Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65639

⸱

30 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Colorado Denver | Anschutz Medical Campus, 2Department of Pediatrics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Streszczenie

Fototopalne hydrożele mogą przekształcać się przestrzennie i czasowo w odpowiedzi na ekspozycję na światło. Włączenie tego typu biomateriałów do platform hodowli komórkowych i dynamiczne wywoływanie zmian, takich jak zwiększenie sztywności mikrośrodowiskowej, umożliwia naukowcom modelowanie zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zachodzą podczas progresji choroby zwłóknieniowej. W niniejszym artykule przedstawiono metodę biodruku 3D fotoprzestrajalnego biomateriału hydrożelowego zdolnego do dwóch sekwencyjnych reakcji polimeryzacji w kąpieli żelatynowej w kąpieli nośnej. Technika freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting została zaadaptowana poprzez dostosowanie pH kąpieli podporowej w celu ułatwienia reakcji addycji Michaela. Po pierwsze, biotusz zawierający poli(glikol etylenowy)-alfa-metakrylan (PEGαMA) poddano reakcji poza stechiometrią z degradowalnym przez komórki środkiem sieciującym, tworząc miękkie hydrożele. Te miękkie hydrożele zostały później wystawione na działanie fotoinicjatora i światła w celu wywołania homopolimeryzacji nieprzereagowanych grup i usztywnienia hydrożelu. Protokół ten obejmuje syntezę hydrożelu, biodruk 3D, fotousztywnianie i charakterystykę punktów końcowych w celu oceny aktywacji fibroblastów w strukturach 3D. Przedstawiona tutaj metoda umożliwia naukowcom biodrukowanie 3D różnych materiałów, które przechodzą reakcje polimeryzacji katalizowane przez pH i mogą być wdrażane do inżynierii różnych modeli homeostazy, choroby i naprawy tkanek.

Wprowadzenie

3D bioprinting to przełomowa technologia, która umożliwia naukowcom precyzyjne umieszczanie komórek i biomateriałów w objętościach 3D i odtwarzanie złożonej hierarchicznej struktury tkanek biologicznych. W ciągu ostatniej dekady postępy w biodruku 3D doprowadziły do powstania bijących tkanek ludzkiego serca1, funkcjonalnych modeli tkanek nerkowych2, modeli wymiany gazowej w płucach3, oraz modeli nowotworów do badań nad rakiem4. Wynalezienie wbudowanych technik biodruku 3D, takich jak Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), umożliwiło odtworzenie złożonych struktur tkanek miękkich, takich jak płucne naczynia krwionośne5, a nawet ludzkie serce6 w 3D. FRESH 3D bioprinting ułatwia drukowanie warstwa po warstwie miękkich i niskolepkich biotuszów poprzez wytłaczanie do kąpieli podporowej rozrzedzonej ścinaniem. Kąpiel podporowa składa się z materiału, takiego jak gęsto upakowane mikrocząsteczki żelatyny, które działają jak tworzywo sztuczne Bingham i zachowują zamierzony kształt i strukturę biotuszu po wydrukowaniu. Gdy wydrukowany konstrukt zastygnie, kąpiel podporowa może zostać rozpuszczona, zwiększając temperaturę do 37 °C7.

Niedawny artykuł przeglądowy podsumował materiały, które zostały wydrukowane biologicznie w 3D w różnych publikacjach przy użyciu techniki FRESH. Te materiały pochodzenia naturalnego obejmują zarówno kolagen typu I, jak i metakrylowany kwas hialuronowy i reprezentują kilka różnych mechanizmów żelowania7. Większość badań naukowych przeprowadzonych przy użyciu tej techniki biodruku 3D wykorzystuje statyczne biomateriały, które nie zmieniają się w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne. Dynamiczne fotoprzestrajalne biomateriały hydrożelowe zostały wykorzystane przez nasze laboratorium i inne 8,9,10,11,12 do modelowania różnych chorób zwłóknieniowych. W przeciwieństwie do biomateriałów statycznych, biotusze fototostrajalne pozwalają na stworzenie zmiękczonego modelu o niższej wartości modułu sprężystości, a następnie usztywnienie go w celu zbadania odpowiedzi komórkowych na wzrost usztywnienia mikrośrodowiskowego.

Choroby zwłóknieniowe charakteryzują się wzrostem produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej, co może powodować bliznowacenie i usztywnienie13. Usztywnienie tkanek może zainicjować dalsze urazy i zniszczenie dotkniętej tkanki, powodując trwałe uszkodzenie narządów, a nawet śmierć; Zaburzenia zwłóknieniowe są odpowiedzialne za jedną trzecią śmiertelności na całym świecie. Fibroblasty wytwarzają nadmiar i nieprawidłową macierz zewnątrzkomórkową w tym stanie chorobowym14,15. Zwiększona proliferacja fibroblastów i odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej dodatkowo usztywniają tkankę i aktywują profibrotyczną pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego16,17,18,19. Badanie aktywacji fibroblastów ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia chorób zwłóknieniowych. Tutaj przedstawiamy ludzkie tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) jako przykład jednego zaburzenia zwłóknieniowego, w którym ważne jest naśladowanie geometrii 3D naczynia krwionośnego za pomocą biodruku 3D i wprowadzenie dynamicznych zdolności usztywniających fototowalnych hydrożeli. TNP to stan, w którym ciśnienie w głównych tętnicach płucnych przekracza normalny poziom i obciąża serce, zwiększając aktywację ludzkiego fibroblastu przybyszowego tętnicy płucnej (HPAAF) i usztywniając tkanki naczyń krwionośnych 16,17,18,19. Fototowalny preparat biotuszu z poli(glikolu etylenowego)-alfa metakrylanu (PEGαMA) pozwala na usztywnienie czasowe w konstruktach i pomaga modelować zarówno zdrowe tkanki, jak i postęp choroby5,8,9,10. Wykorzystanie tej unikalnej cechy umożliwia ilościowe określenie aktywacji i proliferacji HPAAF w odpowiedzi na usztywnienie mikrośrodowiskowe w 3D i może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów komórkowych związanych z tą chorobą. Opisany tutaj protokół pozwoli naukowcom na tworzenie modeli 3D, które podsumowują zmiany w mikrośrodowisku zewnątrzkomórkowym podczas progresji choroby lub naprawy tkanek oraz badają aktywację fibroblastów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Synteza i charakterystyka PEGαMA

UWAGA: Synteza poli(glikolu etylenowego)-metakrylanu alfa (PEGαMA) została opracowana na podstawie metody Hewawasam et al. i przeprowadzona w warunkach bezwodnych9.

