Method Article

Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

DOI:

10.3791/65646

⸱

January 26th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute of Cancer, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, 4Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, 5Institute of life science, Chongqing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj eksperymentalny projekt dostarcza użytecznego modelu reprodukcyjnego do badań specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+ podczas przerzutów do węzłów chłonnych (LN), co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8+ osób postronnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T CD8+ specyficzne dla antygenu nowotworowego z drenujących węzłów chłonnych zyskują coraz większe znaczenie w narastaniu przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej podczas nowotworzenia. Jednak w wielu przypadkach komórki rakowe tworzą przerzutowe loci w węzłach chłonnych przed dalszymi przerzutami do odległych narządów. W jakim stopniu na miejscową i systematyczną odpowiedź limfocytów T CD8 + miały wpływ przerzuty LN, pozostaje niejasne. W tym celu stworzyliśmy mysi model przerzutów LN w połączeniu z linią komórkową czerniaka B16F10-GP wyrażającą zastępczy neoantygen pochodzący z limfocytarnego wirusa zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), glikoproteiny (GP) i transgenicznych myszy P14 zawierających receptory limfocytów T (TCR) specyficzne dla peptydu GP33-41 pochodzącego z GP, prezentowanego przez cząsteczkę głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy IH-2D b. Protokół ten umożliwia badanie odpowiedzi limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN. W tym protokole myszom C57BL / 6J wszczepiono podskórnie komórki B16F10-GP, a następnie adoptywny transfer z naiwnymi komórkami P14. Kiedy guz podskórny urósł do około 5 mm średnicy, guz pierwotny został wycięty, a komórki B16F10-GP zostały bezpośrednio wstrzyknięte do węzła chłonnego drenującego guz (TdLN). Następnie monitorowano dynamikę limfocytów T CD8+ podczas procesu przerzutów LN. Reasumując, model ten zapewnił podejście do precyzyjnego zbadania odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoterapia nowotworów, a zwłaszcza blokada immunologicznego punktu kontrolnego (ICB), zrewolucjonizowała terapię nowotworów1. ICB blokuje immunoreceptory kohamitujące (takie jak PD-1, Tim-3, LAG-3 i TIGIT), które są silnie eksprymowane w wyczerpanych limfocytach T CD8 + w mikrośrodowisku guza (TME), prowadząc do ożywienia wyczerpanych limfocytów T CD8 + 2. Biorąc pod uwagę niejednorodność wyczerpanych limfocytów T CD8 +, gromadzące się dowody wykazały, że specyficzne dla nowotworu limfocyty T CD8 + pochodzące z obwodu, w tym z drenującego węzła chłonnego (dLN), ale nie w TME, pośredniczą w skuteczności ICB3,4,5,6,7,8. Niedawno potwierdzono, że komórki T pamięci CD8 + specyficzne dla nowotworu TCF-1 + TOX (TdLN-TTSM) pochodzące z TdLN są prawdziwymi odpowiedziami na ICB, które ucieleśniają kilka funkcjonalnych właściwości konwencjonalnych komórek T pamięci i mogą dalej się rozszerzać i różnicować w wyczerpane komórki potomne po leczeniu ICB9. Podsumowując, odkrycia te potwierdziły znaczenie LN w budowaniu odporności przeciwnowotworowej.

Węzeł chłonny pełni funkcję krytycznego miejsca ułatwiającego przygotowanie i aktywację specyficznych dla nowotworu limfocytów T CD8+, dostarczając podstawy strukturalnej, jak również sygnałów biologicznych10. Kilka typów komórek nowotworowych często wysiewa wartowniczy węzeł chłonny (SLN, pierwszy LN drenujący guz pierwotny) przed systematycznym rozpowszechnieniem11. Obecność przerzutów SLN wiąże się ze słabymi wynikami w leczeniu nowotworów u ludzi, a modele przedkliniczne wykazały, że komórki nowotworowe w TdLN mogą rozprzestrzeniać się do odległych narządów zarówno przez naczynia limfatyczne, jak i naczynia krwionośne węzła12,13,14,15. Biopsja SLN stanowi obecnie standardową procedurę kierowania późniejszymi decyzjami dotyczącymi leczenia wielu typów guzów litych, co pozwala uniknąć niepotrzebnej resekcji niezaangażowanej LN16,17. Nawet dla zaangażowanego LN pozostaje kwestią sporną, czy i kiedy potrzebna jest resekcja chirurgiczna, ponieważ kilka badań wykazało, że usunięcie regionalnego LN nie wykazało poprawy całkowitego przeżycia w porównaniu z osobami, które otrzymały radioterapię lub terapię ogólnoustrojową bez regionalnej resekcji LN18,19. Jedna z interpretacji mówi, że przerzutowy LN (mLN) z chorobą mikroskopową może zachować pewną zdolność do edukacji komórek odpornościowych i zapewniać pewne korzyści terapeutyczne. Dlatego niezwykle ważne jest wyjaśnienie, w jaki sposób przerzuty LN wpływają na przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, a zwłaszcza na właściwości i funkcje TdLN-TTSM.

