Model przerzutów do węzłów chłonnych drenujących do oceny dynamiki limfocytów T ^CD8+ specyficznych dla antygenu podczas nowotworzenia

Immunoterapia nowotworów, a zwłaszcza blokada immunologicznego punktu kontrolnego (ICB), zrewolucjonizowała terapię nowotworów¹. ICB blokuje immunoreceptory kohamitujące (takie jak PD-1, Tim-3, LAG-3 i TIGIT), które są silnie eksprymowane w wyczerpanych limfocytach T CD8 ⁺ w mikrośrodowisku guza (TME), prowadząc do ożywienia wyczerpanych limfocytów T CD8 ^{+ 2}. Biorąc pod uwagę niejednorodność wyczerpanych limfocytów T CD8 ⁺, gromadzące się dowody wykazały, że specyficzne dla nowotworu limfocyty T CD8 ⁺ pochodzące z obwodu, w tym z drenującego węzła chłonnego (dLN), ale nie w TME, pośredniczą w skuteczności ICB^3,4,5,6,7,8. Niedawno potwierdzono, że komórki T pamięci CD8 ⁺ specyficzne dla nowotworu TCF-1 ⁺ TOX (TdLN-T_TSM) pochodzące z TdLN są prawdziwymi odpowiedziami na ICB, które ucieleśniają kilka funkcjonalnych właściwości konwencjonalnych komórek T pamięci i mogą dalej się rozszerzać i różnicować w wyczerpane komórki potomne po leczeniu ICB⁹. Podsumowując, odkrycia te potwierdziły znaczenie LN w budowaniu odporności przeciwnowotworowej.

Węzeł chłonny pełni funkcję krytycznego miejsca ułatwiającego przygotowanie i aktywację specyficznych dla nowotworu limfocytów T CD8⁺, dostarczając podstawy strukturalnej, jak również sygnałów biologicznych¹⁰. Kilka typów komórek nowotworowych często wysiewa wartowniczy węzeł chłonny (SLN, pierwszy LN drenujący guz pierwotny) przed systematycznym rozpowszechnieniem¹¹. Obecność przerzutów SLN wiąże się ze słabymi wynikami w leczeniu nowotworów u ludzi, a modele przedkliniczne wykazały, że komórki nowotworowe w TdLN mogą rozprzestrzeniać się do odległych narządów zarówno przez naczynia limfatyczne, jak i naczynia krwionośne węzła^12,13,14,15. Biopsja SLN stanowi obecnie standardową procedurę kierowania późniejszymi decyzjami dotyczącymi leczenia wielu typów guzów litych, co pozwala uniknąć niepotrzebnej resekcji niezaangażowanej LN^16,17. Nawet dla zaangażowanego LN pozostaje kwestią sporną, czy i kiedy potrzebna jest resekcja chirurgiczna, ponieważ kilka badań wykazało, że usunięcie regionalnego LN nie wykazało poprawy całkowitego przeżycia w porównaniu z osobami, które otrzymały radioterapię lub terapię ogólnoustrojową bez regionalnej resekcji LN^18,19. Jedna z interpretacji mówi, że przerzutowy LN (mLN) z chorobą mikroskopową może zachować pewną zdolność do edukacji komórek odpornościowych i zapewniać pewne korzyści terapeutyczne. Dlatego niezwykle ważne jest wyjaśnienie, w jaki sposób przerzuty LN wpływają na przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, a zwłaszcza na właściwości i funkcje TdLN-T_TSM.