  1. Odważ substraty.
    UWAGA: Na przykład odważ 5 g 10 kg/mol 8-ramiennego PEG-hydroksylowego (PEG-OH) oraz 0,38 g wodorku sodu (NaH) (patrz Tabela materiałów).
  2. Włóż mieszadło magnetyczne do kolby Schlenka o pojemności 250 mL i przepłucz argonem.
  3. Rozpuść PEG-OH w najmniejszej objętości bezwodnego tetrahydrofuranu (THF) niezbędnej do rozpuszczenia w kolbie Schlenka.
    UWAGA: Około 80 mL THF rozpuści 5 g PEG-OH. Dodaj minimalną ilość THF wymaganą do rozpuszczenia PEG-OH.
  4. Dodaj do mieszaniny reakcyjnej trzykrotną nadwyżkę molową NaH i mieszaj w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min.
  5. Dodaj kroplami do kolby Schlenka sześciokrotną nadwyżkę molową akrylanu 2-(bromometylowego) (EBrMA, patrz Tabela materiałów) i osłoń naczynie reakcyjne folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Mieszaj w temperaturze pokojowej przez około 48 h.
    UWAGA: Dla 5 g PEG-OH i 0,38 g NaH w tej reakcji należy użyć 3,68 mL EBrMA.
  6. Dodaj kilka kropel 1 N kwasu octowego, aby przerwać reakcję. Przefiltruj roztwór pod próżnią za pomocą pomocnika do filtracji.
    UWAGA: Dodanie kwasu octowego spowoduje powstawanie pęcherzyków gazu. Przestań dodawać krople kwasu octowego, gdy pęcherzyki przestaną się tworzyć, co wskazuje na pomyślne przerwanie reakcji.
  7. Zagęść filtrat na ewaporatorze obrotowym i wytrąć w eterze dietylowym w temperaturze 4 °C. Pozostaw osad w temperaturze 4 °C, chroniąc go przed światłem, przez 12-18 h.
  8. Umieść papier filtracyjny Whatman w lejku Büchnera. Powoli wlej mieszaninę reakcyjną na papier filtracyjny i użyj ssania próżniowego, aby oddzielić osad od eteru dietylowego. Zbierz osad do suchej i czystej kolby filtracyjnej.
  9. Susz produkt pod próżnią przez co najmniej 5 h lub przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie rozpuść w minimalnej objętości niezbędnej wody dejonizowanej. Przenieś rozpuszczony produkt do rurki do dializy (patrz Tabela materiałów) i prowadź dializę przeciwko 3,5 L wody dejonizowanej przez co najmniej cztery dni. Wymieniaj wodę do dializy co 12 h.
    UWAGA: Po suszeniu pod próżnią produkt powinien mieć postać całkowicie suchego, czystego, białego proszku.
  10. Zamroź gwałtownie produkt i liofilizuj przez około 72 h lub do całkowitego wyschnięcia.
  11. Rozpuść produkt w chloroformie D (CDCl3). Przeprowadź analizę próbki za pomocą 1H NMR zgodnie z protokołem obejmującym 248 skanów z czasem relaksacji 2,5 s.
  12. Zweryfikuj funkcjonalizację i czystość produktu, kalibrując pik rozpuszczalnika CDCl3 do 7,26 PPM. Zintegruj pik protonów szkieletu PEG (d3,71) i skalibruj całkę do wartości 114.
  13. Zintegruj pozostałe piki: PEGαMA 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,36 (t, 3H, CH3-), 3,71 (s, 114H, PEG CH2-CH2), 4,29 (t, s, 4H, -CH2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH2), 6,34 (q, 1H, -C=CH2) i porównaj całkę pików grupy końcowej alkenowej αMA z wartością oczekiwaną (1H) na podstawie kalibracji szkieletu PEG (Rysunek 1).
    UWAGA: Oblicz średnią z dwóch pików oznaczonych jako „a” (Rysunek 1) i pomnóż przez 100, aby uzyskać średni procent funkcjonalizacji PEGαMA.

Wykres spektroskopii NMR; struktura polimeru, przesunięcia chemiczne; analiza protonowa; schemat edukacyjny.
Rycina 1: Spektroskopia protonowego NMR potwierdziła pomyślną funkcjonalizację PEGαMA. Analiza NMR została przeprowadzona w chloroformie-D (CDCl3) i wykazała stopień funkcjonalizacji wynoszący 96,5%. PEGαMA 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d (ppm) 1,36 (t, 3H, CH3-), 3,71 (s, 114H, PEG CH2-CH2), 4,29 (t, s, 4H, -CH2-C(O)-O-O, -O-CH2-C(=CH2)-), 5,93 (q, 1H, -C=CH2), 6,34 (q, 1H, -C=CH2). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Projekt modelu i konfiguracja biodrukarki 3D

UWAGA: Komercyjnie dostępna drukarka 3D (patrz Tabela materiałów) została zmodyfikowana poprzez zastąpienie ekstrudera termoplastycznego zbudowaną na zamówienie pompą strzykawkową, na podstawie metody Hinton i wsp.20. Projekty open-source są dostępne online: https://3d.nih.gov/users/awfeinberg.