Do tej pory zarówno dane przedkliniczne, jak i kliniczne wykazały pewne zmiany strukturalne i komórkowe w mLN20. Nie określono jednak dynamicznych zmian limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu podczas przerzutów LN. W związku z tym do dalszych badań konieczne jest opracowanie przekonującego modelu przerzutów LN. Rzeczywiście, kilka badań opisało modele myszy mLN na różne sposoby14,21,22. Na przykład, spontaniczne przerzuty w pachowych LN przeprowadzono poprzez implantację komórek raka piersi 4T1 do poduszeczki tłuszczowej sutka22. W innym badaniu Reticker-Flynn i in. wygenerowali linie komórkowe czerniaka o wysokiej częstości rozprzestrzeniania się z podskórnego guza pierwotnego do LN poprzez seryjną inokulację komórek nowotworowych hodowanych ze zdysocjowanych tkanek mLN (dziewięć rund)14. Inny powszechnie stosowany model został przygotowany przez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do opuszki stopy, a przerzutowe loci zostałyby utworzone w podkolanowym LN22. Warto zauważyć, że trudno jest ocenić dokładne punkty czasowe interwencji, ponieważ przerzuty LN w tych modelach nie zawsze są wierne.

W obecnym badaniu, mysi model przerzutowy LN został stworzony poprzez dowęzłowe wstrzyknięcie komórek B16F10-GP23,24, wygenerowany przez insercję genu glikoproteiny (GP) wirusa LCMV za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do genomu linii komórkowej B16F109. Następnie myszy te przeniesiono z komórkami P14, które zawierają transgeniczne receptory limfocytów T (TCR), które specyficznie rozpoznają epitop H-2Db GP33-41 25,26 i można było zbadać ogólnoustrojową i lokalną dynamikę limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN. Nasz projekt eksperymentalny zapewnia użyteczny model do badania odpowiedzi immunologicznych, zwłaszcza limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN, co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8 + osób postronnych. Wyniki te wpłynęłyby na kliniczne możliwości leczenia, czy usunąć lub zachować mLN i rzuciłyby nowe światło na manipulację mLN w celu osiągnięcia maksymalnych korzyści terapeutycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy C57BL/6J (określane jako myszy B6) i naiwne myszy transgeniczne P149,27 były w wieku 6-10 tygodni i ważyły 18-22 g. Zarówno mężczyzna, jak i kobieta zostali włączeni bez randomizacji lub zaślepienia. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania Uniwersytetu Rolniczego w Qingdao.

1. Przygotowanie pożywki i odczynników

  1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek czerniaka B16F10-GP o nazwie D10 (kompletna pożywka DMEM) poprzez dodanie DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy z dodatkowymi 100 U/ml puromycyny. Utrzymuj sterylną D10 i przechowuj do 2 tygodni w temperaturze 2-4 °C.
  2. Przygotuj pożywkę R2 (do zakończenia lizy czerwonych krwinek), dodając RPMI-1640 z 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy.
  3. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), dodając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 2% FBS i 0,01% azydku sodu. Dodatek azydku sodu może wydłużyć czas przechowywania buforu FACS, który może być przechowywany miesiącami w temperaturze 2-4 ° C.
  4. Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek (RBL), dodając 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 i 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do podwójnie destylowanej wody i dostosować jego pH do 7,3. Przechowuj bufor RBL w temperaturze pokojowej (RT) i pozostaje stabilny do 3 miesięcy.
  5. Przygotować środek znieczulający, 2,2,2-tribromoetanol, jak opisano poniżej.
    1. Odważyć odpowiednią ilość kryształu 2,2,2-tribromoetanolu w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową. Dodać odpowiednią ilość 2-metylo-2-butanolu do kryształu, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 500 mg/ml.
    2. Zamieszaj go, aby wymieszać i ogrzać probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż kryształ się rozpuści. Upewnij się, że wszystkie kryształy są rozpuszczone.
    3. Dokładnie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór podstawowy z filtrem 0,22 μm do sterylnego pojemnika. Przechowywać roztwór podstawowy zamrożony, osłonięty przed światłem, w temperaturze -20 °C lub rozcieńczony PBS w roztworze roboczym o stężeniu 12,5 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Najlepiej jest stosować przepisane stężenie, ponieważ wyższe stężenia płynu są drażniące.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek B16F10-GP