Do tej pory zarówno dane przedkliniczne, jak i kliniczne wykazały pewne zmiany strukturalne i komórkowe w mLN²⁰. Nie określono jednak dynamicznych zmian limfocytów T CD8 ⁺ specyficznych dla nowotworu podczas przerzutów LN. W związku z tym do dalszych badań konieczne jest opracowanie przekonującego modelu przerzutów LN. Rzeczywiście, kilka badań opisało modele myszy mLN na różne sposoby^14,21,22. Na przykład, spontaniczne przerzuty w pachowych LN przeprowadzono poprzez implantację komórek raka piersi 4T1 do poduszeczki tłuszczowej sutka²². W innym badaniu Reticker-Flynn i in. wygenerowali linie komórkowe czerniaka o wysokiej częstości rozprzestrzeniania się z podskórnego guza pierwotnego do LN poprzez seryjną inokulację komórek nowotworowych hodowanych ze zdysocjowanych tkanek mLN (dziewięć rund)¹⁴. Inny powszechnie stosowany model został przygotowany przez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do opuszki stopy, a przerzutowe loci zostałyby utworzone w podkolanowym LN²². Warto zauważyć, że trudno jest ocenić dokładne punkty czasowe interwencji, ponieważ przerzuty LN w tych modelach nie zawsze są wierne.

W obecnym badaniu, mysi model przerzutowy LN został stworzony poprzez dowęzłowe wstrzyknięcie komórek B16F10-GP^23,24, wygenerowany przez insercję genu glikoproteiny (GP) wirusa LCMV za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do genomu linii komórkowej B16F10⁹. Następnie myszy te przeniesiono z komórkami P14, które zawierają transgeniczne receptory limfocytów T (TCR), które specyficznie rozpoznają epitop H-2D^b GP_33-41 ^25,26 i można było zbadać ogólnoustrojową i lokalną dynamikę limfocytów T CD8 ⁺ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN. Nasz projekt eksperymentalny zapewnia użyteczny model do badania odpowiedzi immunologicznych, zwłaszcza limfocytów T CD8 ⁺ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN, co wyklucza zaburzenia limfocytów T CD8 ⁺ osób postronnych. Wyniki te wpłynęłyby na kliniczne możliwości leczenia, czy usunąć lub zachować mLN i rzuciłyby nowe światło na manipulację mLN w celu osiągnięcia maksymalnych korzyści terapeutycznych.

Myszy C57BL/6J (określane jako myszy B6) i naiwne myszy transgeniczne P14^9,27 były w wieku 6-10 tygodni i ważyły 18-22 g. Zarówno mężczyzna, jak i kobieta zostali włączeni bez randomizacji lub zaślepienia. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania Uniwersytetu Rolniczego w Qingdao.

1. Przygotowanie pożywki i odczynników

1. Przygotować pożywkę do hodowli komórek czerniaka B16F10-GP o nazwie D10 (kompletna pożywka DMEM) poprzez dodanie DMEM, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy z dodatkowymi 100 U/ml puromycyny. Utrzymuj sterylną D10 i przechowuj do 2 tygodni w temperaturze 2-4 °C.
2. Przygotuj pożywkę R2 (do zakończenia lizy czerwonych krwinek), dodając RPMI-1640 z 2% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy.
3. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), dodając 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) z 2% FBS i 0,01% azydku sodu. Dodatek azydku sodu może wydłużyć czas przechowywania buforu FACS, który może być przechowywany miesiącami w temperaturze 2-4 ° C.
4. Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek (RBL), dodając 155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ i 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do podwójnie destylowanej wody i dostosować jego pH do 7,3. Przechowuj bufor RBL w temperaturze pokojowej (RT) i pozostaje stabilny do 3 miesięcy.
5. Przygotować środek znieczulający, 2,2,2-tribromoetanol, jak opisano poniżej.
   1. Odważyć odpowiednią ilość kryształu 2,2,2-tribromoetanolu w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową. Dodać odpowiednią ilość 2-metylo-2-butanolu do kryształu, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 500 mg/ml.
   2. Zamieszaj go, aby wymieszać i ogrzać probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż kryształ się rozpuści. Upewnij się, że wszystkie kryształy są rozpuszczone.
   3. Dokładnie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór podstawowy z filtrem 0,22 μm do sterylnego pojemnika. Przechowywać roztwór podstawowy zamrożony, osłonięty przed światłem, w temperaturze -20 °C lub rozcieńczony PBS w roztworze roboczym o stężeniu 12,5 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Najlepiej jest stosować przepisane stężenie, ponieważ wyższe stężenia płynu są drażniące.

