Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65638

⸱

9 czerwca 2023

 , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metody przygotowania obwodowych, dojrzałych i jądrowych komórek włókien kryształka oka do barwienia immunofluorescencyjnego w celu zbadania złożonych wnikania komórki w komórkę oraz architekturę błony.

Streszczenie

Soczewica jest przezroczystym i elipsoidalnym narządem w komorze przedniej oka, który zmienia kształt, aby precyzyjnie skupiać światło na siatkówce i tworzyć jasny obraz. Większość tego tkanki składa się ze specjalizowanych, zróżnicowanych komórek włóknistych, które mają sześciokątne przekroje i rozciągają się od przednich do tylnych biegunów soczewki. Te długie i cienkie komórki są ściśle ustawione obok komórek sąsiednich i mają skomplikowane wtopy wzdłuż długości komórki. Specjalizowane, wzajemnie się łączące struktury są wymagane dla normalnych właściwości biomechanicznych soczewki i zostały szczegółowo opisane za pomocą technik mikroskopii elektronowej. Ten protokół demonstruje pierwszą metodę zachowania i immunobarwienia pojedynczych, a także pakietów komórek włóknistych soczewki myszy, aby umożliwić szczegółowe lokalizowanie białek wewnątrz tych skomplikowanych kształtów komórek. Przedstawione dane pokazują barwienie komórek włóknistych obwodowych, różnicujących się, dojrzałych i jądrowych na wszystkich obszarach soczewki. Ta metoda może być potencjalnie stosowana na komórkach włókniskowych izolowanych z soczewek innych gatunków.

Wprowadzenie

Sok jest przezroczystym i owalnym tkankiem w przedniej komorze oka, zbudowanym z dwóch rodzajów komórek, nabłonkowych i włóknistych1 (Rysunek 1). Istnieje pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych, która pokrywa przednią półkulę soczewki. Komórki włókniste są zróżnicowane z komórek nabłonkowych i stanowią większość soczewki. Wysoce specjalizujące się komórki włókniste przechodzą programowanie wydłużania, różnicowania i dojrzewania, oznakowane wyraźnymi zmianami w morfologii błony komórkowej od obwodu soczewki do jej centrum2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, znane również jako jądro soczewki. Funkcja soczewki polegająca na precyzyjnym fokusowaniu światła nadchodzącego z różnych odległości na siatkówkę zależy od jej właściwości biomechanicznych, w tym sztywności i sprężystości13,14,15,16,17,18,19. Złożone przeszycia włókien soczewki zostały wysunięte jako hipoteza20,21 i ostatnio wykazano, że są ważne dla sztywności soczewki22,23.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematy anatomii soczewki i reprezentatywne zdjęcia mikroskopowe skaningowego elektronowego (SEM) z włókien soczewki. Rysunek przedstawia przekrój wzdłużny (od przodu do tyłu od góry do dołu) przedniej warstwy komórek nabłonkowych (zacienione na jasnoniebiesko) i masy komórek włókien soczewki (w kolorze białym). Środek soczewki (zacieniony na różowo) nazywany jest jądrem i składa się z mocno zagęszczonych komórek włóknistych. Po prawej stronie rysunek przekroju pokazuje wydłużony sześciokątny kształt komórek włókien soczewki, upakowane w wzór plastra miodowego. Komórki włókniste mają dwie szerokie strony i cztery krótkie strony. Reprezentatywne zdjęcia SEM umieszczone na dole pokazują złożone przeszycia błon między komórkami włókien soczewki na różnych głębokościach soczewki. Po prawej stronie nowo utworzone włókna soczewki na obwodzie soczewki mają małe wypustki wzdłuż krótkich stron i kulki z gniazdem wzdłuż szerokiej strony (czerwone pudełka). Podczas dojrzewania włókna soczewki tworzą duże domeny w kształcie łopatki, ozdobione małymi wypustkami wzdłuż krótkich stron (niebieskie pudełka). Dojrzałe komórki włókniste posiadają duże domeny w kształcie łopatki zilustrowane przez małe wypustki. Te przeszycia są ważne dla właściwości biomechanicznych soczewki. Komórki włókniste w jądrze soczewki mają mniej małych wypustek wzdłuż krótkich stron i mają złożone przeszycia języczkowo-ryflowane (fioletowe pudełka). Szerokie strony komórek wykazują globularną morfologię błony. Rysunek został zmodyfikowany z22,32 i nie został narysowany w skali. Skala 3 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Sok rośnie poprzez dodawanie warstw nowych komórek włóknistych nakładanych na poprzednie pokolenia włókien24,25. Komórki włókniste mają wydłużony, sześciokątny kształt przekroju z dwiema szerokimi stronami i czterema krótkimi stronami. Te komórki rozciągają się od przedniego do tylnego bieguna soczewki, a w zależności od gatunku, włókna soczewki mogą mieć kilka milimetrów długości. Aby utrzymać strukturę tych wydłużonych i cienkich komórek, specjalistyczne przeszycia wzdłuż szerokich i krótkich stron tworzą przeszycia, aby utrzymać kształt soczewki i jej właściwości biomechaniczne. Zmiany w kształcie błony komórkowej podczas różnicowania i dojrzewania komórek włóknistych zostały szeroko udokumentowane w badaniach mikroskopii elektronowej (EM)2,3,4,5,6,7,8,9,10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były traktowane zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi na Uniwersytecie w Bloomington. Myszy użyte do uzyskania reprezentatywnych danych były kontrolnymi (dzikim typem) zwierzętami w tle C57BL6/J, płci żeńskiej i w wieku 8-12 tygodni. W tym eksperymencie można używać zarówno myszy samców, jak i samic, ponieważ płeć myszy jest bardzo mało prawdopodobna, aby wpłynąć na wynik eksperymentu.