  1. Rozmrozić i wyhodować fiolkę zawierającą 1 x 106 komórek B16F10-GP z 5 ml D10 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Subkulturuj komórki, gdy osiągną gęstość od 80% do 90%, jak opisano poniżej.
    1. Oryginalną pożywkę hodowlaną należy odrzucić przez aspirację za pomocą pistoletu do pipetowania i przemyć komórki 2x PBS. Podczas czyszczenia przylegających komórek za pomocą PBS w naczyniu do hodowli komórkowych, przesuń PBS na boczną ściankę lub wrzuć go do naczynia.
    2. Po aspiracji PBS dodać 0,5-1 ml 0,25% roztworu trypsyny EDTA do naczynia lub kolby do hodowli komórkowej. Delikatnie wstrząśnij, aby pokryć całą powierzchnię komórki. Umieścić naczynie lub kolbę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C na około 1 minutę lub w temperaturze pokojowej, aż komórki zostaną zaokrąglone i rozdzielone. Obserwuj złuszczanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
    3. Dodaj równą objętość świeżo opracowanej formuły D10, aby zakończyć trawienie trypsyny. Przepłukać dolną powierzchnię kolby do hodowli komórkowych za pomocą pistoletu do pipetowania, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.
    4. Przenieść zawiesinę komórek B16F10-GP do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 163 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić komórki w 1-2 ml D10 w celu wytrącenia. Przenieść zawiesinę komórek B16F10-GP do nowego naczynia do hodowli komórkowych lub kolby zawierającej 8-10 ml D10, a następnie inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
  2. W dniu implantacji guza należy pobrać komórki B16F10-GP o gęstości około 90%, jak opisano w krokach 2.1.1 do 2.1.4. Po odwirowaniu odessać supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
  3. Policz żywe komórki za pomocą 0,4% hemocytometru błękitu trypanowego. Dodać PBS, aby rozcieńczyć komórkę do 5 x 105 komórek na 100 μl. Umieść komórki na lodzie do czasu użycia.

3. Ektopowa inokulacja komórek B16F10-GP w obustronnym obszarze pachwinowym myszy

  1. Odessać 100 μl przygotowanej zawiesiny komórek B16F10-GP za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Przesuń ściankę rurki, aby przesunąć bąbelki do góry i popchnij tłok, aby wysunąć górną bańkę.
  2. Trzymaj mysz w pozycji leżącej, odsłaniając jej brzuch. Naciśnij palcem prawą tylną kończynę myszy w pozycji leżącej, tak aby skóra w prawej okolicy pachwinowej była całkowicie odsłonięta (to samo z lewą okolicą pachwinową).
  3. Usuń sierść na brzuchu kremem do depilacji, a następnie oczyść obustronny obszar brzucha bawełną zawierającą 75% etanolu.
  4. Przed wkłuciem igły upewnij się, że skóra w okolicy pachwinowej jest napięta. Wprowadzić igłę pod kątem 45° w przestrzeń podskórną w okolicy pachwinowej górnej części uda. Upewnij się, że igła jest ścięta do góry, a głębokość igły wynosi 0,5-1 cm.
  5. Przed wstrzyknięciem należy zastosować delikatne odsysanie, jeśli nie ma krwi, wstrzyknąć powoli wstrzykiwane komórki do tkanki podskórnej. W tym samym czasie obserwuj mały bolus (tworzenie się kieszeni płynowej) w okolicy podskórnej.
  6. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę, umieścić ją w pojemniku na ostre przedmioty i umieścić mysz z powrotem w klatce.