2. Przygotowanie zawiesiny komórek B16F10-GP

1. Rozmrozić i wyhodować fiolkę zawierającą 1 x 10⁶ komórek B16F10-GP z 5 ml D10 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Subkulturuj komórki, gdy osiągną gęstość od 80% do 90%, jak opisano poniżej.
   1. Oryginalną pożywkę hodowlaną należy odrzucić przez aspirację za pomocą pistoletu do pipetowania i przemyć komórki 2x PBS. Podczas czyszczenia przylegających komórek za pomocą PBS w naczyniu do hodowli komórkowych, przesuń PBS na boczną ściankę lub wrzuć go do naczynia.
   2. Po aspiracji PBS dodać 0,5-1 ml 0,25% roztworu trypsyny EDTA do naczynia lub kolby do hodowli komórkowej. Delikatnie wstrząśnij, aby pokryć całą powierzchnię komórki. Umieścić naczynie lub kolbę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C na około 1 minutę lub w temperaturze pokojowej, aż komórki zostaną zaokrąglone i rozdzielone. Obserwuj złuszczanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu.
   3. Dodaj równą objętość świeżo opracowanej formuły D10, aby zakończyć trawienie trypsyny. Przepłukać dolną powierzchnię kolby do hodowli komórkowych za pomocą pistoletu do pipetowania, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały oddzielone.
   4. Przenieść zawiesinę komórek B16F10-GP do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 163 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
   5. Odessać supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić komórki w 1-2 ml D10 w celu wytrącenia. Przenieść zawiesinę komórek B16F10-GP do nowego naczynia do hodowli komórkowych lub kolby zawierającej 8-10 ml D10, a następnie inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
2. W dniu implantacji guza należy pobrać komórki B16F10-GP o gęstości około 90%, jak opisano w krokach 2.1.1 do 2.1.4. Po odwirowaniu odessać supernatant i wyrzucić. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS.
3. Policz żywe komórki za pomocą 0,4% hemocytometru błękitu trypanowego. Dodać PBS, aby rozcieńczyć komórkę do 5 x 10⁵ komórek na 100 μl. Umieść komórki na lodzie do czasu użycia.

3. Ektopowa inokulacja komórek B16F10-GP w obustronnym obszarze pachwinowym myszy

1. Odessać 100 μl przygotowanej zawiesiny komórek B16F10-GP za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Przesuń ściankę rurki, aby przesunąć bąbelki do góry i popchnij tłok, aby wysunąć górną bańkę.
2. Trzymaj mysz w pozycji leżącej, odsłaniając jej brzuch. Naciśnij palcem prawą tylną kończynę myszy w pozycji leżącej, tak aby skóra w prawej okolicy pachwinowej była całkowicie odsłonięta (to samo z lewą okolicą pachwinową).
3. Usuń sierść na brzuchu kremem do depilacji, a następnie oczyść obustronny obszar brzucha bawełną zawierającą 75% etanolu.
4. Przed wkłuciem igły upewnij się, że skóra w okolicy pachwinowej jest napięta. Wprowadzić igłę pod kątem 45° w przestrzeń podskórną w okolicy pachwinowej górnej części uda. Upewnij się, że igła jest ścięta do góry, a głębokość igły wynosi 0,5-1 cm.
5. Przed wstrzyknięciem należy zastosować delikatne odsysanie, jeśli nie ma krwi, wstrzyknąć powoli wstrzykiwane komórki do tkanki podskórnej. W tym samym czasie obserwuj mały bolus (tworzenie się kieszeni płynowej) w okolicy podskórnej.
6. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę, umieścić ją w pojemniku na ostre przedmioty i umieścić mysz z powrotem w klatce.

