Artykuł metodologiczny

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

DOI:

10.3791/65642

⸱

28 marca 2025

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Division of Surgical Oncology, Department of Surgery, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, jak immunometabolizm wpływa na funkcję, różnicowanie i los limfocytów, wzbudziło duże zainteresowanie i uwagę. Biologia limfocytów została zbadana za pomocą analizy bioenergetycznej i stała się obecnie niezwykle ważnym narzędziem w tej dziedzinie. W związku z tym staraliśmy się zoptymalizować test analizy bioenergetycznej, który można dostosować do wstępnych zabiegów i ostrego wstrzykiwania w celu stymulacji receptorów. Tutaj oceniliśmy metabolizm limfocytów T CD8 ex vivo za pomocą testu wysiłkowego Cell Mito w celu oceny wskaźników zużycia tlenu i zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w naiwnych i efektorowych limfocytach T CD8. Specyficzne dla antygenu efektorowe limfocyty T CD8 uzyskano poprzez stymulację ex vivo, a naiwne limfocyty T CD8 pobrano ze splenocytów i wyizolowano za pomocą separacji kolumn z kulkami magnetycznymi.

Wstępne obróbki są wykonywane na mikropłytkach i szczegółowo opisujemy, jak przygotować wkłady z czujnikami. Pokazujemy, w jaki sposób porty iniekcyjne mogą być ładowane lekami, aby pośrednio mierzyć zdolności metaboliczne, a dzięki modulatorom metabolicznym protokół ten można wykorzystać do badania określonej aktywności enzymów. Stymulacje receptorów limfocytów T można badać w czasie rzeczywistym za pomocą ostrego wstrzyknięcia i stymulacji anty-CD3/CD28 za pomocą portów iniekcyjnych. Analizatory przyrządów służą do pomiarów i gromadzenia danych, a wizualizacja danych odbywa się za pomocą programów do interpretacji metabolizmu komórkowego. Strategia ta generuje obszerną ilość danych na temat biologii komórek odpornościowych i bioenergetyki mitochondriów, umożliwiając naukowcom dostosowanie protokołu na wiele sposobów w celu zbadania metabolizmu limfocytów T CD8.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na los i funkcjonalność komórek odpornościowych znaczący wpływ mają metabolizm, zużycie oksydacyjne i oddychanie beztlenowe1,2,3,4. Ostatnio wzrosło zainteresowanie modulacją metaboliczną jako strategią przeprogramowania lub ożywienia losu limfocytów T CD8 i funkcji efektorowej oraz poprawy klirensu wirusa lub wzmocnienia endogennej odporności przeciwnowotworowej5,6,7,8,9. Warto zauważyć, że sygnalizacja receptora antygenowego przez receptor limfocytów T (TCR) jest kluczowym wymogiem różnicowania limfocytów T CD8, co skutkuje dalszą sygnalizacją i aktywacją10,11,12 (Rysunek 1). Długotrwałe narażenie na uszkodzenia immunologiczne powoduje uporczywą stymulację TCR specyficzną dla antygenu, co ostatecznie prowadzi do przewlekłych stanów zapalnych, zmęczenia limfocytów T, przebudowy mikrośrodowiska immunologicznego i ucieczki immunologicznej11,13,14,15,16,17,18,19.

Metabolizm wyczerpanych limfocytów T CD8 zasadniczo różni się od metabolizmu funkcjonalnych efektorowych limfocytów T CD82,3,14,15,18,20. Różnicowanie limfocytów T, wydzielanie γ interferonu (IFNγ) i zdolność przypominania są częściowo determinowane przez funkcję mitochondriów i produkty rozpadu β-oksydacji. Limfocyty T IFNγ+ CD8 są krytycznymi składnikami zarówno przeciwnowotworowej, jak i przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej21,22,23. Specyficzny strumień metaboliczny poprzez glikolizę i łańcuch transportu elektronów jest ważny dla aktywacji limfocytów T CD8, wydzielania cytokin i odpowiedzi pamięciowych4,11,13,15,18,24,25,26,27,28. Optymalne odpowiedzi, w tym aktywacja limfocytów T i różnicowanie efektorów, wymagają skoordynowanej i specyficznej odpowiedzi mitochondrialnej, podczas gdy defekty mitochondrialne i nadmierne reaktywne formy tlenu (ROS) charakteryzują wyczerpane lub dysfunkcyjne limfocyty T9,29. Ostatnio, uporczywa stymulacja TCR limfocytów T CD8 in vitro sprzyja wyczerpującemu różnicowaniu limfocytów T CD8 częściowo poprzez indukowanie stresu oksydacyjnego i przeprogramowanie metabolizmu oksydacyjnego i zdolności metabolicznych wymaganych do proliferacji limfocytów T1,2,13,20,24,29. Ogólnie rzecz biorąc, osie kontroli metabolicznej są kluczowymi elementami w kierowaniu różnicowaniem limfocytów T CD8 i ich progresją do fenotypów efektorowych, pamięciowych lub wyczerpania/dysfunkcji.

Związki metaboliczne również kierują odpowiedzią komórek odpornościowych, działając jako autokrynne lub parakrynne cząsteczki sygnałowe9,30,31,32,33,34,35. Sfingozyno-1-fosforan (S1P) i kwas lizofosfatydowy (LPA) są bioaktywnymi i zapalnymi lipidami, które sygnalizują za pośrednictwem receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) modulowanie wyjścia limfocytów i cytotoksyczności przez limfocyty T CD836. Sygnalizacja LPA za pośrednictwem receptorów GPCR LPA na limfocytach T CD8 przeprogramowuje metabolizm w celu zwiększenia lipolizy, utleniania kwasów tłuszczowych i wycieku protonów9. Ogólnie rzecz biorąc, bioenergetyka i metabolizm limfocytów T CD8 są w dużej mierze napędzane przez dostępność substratu, sygnały środowiskowe i wymagania energetyczne.