4. Adoptywny transfer limfocytów T P14 do myszy z nowotworem

  1. Wykonaj transfer adoptywny u myszy z guzem 6-8 dni po implantacji guza, gdy guzy są wyczuwalne palpacyjnie (około 3-5 mm średnicy). Dootrzewnowo wstrzyknąć 4 mg cyklofosfamidu dzień przed transferem28,29,30.
    UWAGA: Celem wstrzyknięcia CTX jest stworzenie przestrzeni w przedziale limfatycznym dla adoptywnie przenoszonych limfocytów T poprzez przejściowe eliminowanie proliferujących limfocytów.
  2. Wyizoluj limfocyty ze śledziony i LN naiwnych myszy transgenicznych P14, jak opisano poniżej31,32 (6-10 tygodni, tej samej płci co myszy z guzem, aby uniknąć problemów z odrzuceniem).
    UWAGA: Wykonaj następujące procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić ściśle sterylne warunki.
    1. Przygotuj dwie 6-centymetrowe szalki i dodaj 3 ml pożywki R2 do jednej z naczyń i 3 ml buforu RBL do drugiej potrawy. Umieścić filtr komórkowy o wielkości 70 μm na szalce Petriego zawierającej bufor RBL.
    2. Eutanazja myszy P14 w hermetycznych pojemnikach zawierających izofluran, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Dostosuj liczbę myszy P14 do liczby myszy biorców.
    3. Zbierz śledzionę, pachwinowe i pachowe węzły chłonne od myszy poddanych eutanazji i przenieś je na 6-centymetrowe szalki zawierające 4 ml pożywki R2 i umieść na lodzie.
    4. Umieść śledzionę w sitku nasączonym 3 ml buforu RBL, zmiel śledzionę za pomocą puttera wewnątrz strzykawki o pojemności 1 ml. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, a następnie zakończyć reakcję 3 ml zimnego podłoża R2.
    5. Zmiel LN za pomocą miotacza wewnątrz strzykawki o pojemności 1 ml, aż w sitku z filtrem komórkowym 70 μm pozostanie tylko tkanka łączna. Przepłukać filtr zimnym podłożem R2 i przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować próbki o masie 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml PBS. Użyj filtra komórkowego o wielkości 70 μm, aby usunąć kłaczki z zawiesiny komórek.
    7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić komórki w 3 ml PBS i umieścić probówkę na lodzie. Weź małą próbkę, wymieszaj z błękitem trypanowym i policz komórki za pomocą płytki do liczenia krwinek.
  3. Określ procent komórek P14 (żywych/martwych-CD45.1 + CD8 + Vα2 +) za pomocą cytometrii przepływowej. Upewnij się, że przeniesione komórki dawcy wykazują wyraźny marker kongeniczny u myszy biorców (myszy z nowotworem B6 to CD45.2 +). Wykonaj barwienie przed transferem, aby zweryfikować prawidłowy fenotyp przenoszonych komórek.
    1. Dodać 5 x 104-1 x 105 komórek do 1,5 ml probówki wirówkowej zawierającej 1 ml buforu FACS. Odwirować zawiesinę komórkową przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min.
    2. Wyrzucić supernatant, strzepnąć dno probówki, aby rozproszyć komórki, i umieścić probówkę na lodzie.
    3. Przygotować następującą mieszaninę sprzężonych przeciwciał9,32 rozcieńczoną w 100 μl buforu FACS: anty-CD8, 1:200; anty-TCR Vα2, 1:100; anty-CD45.1, 1:200; Żywa/martwa plama, 1:400. (Tabela materiałów).
    4. Odwirować mieszaninę przeciwciał przy 15 000 x g przez 3 minuty w celu agregacji cząstek. Umieść miksturę na lodzie i osłoń ją przed światłem, zawijając w folię. Weź tylko supernatant, aby uniknąć aspiracji cząstek.
    5. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszaniny przeciwciał i dokładnie wymieszać, przesuwając ściankę probówki. Po zawinięciu w folię aluminiową inkubować probówkę przez 30 minut na lodzie.
    6. Umyj komórki 2x buforem FACS. Odwirować probówkę o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS i przenieść zawiesinę komórek do rurki przepływowej.
    7. Uruchom rurkę przepływową z barwionymi komórkami na cytometrze przepływowym, aby określić procent żywych/martwych komórek CD45.1+CD8+Vα2+.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ponad 90% limfocytów T CD8 + od transgenicznych myszy P14 zawierało Vα2 + TCR, które są specyficzne dla epitopu H-2Db GP33-41 LCMV (wirus limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych).
  4. Oblicz bezwzględną liczbę żywych/martwych komórek CD45.1+CD8+Vα2+, mnożąc ich wartość procentową i liczbę żywych komórek uzyskaną w krokach 4.2 i 4.3.
  5. Odessać 200 μl zawiesiny komórek P14 (5 x 105 komórek) za pomocą strzykawki insulinowej 100 j. i usunąć pęcherzyki. Początkowa liczba przeniesionych naiwnych komórek P14 (5 x 103 - 5 x 105) nie wpłynęła na fenotyp przeniesionych komórek9.
  6. Umieść myszy w klatce i ogrzej lampą podczerwoną przez 5-10 minut, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Przytrzymaj w miejscu za pomocą odpowiedniej wielkości utrwalacza dla myszy, wyprostuj ogon i przetrzyj go wacikiem zawierającym 75% etanolu, aby żyły były widoczne.
  7. Wprowadzić igłę równolegle do żyły ogonowej i delikatnie odciągnąć tłok. Jeśli do strzykawki napływa krew, powoli wepchnij zawiesinę komórkową do żyły.
    UWAGA: Jeśli podczas wstrzykiwania występuje opór lub obrzęk ogona, należy wyregulować pozycję wtrysku. Miejsce wstrzyknięcia powinno zaczynać się od dystalnego końca.
  8. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy szybko wyciągnąć igłę i delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem. Umieść mysz z powrotem w nowej, czystej klatce i uważnie obserwuj ją przez kilka minut pod kątem jakichkolwiek niepożądanych skutków.