  1. Uruchom oprogramowanie Fusion 360 (patrz Tabela materiałów) i zaprojektuj w systemie 3D wspomaganym komputerowo pusty cylinder.
    UWAGA: Plik do pobrania, który można wykorzystać w tym kroku i który odwzorowuje geometrię naczynia krwionośnego, znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
  2. Zapisz plik i otwórz go w oprogramowaniu Slic3r (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że wszystkie parametry są prawidłowe, a następnie kliknij przycisk eksportu G-code. Zapisz plik G-code na komputerze.
  3. Uruchom oprogramowanie Pronterface (patrz Tabela materiałów) i prześlij plik G-code.
    UWAGA: Oprogramowanie Pronterface komunikuje się z biodrukarką i zapewnia odpowiednią kontrolę nad sprzętem. Gotowy plik G-code znajduje się w Pliku uzupełniającym 2.
  4. Przenieś biodrukarkę oraz wszystkie powiązane części do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC), stosując techniki aseptyczne.
  5. Zamocuj tępy czubek igły 30 G o długości 0,5" (patrz Tabela materiałów) do szklanej strzykawki drukującej i odstaw na bok.
  6. Podłącz kabel zasilający biodrukarki do gniazda elektrycznego. Naciśnij czerwony przycisk zasilania z przodu biodrukarki, aby ją włączyć. Połącz komputer z biodrukarką za pomocą kabla USB i upewnij się, że wszystkie połączenia przewodowe zostały nawiązane i prawidłowo wpięte.

3. Przygotowanie kąpieli wspierającej i odczynników

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując techniki aseptyczne.

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej składającą się z SmBM Basal Medium (CC-3181) oraz suplementów SmGM-2 SingleQuots (CC-4149), z wyłączeniem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w 4 °C do momentu użycia.
  2. Odmierz 50 ml pożywki do hodowli komórkowych i dodaj 1% obj. FBS (CC-4149) (patrz Tabela materiałów) w celu przygotowania medium z niską zawartością surowicy. Przechowywać w 4 °C do momentu użycia.
  3. Resuspender proszek zawiesiny żelatynowej zgodnie z instrukcją producenta, używając sterylnej pożywki do hodowli komórkowej bez FBS jako rozpuszczalnika (patrz Tabela materiałów). Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować końcowe pH zawiesiny żelatyny do wartości 9, wykorzystując 2 M wodorotlenek potasu (KOH) i/lub 2 M kwas solny (HCl), korygując pH roztworu w zależności od potrzeb przy użyciu pH-metru.
  4. Napełnij pożądaną liczbę dołków płytki 24-dołkowej, wypełniając każdy z nich mniej więcej do połowy, za pomocą strzykawki bez igły, dozując 1 ml zawiesiny żelatynowej na dołek.
    UWAGA: Należy równomiernie wypełnić środek studzienek i upewnić się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Płytkę należy opukać, aby pomóc w równomiernym rozłożeniu zawiesiny z mikrocząsteczkami. Wysokość i objętość zawiesiny w każdej studni należy dostosować w zależności od rozmiaru i kształtu każdego biodruku. Użytkownicy mogą stworzyć prowizoryczną strzykawkę do przenoszenia zawiesiny żelatynowej do poszczególnych studzienek. Można to zrobić, wkładając tłok od odpowiednio dobranej strzykawki do probówki o pojemności 50 ml, w której na dnie znajduje się już zagęszczona zawiesina żelatynowa. Podczas wkładania tłoka należy wsunąć wzdłuż probówki cienki drut prowadzący, aby umożliwić ucieczkę powietrza, a następnie wyjąć go w momencie, gdy tłok zetknie się z zawiesiną żelatynową. Bezpośrednio przed użyciem należy odciąć końcówkę probówki żyletką, aby stworzyć otwór, przez który zostanie wyciśnięta zawiesina żelatynowa, a następnie nacisnąć tłok. 
  5. Umieść wypełnioną płytkę 24-dołkową na środku stołu biodrukarki i przymocuj ją do stołu.
    UWAGA: Rycina 2 przedstawia ogólną konfigurację biodrukarki. Na wokół platformy drukującej należy założyć gumkę recepturkę, aby przymocować płytkę 24-dołkową do platformy i zapobiec jej przemieszczaniu się.

Układ do biodruku 3D ze strzykawką, bioatramentem i głowicą ekstruzyjną na stole; proces inżynierii tkankowej.
Rycina 2: Podstawowy układ do biodruku 3D. Biodrukarkę ustawiono w środowisku sterylnym, takim jak komora z laminarnym przepływem powietrza, a głowicę drukującą zmontowano w taki sposób, aby szklana strzykawka i igła były obniżane pionowo do obszaru druku w kąpieli wspierającej znajdującej się poniżej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Hodowla komórkowa

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując techniki aseptyczne.

  1. Rozmrozić komórki HPAAF (pozyskane komercyjnie, patrz Tabela Materiałów) i prowadzić ich ekspansję w plastikowych kolbach T-75 traktowanych do hodowli tkanek, zawierających SmBM Basal Medium (CC-3181) oraz wszystkie suplementy SmGM-2 SingleQuots (CC-4149) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Należy stosować standardowe protokoły hodowli komórek dla komórek adherentnych, utrzymując komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 oraz wymieniając pożywkę co kilka dni.
  2. Po osiągnięciu przez HPAAF konfluencji na poziomie ~80-90%, odessać pożywkę i jednokrotnie wypłukać komórki solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS).
  3. Do każdej kolby T-75 dodać około 4 mL uprzednio ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA. Przechylić kolbę, aby upewnić się, że cała powierzchnia hodowli komórkowej jest pokryta 0,05% roztworem trypsyny-EDTA. Inkubować kolby przez 3-5 min w temperaturze 37 °C i sprawdzić, czy komórki się oddzieliły.
  4. Gdy komórki zaczną unosić się w roztworze, dodać do każdej kolby co najmniej 6 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) i przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
  5. Wirować zawiesinę komórkową przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Odessać nadosad z osadu komórkowego i resuspendować komórki w 1-3 mL pożywki z FBS za pomocą pipety 1000 µL, zapewniając uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek.
  6. Przenieść 10 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrowirowania. Dodać 10 µL roztworu błękitu trypanowego i dobrze wymieszać. Odmierzyć 10 µL tej mieszaniny, aby policzyć komórki w komorze hemocytometru za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego.
    UWAGA: Aby uzyskać końcowe stężenie bioatramentu wynoszące 4 x 106 komórek/mL, dla każdych 200 µL bioatramentu odliczono 800 000 fibroblastów.

5. Przygotowanie bioatramentu hydrożelowego

UWAGA: Przygotowanie bioatramentu zostało dostosowane na podstawie pracy Davis-Hall i wsp.5. Kroki 5.1-5.2 można wykonać równolegle z krokami 4.1-4.3, aby zminimalizować czas między pobraniem komórek a ich resuspensją w bioatramencie. Wszystkie czynności należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę aseptyczną.