Metodologie badania metabolizmu limfocytów T CD8 stały się coraz ważniejsze. Test stresu Cell Mito zapewnia kompleksową ocenę bioenergetyki i jest obecnie uznawany za technikę charakterystyczną w dziedzinie immunometabolizmu i energetyki komórek T CD89,37. Komórki adherentne były historycznie używane do testu Mito Stress Test38; jednak rośnie zainteresowanie stosowaniem tego protokołu do komórek hodowanych w zawiesinie, a konkretnie przy użyciu komórek odpornościowych do testu stresu Cell Mito. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru aktywności metabolicznej limfocytów T CD8 w oparciu o naszą najnowszą publikację9. Zapewniamy szczegółowe wyjaśnienie ekspansji limfocytów T CD8, naiwnej izolacji limfocytów T CD8, przygotowania testu i leczenia za pomocą protokołów zarówno leczenia wstępnego, jak i ostrych wstrzyknięć w teście Cell Mito Stress Test. Co ważne, porównujemy i kontrastujemy wiele metod stymulacji TCR i aktywacji limfocytów T CD8, w tym stymulację poliklonalną i specyficzną dla antygenu TCR.

Ten protokół szczegółowo opisuje stymulację specyficzną dla antygenu przy użyciu transgenicznych myszy OT-I (klasyczny transgeniczny model myszy), dla których wszystkie mysie limfocyty T wyrażają te same geny Vα2 i Vβ539. Wszystkie mysie limfocyty T CD8 OT-I zawierają ten sam TCR, który jest specyficzny wobec oktapeptydu albuminy jaja kurzego (OVA257-264, zapisywany również jako sekwencja aminokwasowa SIINFEKL lub N4, szeroko badany epitop, który po prezentacji przez główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) klasy I aktywuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 39 (Rysunek 1A). Ogólnie rzecz biorąc, transgeniczny model myszy OT-I jest szeroko stosowany przez immunologów do badania sygnalizacji TCR i funkcji efektora limfocytów T specyficznych dla antygenu. W przeciwieństwie do aktywacji monoklonalnej za pomocą mysiego modelu OT-I, poliklonalne limfocyty T CD8 mogą być generowane z przeciwciałami anty-CD3 / CD28 przeciwko podjednostkom TCR CD3 i cząsteczce kostymulującej CD2840 (Figura 1B). Przeciwciała anty-CD3/CD28 omijają specyficzny dla antygenu komponent sygnalizacji TCR, aby aktywować poliklonalną populację limfocytów T40. Ostatecznie wyniki opisane w tym raporcie porównują wiele metod wykorzystania testu wysiłkowego Cell Mito do ilościowego określenia dynamicznego przepływu metabolicznego w limfocytach T CD8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy były trzymane w środowisku wolnym od patogenów i utrzymywane zgodnie ze standardami i przepisami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Generowanie i ekspansja limfocytów T CD8 poprzez stymulację specyficzną dla antygenu