5. Resekcja guza pierwotnego

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed użyciem. Wysterylizuj obszar operacyjny wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego 75% etanolem, a następnie naświetlaj promieniami UV przez co najmniej 30 minut. Podczas operacji noś czyste fartuchy, czapki, maski i sterylne rękawiczki.

  1. Gdy guz jest wyczuwalny palpacyjnie (około 5 mm średnicy), należy wyciąć guz pierwotny.
  2. Znieczulić myszy dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg). Ściśnij podkładkę pod stopę, aby ocenić stopień znieczulenia, jeśli nie ma odruchu bólowego, wskazuje to właściwy czas na operację. Jeśli kończyny tylne zostały wycofane, należy podać kolejną dawkę 10-30 μL.
    UWAGA: Alternatywnie, medetomidyna podawana dootrzewnowo (1 mg/kg masy ciała; Domitor) zaleca się znieczulanie myszy.
  3. Nałóż maść zapobiegającą wysuszaniu na oczy myszy. Usuń sierść na brzuchu za pomocą kremu do depilacji, aby w pełni odsłonić pole operacyjne.
  4. Umieść mysz w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść ją na anatomicznej tablicy pokrytej czystym papierem chłonnym w pozycji leżącej na plecach, tak aby oś podłużna myszy była równoległa do eksperymentatora.
    UWAGA: Aby utrzymać ścisłe sterylne środowisko, w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy wykonać następujące procedury.
  5. Zdezynfekuj brzuch myszy wacikiem nasączonym jodonem powidonu. Naciąć skórę w pobliżu miejsca, w którym znajduje się guz, sterylnym skalpelem lub nożyczkami okulistycznymi. Włóż zamkniętą końcówkę nożyczek do nacięcia, aby wyraźnie odsłonić guz. Podczas nacinania skóry należy uważać, aby nie uszkodzić pachwinowych węzłów chłonnych.
  6. Podczas usuwania guza utrzymuj kapsułkę w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Ostrożnie i delikatnie usuń tkankę łączną przylegającą do guza sterylnymi nożyczkami. Całkowicie usuń guz in situ, w przeciwnym razie może on nawrócić.

6. Dowęzłowe wstrzyknięcie komórek B16F10-GP do pachwinowego węzła chłonnego

UWAGA: Po obustronnym usunięciu guza, komórki B16F10-GP zostały wstrzyknięte do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego, a PBS został wstrzyknięty na drugą stronę.