  1. Przygotować roztwór 20 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP, patrz Tabela materiałów) o pH 7 i przefiltrować sterylnie, używając filtra strzykawkowego 0,2 µm. Bezpośrednio przed użyciem dodać 2 M KOH i/lub 2 M HCl, aby w razie potrzeby dostosować pH roztworu. Zmierzyć wartość za pomocą pH-metru i skorygować odpowiednio.
    UWAGA: TCEP redukuje mostki disiarczkowe.
  2. Przygotować roztwór zapasowy PEGαMA o stężeniu 0,25 mg/mL resuspendowany w sterylnej pożywce do hodowli komórkowej bez FBS, roztwory zapasowe 250 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT), sieciowania degradowalnego przez MMP2 oraz peptydu CGRGDS (RGD) (patrz Tabela materiałów), resuspendując wszystko w sterylnym 20 mM TCEP, a także 15% wagowy roztwór zapasowy poly(tlenku etylenu) (PEO) w wodzie destylowanej (DI), używając w razie potrzeby pipet.
  3. Kierując się Tabelą 1, połączyć odpowiednie ilości PEGαMA, DTT, sieciowania degradowalnego przez MMP2, PEO, CGRGDS oraz pożywki do hodowli komórkowej o niskiej zawartości surowicy wraz z fibroblastami w probówce stożkowej o pojemności 50 mL.
    UWAGA: Zaleca się sprawdzenie pH paskami do pomiaru pH po dodaniu wszystkich składników z wyjątkiem pożywki do hodowli komórkowej, ponieważ ta kombinacja powinna skutkować pH bardzo bliskim 6,2. Jeśli wymagane są dalsze korekty pH, należy monitorować, jaka dodatkowa objętość jest potrzebna do dostosowania pH roztworu prekursora. Doprowadzić całkowitą objętość do 200 µL, dodając pozostałą objętość pożywki do hodowli komórkowej pomniejszoną o objętość dodaną podczas końcowej korekty pH.
  4. Wymieszać bioatrament, używając pipety wypierającej, aby upewnić się, że komórki są pojedyncze, i potwierdzić, że końcowy roztwór prekursora ma pH 6,2, aby zapobiec polimeryzacji katalizowanej zasadami podczas biodruku 3D.
  5. Napełnić szklaną strzykawkę bioatramentem, wyjmując tłok i używając oddzielnej strzykawki z tępą igłą 15 gauge o długości 1,5" (patrz Tabela materiałów), aby przenieść bioatrament z probówki wirówkowej do strzykawki, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza w roztworze.
  6. Umieścić szklaną strzykawkę w głowicy drukującej i zamocować komponenty głowicy tak, aby wszystko było stabilnie złożone i gotowe do drukowania.
    UWAGA: Na tym etapie do szklanej strzykawki w głowicy drukującej powinna być przymocowana tępa igła 30 gauge o długości 0,5" do drukowania.

   

KomponentStężenie roztworu stokowegoIlość do dodania
PEGαMA0,25 mg/ml140 µL
DTT250 mM12.24 µL
Sieciujący czynnik degradowalny przez MMP2250 mM5.25 µL
RGD250 mM1.6 µL
PEO15% wag.33.33 µL
Pożywki aktywacyjne i/lub odczynniki do regulacji pH-7.58 µL
Fibroblasty-800 000 komórek

Tabela 1: Przykładowe objętości wymagane do przygotowania 200 µL bioatramentu (roztworu prekursora hydrożelu i komórek fibroblastów).

6. Biodruk 3D

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego, stosując techniki aseptyczne.

  1. Za pomocą strzałek kierunkowych w oprogramowaniu Pronterface ręcznie ustaw pozycję igły ekstruzyjnej w centrum studni i wewnątrz zawiesiny kąpieli wspierającej. Pozostaw co najmniej 1 mm zawiesiny kąpieli wspierającej poniżej końcówki igły.
    UWAGA: Oprogramowanie nie posiada funkcji określania położenia igły w przestrzeni. Przesunięcie igły zależy wyłącznie od użytkownika, który musi to zrobić, ręcznie klikając strzałki w programie (np.., kliknięcie strzałki w górę przesunie igłę w górę lub z dala od platformy drukującej, itp.). Ostrożnie przesuń igłę, aby upewnić się, że nie uderzy ona w ścianki dołka.
  2. Gdy końcówka igły znajdzie się w centrum zawiesiny wewnątrz studzienki, należy nacisnąć przycisk start w programie Pronterface i poczekać na zakończenie druku w celu uzyskania konstruktów, zgodnie z demonstracją w Rysunek 3A.
    UWAGA: Aby wydrukować biologicznie jeden konstrukt przy użyciu dostarczonego pliku (Plik uzupełniający 1), zajmie to około 3 min. Orientacja i przemieszczanie igły oraz pełny wydruk jednego konstruktu od początku do końca zajmują około 5 min.
  3. Powtarzać kroki 6.1-6.2 do momentu uzyskania pożądanej liczby biodrukowanych konstruktów.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie większej liczby konstruktów niż wymagana, aby uwzględnić ewentualne nieudane wydruki. W przypadku wystąpienia błędu należy przejść do kolejnego dołka, zresetować wszystkie ustawienia i ponownie powtórzyć kroki 6.1–6.2. 
  4. Pozostaw płytkę wielodołkową w temperaturze pokojowej i przykryj ją wewnątrz BSC na 1 h po zakończeniu drukowania, aby umożliwić polimeryzację hydrożelu fotoregulowanego katalizowaną zasadami.
  5. Umieść płytkę wielodołkową zawierającą biodrukowane w 3D konstrukty w 37 °C do sterylnego inkubatora i pozostawić je na 12–18 h w celu rozpuszczenia materiału wspierającego.