  1. Pierwszego dnia należy pobrać splenocyty pochodzące od myszy OT-I, a następnie przygotować je i aktywować in vitro za pomocą peptydu SIINFEKL (4).
    1. Oczyść przestrzeń maski, przygotuj odczynniki i zbierz podłoże mysie. Ogrzej pożywkę dla myszy w inkubatorze wodnym lub perełkowym.
      1. Na 6-dołkowej płytce umieść 7 ml pożywki mysiej w jednym dołku, a następnie kolejne 3 ml pożywki mysiej w innym dołku. Następnie włóż sitko do studzienki zawierającej 7 ml pożywki.
    2. Przynieś mysz do laboratorium z wiwarium w klatce transferowej. Przenieś mysz do pustej nowej klatki i umieść adapter CO2 na górze. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO2 do poziomu przepływu 2,75.
      1. Uważnie obserwuj mysz i obserwuj, czy nie ma oznak niepokoju. Po ostatnim oddechu obserwuj oznaki oddychania i życia przez co najmniej 1 minutę. Wyłączyć CO2 i wykonać zwichnięcie szyjki macicy jako wtórną metodę eutanazji. Następnie wyczyść blat, klatkę i resztę obszaru roboczego i przenieś mysz do okapu preparacyjnego.
    3. Wypreparuj śledzionę z myszy.
      1. Użyj 70% etanolu do sterylizacji sprzętu do preparowania i kładąc mysz lewą stroną do dołu, spryskaj lewą stronę myszy w celu dezynfekcji.
      2. Za pomocą czystych narzędzi przeprowadź sekcję, aby usunąć skórę i zidentyfikować otrzewną. Wykonaj małe nacięcie przez otrzewną, aby znaleźć śledzionę, a następnie wyciąć śledzionę. Umieść śledzionę na 6-dołkowej płytce na sitku.
      3. Oczyść obszar, włóż tuszę myszy do worka na odpady, a następnie umieść torbę w zamrażarce w celu wyrzucenia.
      4. Upewnij się, że cały obszar jest czysty i przenieś 6-dołkową płytkę do kaptura do hodowli tkankowej, aby wykonać kolejne kroki.
    4. W kapturze do hodowli tkankowej homogenizować śledzionę i ponownie zawiesić komórki w zawiesinie jednokomórkowej bez grudek.
      1. Przepchnąć śledzionę przez sitko do studzienki z 7 ml pożywki za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
      2. Opłucz sitko i wszelkie pozostałości tkanki za pomocą 3 ml pożywki w dodatkowym dołku.
      3. Przenieść zawiesinę komórek za pomocą pipety serologicznej do nowej stożkowej probówki o pojemności 10 ml.
      4. Wirować przez 5 minut przy stężeniu 500 × g i odsysać supernatant za pomocą szklanej pipety.
    5. Liza czerwonych krwinek.
      1. Rozpocznij proces lizy czerwonych krwinek przy użyciu 1 ml buforu do lizy ACK, ponownie zawieszając komórki w buforze do lizy ACK i inkubując w temperaturze pokojowej przez 1-5 minut.
        UWAGA: Czas inkubacji powinien być zoptymalizowany do konkretnej partii buforu do lizy ACK, aby osiągnąć maksymalną lizę krwinek czerwonych przy minimalnej śmierci splenocytów.
      2. Dodać 10 ml pożywki do stożkowej probówki w celu zobojętnienia i wirować przez 5 minut w temperaturze 500 × g.
      3. Zawiesić komórki w 50 ml pożywki i przenieść je do kolby T75.
    6. Stymuluj komórki peptydem SIINFEKL (N4).
      1. Wprowadzić peptyd SIINFEKL do kaptura do hodowli tkankowej. Peptyd SIINFEKL należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Dodać SIINFEKL bezpośrednio do podłoża, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μg/ml. Dodać 50 μl SIINFEKL (2 mg/ml) do 50 ml pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μg/ml.
    7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
    8. Zdezynfekuj kaptur do hodowli tkankowych za pomocą 70% etanolu.
  2. Czwartego dnia umyj komórki, aby usunąć peptyd. Używając świeżo przygotowanych pożywek z dodatkiem IL-2, ponownie zawiesić komórki, a następnie umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze.
    1. Zebrać komórki z kolby do hodowli tkankowej T75 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować i osadzać limfocyty T OT-I CD8, a następnie usunąć nadmiar pożywki za pomocą aspiracji. Dodać 50 ml nowej pożywki mysiej zawierającej 1000 U/ml IL-2 i przenieść komórki do nowej kolby T75.
    2. Do przechowywania należy przechowywać porcje IL-2 w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C zminimalizuje degradację peptydów.
  3. Przygotowanie ekspandowanych cytotoksycznych limfocytów T CD8 swoistych dla antygenu do testu funkcji mitochondriów
    1. W siódmym dniu przeprowadza się test funkcji mitochondriów. Przygotuj specyficzne dla antygenu limfocyty T OT-I CD8 do testu.
    2. Zbierz żywe limfocyty T CD8.
      1. Przenieść komórki z kolby do hodowli tkankowej T-75 do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie odwirować stożkową probówkę przez 5 minut przy 500 × g.
      2. W nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml odpipetuj 20 ml pożywki o gradiencie gęstości (gęstość = 1,077 g/ml), podczas gdy komórki się obracają.
      3. Po zakończeniu wirowania weź stożkową probówkę i używając 10 ml pożywki, ponownie zawieś komórki. Następnie, pipetując bardzo powoli, ułóż zawieszone komórki na wierzchu gradientu gęstości. Nie naruszając gradientu, odwirować probówkę stożkową o masie 1 300 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej z ustawieniem na maksymalne przyspieszenie i minimalne opóźnienie bez hamulca.
      4. Po zakończeniu wirowania użyj pipety P1000, aby zebrać środkową warstwę limfocytów T. Zwizualizuj warstwę komórkową i upewnij się, że pipeta pozostaje nad nią i nie narusza warstwy. Przenieś zebrane komórki do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml kompletnej pożywki mysiej. Następnie odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml o masie 500 × g przez 5 minut. Po zakończeniu wirowania odessać nadmiar supernatantu z limfocytów T OT-I CD8. Za pomocą 20 ml świeżej pożywki mysiej ponownie zawieś komórki.
    3. Za pomocą hemocytometru policz całkowitą liczbę żywotnych komórek. Zabarwić małą porcję komórek błękitem trypanowym w rozcieńczeniu 1:4 w celu identyfikacji martwych komórek.
      UWAGA: Po jednej myszy OT-I można spodziewać się około 40-60 × 106 komórek.
    4. Na dodatkowym etapie wirowania umyj pozostałe komórki dodatkowymi 20 ml świeżej pożywki mysiej. Następnie za pomocą mikropłytki odpipetuj komórki 200 000 komórek/dołek w kompletnym pożywce mysim.

