytki pokryte matrycą w RT lub inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20-30 min. Wstępnie podgrzej ilość pożywki E8 potrzebną do uzyskania suchej smokry
    2. .
  2. Odessać pożywkę hodowlaną za pomocą pipety.
  3. Przepłukać iPSC (patrz tabela materiałów) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco (bez Ca2+/Mg2+) (DPBS-/-) (4 ml na jeden dołek w płytce 6-dołkowej).
  4. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) (0,5 mM) (1 ml na jedno zagłębienie w płytce 6-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu, gdy brzegi kolonii zaczną odklejać się od płytki (zwykle 3-5 minut).
  5. Zassać roztwór dysocjacyjny.
  6. Dodaj wstępnie podgrzane podłoże E8 (4 ml na jedną studzienkę w płytce 6-dołkowej) i użyj wysokiego ciśnienia, aby odłączyć kolonie iPSC.
  7. Przenieść do dwóch różnych dołków na pokrytej matrycą płytce 6-dołkowej (2 ml na jedno zagłębienie w płytce 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Delikatnie wstrząśnij przed włożeniem płytki do inkubatora. Współczynnik podziału może wynosić 1:2-1:4.
  8. Wymieniaj media codziennie, aż kolonie osiągną 80% zbieżności z dobrym rozmiarem i połączeniami.
    UWAGA: Monitoruj kolonie o odpowiedniej wielkości, zwykle charakteryzujące się dobrze zdefiniowanym, okrągłym kształtem i średnicą w zakresie od 0,5 do 1 mm. Kolonie powinny wykazywać gęste, zwarte struktury z wyraźnie zaznaczonymi, gładkimi granicami.

4. Tworzenie ciała embrionalnego (EB) i indukcja neuronalna

  1. Przygotuj pożywkę do indukcji neuronalnej (NIM), łącząc składniki wymienione w Tabeli materiałów.
  2. Odessać pożywkę i przepłukać komórki DPBS -/- (4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
  3. Dodać wstępnie podgrzaną akutazę (1 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej) (patrz tabela materiałów) do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  4. Delikatnie odpipetować roztwór w górę i w dół 3 do 4 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl.
  5. Zneutralizować za pomocą 2 ml DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą komórki o stężeniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
  6. Ponownie zawiesić granulki komórek, delikatnie pipetując w górę iw dół, aż do palet jednokomórkowych.
  7. Policz i oblicz stężenie żywych komórek za pomocą trypan blue14 w automatycznym liczniku komórek.
  8. Oblicz współczynnik rozcieńczenia i rozcieńcz komórki w NIM, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 60 000 żywych komórek/ml.
  9. Dodać inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) Y-27632 (końcowe stężenie 50 μM) (patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszać.
  10. Dodać 150 μl zawiesiny jednokomórkowej do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim natężeniu (patrz tabela materiałów) i umieścić w inkubatorze. Ustaw jako Dzień 0.
  11. W dniu 1 sprawdź komórki i formy EB w każdym dołku.
    UWAGA: Oceń pomyślne tworzenie EB na podstawie ich jasnego, kulistego i półprzezroczystego wyglądu pod mikroskopem, ich zdolności do pozostawania swobodnie unoszącymi się i oddzielonymi oraz braku martwych komórek, które wyglądają jak ciemne plamy.
  12. W dniu 2 ostrożnie usunąć 75 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 150 μL NIM wraz z 50 μM Y-27632 do każdej studzienki.
  13. W dniach 4, 6 i 8 usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i dodać 150 μl NIM do każdej studzienki.

5. Wytwarzanie organoidów korowych

  1. Przygotuj pożywkę różnicującą neuronalną minus witaminę A (NDM-), łącząc składniki wymienione w Tabeli Materiałów.
  2. W dniu 10 przenieś EBs z 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce na 6-dołkową płytkę o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Ostrożnie przenieś osiem EB do każdego dołka (Rysunek 2). Dodaj 5 ml NDM- do każdej studzienki.
  3. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej wewnątrz inkubatora i zacznij wirować z prędkością 80 obr./min.
  4. W dniach 12, 14 i 16 zastąp NDM- 4 ml po zaessaniu 3 ml starej pożywki.