Konstrukcje z hydrożelu 3D; fotopolimeryzacja; markery komórkowe; układ eksperymentalny; analiza mikroskopowa.
Rycina 3: Schemat eksperymentalny. Protokół ten opisano w trzech głównych etapach: (A) biodruk 3D pustych w środku rurek z PEGαMA z zatopionymi komórkami w celu naśladowania naczyń krwionośnych płuc. (B) Fotoinicjacja reakcji homopolimeryzacji w celu usztywnienia mikrośrodowiska komórkowego. (C) Ocena markerów komórkowych proliferacji i aktywacji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

7. Hodowla biodrukowanego konstruktu 3D i fotoutwardzanie

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując techniki aseptyczne.

  1. Przygotować roztwór zapasu 2,2 mM fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) (patrz Tabela materiałów) w PBS i przefiltrować sterylnie za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm. Roztwór LAP należy przechowywać w warunkach chroniących przed światłem.
  2. Po 12–18 h zmienić pożywkę otaczającą biodrukowane konstrukty. Ręcznie usunąć pożywkę oraz roztopioną kąpiel wspierającą z żelatyny z dołków, uważając, aby nie naruszyć biodrukowanych konstruktów.
    UWAGA: Pomocne jest powolne usuwanie pożywki podczas trzymania płytki pod kątem 45°, tak aby konstrukty wyłoniły się w obrębie dołka i były widoczne. W przypadku udanego druku w każdym dołku powinien być widoczny przezroczysty cylinder hydrożelu (Rycina 4A).
  3. Do każdego dołka dodać odpowiednią objętość pożywki z niską zawartością surowicy.
    UWAGA: W przypadku płytki 24-dołkowej 700 µL pożywki na dołek powinno całkowicie pokryć biodrukowane konstrukty. Dostosować objętość w razie potrzeby.
  4. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora i wymieniać pożywkę w próbkach co 3 dni lub zgodnie z planem eksperymentalnym.
  5. Na dwadzieścia cztery godziny przed planowanym momentem utwardzania usunąć pożywkę z próbek i zastąpić ją pożywką z niską zawartością surowicy, uzupełnioną o 2,2 mM sterylnego LAP.
    UWAGA: Aby znakować strukturę fluorescencyjnie, inkubować biodrukowane konstrukty 3D przez noc w PBS uzupełnionym o 10 µM metakryloyloxyethyl tiokarbamoil rhodaminy B (patrz Tabela materiałów), a następnie utwardzić zgodnie z opisem w kroku 7.6 w celu uzyskania oznakowania fluorescencyjnego struktury. Przenieść do PBS na 2 dni w temperaturze 4 °C, aby usunąć nadmiar rhodaminy, i obrazować przy użyciu filtra TRITC (Rycina 4B,C).
  6. W wybranym momencie utwardzania usunąć połowę pożywki z dołków przeznaczonych do utwardzenia i umieścić płytkę bez pokrywki pod światłem UV. Włączyć światło UV i utwardzić konstrukty, naświetlając je światłem 365 nm o natężeniu 10 mW/cm2 przez 5 min przy użyciu urządzenia Omnicure (patrz Tabela materiałów) oraz filtra pasmowo-przepuszczalnego 365 nm (Rycina 3B).
    UWAGA: Przed naświetleniem komórek światłem UV użyć radiometru/fotometru, aby potwierdzić poprawność natężenia światła.
  7. Usunąć pozostałą pożywkę z tych dołków i dodać do każdego z nich świeżą pożywkę z niską zawartością surowicy. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.
  8. Wyjąć płytkę z inkubatora i przeprowadzić badanie aktywacji fibroblastów w wybranym punkcie czasowym zgodnie z krokiem 9.

Analiza żywotności komórek, test żywe/martwe; obrazy przedstawiają mikroskopię, wykres żywych komórek w ciągu 21 dni.
Rysunek 4: Biodrukowane w 3D struktury hydrożelowe zapewniały żywotność komórek w czasie. (A) Fotografia biodrukowanej w 3D struktury hydrożelowej w płytce 24-dołkowej. (B) Maksymalna projekcja intensywności fluorescencyjnie znakowanego hydrożelu PEGαMA biodrukowanego w 3D. Pasek skali = 1 mm. Mikroskopia przy większym powiększeniu wykazała pory w strukturze hydrożelu wywołane przez mikrocząsteczki żelatyny w kąpieli wspierającej FRESH. (C) Biodrukowana w 3D rurka z PEGαMA z fluorescencyjnie znakowanymi usztywnionymi obszarami obrazowana za pomocą mikroskopu konfokalnego (stos z-stack 100 µm wyświetlony jako maksymalna projekcja intensywności) wykazała przestrzenną kontrolę nad usztywnianiem w 3D. Pasek skali = 500 µm. (D) Żywotność HPAAF w biodrukowanych w 3D konstruktach mierzona testami Live/Dead. Konstrukty o grubości 300 µm i zagęszczeniu 4 × 106 komórek/mL wykazały lepsze wyniki niż wszystkie pozostałe warunki w każdym punkcie czasowym. Żywotność osiągnęła szczyt w 7. dniu. Ten warunek i punkt czasowy wybrano do dalszych eksperymentów. Kolumny przedstawiają średnią ± SEM, n = 3. *, p < 0,05, ANOVA, test Tukeya HSD. (E) Reprezentatywne obrazy konfokalne komórek w konstruktach 3D barwionych odczynnikiem live/dead w 7. dniu, punkcie czasowym o najwyższej ogólnej żywotności. Calcein AM znakował żywe komórki na zielono, a jodek propidynyu martwe komórki na czerwono. Kolumna najbardziej po prawej stronie pokazuje, że warunek o najlepszych wynikach charakteryzował się jednorodnym rozkładem komórek i wysokim odsetkiem żywych komórek. Pasek skali = 500 µm. Reprodukowano za zgodą Davis-Hall et al.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Ocena żywotności fibroblastów

  1. W wybranych punktach czasowych oceny żywotności przeprowadzić barwienie przy użyciu kalceiny AM i jodku propidyny (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Podsumowując, z każdej studni należy usunąć pożywkę, a konstrukty przepłukać sterylnym PBS. Konstrukty należy inkubować w roztworze do barwienia żywotności przez 40 min w temperaturze 37°C na wytrząsarce. Roztwór barwiący powinien zawierać kalceinę AM (rozcieńczenie 1:1000) i jodek propidyny (rozcieńczenie 1:1000), aby umożliwić identyfikację komórek żywych i martwych podczas obrazowania.
  2. Przenieść konstrukty do sterylnego PBS i niezwłocznie przeprowadzić obrazowanie za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Dla każdej próbki w każdym punkcie czasowym należy wykonać trzy różne serie obrazów z-stack o grubości 100 µm, a żywotność wyrazić jako średni procent komórek żywych (Rysunek 4D,E).