  1. Odessać 20 μl (5 x 104 komórki) zawiesiny komórek B16F10-GP za pomocą strzykawki insulinowej 100 j., usunąć pęcherzyki, a następnie wstrzyknąć do jednego pachwinowego węzła chłonnego. Wstrzyknąć równą objętość PBS do pachwinowego węzła chłonnego po drugiej stronie.
    1. Podczas wstrzyknięcia należy wprowadzić igłę od dystalnego końca węzła chłonnego, a następnie powoli wprowadzić igłę do środka węzła chłonnego. W tym czasie, jeśli płyn zostanie dokładnie wstrzyknięty do węzła chłonnego, można zauważyć, że węzeł chłonny znacznie puchnie.
      UWAGA: Gdy igła jest wprowadzana od dystalnego końca węzła chłonnego, należy uważać, aby nie przebić węzła.
  2. Zszyj nacięcie za pomocą 2-3 szwów za pomocą szwu 3-0. Zdezynfekuj skórę otaczającą ranę bawełną nasączoną jodonem powidonu. Zadbaj o ominięcie węzłów chłonnych podczas szycia.
  3. Umieść mysz w czystej klatce i utrzymuj ją w cieple za pomocą światła podczerwonego w bocznej pozycji odleżynowa. Monitoruj w sposób ciągły, aż do odzyskania przytomności. Upewnij się, że myszy, które przeszły operację, nie zostaną zwrócone do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
  4. Buprenorfinę należy podawać co 4-6 godzin przez 3 kolejne dni po operacji w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego (w dawce 0,1-0,5 mg/kg, SQ lub IP). Monitoruj obszary karmienia, picia, ruchu i aktywności myszy. Zazwyczaj myszy wracają do zdrowia po urazie chirurgicznym w ciągu 3 dni.
    UWAGA: Jeśli myszy nie są w stanie wznowić normalnego karmienia i czynności oraz wykazują jakiekolwiek oznaki infekcji, skonsultuj się z weterynarzem w celu interwencji lub poddaj je eutanazji.
  5. Ofiaruj myszy w różnych punktach czasowych: dzień 8 i dzień 18 po dowęzłowym wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Odzyskaj aktywowane komórki dawcy za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat ideowy tego eksperymentalnego projektu jest pokazany w Rysunek 1A. W sumie 5 x 105 komórek B16F10-GP w 100 μl PBS wszczepiono podskórnie (s.c.) do obustronnego regionu pachwinowego myszy CD45.2 C57BL / 6J. Po 7 dniach tym myszom z guzem wstrzyknięto dootrzewnowo (i.p.) 4 mg CTX, a następnie adoptywnie przeniesiono 5 x 105 komórek CD45.1 + P14 przez dożylne wstrzyknięcie ogona (IV). Gdy guzy urosły do około 3-5 mm średnicy (około 7 dni po przeniesieniu komórek P14), guzy pierwotne wycięto, a 5 x 104 komórek B16F10-GP w 20 μl PBS wstrzyknięto bezpośrednio do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego. Do pachwinowego węzła chłonnego po drugiej stronie wstrzyknięto równe objętości PBS. Reprezentatywne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E, 100x) nieprzerzutowego węzła chłonnego (nLN) i przerzutowego węzła chłonnego (mLN) we wskazanych punktach czasowych pokazano w Rysunek 1B. Struktura nLN pozostała nienaruszona. We wczesnym stadium przerzutów LN (D8) mLN był częściowo zajęty przez komórki nowotworowe (strzałka) i nadal pozostaje pewien obszar z limfocytami, które nie zostały zaatakowane przez komórki nowotworowe (czerwona strzałka). Natomiast w późnym stadium przerzutów LN (D18), mLN jest wypełniony komórkami nowotworowymi, którym towarzyszy angiogeneza guza i małe limfocyty. Aktywowane komórki P14 odzyskane w TdLN wytworzyły wysoki poziom IFN-γ po stymulacji peptydem GP33-419,31. Tutaj procenty aktywowanych komórek P14 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w różnych punktach czasowych, a strategia bramkowania jest pokazana na Rysunek 2. Częstość występowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + we krwi obwodowej we wczesnym stadium (D8) i późnym etapie (D18) wynosi odpowiednio 2,81% i 1,48% (Figura 3A). Doniesiono, że specyficzne dla nowotworu limfocyty T CD8 + ściśle rezydują w dLN podczas nowotworzenia, a niedrenujące LN odzyskały ograniczone komórki dawcy33. Odsetek komórek P14 specyficznych dla antygenu w nLN był stabilny podczas przerzutów LN. Co ciekawe, specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 + w mLN były przejściowo wzmocnione na wczesnym etapie, o czym świadczy wyższa częstotliwość komórek P14 w porównaniu z nLN, podczas gdy gwałtownie spadła w późnym stadium (Figura 3B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ideowy projektu eksperymentalnego. (A) Myszom C57BL / 6J (CD45.2 +) wszczepia się 5 x 105 komórek nowotworowych B16F10-GP w obustronnej okolicy pachwinowej. Po 7 dniach myszom tym wstrzykuje się dootrzewnowo 4 mg CTX, a następnie następnego dnia następuje adoptywny transfer różnych genetycznie oznaczonych (CD45.1 +) komórek P14. Gdy guzy rosną do około 3-5 mm średnicy (około 7 dni po przeniesieniu komórek P14), guzy pierwotne są wycinane, a następnie 5 x 104 komórek B16F10-GP w 20 μl PBS jest bezpośrednio wstrzykiwane do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego, a pachwinowy węzeł chłonny po drugiej stronie jest wstrzykiwany z równymi objętościami PBS. (B) Reprezentatywne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E,100x) LNs. Skróty: s.c. = podskórnie; CTX = cyklofosfamid; i.v. = dożylnie; Sac = ofiara; nLN = LN bez przerzutów; mLN = przerzutowy LN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania stosowana do identyfikacji aktywowanych limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu pochodzących od dawcy. Skróty: L/D = żywy/martwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Dynamika limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN. Proporcja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu w (A) krwi obwodowej, (B) nLN i mLN w różnych punktach czasowych. Skróty: nLN = LN bez przerzutów; mLN = przerzutowy LN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas nowotworzenia komórki prezentujące antygen (APC) pochłaniają antygeny nowotworowe i migrują do TdLN, gdzie przygotowują limfocyty T CD8 +. Po zapoczątkowaniu i aktywacji limfocyty T CD8 + opuszczają TdLN i infiltrują guz, aby zabić komórki nowotworowe10. Poprzez resekcję TdLN i podanie FTY720, które blokują wyjście komórek odpornościowych z narządów limfatycznych, kilka badań wykazało kluczową rolę TdLN w zapewnieniu skuteczności terapii punktów kontrolnych PD-1 / PD-L134,35. W związku z tym niedawno odkryliśmy, że specyficzne dla nowotworu limfocyty T pamięci CD8 + (TTSM) znajdują się głównie w TdLN, te komórki TdLN-TTSM służą jako bona fide odpowiedzi na ICB9. Niestety, kilka typów komórek nowotworowych często rozprzestrzenia się do TdLN z pierwotnych miejsc guza, co prowadzi do strukturalnego potwierdzenia i dysfunkcji komórek odpornościowych w TdLN. Upośledzona ilość i jakość limfocytów T CD8 + w mLN została już opisana20,36. Jednak dynamiczne zmiany limfocytów T CD8 +, zwłaszcza limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu nowotworowego podczas kaskady przerzutów LN, nie zostały wyjaśnione.