6. Dojrzewanie i długotrwała hodowla organoidów korowych

  1. Przygotuj pożywkę różnicującą neurony z witaminą A (NDM+) i neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego (BDNF). Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów.
  2. W dniu 18 usuń 3 ml pożywki i dodaj 4 ml NDM+.
  3. Przywróć talerz do wirującej kultury.
  4. Karm co 4 dni i utrzymuj zróżnicowane organoidy korowe w NDM+ aż do użycia. Do dalszej analizy użyto 25-40-dniowych organoidów korowych.
    UWAGA: Organoidy korowe mogą być utrzymywane dłużej (do 3-4 miesięcy); Ale żywotność komórek zostanie zmniejszona z powodu braku wymiany składników odżywczych
    5. .

7. Charakterystyka komórek za pomocą immunocytochemii i barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl delikatnie pobrać organoid z pożywki i delikatnie umieścić go na podłożu z minimalną ilością pożywki na standardowym szkiełku mikroskopowym.
  2. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) (300 μl na próbkę) przez 30 minut. Usuń PFA, a następnie spłucz dwukrotnie PBS.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz obchodzić się z nimi pod wyciągiem chemicznym.
  3. Dodać 30% roztwór sacharozy (300 μl na próbkę) do szkiełek i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Blokować i przepuszczać organoidy za pomocą buforu blokującego (BB) (300 μl na próbkę) zawierającego PBS (z Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy koziej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Obrysuj organoidy hydrofobowym pisakiem barierowym, aby utrzymać bufor na szkiełku.
  5. Nałożyć próbki z przeciwciałem pierwszorzędowym w buforze blokującym (300 μl na próbkę), anty-SRY (region determinujący płeć Y)-ramka 2 (SOX2, 1:100) i markerem antyneuronalnym tuberyna beta III (Tuj1, 1:1000) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności (patrz tabela materiałów).
  6. Myj w PBS przez 3 godziny z dwiema lub trzema wymianami bufora na delikatnie kołyszącej się platformie.
  7. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (300 μl na próbkę), mąką anty-Alexa 488 (1:800) i mąką anty-Alexa 594 (1:800), przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej ciemni. W tym samym czasie dodać barwnik jądrowy Hoechst 33342 (1:5000) (patrz tabela materiałów).
  8. Odessać przeciwciało i szybko przepłukać PBS, a następnie dodawać PBS zawierający 0,01% Naazydu przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  9. Odessać PBS i usunąć nadmiar roztworu. Zamontuj organoidy za pomocą podłoża montażowego (patrz tabela materiałów), a następnie dodaj szkiełko nakrywkowe. Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza i umieścić w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze pokojowej na co najmniej 12 godzin, aby umożliwić pełną polimeryzację mocowania.
    UWAGA: Próbka jest teraz gotowa do wyobrażenia sobie pod mikroskopem fluorescencyjnym.

8. Dysocjacja organoidów korowych

  1. Dodać 30 ml DPBS -/- do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  2. Delikatnie zbierz organoidy mózgowe w probówce za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Do jednego barwienia używa się co najmniej 3 organoidów, które powinny mieć więcej niż 25 dni, ale mniej niż 40 dni.
  3. Organoidy osadowe przez około 5 min. Nie odwirowywać.
  4. Odessać DPBS i dodać do probówki 2 ml wstępnie podgrzanej Accutase. Inkubować próbkę w łaźni wodnej przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Delikatnie rozetrzeć 15 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1000 μl, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza. Inkubować próbkę przez kolejne 5 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  6. Delikatna dysocjacja przy użyciu końcówek do pipet 1000 μl 15 razy bez generowania pęcherzyków (Rysunek 3A).
    UWAGA: Jeśli nadal istnieją niezdysocjowane komórki, przenieś niezdysocjowane komórki do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie inkubuj przez kolejne 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie zdysocjuj, używając końcówek do pipet o pojemności 1000 μl 20 razy.
  7. Zneutralizować 4 ml DMEM z 10% FBS i odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą komórki o stężeniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić za pomocą 200 μl DPBS za pomocą końcówek do pipet 1000 μl 10 razy, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza.
  9. Dodaj 200 μl DPBS, aby uzyskać całkowitą objętość 400 μl zawiesin komórek w DPBS.
  10. Filtruj za pomocą filtra lub rurki filtracyjnej (użyj filtrów 35 lub 40 μm i przepłucz filtr DPBS przed użyciem filtra).
  11. Oddzielić połowę roztworu w probówce i użyć go jako niebarwionej próbki.