2. Generowanie i ekspansja polispecyficznych limfocytów T CD8 poprzez stymulację anty-CD3/anty-CD28

  1. W dniu 0 pokryj 24-dołkową płytkę w CD3. Dodać 1 ml anty-CD3-biotyny o stężeniu 5 μg/ml, rozcieńczonej w PBS, do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 2 na noc.
  2. Następnego dnia zbierz mysz i zbierz splenocyty. Aktywuj splenocyty in vitro za pomocą anty-CD3/anty-CD28, wykonując czynności 1.1.1-1.1.5.3.
  3. Korzystając z protokołu separacji kulek magnetycznych, wyizoluj limfocyty T CD8.
    UWAGA: Upewnij się, że ogniwa są utrzymywane w niskiej temperaturze. W wstępnie schłodzonych warunkach pracuj szybko.
    1. Używając 40 μl buforu MACS, ponownie zawiesić komórki z 10 000 000 komórek na 40 μl bufora MACS. Do roztworu dokładnie wymieszać 10 μl koktajlu przeciwciał biotyny z roztworem komórkowym, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Czekając, aż komórka zacznie inkubować w lodówce, przygotuj kolumnę do pozytywnej selekcji. Użyj 3 ml buforu do umycia kolumny, a następnie wyrzuć przepływające odpady.
    3. Po 5 minutach pobrać z lodówki roztwór przeciwciała komórkowego i dodać 30 μl buforu MACS na 10 000 000 komórek, 20 μl antybiotyny, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez dodatkowe 10 minut.
    4. Przygotować nową probówkę zbiorczą pod kolumną pozytywnej selekcji, używając świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji przenieść zawiesinę komórek do kolumny selekcji pozytywnej. W świeżej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zebrać przepływ. Używając 3 ml buforu MACS, umyj kolumnę, aby zebrać resztki komórek.
      UWAGA: Upewnij się, że zawiesina komórek ma minimalną objętość 0.5 ml.
    5. Ponownie płytkować pozytywnie wybrane limfocyty T CD8 w 24-dołkowej płytce w celu stymulacji anty-CD3 / anty-CD28.
      1. Odwirować przepływ przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać nadmiar supernatantu i pipetować komórki w celu ich ponownego zawieszenia w roztworze. Za pomocą hemekytometru i trypana niebieskiego policz komórki.
        UWAGA: Spodziewaj się, że ~ 8-10 × 106 żywych komórek zostanie policzonych na śledzionę myszy.
      2. Po zliczeniu komórek ponownie zawieś limfocyty T CD8 w ilości 500 000 komórek na ml. Następnie ostrożnie odessać 1 ml PBS z płytki 24-dołkowej, ponownie poszczepić zliczone komórki na płytce 24-dołkowej i dodać 106 komórek do dołka.
      3. Aby stymulować komórki, pipetuj anty-CD28 do 24-dołkowej płytki, tak aby końcowe stężenie anty-CD28 wynosiło 2 μg/ml. Aby wymieszać komórki, ostrożnie postukaj w płytkę. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C przez następne 72 godziny.
  4. Używając 70% etanolu, wyczyść kaptur do hodowli tkankowych.
  5. W dniu 4 (72 godziny później) usuń komórki ze stymulacji anty-CD3/anty-CD28. Umyj komórki przez odwirowanie poliklonalnych limfocytów T CD8. Usunąć nadmiar supernatantu przez aspirację, a następnie ponownie zawiesić komórki świeżą pożywką mysią z 1000 jednostek/ml IL-2 z 10 ml pożywki. Przenieść zawieszone komórki na nową płytkę 6-dołkową i umieścić ją w inkubatorze.
    UWAGA: 1.2.2. Do przechowywania, porcje IL-2 mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Przechowywanie w temperaturze -80 °C zminimalizuje degradację peptydów.
  6. Przygotować ekspandowane limfocyty T CD8 efektora poliklonalnego do testu funkcji mitochondriów.
    1. Siódmego dnia przygotuj i przetwórz poliklonalne limfocyty T CD8 do testu.
    2. Zbierz żywe limfocyty T CD8.
      1. Przenieść komórki z płytki 6-dołkowej do czystej stożkowej probówki za pomocą pipety, a następnie odwirować komórki przez 5 minut przy 500 × g.
      2. Wykonaj kroki 1.3.3.2-1.3.4.
        UWAGA: Po jednej myszy C57BL/6 można spodziewać się około 10-30 milionów żywych limfocytów T CD8
        3. .
      3. Zapisz podwielokrotność komórek do cytometrii przepływowej, aby ocenić czystość CD8. W przypadku cytometrii przepływowej wybarwiaj komórki na lodzie przez 20 minut wybranym barwnikiem żywotności9.

3. Zbieranie naiwnych limfocytów T CD8

  1. Siódmego dnia zbierz splenocyty od myszy, wykonując czynności 1.1.1-1.1.5.3.
  2. Przeprowadź izolację limfocytów T CD8 przy użyciu protokołu opartego na kulkach magnetycznych opisanego w krokach 2.3-2.3.5.1.
  3. Umieść limfocyty T CD8 w mikropłytce w ilości 200 000 komórek / na dołek w kompletnym pożywce.