1. Sekcja oka i usuwanie torebki

  1. Wyłącz myszy zgodnie z 'Wytycznymi ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi' Narodowych Instytutów Zdrowia, a także z protokołami dotyczącymi stosowania zwierząt zatwierdzonymi przez instytucję.
    UWAGA: W niniejszym badaniu myszy zostały uśpione przez przedawkowanie CO2, a następnie przeprowadzono dyslokację szyjną zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt (Uniwersytet Indiana).
  2. Usuń oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy, wciskając tkankę wokół oczu jedną stroną kleszczy, aby przemieścić oko z oczodół. Następnie zamknij kleszcze pod okiem i podnieś, aby usunąć oko z oczodół. Przenieś oczy do świeżego 1x roztworu tamponowego fosforanowego (PBS) w tackę do sekcjonowania.
  3. Przeciąć nerw wzrokowy ultradrobnymi nożyczkami jak najbliżej gałki ocznej. Ostrożnie wsuń drobne, proste kleszcze przez nerw wzrokowy do gałki ocznej w jego wylocie w tylnej części oka.
  4. Ostrożnie wsuń nożyczki w tym samym miejscu co kleszcze w kroku 1.3 i zacznij ciąć nacięcie od tyłu ku złączeniu rogówki i twardówki.
    UWAGA: Soczewkowe okulisty zajmują około 30% ich oczu. Przypadkowe uszkodzenie wystąpi, jeśli kleszcze lub nożyczki zostaną włożone zbyt głęboko w oko.
  5. Kontynuuj cięcie wzdłuż złączenia rogówki i twardówki, aż co najmniej połowa złącza zostanie oddzielona.
  6. Użyj kleszczy, aby delikatnie nacisnąć na rogówkę, aby soczewka mogła wyjść przez nacięcie wykonane w krokach 1.4 i 1.5.
  7. Ostrożnie usuń wszelkie duże kawałki tkanki z soczewki za pomocą drobnych, prostych kleszczy. Zbadaj soczewkę, aby znaleźć region równikowy.
  8. Lekko przekłuj soczewkę za pomocą drobnych, prostych kleszczy, a następnie usuń torebkę soczewki. Masa komórek włókien soczewki pozostanie nienaruszona, a warstwa nabłonkowa soczewki pozostanie przymocowany do torebki soczewki. Wyrzuć torebkę soczewki.