9. Pomiar metodą cytometrii przepływowej podjednostek kompleksu MRC i TFAM w komórkach stałych

  1. Dodać żywy i martwy (L/D) barwnik barwiący (1: 1000) (patrz tabela materiałów) (z daleką czerwienią lub bliską podczerwienią, w zależności od konfiguracji markerów cytometrii przepływowej).
    UWAGA: W przypadku otwarcia nowej fiolki z barwnikiem L/D, dodać 50 μl DMSO w celu rozpuszczenia i przygotować 10 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  2. Przechowywać w temperaturze przegrzanej do suchego ekranu i w ciemności przez 30 minut. Dodać 40 ml DPBS -/-. Wirować przy 600 x g przez 5 min.
  3. Zawiesić ponownie w zawiesinie jednokomórkowej po odrzuceniu supernatantu.
  4. Utrwal i przeniknij komórki za pomocą 1 ml lodowatego 90% metanolu w temperaturze -20 °C przez 20 minut.
  5. Zablokuj próbki w 1 ml buforze blokowym zawierającym 0,3 M glicyny, 5% koziej surowicy i 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (z Ca2 + / Mg2 +).
  6. Przemyć 20 ml buforem przepływowym zawierającym PBS (z Ca2+/Mg2+) 0,2% BSA raz lub dwa razy.
  7. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe anty-NDUFB10 sprzężone z Alexa Fluor 405 (1:100), anty-VDAC 1 sprzężone z Alexa Fluor PE (1:100) i przeciwciało anty-TFAM skoniugowane z Alexa Fluor 488 (1:200) przez 30 minut (patrz tabela materiałów).
  8. Przemyć 20 ml buforem przepływowym.
  9. Odessać i pozostawić około 100 μl i rozpuść granulki komórek w 300 μl buforu przepływowego.
  10. Przenieś komórki do probówek przepływowych o pojemności 1,5 ml. Trzymaj w ciemności i lodzie.
  11. Przeprowadzić analizę na cytometrze przepływowym (patrz tabela materiałów). Sygnały zostały wykryte dla Anti NDUFB10-Alexa 405 przy użyciu filtra pasmowoprzepustowego 450/50, TFAM-Alexa 488 przy użyciu filtra pasmowoprzepustowego 530/30, VDAC 1-Alexa 647 przy użyciu filtra pasmowoprzepustowego 670/14 i barwnika L/D w filtrze pasmowoprzepustowym 780/60 (Rysunek 3B).