4. Wykonaj test funkcji mitochondriów

  1. Przygotuj materiały na dzień przed przeprowadzeniem testu funkcji mitochondriów.
    1. Uwodnić wkład czujnika.
      1. Wlej 200 μl wody destylowanej do każdej studzienki płytki użytkowej. Umieść wkład czujnika na górze tabliczki użytkowej. Sprawdź, czy końce wkładu czujnika są zanurzone, aby zapewnić prawidłowe nawodnienie. Umieścić zarówno wkład czujnika, jak i płytkę użytkową w inkubatorze innym niż CO2 w temperaturze 37 °C na co najmniej 10 godzin.
      2. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 50 ml Calbrant i umieść ją w inkubatorze bez zawartościCO2 i inkubuj przez noc.
      3. Dzień przed badaniem należy przygotować kompletną świeżą pożywkę w ramach przygotowań do testu. W sumie 50 ml przygotuj roztwór 1 mM pirogronianu, 2 mM glutaminy i 10 mM glukozy w pożywce testowej.
  2. Wykonaj test funkcji mitochondriów następnego dnia.
    1. Usuń wodę destylowaną z tabliczki narzędziowej, strzepując ją. Ponownie nawodnij za pomocą 200 μl Calibrant. Użyj kalibru, który był przechowywany przez noc w inkubatorze innym niż CO2 . Po wymianie wkładu czujnika na górze tabliczki użytkowej. Włóż tabliczkę narzędziową z wkładem czujnika z powrotem do inkubatora bezCO2.
      UWAGA: Aby przesunąć talerz, szybko i sprawnie odwróć talerz jednym płynnym ruchem nad zlewem, aby destylowana woda szybko wypadła z talerza.
  3. Przygotuj limfocyty T CD8 zgodnie z powyższym opisem w sekcjach 1-3.
    1. Za pomocą pipety wielokanałowej płytkować 200 000 komórek na studzienkę, ponownie zawieszając 10 × 106 komórek w 4,5 ml kompletnego podłoża i posiewając 90 μl na studzienkę. Następnie dodaj kolejne 90 μl wyznaczonej pożywki do studzienki podczas obróbki wstępnej.
      UWAGA: Jeśli nie ma obróbki wstępnej, umieść komórki w 180 μl na studzience o końcowym stężeniu 200 000 komórek na studzienkę. Począwszy od tego momentu w protokole, należy przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej otoczenia lub w inkubatorze innym niż CO2 . Płytki nie należy umieszczać w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Należy pamiętać, że ostateczna objętość mikropłytki będzie wynosić 180 μl.
  4. Przygotuj zabiegi wstępne (w tym suplementację lipidów lub innych metabolitów).
    1. Przygotuj wstępną obróbkę lipidów, odkręcając liofilizowane lipidy z zamrażarki za pomocą mini wirówki do szybkiego wirowania. Określ pożądane stężenia do obróbki wstępnej i przygotuj obróbkę wstępną lipidów do tych stężeń. Sonikować rozcieńczony lipid przez 30 minut bezpośrednio przed użyciem.
    2. Przygotuj koktajle lipidowe.
      1. Określ pożądane stężenie lipidów, które ma być użyte w teście funkcji mitochondriów.
      2. Przygotuj lipidy w stężeniu, które jest 2x większe od pożądanego stężenia. Następnie dodaj roztwór lipidów do istniejącej objętości w mikropłytce, aby uzyskać rozcieńczenie 1:2. Uzupełnij to, dodając 90 μl roztworu lipidowego bezpośrednio do istniejących wcześniej 90 μl. Ostateczna objętość wyniesie 180 μl (rozcieńczenie 1:2) na studzienkę.
        UWAGA: Tabela 1 zawiera przykładowy schemat możliwej konfiguracji i konstrukcji płyty. Sugerujemy przeprowadzenie testu z 5-6 kontrpróbami technicznymi, zawierającymi zarówno naiwne, jak i specyficzne dla antygenu efektorowe limfocyty T CD8 z dodatkami lipidowymi i bez. Warto zauważyć, że protokół ten ma na celu uniknięcie wirowania w celu zminimalizowania zakłóceń komórkowych. Ponieważ test funkcji mitochondriów jest bardzo wrażliwy na liczbę komórek, zmniejszenie utraty komórek ma kluczowe znaczenie. Zamiast wirowania, komórki są obsługiwane przez trzeganie, aby zachować ich integralność.
      3. Odmierzyć pipetę 180 μl kompletnego podłoża do każdego rogu płytki. Umieścić mikropłytkę z limfocytami T CD8 w inkubatorze innym niż CO2 .
        UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnić w zależności od pożądanej długości obróbki wstępnej. Aby zminimalizować śmierć komórki, zalecamy maksymalnie 4-godzinne leczenie wstępne limfocytów T CD8. Nadmierne wydłużenie czasu obróbki wstępnej może spowodować nadmierną śmierć komórek, wpływając na dokładność wyników.
  5. Przygotuj trucizny i roztwory do ostrych wstrzyknięć.
    1. Używając roztworów podstawowych, przygotuj rozcieńczoną formę oligomycyny. Utworzyć rozcieńczenie oligomycyny w 3 ml kompletnego podłoża. W stożkowych probówkach o pojemności 15 ml ostrożnie przygotuj trucizny i ostre zastrzyki. Ponieważ trucizny są wrażliwe na światło, przygotuj te roztwory za pomocą probówek owiniętych folią aluminiową, aby chronić przed ekspozycją na światło.
      1. W jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową rozcieńczyć oligomycynę w 3 ml kompletnego podłoża, tak aby końcowe stężenie po wstrzyknięciu wynosiło 2,5 μM.
      2. W drugiej stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową rozcieńczyć FCCP w 3 ml kompletnego podłoża, tak aby końcowe stężenie po wstrzyknięciu wynosiło 2,0 μM.
      3. W trzeciej stożkowej probówce o pojemności 15 ml owiniętej folią aluminiową utwórz roztwory rotenonu i antymycyny A w 3 ml kompletnego podłoża, aby osiągnąć stężenie 0,5 μM dla obu toksyn po wstrzyknięciu.
      4. Jeśli test jest wykonywany z dodatkowymi modulatorami metabolicznymi, lekami lub stymulacjami, należy rozcieńczyć te środki w pełnej pożywce. Jeśli planujesz stosować etomoksyr lub inne modulatory metaboliczne i leki, najpierw wykonaj test w celu przetestowania krzywej miareczkowania i określenia optymalnego stężenia do użycia. W przypadku przeprowadzania stymulacji TCR przez ostre wstrzyknięcie, test można wykonać przy użyciu kulek magnetycznych anty-CD3/anty-CD28 lub kombinacji anty-CD3-biotyny związanej z płytką ze streptawidyną anty-CD28.
        UWAGA: Dodatkowe opisy znajdują się w sekcji 5, która opisuje protokół stymulacji TCR z ostrym wstrzyknięciem anty-CD3/CD28.
    2. Wyjmij wkład czujnika z inkubatora bez emisjiCO2. Za pomocą adapterów płytek odpipetuj trucizny do wkładu czujnika. Adaptery płytek należy umieścić w taki sposób, aby każda komora mogła być specjalnie załadowana truciznami lub innymi ostrymi iniekcjami.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas pipetowania trucizn.
      1. Załaduj trucizny do portów wkładu czujnika. Jeśli nie są wykonywane żadne dodatkowe zastrzyki, porty A-C zostaną załadowane truciznami. Odpipetować 20 μl oligomycyny do portu A, 22 μl FCCP do portu B, 25 μl rotenonu do portu C i 25 μl antymycyny A do portu C.
  6. Na godzinę przed rozpoczęciem testu na instrumencie umieść mikropłytkę w inkubatorze bezCO2
    7. .
  7. Przed uruchomieniem przyrządu otwórz oprogramowanie i skalibruj przyrząd. Wykonaj to zadanie 30 minut przed załadowaniem mikropłytki do urządzenia, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na kalibrację.
    1. W systemie oprogramowania oznacz studzienki i przejrzyj schemat wtrysku.
    2. Podczas kalibracji załaduj wkład czujnika do przyrządu. Oprogramowanie poprosi Cię o dokończenie inicjalizacji i kontroli jakości. Kalibracja oceni pH iO2 w każdym dołku, który przejdzie lub nie. Przyrząd poda wyniki na ekranie za pomocą znacznika wyboru lub "X".

