Ten protokół opisuje metody przygotowania obwodowych, dojrzałych i jądrowych komórek włókien kryształka oka do barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania złożonych wnikania komórki w komórkę oraz architekturę błony.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Soczewica jest przezroczystym i elipsoidalnym narządem w komorze przedniej oka, który zmienia kształt, aby precyzyjnie skupiać światło na siatkówce i tworzyć jasny obraz. Większość tego tkanki składa się ze specjalizowanych, zróżnicowanych komórek włóknistych, które mają sześciokątne przekroje i rozciągają się od przednich do tylnych biegunów soczewki. Te długie i cienkie komórki są ściśle ustawione obok komórek sąsiednich i mają skomplikowane wtopy wzdłuż długości komórki. Specjalizowane, wzajemnie się łączące struktury są wymagane dla normalnych właściwości biomechanicznych soczewki i zostały szczegółowo opisane za pomocą technik mikroskopii elektronowej. Ten protokół demonstruje pierwszą metodę zachowania i immunobarwienia pojedynczych, a także pakietów komórek włóknistych soczewki myszy, aby umożliwić szczegółowe lokalizowanie białek wewnątrz tych skomplikowanych kształtów komórek. Przedstawione dane pokazują barwienie komórek włóknistych obwodowych, różnicujących się, dojrzałych i jądrowych na wszystkich obszarach soczewki. Ta metoda może być potencjalnie stosowana na komórkach włókniskowych izolowanych z soczewek innych gatunków.
Wprowadzenie
Sok jest przezroczystym i owalnym tkankiem w przedniej komorze oka, zbudowanym z dwóch rodzajów komórek, nabłonkowych i włóknistych1 (Rysunek 1). Istnieje pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych, która pokrywa przednią półkulę soczewki. Komórki włókniste są zróżnicowane z komórek nabłonkowych i stanowią większość soczewki. Wysoce specjalizujące się komórki włókniste przechodzą programowanie wydłużania, różnicowania i dojrzewania, oznakowane wyraźnymi zmianami w morfologii błony komórkowej od obwodu soczewki do jej centrum2,3,4
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy były traktowane zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi na Uniwersytecie w Bloomington. Myszy użyte do uzyskania reprezentatywnych danych były kontrolnymi (dzikim typem) zwierzętami w tle C57BL6/J, płci żeńskiej i w wieku 8-12 tygodni. W tym eksperymencie można używać zarówno myszy samców, jak i samic, ponieważ płeć myszy jest bardzo mało prawdopodobna, aby wpłynąć na wynik eksperymentu.
1. Sekcja oka i usuwanie torebki
- Wyłącz myszy zgodnie z 'Wytycznymi ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi' Narodowych Instytutów Zdrowia, a tak....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki włókien soczewki są przygotowywane z kory soczewki (różnicujące się włókna i dojrzałe włókna) oraz jądra, a komórki są barwione za pomocą phalloidyny na F-aktynę i WGA na błonę komórkową. Obserwuje się i obrazuje mieszankę pęczków komórek lub pojedynczych włókien soczewkowych (Rysunek 3). Z kory soczewki znajduje się dwa rodzaje komórek (Rysunek 3A). Różnicujące się komórki włókien na obrzeżach soczewki są proste, z bardzo małymi wypustkami wzdłuż ich kr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
To protokół wykazał metody fiksacji, zachowania i immunobarwienia, które wiernie zachowują 3D morfologię błony pęczków lub pojedynczych włókien soczewki z różnych głębokości soczewki. Barwione włókna soczewki są porównywane z preparatami SEM, które od dawna są używane do badania morfologii komórek włókien soczewki. Wyniki pokazują porównywalne struktury błony między obiema preparatami. EM pozostaje standardem złotym w badaniach morfologii komórek, ale immunolabeling jest bardziej wymagający w próbkach SEM w lokalizowaniu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To dzieło zostało wsparte przez grant R01 EY032056 (dla CC) z National Eye Institute. Autorzy dziękują dr Theresie Fassel i Kimberly Vanderpool z Scripps Research Core Microscopy Facility za pomoc w obrazach mikroskopu elektronowego.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X phosphate buffered saline | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Cover slips (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Curved tweezers | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissection microscope | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Fine tip straight tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nail polish | |||
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primary antibody | |||
| Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secondary antibody | |||
| Straight forceps | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultra-fine scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wheat germ agglutinin (fluorescein) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
Bibliografia
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