10. Akwizycja i analiza cytometrii przepływowej

  1. Użyć niebarwionych i pojedynczo barwionych próbek organoidu kontrolnego, aby ustawić napięcie ustawień cytometru.
  2. Użyj niebarwionej rurki kontrolnej, aby ustawić wykresy punktowe obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) i obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) w oparciu o rozmiar i stopień szczegółowości populacji komórek (Rysunek 4A).
  3. Odsuń zanieczyszczenia, aby wybrać żywe komórki z działek FSC-A i SSC-A. Dublety bramkowe z wykorzystaniem wysokości rozproszenia bocznego (SSC-H) vs. Wykres SSC-A (Rysunek 4B).
  4. Wybierz żywe komórki na podstawie barwienia barwnika L/D, przełączając się na APC-cy7 vs. Wykres FSC-A (Rysunek 4C).
  5. Korzystając z niebarwionych próbek każdej linii, narysuj bramkę powyżej głównej populacji zdarzeń na wykresach FSC-A w porównaniu z kanałami fluorochromowymi (FITC, APC, BV 421).
  6. Konfiguracja kompensuje cytometr przepływowy15.
  7. Użyj kontroli izotypu do kontroli ujemnej, aby zaobserwować zabarwienie tła.
  8. Wykonaj akwizycję danych.
    1. Wybierz żywe komórki na podstawie barwienia barwnika L/D, przełączając się na APC-cy7 w porównaniu z wykresem FSC-A (Rysunek 4C).
    2. Wykorzystaj niesplamione jako kontrolę negatywną. Następnie, podczas badania FSC-A vs. kanały fluorochromowe (FITC, APC, BV 421) ustanawiają bramę powyżej głównej populacji zdarzeń jednokomórkowych (Rysunek 4D-F).
  9. Przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania FlowJo (patrz Tabela materiałów).
    1. Zduplikować pozycje bramek na barwionych próbkach komórek. Udokumentuj liczbę komórek, które wykazują dodatnie barwienie.
    2. Dla każdej populacji docelowej oceń medianę intensywności fluorescencji (MFI) różnych kanałów (FITC, APC, BV 421) wykreślonych na osi x histogramu w celu identyfikacji sygnału mitochondrialnego. Specyficzne wartości dla podjednostki kompleksu I NDUFB10 i TFAM można wyznaczyć, dzieląc MFI wyrażenia zespolonego lub TFAM przez wskaźnik masy mitochondrialnej, VDAC 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia diagramowe przedstawienie procesu różnicowania i strategii stosowanych do analizy cytometrycznej przepływowej. Ludzkie iPSC hodowano na nieprzylegających płytkach 96-dołkowych w celu utworzenia EB, a następnie przeniesiono na nieprzylegające płytki 6-dołkowe w celu uzyskania w pełni rozwiniętych organoidów korowych. Skład komórkowy organoidów zweryfikowano za pomocą mikroskopii konfokalnej po barwieniu immunologicznym za pomocą neuronalal16 i mar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół do generowania organoidów korowych mózgu z ludzkich iPSC oraz do wykonywania analizy cytometrycznej parametrów mitochondrialnych w pojedynczych komórkach wyizolowanych z tych organoidów. Skład komórkowy organoidów zweryfikowano za pomocą mikroskopii konfokalnej z barwieniem immunohistochemicznym dla markerów neuronalnych i glejowych. Wykazano, że strategia oparta na cytometrii przepływowej polegająca na współbarwieniu z anty-NDUFB10, VDAC 1 i TFAM umożliwia pomiar określonych poziomów kompleksu I i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy naszą szczerą wdzięczność Garethowi Johnowi Sullivanowi z Instytutu Podstawowych Nauk Medycznych na Uniwersytecie w Oslo, Norwegia, za hojne dostarczenie nam linii komórkowej AG05836 (RRID:CVCL_2B58). Serdecznie dziękujemy Centrum Obrazowania Molekularnego, Centralnemu Zarządowi Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu w Bergen w Norwegii. Prace te były wspierane przez następujące fundusze: K.L była częściowo wspierana przez Uniwersytet w Bergen Meltzers Høyskolefonds (numer projektu:103517133) oraz Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat (numer projektu: 103816102). L.A.B było wspierane przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (numer projektu: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat oraz Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson og Gerdt Meyer Nyquists legat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciała wykorzystujące w cytometrii
anty-DUFB10 Alexa Fluor 405NOVUS biologiczneNBP2-72915AF405
anty-VDAC1 Alexa Fluor 647Technologia Santa Cruzsc-390996
anty-TFAM Alexa Fluor 488Abcamab198308
L/D zestaw do nawożenia martwych komórek w bliskiej podczerwieni L/DTechnologie życiaL10119
Przeciwciała stosowane w barwieniu immunofluorencyjnym
anty-Tuj1Abcamab78078
anty-SOX2 Abcamab97959
Mąka anty-Alexa 488Thermo Fisher ScientificA28175
Mąka anty-Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-21442
Commercial cellsAG05836
(RRID:CVCL_2B58)Dostarczone przez Garetha Johna Sullivana z Instytutu Podstawowych Nauk Medycznych w Uniwersytet w Oslo, Norwegia
Essential 8 Medium (pożywka hodowlana iPSC)
Pożywka Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher ScientificA1516901
Essential 8 Suplement (50x) 2% (v/v)Thermo Fisher ScientificA1517101
Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C i rozgrzać do RT przed użyciem.
Instruments
Heracell 150i Inkubatory CO2Fisher Scientific, Stany Zjednoczone
Wytrząsarki orbitalne - SSM1, SSL1Stuart Equipment, Wielka Brytania
Kamera mikroskopowa CCD Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Niemcy
Kąpiel wodna Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentyGrant Instruments, USA
System aspiracji płynów Sterowanie BVCVacuubrand, Niemcy