9. Ocena aktywacji fibroblastów

  1. Przygotować 3% (m/V) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0,1% (V/V) Tween 20 w PBS. Roztwór ten będzie określany jako roztwór do immunofluorescencji (IF).
  2. W wybranych punktach czasowych usunąć medium z dołków z próbkami i opłukać konstrukty roztworem PBS. PBS zastąpić 4% paraformaldehydem (PFA) i przechowywać te próbki w 37 °C przez 30 min na wytrząsarce. Następnie zastąpić 4% PFA roztworem 100 mM glicyny w PBS i pozostawić te próbki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (RT) przez kolejne 15 min.
  3. Następnie przenieście te próbki do form do mrożenia Tissue-Tek Cryomolds i całkowicie przykryjcie próbkę roztworem OCT (optimal cutting temperature) (patrz Tabela materiałów), a następnie pozostawić OCT do dyfuzji w próbkach przez 12–18 h w 4 °C.
  4. Próbki nasączone OCT należy zamrozić szokowo w 2-metylobutanie przy użyciu ciekłego azotu. Styropianowe pudełko lub inny odpowiedni pojemnik należy wypełnić ciekłym azotem, a następnie umieścić w nim drugi pojemnik z 2-metylobutanem w taki sposób, aby był on zanurzony co najmniej do połowy. Za pomocą pęsety należy trzymać każdą formę kriogeniczną zawierającą próbkę pokrytą OCT w chłodzonym ciekłym azotem 2-metylobutanie aż do momentu widocznego zamrożenia. Próbki te można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania ich do kriotomii.
    OSTRZEŻENIE: Środki ochrony indywidualnej (ŚOI), takie jak rękawice chroniące przed zimnem, fartuch chroniący przed zimnem oraz osłona twarzy, zawarte w zestawie bezpieczeństwa kriogenicznego (patrz Tabela materiałów) należy stosować podczas pracy z ciekłym azotem.
  5. Wykonaj kriosekcje zamrożonych próbek w OCT w temperaturze -22 °C i przymocować 10 µm grube plastry na pozytywnie naładowane szkiełka mikroskopowe. Przygotować trzy szkiełka mikroskopowe z co najmniej 3–5 krioprzekrojami na każdym szkiełku dla każdej próbki hydrożelu 3D.
    UWAGA: Na tym etapie można przechowywać preparaty na szkiełkach w temperaturze -80 °C jeśli zajdzie potrzeba przerwania procesu.
  6. Utrwalaj skrawki mrożone w lodowatym acetonie przez 15 min, aby poprawić ich przyleganie do szkiełek. Delikatnie opłucz skrawki wodą w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałości OCT. Pozostaw próbki do wyschnięcia, a następnie obrysuj skrawki markerem hydrofobowym (patrz Tabela materiałów).
  7. Przepermsbilizować próbki w temperaturze pokojowej, używając 0,2% v/v Triton X-100 w PBS przez 10 min, a następnie zablokować przekroje, stosując 5% BSA w/v w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  8. Dodaj pierwotne przeciwciało mysie anty-ludzka alfa-aktyna mięśni gładkich (αSMA) (rozcieńczenie 1:250) (patrz Tabela materiałów) do roztworu IF. Próbki w formie przekrojów z naniesionym przeciwciałem pierwszorzędowym należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °CPrzelej próbki trzykrotnie roztworem do immunofluorescencji (IF).
  9. Inkubować przekroje w roztworze do immunofluorescencji zawierającym przeciwciało wtórne kozie anty-mysie Alexa Fluor 555 (rozcieńczenie 1:250) oraz dwie krople ActinGreen 488 ReadyProbe (patrz Tabela materiałów) na mililitr roztworu do IF. Przykryć próbki folią aluminiową w celu ochrony przed światłem we wszystkich kolejnych etapach i inkubować próbki z roztworem przeciwciał wtórnych przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  10. Przepłucz przekroje 3 razy roztworem do immunofluorescencji (IF). Inkubuj je w 300 nM 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI) w wodzie dejonizowanej przez 15 min w temperaturze pokojowej. Przepłucz przekroje końcowo 3 razy wodą dejonizowaną.
  11. Zastosowanie 10 µL dostępnego w handlu odczynnika zapobiegającego zanikaniu sygnału (patrz Tabela materiałów), przykryć przekroje szkiełkami przykrywkowymi, stosując standardowe metody.
    UWAGA: Przygotowane preparaty mogą być przechowywane w ciemności w temperaturze -80 °C w zamrażarce do czasu obrazowania.
  12. Wykonaj obrazowanie skrawków mrożonych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego (Rysunek 3C i Rycina 5BWykonaj zdjęcia trzech losowych przekrojów na każdym preparacie, korzystając z obiektywu 10x.
    UWAGA: Obrazy powinny zostać wykonane w kanałach DAPI, FITC i TRITC.
  13. Wgrać obrazy do programu ImageJ (NIH). Ilościowo określić procent komórek wykazujących pozytywną ekspresję αSMA jako miarę aktywacji fibroblastów (Rycina 5A) poprzez podzielenie całkowitej liczby komórek wykazujących ekspresję αSMA przez całkowitą liczbę jąder komórkowych w każdym polu widzenia.