5. Wykonaj zmodyfikowaną wersję testu funkcji mitochondriów ze stymulacją TCR w oddzielnym eksperymencie z ostrym wstrzyknięciem anty-CD3/CD28

UWAGA: Test funkcji mitochondriów może być przeprowadzony z symulacją ostrego TCR za pomocą dwóch różnych podejść przez 1) użycie biotynylowanych anty-CD3 + anty-CD28 + streptawidyny opisanych w kroku 5.2 lub 2) kulek magnetycznych anty-CD3/CD28 opisanych w kroku 5.3 Te oddzielne eksperymenty działają w celu stymulacji TCR poprzez ostre wstrzyknięcie podczas testu.

  1. W przypadku wykonywania dodatkowych wstrzyknięć należy przygotować test zgodnie z opisem w poprzednim punkcie 4. Zmodyfikuj schematy wtrysku za pomocą dodatkowej komory do wtrysku. W tym protokole anty-CD3/anty-CD28 są ładowane do portu A wkładu czujnika. Następnie załaduj inne porty w podobny sposób, z oligomycyną do portu B, FCCP do portu C, a rotenonem i antymycyną A do portu D.
  2. Przygotować i załadować biotynylowane składniki anty-CD3 + anty-CD28 + streptawidyna.
    1. Odpipetować 20 μl biotynylowanego anty-CD3 w stężeniu 10 μg/ml do wyznaczonych studzienek we wkładzie czujnika.
    2. Odpipetować 20 μl anty-CD28 w stężeniu 2 μg/ml + streptawidynę w stężeniu 20 μg/ml do wyznaczonych studzienek we wkładzie czujnika.
    3. Odmierzyć pipetą 20 μl biotynylowanego anty-CD3 w stężeniu 10 μg/ml + anty-CD28 w stężeniu 2 μg/ml + streptawidyny w stężeniu 20 μg/ml do wyznaczonych dołków we wkładzie czujnika.
    4. Upewnij się, że studzienki kontrolne są przygotowane. Upewnij się, że są wyznaczone studzienki, do których wstrzykuje się tylko pożywkę, samą biotynylowaną anty-CD3, anty-CD28 + streptawidynę i biotynylowaną anty-CD3 + anty-CD28 + streptawidynę.
  3. Używając stosunku koralików do komórek 1:1, przygotuj i załaduj kulki magnetyczne anty-CD3/CD28.
    1. Na płytce z 200 000 komórek na studzienkę odpipetuj 5 μl kulek magnetycznych do wyznaczonych dołków we wkładzie czujnika.
    2. Przygotować wyznaczone studzienki kontrolne z pożywką tylko do wstrzykiwań.
  4. Dostosuj objętość trucizn tak, aby końcowe stężenia po wstrzyknięciu wynosiły: 2,5 μM dla oligomycyny, 2,0 μM dla FCCP i 0,5 μM dla rotenonu i antymycyny A.
  5. Upewnij się, że schemat wstrzykiwania został zmodyfikowany tak, aby odzwierciedlał zaktualizowane punkty czasowe przed załadowaniem mikropłytki na instrument.
  6. Zaprogramuj oprogramowanie tak, aby uruchamiało ostrą stymulację TCR przez łącznie 140 minut. W tym czasie zmodyfikuj schemat tak, aby przed wstrzyknięciem oligomycyny było x10 pomiarów punktu czasowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolności metaboliczne glikolityczne i oksydacyjne mogą być mierzone za pomocą testu funkcjonalnego mitochondriów, który ocenia zdolności poprzez celowanie w składniki łańcucha transportu elektronów w określonych punktach czasowych (Rysunek 2A). Do portów wkładów czujnika można załadować różne schematy wstrzykiwań, aby zmodyfikować tradycyjny test i ocenić ostrą stymulację TCR (Rysunek 2B, C). Liczba komórek i stężenie leku dla różnych typów komórek powinny być zop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono protokół oceny funkcji mitochondriów naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8. Szczegółowo opisujemy i porównujemy metody przygotowania zarówno specyficznych dla antygenu, jak i poliklonalnych limfocytów T CD8 przy użyciu myszy OT-I i C57BL / 6. Nasze wyniki pokazują, że istnieją podobne trendy w metabolizmie pomimo metody aktywacji i wstępnego leczenia w limfocytach T CD8. Dane pokazują, że aktywacja specyficzna dla antygenu prowadzi do bardziej aktywnych metabolicznie limfocytów T OT-I CD8 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundacja Hertz, Fundacja Amy Davis, Fundacja Rodziny Moore i Fundacja Heidi Horner dostarczyły nieocenionego wsparcia, za co jesteśmy wdzięczni. Praca ta była również częściowo wspierana przez granty NIH dla RMT (AI052157, AI136534), podczas gdy JAT był wspierany przez Hertz Graduate Fellowship.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Antymycyna ASigma-AldrichA8674
Anti-CD28Biolegend102116
Anti-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
Biotynylowany anty-CD3Biolegend317320
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ Zestawdo izolacji limfocytów TMiltenyi Biotec130-104-075
Sitka do komórek (100 &mikro; m)LECZENIE KOMÓRKOWE229485
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8gradient gęstości średni 
FCCP ((4-(trifluorometoksy)fenylo)karbohydrazonoilodicyjanek)Sigma-AldrichC2920
GlukozaSigma-AldrichG-6152
GlutaminaSigma-AldrichG7513