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 STEDLeica Microsystems, Niemcy
50 ml probówka FalconSigma-AldrichCLS430828
BD LSR FortessaBD Biosciences, Stany Zjednoczone
Analiza próbnika FlowjoFlowJo LLC, Stany Zjednoczone
Pipeta 10 mlSigma-AldrichSIAL1100
1, 10, 100, 1000 ml PipetaSigma-Aldrich
40 µ m Cell starinerSigma-AldrichCLS431750
96-dołkowa płytka o ultraniskim nasadceS-BIOMS-9096UZ
Automatyczny licznik komórek Countess IIThermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12Technologie życia11330032
Podłoże neuropodstawoweTechnologie życiowe2110349
Suplement Glutamax 1% (v/v)Technologie życia35050
Suplement N2 0,5% (v/v)Technologie życia17502-048
B27 suplement 1% (v/v)Życie technologie17504-044
β-Merkaptoetanol 50 &mikro; MSigma-aldrichM3148
BDNF 20 ng/mlPeprotech450-02
Kwas askorbinowy 200 &mikro; MSigma-Aldrich A92902
Sklep pod adresem 4° C przez okres do 2 tygodni
Pożywka różnicowania neuronalnego minus wiatmina A (NDM-)
DMEM/F12Technologie życiowe11330032
Neurobaseal mediumTechnologie życiowe2110349
Glutamax suplement 1% (v/v)Technologie życiowe35050
Suplement N2 0,5% (v/ v)Life technologies17502-048
B27 suplement W/O wit. A 1% (v/v)Technologie życiowe12587010
β-Merkaptoetanol 50 &mikro; MSigma-aldrichM3148
Sklep pod adresem 4° C przez okres do 8 dni
Neural Induction Medium (NIM)
DMEM/F12Technologie życia11330032
Wymiana surowicy nokautującej 15% (v/v)Technologie życia10828028
Suplement Glutamax 1% (v/v)Technologie życia35050
β- Merkaptoetanol 100 &mikro; MSigma-AldrichM3148
LDN-193189 100 nMStemgent/Reprocell04-0074
SB431542 10 µ MTocris1614
XAV939 2 & mikro; MSigma-AldrichX3004
Sklep w 4° C do 10 dni
Neutralizator pożywka
IMDMTechnologie życia21980032
FBS 10%Sigma-Aldrich12103C
Inne odczynniki
DPBS (wolny od Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific14190250
Surowica bydlęca AlbuminaEuropa BioproductsEQBAH62-1000
Technologie AccutaseLifeA11105-01
Technologie GeltrexLifeA1413302
Technologie EDTALife15575038
Zaawansowane technologie DMEM / F12Life12634010
Tkanka nerwowa zestaw dysocjacyjnyMiltenyi biotec130-092-628
Y-27632 dichlorowodorek Inhibitor skałBiotechne Tocris1254
Fluoromount-G™ Medium montażoweSouthernBiotech0100-20
PFAThermo Fisher Scientific28908
przepływowej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bindoff, L. A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N. E., Parker, W. D. Jr, Turnbull, D. M. Mitochondrial function in Parkinson's disease. The Lancet. 2 (8653), 49(1989).
  2. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  3. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).
  4. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  5. Trifunovic, A., Larsson, N. G. Mitochondrial dysfunction as a cause of ageing. Journal of Internal Medicine. 263 (2), 167-178 (2008).
  6. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  7. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  10. Xu, L., et al. Abnormal mitochondria in Down syndrome iPSC-derived GABAergic interneurons and organoids. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1868 (6), 166388(2022).
  11. Liu, C., et al. Mitochondrial HSF1 triggers mitochondrial dysfunction and neurodegeneration in Huntington's disease. EMBO Molecular Medicine. 14 (7), e15851(2022).
  12. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  13. Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives. The Journal of Visualized Experiments. 177, e63116(2021).
  14. Strober, W. Trypan Blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, (2015).
  15. Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. Chapter 1 (Unit 1), 14(2002).
  16. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome Biology. 6 (1), 204(2005).
  17. Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
  18. Xiang, Y., et al. Generation and fusion of human cortical and medial ganglionic eminence brain organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 47 (1), e61(2018).
  19. Pevny, L., Placzek, M. SOX genes and neural progenitor identity. Current Opinion in Neurobiology. 15 (1), 7-13 (2005).
  20. Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cytoskeleton and Cell Motility. 17 (2), 118-132 (1990).
  21. Rosebrock, D., et al. Enhanced cortical neural stem cell identity through short SMAD and WNT inhibition in human cerebral organoids facilitates emergence of outer radial glial cells. Nature Cell Biology. 24 (6), 981-995 (2022).
  22. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  23. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  24. Yan, Y., Zhang, S. C. Generation of cerebral cortical neurons from human pluripotent stem cells in 3D culture. Methods in Molecular Biology. 2683, 1-11 (2023).
  25. Pamies, D., et al. Human IPSC 3D brain model as a tool to study chemical-induced dopaminergic neuronal toxicity. Neurobiology of Disease. 169, 105719(2022).
  26. Pamies, D., Hartung, T., Hogberg, H. T. Biological and medical applications of a brain-on-a-chip. Experimental biology and medicine (Maywood, N.J. : Online). 239 (9), 1096-1107 (2014).
  27. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  28. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBrain OrganoidsMitochondrial ParametersiPSC Derived OrganoidsMitochondrial DysfunctionSingle Cell DissociationMitochondrial MassMRC ComplexesTFAM StainingmtDNA Copy Number
Video Coming Soon

Related Articles