W tym przypadku opracowaliśmy wygodny model mysi do monitorowania dynamiki układowych i miejscowych limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas procesu przerzutów LN. Komórki czerniaka B16F10-GP wszczepiono podskórnie do obustronnego regionu pachwinowego, a następnie adoptywnie przeniesiono z komórkami P14, które mogły być specyficznie aktywowane przez peptyd GP33-41 pochodzący z GP. W 7 dniu po transferze komórek, kiedy komórki P14 w pachwinowych LN były w pełni aktywowane, pierwotne guzy po obu stronach zostały wycięte, a komórki B16F10-GP zostały bezpośrednio wstrzyknięte do jednostronnego pachwinowego LN, pozorowaną operację po drugiej stronie przeprowadzono poprzez wstrzyknięcie z równymi objętościami PBS. Ta genialna konstrukcja umożliwia porównanie komórek P14 w mLN i LN bez przerzutów (nLN) u tych samych myszy. Jednocześnie komórki P14 we krwi obwodowej u tych samych myszy wykryto w różnych punktach czasowych podczas przerzutów LN poprzez krwawienie z żyły oczodołowej. Oprócz częstości komórek P14 we krwi obwodowej i TdLN na różnych etapach podczas przerzutów LN, właściwości transkrypcyjne i epigenetyczne tych specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + można dalej badać za pomocą innych technik.