4. Adoptywny transfer limfocytów T P14 do myszy z nowotworem

1. Wykonaj transfer adoptywny u myszy z guzem 6-8 dni po implantacji guza, gdy guzy są wyczuwalne palpacyjnie (około 3-5 mm średnicy). Dootrzewnowo wstrzyknąć 4 mg cyklofosfamidu dzień przed transferem^28,29,30.
   UWAGA: Celem wstrzyknięcia CTX jest stworzenie przestrzeni w przedziale limfatycznym dla adoptywnie przenoszonych limfocytów T poprzez przejściowe eliminowanie proliferujących limfocytów.
2. Wyizoluj limfocyty ze śledziony i LN naiwnych myszy transgenicznych P14, jak opisano poniżej^31,32 (6-10 tygodni, tej samej płci co myszy z guzem, aby uniknąć problemów z odrzuceniem).
   UWAGA: Wykonaj następujące procedury w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić ściśle sterylne warunki.
   1. Przygotuj dwie 6-centymetrowe szalki i dodaj 3 ml pożywki R2 do jednej z naczyń i 3 ml buforu RBL do drugiej potrawy. Umieścić filtr komórkowy o wielkości 70 μm na szalce Petriego zawierającej bufor RBL.
   2. Eutanazja myszy P14 w hermetycznych pojemnikach zawierających izofluran, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Dostosuj liczbę myszy P14 do liczby myszy biorców.
   3. Zbierz śledzionę, pachwinowe i pachowe węzły chłonne od myszy poddanych eutanazji i przenieś je na 6-centymetrowe szalki zawierające 4 ml pożywki R2 i umieść na lodzie.
   4. Umieść śledzionę w sitku nasączonym 3 ml buforu RBL, zmiel śledzionę za pomocą puttera wewnątrz strzykawki o pojemności 1 ml. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty, a następnie zakończyć reakcję 3 ml zimnego podłoża R2.
   5. Zmiel LN za pomocą miotacza wewnątrz strzykawki o pojemności 1 ml, aż w sitku z filtrem komórkowym 70 μm pozostanie tylko tkanka łączna. Przepłukać filtr zimnym podłożem R2 i przenieść zawiesinę komórek do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować próbki o masie 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 3 ml PBS. Użyj filtra komórkowego o wielkości 70 μm, aby usunąć kłaczki z zawiesiny komórek.
   7. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić komórki w 3 ml PBS i umieścić probówkę na lodzie. Weź małą próbkę, wymieszaj z błękitem trypanowym i policz komórki za pomocą płytki do liczenia krwinek.
3. Określ procent komórek P14 (żywych^{/martwych-CD45.1 +} CD8 ⁺ Vα2 ⁺) za pomocą cytometrii przepływowej. Upewnij się, że przeniesione komórki dawcy wykazują wyraźny marker kongeniczny u myszy biorców (myszy z nowotworem B6 to CD45.2 ⁺). Wykonaj barwienie przed transferem, aby zweryfikować prawidłowy fenotyp przenoszonych komórek.
   1. Dodać 5 x 10^4-1 x 10⁵ komórek do 1,5 ml probówki wirówkowej zawierającej 1 ml buforu FACS. Odwirować zawiesinę komórkową przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min.
   2. Wyrzucić supernatant, strzepnąć dno probówki, aby rozproszyć komórki, i umieścić probówkę na lodzie.
   3. Przygotować następującą mieszaninę sprzężonych przeciwciał^9,32 rozcieńczoną w 100 μl buforu FACS: anty-CD8, 1:200; anty-TCR Vα2, 1:100; anty-CD45.1, 1:200; Żywa/martwa plama, 1:400. (Tabela materiałów).
   4. Odwirować mieszaninę przeciwciał przy 15 000 x g przez 3 minuty w celu agregacji cząstek. Umieść miksturę na lodzie i osłoń ją przed światłem, zawijając w folię. Weź tylko supernatant, aby uniknąć aspiracji cząstek.
   5. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszaniny przeciwciał i dokładnie wymieszać, przesuwając ściankę probówki. Po zawinięciu w folię aluminiową inkubować probówkę przez 30 minut na lodzie.
   6. Umyj komórki 2x buforem FACS. Odwirować probówkę o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS i przenieść zawiesinę komórek do rurki przepływowej.
   7. Uruchom rurkę przepływową z barwionymi komórkami na cytometrze przepływowym, aby określić procent żywych/martwych komórek CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, ponad 90% limfocytów T CD8 ⁺ od transgenicznych myszy P14 zawierało Vα2 ⁺ TCR, które są specyficzne dla epitopu H-2D^b GP_33-41 LCMV (wirus limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych).
4. Oblicz bezwzględną liczbę żywych/martwych komórek CD45.1⁺CD8⁺Vα2⁺, mnożąc ich wartość procentową i liczbę żywych komórek uzyskaną w krokach 4.2 i 4.3.
5. Odessać 200 μl zawiesiny komórek P14 (5 x 10⁵ komórek) za pomocą strzykawki insulinowej 100 j. i usunąć pęcherzyki. Początkowa liczba przeniesionych naiwnych komórek P14 (5 x 10³ - 5 x 10⁵) nie wpłynęła na fenotyp przeniesionych komórek⁹.
6. Umieść myszy w klatce i ogrzej lampą podczerwoną przez 5-10 minut, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Przytrzymaj w miejscu za pomocą odpowiedniej wielkości utrwalacza dla myszy, wyprostuj ogon i przetrzyj go wacikiem zawierającym 75% etanolu, aby żyły były widoczne.
7. Wprowadzić igłę równolegle do żyły ogonowej i delikatnie odciągnąć tłok. Jeśli do strzykawki napływa krew, powoli wepchnij zawiesinę komórkową do żyły.
   UWAGA: Jeśli podczas wstrzykiwania występuje opór lub obrzęk ogona, należy wyregulować pozycję wtrysku. Miejsce wstrzyknięcia powinno zaczynać się od dystalnego końca.
8. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy szybko wyciągnąć igłę i delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem. Umieść mysz z powrotem w nowej, czystej klatce i uważnie obserwuj ją przez kilka minut pod kątem jakichkolwiek niepożądanych skutków.