2. Barwienie pojedynczych komórek włókien soczewki

  1. Przenieś masę komórek włókien soczewki do płytki dolnej z 500 μL świeżo przygotowanego 1% roztworu paraformaldehydu (PFA; w 1x PBS) i inkubować próbki w 4 °C przez noc z łagodnym nutowaniem (Rysunek 2A).
    UWAGA: Podane objętości roztworów są zoptymalizowane dla płytek 48-dołkowych. Jeśli używane są płytki innego rozmiaru lub probówki, dostosuj objętości roztworów odpowiednio. Roztwory do fiksacji, blokowania i mycia (1x PTX, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) zostały przygotowane z 10x PBS i podwójnie destylowana woda (ddH2O) do końcowej koncentracji 1x PBS.
  2. Przenieś komórki włókien soczewki do 60 mm naczynia z 1% PFA. Użyj ostrego nożyka, aby podzielić kulkę komórek włókien na pół wzdłuż osi przednio-tylnej (Rysunek 2B). Pokrój połowy ponownie na pół wzdłuż tej samej osi, aby uzyskać ćwiartki.
  3. Użyj prostych kleszczy, aby usunąć region jądra z ćwiartkami komórek włókien soczewki (Rysunek 2C).
    UWAGA: Oś przednio-tylna jest łatwo rozpoznawalna przez kierunek komórek włókien w masie tkankowej.
  4. Pofiksuj ćwiartki regionu kory soczewki w 200 μL 1% PFA przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT) z łagodnym wstrząsaniem (300 obr./min na wstrząsaczu płytkowym).
  5. Wypłucz ćwiartki tkanki dwa razy w 750 μL 1x PBS przez 5 min każdy z łagodnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej.
  6. Zablokuj próbki za pomocą 200 μL roztworu blokującego (5% surowicy, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem.
    UWAGA: W reprezentatywnych danych w tym protokole próbki nie były barwione antyczałkami pierwotnymi ani wtórnymi. Po etapie blokowania próbki były inkubowane z lektyną z żyta (WGA; 1:100) i fałdyną (1:100) (patrz Tabela materiałów) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym wstrząsaniem i ochroną przed światłem. Barwienie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki włókien soczewki są przygotowywane z kory soczewki (różnicujące się włókna i dojrzałe włókna) oraz jądra, a komórki są barwione za pomocą phalloidyny na F-aktynę i WGA na błonę komórkową. Obserwuje się i obrazuje mieszankę pęczków komórek lub pojedynczych włókien soczewkowych (Rysunek 3). Z kory soczewki znajduje się dwa rodzaje komórek (Rysunek 3A). Różnicujące się komórki włókien na obrzeżach soczewki są proste, z bardzo małymi wypustkami wzdłuż ich kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

To protokół wykazał metody fiksacji, zachowania i immunobarwienia, które wiernie zachowują 3D morfologię błony pęczków lub pojedynczych włókien soczewki z różnych głębokości soczewki. Barwione włókna soczewki są porównywane z preparatami SEM, które od dawna są używane do badania morfologii komórek włókien soczewki. Wyniki pokazują porównywalne struktury błony między obiema preparatami. EM pozostaje standardem złotym w badaniach morfologii komórek, ale immunolabeling jest bardziej wymagający w próbkach SEM w lokalizowaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To dzieło zostało wsparte przez grant R01 EY032056 (dla CC) z National Eye Institute. Autorzy dziękują dr Theresie Fassel i Kimberly Vanderpool z Scripps Research Core Microscopy Facility za pomoc w obrazach mikroskopu elektronowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60mm plateFisherScientificFB0875713A
16% paraformaldehydElectron Microscopy Sciences15710
10X phosphate buffered salineThermoFisher70011-044
1X phosphate buffered salineThermoFisher14190136
48-well plateCytoOneCC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)FisherScientific12-553-467
Curved tweezersWorld Precision Instruments501981
Dissection microscopeCarl ZeissStereo Discovery V8
Fine tip straight tweezersElectron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherScientific12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 SoftwareCarl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin (rhodamine)ThermoFisherR415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11VWR76241-186
Secondary antibody
Straight forcepsWorld Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)FisherScientific12-565-154
Ultra-fine scissorsWorld Precision Instruments501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)Vector LaboratoriesFL-1021-5

Bibliografia

  1. Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
  2. Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).
  4. Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens. Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).
  5. Lo, W. K., Harding, C. V. Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers. Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).
  6. Taylor, V. L., et al. Morphology of the normal human lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).
  7. Vrensen, G. F. Aging of the human eye lens-a morphological point of view. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).
  8. Vrensen, G. F., Duindam, H. J. Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations. Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).
  9. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation. Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).
  10. Willekens, B., Vrensen, G. The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).
  11. Zhou, C. J., Lo, W. K. Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells. Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).
  12. Kuwabara, T. The maturation of the lens cell: a morphologic study. Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).
  13. Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. Stiffness gradient in the crystalline lens. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).
  14. Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).
  15. Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).
  16. Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).
  17. Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
  18. Glasser, A., Campbell, M. C. Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).
  19. Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).
  20. Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
  21. Lo, W. K., et al. Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).
  22. Cheng, C., et al. Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties. Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).
  23. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  24. Kuszak, J. R. The development of lens sutures. Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).
  25. Bassnett, S., Costello, M. J. The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens. Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).
  26. Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice. Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).
  27. Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).
  28. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).
  29. Cheng, C., et al. EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).
  30. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses. Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).
  31. Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. The Eye (Fourth Edition). Saunders, W. B. , 1(2016).
  32. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).
  33. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labeling for scanning electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  34. Goldberg, M. W. High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex. Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).
  35. Hermann, R., Walther, P., Muller, M. Immunogold labeling in scanning electron microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).
  36. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki w kien soczewkikora soczewkij dro soczewkimikroskopia konfokalnamikroskopia elektronowap czki kom rek w kienlokalizacja bia eksekcja soczewkibarwienie aktyny F
Przygotowanie i barwienie immunofluorescencyjne pęczków i pojedynczych komórek włókien z kory i jądra soczewki oka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.