Aktywacja i proliferacja fibroblastów; wykresy słupkowe, mikroskopia fluorescencyjna, analiza wpływu sztywności.
Rysunek 5: Aktywacja fibroblastów w biodrukowanych modelach 3D błony zewnętrznej tętnicy płucnej. (A) Aktywacja włóknista w miękkich i utwardzonych hydrożelach 3D mierzona ekspresją αSMA. HPAAFs w utwardzonych konstruktach wykazywały znacznie silniejszą pozytywność na αSMA niż komórki w konstruktach miękkich. Słupki reprezentują średnią ± SEM, n = 3. *, p < 0.05, test U Manna-Whitneya. (B) Reprezentatywne obrazy konfokalne immunobarwienia na αSMA, aktynę i DAPI w miękkich i utwardzonych hydrożelach 3D. HPAAFs w utwardzonych konstruktach wykazywały bardziej rozpowszechnioną immunofluorescencję αSMA niż komórki w konstruktach miękkich. Pasek skali = 250 µm. (C) Proliferacja fibroblastów w miękkich i utwardzonych biodrukowanych konstruktach 3D mierzona pozytywnością na EdU. HPAAFs w utwardzonych konstruktach wykazywały znacznie silniejszą pozytywność na EdU niż komórki w konstruktach miękkich. Słupki reprezentują średnią ± SEM, n = 3. *, p < 0.05, test U Manna-Whitneya. (D) Reprezentatywne obrazy konfokalne immunobarwienia na EdU i barwnik Hoechst w miękkich i utwardzonych hydrożelach 3D. HPAAFs w utwardzonych konstruktach wykazywały bardziej rozpowszechnioną immunofluorescencję EdU niż komórki w konstruktach miękkich. Pasek skali = 300 µm. Reprodukowano za zgodą Davis-Hall et al.5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Ocena proliferacji fibroblastów