5. Resekcja guza pierwotnego

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie przed użyciem. Wysterylizuj obszar operacyjny wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego 75% etanolem, a następnie naświetlaj promieniami UV przez co najmniej 30 minut. Podczas operacji noś czyste fartuchy, czapki, maski i sterylne rękawiczki.

1. Gdy guz jest wyczuwalny palpacyjnie (około 5 mm średnicy), należy wyciąć guz pierwotny.
2. Znieczulić myszy dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg). Ściśnij podkładkę pod stopę, aby ocenić stopień znieczulenia, jeśli nie ma odruchu bólowego, wskazuje to właściwy czas na operację. Jeśli kończyny tylne zostały wycofane, należy podać kolejną dawkę 10-30 μL.
   UWAGA: Alternatywnie, medetomidyna podawana dootrzewnowo (1 mg/kg masy ciała; Domitor) zaleca się znieczulanie myszy.
3. Nałóż maść zapobiegającą wysuszaniu na oczy myszy. Usuń sierść na brzuchu za pomocą kremu do depilacji, aby w pełni odsłonić pole operacyjne.
4. Umieść mysz w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść ją na anatomicznej tablicy pokrytej czystym papierem chłonnym w pozycji leżącej na plecach, tak aby oś podłużna myszy była równoległa do eksperymentatora.
   UWAGA: Aby utrzymać ścisłe sterylne środowisko, w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy wykonać następujące procedury.
5. Zdezynfekuj brzuch myszy wacikiem nasączonym jodonem powidonu. Naciąć skórę w pobliżu miejsca, w którym znajduje się guz, sterylnym skalpelem lub nożyczkami okulistycznymi. Włóż zamkniętą końcówkę nożyczek do nacięcia, aby wyraźnie odsłonić guz. Podczas nacinania skóry należy uważać, aby nie uszkodzić pachwinowych węzłów chłonnych.
6. Podczas usuwania guza utrzymuj kapsułkę w jak najbardziej nienaruszonym stanie. Ostrożnie i delikatnie usuń tkankę łączną przylegającą do guza sterylnymi nożyczkami. Całkowicie usuń guz in situ, w przeciwnym razie może on nawrócić.