LS KolumnyMiltenyi Biotec130-042-401Kolumny pozytywnej selekcji
Magnetyczna kolumna do separacji komórekMiltenyi Biotec130-042-301
Microplate Agilent102601-100
OligomycynaSigma-Aldrich75351
PirogronianSigma-Aldrich113-24-6
Rekobinant IL-2PeproTech200-02
RotenonSigma-AldrichR8875
Pożywka dla konika morskiegoAgilent103576-100
Kartridż z czujnikiemAgilent102601-100
StreptavidinSigma-AldrichA9275
Sterylna płytka 6-dołkowaCELL TREAT230601
Sterylna płytka 24-dołkowaCELL TREAT229524
XF CalibrantAgilent102601-100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patsoukis, N., et al. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 6, 6692(2015).
  2. Scharping, N. E., et al. Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion. Nat Immunol. 22, 205-215 (2021).
  3. Schurich, A., et al. Distinct Metabolic Requirements of Exhausted and Functional Virus-Specific CD8 T Cells in the Same Host. Cell Rep. 16 (5), 1243-1252 (2016).
  4. Zhang, L., Romero, P. Metabolic control of CD8(+) T cell fate decisions and antitumor immunity. Trends Mol Med. 24 (1), 30-48 (2018).
  5. Batabyal, R., et al. Metabolic dysfunction and immunometabolism in COVID-19 pathophysiology and therapeutics. Int J Obes (Lond). 45 (6), 1163-1169 (2021).
  6. Chavakis, T. Immunometabolism: Where immunology and metabolism meet. J Innate Immun. 14, 1-3 (2022).
  7. Frezza, C., Mauro, C. Editorial: The metabolic challenges of immune cells in health and disease. Front Immunol. 6, 293(2015).
  8. Wang, X., Ping, F. F., Bakht, S., Ling, J., Hassan, W. Immunometabolism features of metabolic deregulation and cancer. J Cell Mol Med. 23 (2), 694-701 (2019).
  9. Turner, J. A., et al. Lysophosphatidic acid modulates CD8 T cell immunosurveillance, metabolism, and anti-tumor immunity. Nat Commun. 14, 3214(2023).
  10. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, 860-867 (2002).
  11. Jiang, Y., Li, Y., Zhu, B. T-cell exhaustion in the tumor microenvironment. Cell Death Dis. 6 (6), e1792(2015).
  12. Krangel, M. S. Mechanics of T cell receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol. 21 (2), 133-139 (2009).
  13. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  14. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  15. Bengsch, B., et al. Bioenergetic insufficiencies due to metabolic alterations regulated by the inhibitory receptor PD-1 are an early driver of CD8(+) T cell exhaustion. Immunity. 45 (2), 358-373 (2016).
  16. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol. 19, 665-674 (2019).
  17. Dolina, J. S., Van Braeckel-Budimir, N., Thomas, G. D., Salek-Ardakani, S. CD8(+) T cell exhaustion in cancer. Front Immunol. 12, 715234(2021).
  18. Mognol, G. P., et al. Exhaustion-associated regulatory regions in CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (13), E2776-E2785 (2017).
  19. Wang, D., et al. A comprehensive profile of TCF1(+) progenitor and TCF1(-) terminally exhausted PD-1(+)CD8(+) T cells in head and neck squamous cell carcinoma: implications for prognosis and immunotherapy. Int J Oral Sci. 14 (1), 8(2022).
  20. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21, 1022-1033 (2020).
  21. Kang, S., Brown, H. M., Hwang, S. Direct antiviral mechanisms of interferon-gamma. Immune Netw. 18 (5), e33(2018).
  22. Samuel, C. E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 14, 778-809 (2001).
  23. Schellekens, H., Weimar, W., Cantell, K., Stitz, L. Antiviral effect of interferon in vivo may be mediated by the host. Nature. 278, 742(1979).
  24. Radoja, S., et al. CD8(+) tumor-infiltrating T cells are deficient in perforin-mediated cytolytic activity due to defective microtubule-organizing center mobilization and lytic granule exocytosis. J Immunol. 167 (9), 5042-5051 (2001).
  25. van der Windt, G. J., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  26. Balmer, M. L., et al. Memory CD8(+) T cells require increased concentrations of acetate induced by stress for optimal function. Immunity. 44 (6), 1312-1324 (2016).
  27. Pereira, R. M., Hogan, P. G., Rao, A., Martinez, G. J. Transcriptional and epigenetic regulation of T cell hyporesponsiveness. J Leukoc Biol. 102, 601-615 (2017).
  28. Sen, D. R., et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science. 354, 1165-1169 (2016).
  29. Quintana, A., et al. T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14418-14423 (2007).
  30. Brindley, D. N. Lysophosphatidic acid signaling in cancer. Cancers (Basel). 12 (12), 3791(2020).