  1. Na dwadzieścia cztery godziny przed wybranym punktem czasowym analizy proliferacji, usunąć pożywkę z hodowli komórkowych z każdej studni i zastąpić ją pożywką z niską zawartością surowicy, uzupełnioną o 10 µM roztworu EdU z dostępnego komercyjnie zestawu do badania proliferacji komórek (patrz Tabela materiałów). Przenieść próbki do inkubatora na nocną inkubację.
  2. W wybranym punkcie czasowym proliferacji, utrwalić próbki inkubowane z EdU, stosując 4% PFA w temperaturze 37 °C przez 30 min na wytrząsarce. Zastąpić roztwór 4% PFA 100 mM glicyną w PBS i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut. Dodać barwnik Hoechst w odpowiednim stężeniu na 30 min, a następnie przepłukać konstrukty 2x za pomocą PBS.
    UWAGA: Próbki można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania.
  3. Wykonać obrazowanie wszystkich utrwalonych i przechowywanych próbek EdU przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, stosując ustawienia i filtry sugerowane przez producenta zestawu do badania proliferacji komórek (Rysunek 3C oraz Rysunek 5D). Pozyskać trzy różne obrazy z serii z-stack o grubości 100 µm dla każdej próbki i utworzyć projekcje maksymalne z każdego z tych z-stacków. Zmierzyć proliferację HPAAF poprzez zliczenie liczby komórek EdU-dodatnich i podzielenie jej przez całkowitą liczbę komórek zidentyfikowanych za pomocą przeciwbarwienia Hoechst na obrazach projekcji maksymalnych (Rysunek 5C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten protokół opisuje, jak drukować 3D fotoprzestrajalne hydrożele w kąpieli wspomagającej, aby stworzyć konstrukcje zdolne do dynamicznego i czasowego usztywnienia do badania aktywacji fibroblastów w geometriach naśladujących ludzkie tkanki. Po pierwsze, w protokole wyjaśniono, w jaki sposób zsyntetyzować PEGαMA, szkielet tego fotoprzestrajalnego systemu polimerowego. Pomiary spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) wykazały pomyślną funkcjonalizację PEGαMA na poziomie 96,5% (Rysunek 1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dwustopniowe reakcje polimeryzacji w odpowiedzi na kontrolowaną ekspozycję na światło mogą usztywniać biomateriały przy kontroli przestrzennej i czasowej. W kilku badaniach wykorzystano tę technikę do oceny interakcji komórka-macierz na różnych platformach 5,8,9,10,11,21,22,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić. Fragmenty tego manuskryptu zostały zreprodukowane za zgodą © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Wszelkie prawa zastrzeżone.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Adamowi Feinbergowi (Carnegie Mellon University) oraz tym, którzy byli gospodarzami warsztatów Open-Source 3D Bioprinting. Osoby te umożliwiły poznanie technik biodruku FRESH i zbudowanie biodrukarki 3D wykorzystywanej w tych badaniach. Dodatkowo autorzy pragną podziękować Biorender.com, który został wykorzystany do stworzenia rycin w tym rękopisie. Praca ta była wspierana przez wiele grup lub źródeł finansowania, w tym Rose Community Foundation (DDH i CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH i CMM), National Science Foundation w ramach Award 1941401 (CMM), Departament Armii w ramach Award W81XWH-20-1-0037 (CMM), National Cancer Institute of the NIH w ramach Award R21 CA252172 (CMM), Ludeman Family Center for Women's Health Research na University of Colorado Anschutz Medical Campus (DDH i CMM), Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagród R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) i T32 HL072738 (DDH i AT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw radiometru/fotometru AccuMaxSpectronics CorporationXPR-3000Do pomiaru natężenia światła, służy do fotousztywniania
Kwas octowy Fisher ScientificBP2401-500Używany podczas syntezy PEGaMA
AcetonFisher ScientificA184Używany z kriosekcjami
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110Używany do barwienia
folii aluminiowejReynoldsF28028
Bezwodny tetrahydrofuran (THF)Sigma-Aldrich401757-1LUżywany podczas syntezy PEGaMA
Argon Sprężony gazPowietrznyAR R300Używany podczas syntezy PEGaMA
8 Arm Poli(glikol etylenowy)-hydroksylowy (PEG-OH)JenKem Technologia8ARM-PEG-10KStosowany podczas syntezy PEGaMA
Filtr pasmowoprzepustowy 365 nmEdmund Optics65-191Używany do fotousztywniania
albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP9700-100Używany podczas procesu barwienia
Buchner FunnelQuark GlassQFN-8-14Używany podczas syntezy PEGaMA
Calcein AMInvitrogen65-0853-39Używany podczas procesu barwienia
Celite 545 (Filtration Aid)EMD MilliporeCX0574-1Używany podczas syntezy PEGaMA
Naładowane szkiełka mikroskopoweGlobe Scientific1358W
Chloroform-dSigma-Aldrich151823-10X0,75MLSłuży do charakteryzowania zestawu do proliferacji komórek PEGaMA
Click-iT Plus EdUInvitrogenC10637Służy do barwienia
probówek stożkowych 50 mlCELLTREAT667050B
Zestaw bezpieczeństwa kriogenicznegoCole-ParmerEW-25000-85
KriostatLeicaCM 1850-3-1
Rurka do dializyRepligen132105
4',6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGUżywana do barwienia
eteru dietylowegoFisher ScientificE1384Używana podczas syntezy PEGaMA
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich10197777001składnik biotuszu
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)CytivaSH30271.
Bibuła filtracyjnaWhatman1001-090Używana podczas syntezy PEGaMA
Freezone 2.5L Freeze Dry SystemLabconcoLA-2.5LRLiofilizator
Fusion 360AutodeskN/A Pobieranieoprogramowania
2,5 mL Strzykawka gazoszczelnaHamilton81420Używana do biodruku
15 Gauge 1,5" Końcówka serii ITJensen GlobalJG15-1.5XUżywany do biodruku
30 Gauge 0,5 "HP Series TipJensen GlobalJG30-0.5HPXUżywany do biodruku
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555Przeciwciało Fisher ScientificA21422Używany do barwienia
GlycineFisher ScientificC2H5NO2Używany podczas procesu barwienia
HemocytometrFisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249Używany podczas procesu barwienia
Ludzkie fibroblasty przybyszowe tętnicy płucnej (HPAAFs)AcceGenABC-TC3773 Od 2-letniego pacjenta płci męskiej
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144-500Służy do regulacji pH roztworów
ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/A Darmoweoprogramowanie do pobrania
ImmEdge® Pen Vector LaboratoriesH-4000Używany podczas procesu barwienia
InkubatorVWRVWR51014991
LifeSupport Zawiesina mikrocząstek żelatyny (zawiesina żelatynowa)Zaawansowana biomatryca5244-10GMUżywana do biodruku
Mikroskop świetlnyOlympusCKX53Mikroskop światła odwróconego
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu ( LAP)Sigma-Aldrich900889-5GFotoinicjator używany do fotousztywniania
ciekłego azotuN/AN/A
LulzBot Mini 2 LulzBotN/A Bioprinterdostosowany
do metakryloksyetylu tiokarbamoilorodaminy B Polinauki Inc.669775-30-8
2-metylobutanSigma-AldrichM32631-4L
Tłoki kapilarne Microman CP1000VWR76178-166Końcówki do pipet wyporowych
MMP2 Degradowalny środek sieciujący (KCGGPQGIWGQGCK)GL BiochemN/ASkładnik biotuszu
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie i alfa;SMAFisher ScientificMA5-11547Służy do barwienia
Seria OmniCure 2000  Źródło światła UV Lumen DynamicsS2000-XLAstosowane do fotousztywniania
Paraformaldehydu (PFA) Mikroskopia elektronowa Nauki15710Służy do utrwalania
próbek pH-metrMettler Toledo 20PR 
Paski pHCytiva10362010
buforowana fosforanem (PBS)Hyclone Laboratories, Inc.Cytiva SH30256.
Zestaw pipetFisher Scientific14-388-100
10 µ L Końcówki do pipetUSA Scientific1120-3710
20 i mikro; L Końcówki do pipetUSA Scientific1183-1510
200 &mikro; L Końcówki do pipetUSA Scientific1111-0700
1000 µ L Końcówki do pipetUSA Scientific1111-2721
Poli(glikol etylenowy)-alfa metakrylan (PEG i alfa; MA)NIEDOTYCZY NIE DOTYCZYZapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się z etapami syntezy
Poli(tlenek etylenu) (PEO)Sigma-Aldrich372773-250GSkładnik biotuszu
Pipeta wyporowaFisher ScientificFD10004G100-1000 µ L
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich221473-500GSłuży do regulacji pH roztworów
ProLong Gold Antifade OdczynnikInvitrogenP36930Używany podczas procesu barwienia
PronterfaceAll3DPN/APobieranie oprogramowania
Jodek propidiumSigma-AldrichP4864-10MLUżywany do barwienia
peptydu RGD (CGRGDS)GL BiochemN/AKomponent biotuszu
RockerVWR10127-876
Parownik obrotowy Thomas Scientific11100V2022Używany podczas syntezy PEGaMA
Zszywkigumowe808659
Schlenk Flask Kemtech AmericaF902450Używany podczas syntezy PEGaMA
Slic3rSlic3rN/APobieranie oprogramowania
BulletKit Smooth Muscle Cell Growth-2 (SmGM-2) ZestawLonzaCC-3182zawiera składniki CC-3181 i CC-4149
Wodorek sodu Sigma-Aldrich223441-50GUżywany podczas syntezy PEGaMA
Wirówka Sorvall ST 40RFisher Scientific75-004-525
MieszadłoVWR58948-091
Filtr strzykawkowyVWR28145-483Służy do sterylnych roztworów filtracyjnych
T-75 Kolba poddana hodowli tkankowejVWR82050-856Używany do prac
Tissue-Tek CyromoldSakura4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)Sakura4583
Tris(2-karboksyetylo)Fosfina (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Triton X-100Fisher BioodczynnikiC34H622O11Używany podczas procesu barwienia
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUżywany do hodowli komórkowych praca
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25-300-062Używany do pracy z hodowlami komórkowymi
Tween 20Bioodczynniki FisherC58H114O26Używany podczas procesu barwienia
Mikroskop pionowyOlympusBX63FMożliwości mikroskopu fluorescencyjnego
Kąpiel wodnaPolyScienceWBE20A11B
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3527
FS Sól fizjologiczna FS związanych z hodowlą komórkową TGL

Bibliografia

  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
  3. Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
  4. Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
  5. Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
  6. Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
  7. Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904(2021).
  8. Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
  9. Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
  10. Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
  11. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792(2012).
  12. Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
  13. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
  14. Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
  15. Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).
  16. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  17. Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2(2014).
  18. Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
  19. Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
  22. Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
  23. Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387(2016).
  24. Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
  25. Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
  26. Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
  27. Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
  28. Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
  29. Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
  30. Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758(2023).
  31. Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871(2023).
  32. Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550(2023).
  33. Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

bioatrament hydro elowymacierz pozakom rkowak piel wspieraj ca z elatynyreakcja polimeryzacjimikroskopia konfokalnasztywno mikro rodowiskowamodele chor b w knistych
Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.