Należy pamiętać, że należy wykonać kilka kroków ostrożnie. Po pierwsze, pierwotne guzy powinny zostać dokładnie wycięte, ponieważ pozostałe komórki nowotworowe szybko by odrosły. Po drugie, operacja powinna być wykonana delikatnie, ponieważ tkanki nowotworowe zawierają wiele nowych naczyń krwionośnych, które zwykle nieuchronnie ulegają przerwaniu podczas pierwotnej resekcji guza i prowadzą do śmierci myszy chirurgicznych z powodu masywnego krwotoku. Dlatego czas resekcji guza pierwotnego jest niezwykle ważny. Ogólnie rzecz biorąc, usunięcie go jest stosunkowo bezpieczne, gdy guz urośnie do rozmiarów około 5 x 5 mm, a komórki nowotworowe powinny być precyzyjnie wstrzykiwane do LN, a nie do dna lub sąsiednich tkanek. Ponadto objętość zawiesin komórek nowotworowych powinna być kontrolowana poniżej 20 μl, w przeciwnym razie wyciek utworzy nowy guz poza LN. Wreszcie, ograniczeniem tego protokołu jest to, że operacja jest traumatyczna, a myszy mogą doświadczyć infekcji podczas procesu gojenia, co wpłynęłoby na właściwości limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu. Dlatego niezwykle ważne jest zachowanie ścisłej aseptyki podczas operacji, a pozorowane wstrzyknięcie PBS powinno być wykonane, aby wykluczyć wpływ fizycznego uszkodzenia komórek T CD8 + specyficznego dla antygenu przez wstrzyknięcie.

Ogólnie rzecz biorąc, zapewniamy wygodny model do badania limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN, a interakcje między limfocytami T CD8 + specyficznymi dla antygenu a innymi komórkami odpornościowymi lub komórkami zrębu podczas przerzutów LN mogą być również wyjaśnione. Ponadto można go łatwo rozszerzyć na kilka innych modeli nowotworów. Reasumując, protokół ten stanowi użyteczny model reprodukcyjny do badania immunologii nowotworów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr 82122028 do LX), National Natural Science Foundation of China (nr 82173094 do LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr 2023NSCQ-BHX0087 do SW).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka wirówkowa 1,5 mlKIRGENKG2211
100 U strzykawka insulinowaBD Biosciences 320310
Rurka stożkowa 15 ml BÓBR 43008
2,2,2-tribromoetanol (Avertin) Sigma T48402-25G 
2-metylo-2-butanolSigma240486-100ML 
70 μ m nylonowy sitkokomórkowe BD Falcon 352350
Układ anty-mysi APC CD45.1 Legenda biologiczna 110714Klon:A20 
Linia komórkowa B16-GPBeijing Biocytogen Co.Ltd, ChinyNiestandardowe
BSA-V (albumina surowicy bydlęcej) Biossbs-0292P
naczynie do hodowli komórkowychBÓBR 43701/43702/43703 
wirówkaEppendorf5810R-A462/5424R 
cyklofosfamidSigma C0768-25G 
Cyklofosfamid (CTX)SigmaPHR1404
 Gibco C11995500BT 
EDTASigmaEDS-500g 
Rurki FACSBD Falcon352052
płodowa surowica bydlęca Gibco10270-106
Hemocytometr BDFACSCanto II
PorLab ScientificHM330
izofluranRWD nauki przyrodnicze Przekaźnik R510-22-16 
KHCO3 Sangon Biotechnologia A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nm Technologie życiowe L10199 
nośnik igieł RWD Nauki przyrodnicze F31034-14 
NH4Cl Sangon BiotechA501569-0500 
paraformaldehydBeyotimeP0099-500ml 
PE przeciw myszom TCR Vα 2Klon BioLegend127808:B20.1 
Pióro Strep Glutamina (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 anty-mysz CD8a BioLegend100734Clone: 53-6,7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
azydek soduSigmaS2002 
kleszcze chirurgiczneRWD Life Science F12005-10
nożyczki chirurgiczneRWD Life Science S12003-09 
nić do szyciaRWD Life ScienceF34004-30 
trypsyna-EDTASigmaT4049-100ml
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy DulbeccoCytometr przepływowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616(2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551(2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182(2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867(2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442(2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507(2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575(2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node MetastasisAntigen Specific CD8 T CellsTumor Draining Lymph NodeAdoptive TransferB16F10 GP MelanomaTumor ResectionImmune Checkpoint BlockadeMemory T CellsTumorigenesis ModelTumor Angiogenesis

Related Articles