  31. Chae, C. S., et al. Tumor-derived lysophosphatidic acid blunts protective type I interferon responses in ovarian cancer. Cancer Discov. 12, 1904-1921 (2022).
  32. Kremer, K. N., et al. LPA suppresses T cell function by altering the cytoskeleton and disrupting immune synapse formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2118816119(2022).
  33. Mathew, D., et al. LPA5 is an inhibitory receptor that suppresses CD8 T-cell cytotoxic function via disruption of early TCR signaling. Front Immunol. 10, 1159(2019).
  34. Mathew, D., Torres, R. M. Lysophosphatidic acid is an inflammatory lipid exploited by cancers for immune evasion via mechanisms similar and distinct from CTLA-4 and PD-1. Front Immunol. 11, 531910(2020).
  35. Oda, S. K., et al. Lysophosphatidic acid inhibits CD8 T cell activation and control of tumor progression. Cancer Immunol Res. 1 (4), 245-255 (2013).
  36. Lidgerwood, G. E., Pitson, S. M., Bonder, C., Pebay, A. Roles of lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate in stem cell biology. Prog Lipid Res. 72, 42-54 (2018).
  37. Torres, R. M., Turner, J. A., D'Antonio, M., Pelanda, R., Kremer, K. N. Regulation of CD8 T-cell signaling, metabolism, and cytotoxic activity by extracellular lysophosphatidic acid. Immunol Rev. 317 (1), 203-222 (2023).
  38. Turner, J. A., et al. BRAF modulates lipid use and accumulation. Cancers (Basel). 14 (9), 2110(2022).
  39. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  40. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8, 104(2010).
  41. Ralli, M., et al. Immunotherapy in the treatment of metastatic melanoma: current knowledge and future directions. J Immunol Res. 2020, 9235638(2020).
  42. Philip, M., Schietinger, A. CD8(+) T cell differentiation and dysfunction in cancer. Nat Rev Immunol. 22, 209-223 (2022).
  43. Bajrai, L. H., et al. Understanding the role of potential pathways and its components including hypoxia and immune system in case of oral cancer. Sci Rep. 11, 19576(2021).
  44. Nicholls, D. G. Mitochondrial proton leaks and uncoupling proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862, 148428(2021).
  45. Tyrakis, P. A., et al. S-2-hydroxyglutarate regulates CD8(+) T-lymphocyte fate. Nature. 540, 236-241 (2016).
  46. Guo, Y., et al. Metabolic reprogramming of terminally exhausted CD8(+) T cells by IL-10 enhances anti-tumor immunity. Nat Immunol. 22, 746-756 (2021).
  47. Notarangelo, G., et al. Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8(+) T cell function. Science. 377 (6614), 1519-1529 (2022).
  48. Yang, K., et al. T cell exit from quiescence and differentiation into Th2 cells depend on Raptor-mTORC1-mediated metabolic reprogramming. Immunity. 39 (6), 1043-1056 (2013).
  49. Ricciardi, S., et al. The translational machinery of human CD4(+) T cells is poised for activation and controls the switch from quiescence to metabolic remodeling. Cell Metab. 28 (6), 895-906.e5 (2018).
  50. Moller, S. H., Hsueh, P. C., Yu, Y. R., Zhang, L., Ho, P. C. Metabolic programs tailor T cell immunity in viral infection, cancer, and aging. Cell Metab. 34 (3), 378-395 (2022).
  51. Alrubayyi, A., et al. Functional restoration of exhausted CD8 T cells in chronic HIV-1 infection by targeting mitochondrial dysfunction. Front Immunol. 13, 908697(2022).
  52. Vignali, P. D. A., et al. Hypoxia drives CD39-dependent suppressor function in exhausted T cells to limit antitumor immunity. Nat Immunol. 24, 267-279 (2023).
  53. Ogando, J., et al. PD-1 signaling affects cristae morphology and leads to mitochondrial dysfunction in human CD8(+) T lymphocytes. J Immunother Cancer. 7 (1), 151(2019).
  54. Billingham, L. K., et al. Mitochondrial electron transport chain is necessary for NLRP3 inflammasome activation. Nat Immunol. 23, 692-704 (2022).
  55. Eberhardt, D. R., et al. EFHD1 ablation inhibits cardiac mitoflash activation and protects cardiomyocytes from ischemia. J Mol Cell Cardiol. 167, 1-14 (2022).
  56. Hou, T., et al. Identification of EFHD1 as a novel Ca(2+) sensor for mitoflash activation. Cell Calcium. 59 (5), 262-270 (2016).
  57. Mun, S. A., et al. Structural and biochemical characterization of EFhd1/Swiprosin-2, an actin-binding protein in mitochondria. Front Cell Dev Biol. 8, 628222(2020).
  58. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death Differ. 24 (7), 1239-1252 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

efektorowe limfocyty Tnaiwne limfocyty Tanaliza bioenergetycznatest stresu mitochondrialnego kom rekszybko zu ycia tlenuzewn trzkom rkowe zakwaszeniestymulacja TCRizolacja za pomoc kulek magnetycznych

Powiązane artykuły