6. Dowęzłowe wstrzyknięcie komórek B16F10-GP do pachwinowego węzła chłonnego

UWAGA: Po obustronnym usunięciu guza, komórki B16F10-GP zostały wstrzyknięte do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego, a PBS został wstrzyknięty na drugą stronę.

1. Odessać 20 μl (5 x 10⁴ komórki) zawiesiny komórek B16F10-GP za pomocą strzykawki insulinowej 100 j., usunąć pęcherzyki, a następnie wstrzyknąć do jednego pachwinowego węzła chłonnego. Wstrzyknąć równą objętość PBS do pachwinowego węzła chłonnego po drugiej stronie.
   1. Podczas wstrzyknięcia należy wprowadzić igłę od dystalnego końca węzła chłonnego, a następnie powoli wprowadzić igłę do środka węzła chłonnego. W tym czasie, jeśli płyn zostanie dokładnie wstrzyknięty do węzła chłonnego, można zauważyć, że węzeł chłonny znacznie puchnie.
      UWAGA: Gdy igła jest wprowadzana od dystalnego końca węzła chłonnego, należy uważać, aby nie przebić węzła.
2. Zszyj nacięcie za pomocą 2-3 szwów za pomocą szwu 3-0. Zdezynfekuj skórę otaczającą ranę bawełną nasączoną jodonem powidonu. Zadbaj o ominięcie węzłów chłonnych podczas szycia.
3. Umieść mysz w czystej klatce i utrzymuj ją w cieple za pomocą światła podczerwonego w bocznej pozycji odleżynowa. Monitoruj w sposób ciągły, aż do odzyskania przytomności. Upewnij się, że myszy, które przeszły operację, nie zostaną zwrócone do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
4. Buprenorfinę należy podawać co 4-6 godzin przez 3 kolejne dni po operacji w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego (w dawce 0,1-0,5 mg/kg, SQ lub IP). Monitoruj obszary karmienia, picia, ruchu i aktywności myszy. Zazwyczaj myszy wracają do zdrowia po urazie chirurgicznym w ciągu 3 dni.
   UWAGA: Jeśli myszy nie są w stanie wznowić normalnego karmienia i czynności oraz wykazują jakiekolwiek oznaki infekcji, skonsultuj się z weterynarzem w celu interwencji lub poddaj je eutanazji.
5. Ofiaruj myszy w różnych punktach czasowych: dzień 8 i dzień 18 po dowęzłowym wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Odzyskaj aktywowane komórki dawcy za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Schemat ideowy tego eksperymentalnego projektu jest pokazany w Rysunek 1A. W sumie 5 x 105 komórek B16F10-GP w 100 μl PBS wszczepiono podskórnie (s.c.) do obustronnego regionu pachwinowego myszy CD45.2 C57BL / 6J. Po 7 dniach tym myszom z guzem wstrzyknięto dootrzewnowo (i.p.) 4 mg CTX, a następnie adoptywnie przeniesiono 5 x 105 komórek CD45.1 + P14 przez dożylne wstrzyknięcie ogona (IV). Gdy guzy urosły do około 3-5 mm średnicy (około 7 dni po przeniesieniu komórek P14), guzy pierwotne wycięto, a 5 x 104 komórek B16F10-GP w 20 μl PBS wstrzyknięto bezpośrednio do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego. Do pachwinowego węzła chłonnego po drugiej stronie wstrzyknięto równe objętości PBS. Reprezentatywne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E, 100x) nieprzerzutowego węzła chłonnego (nLN) i przerzutowego węzła chłonnego (mLN) we wskazanych punktach czasowych pokazano w Rysunek 1B. Struktura nLN pozostała nienaruszona. We wczesnym stadium przerzutów LN (D8) mLN był częściowo zajęty przez komórki nowotworowe (strzałka) i nadal pozostaje pewien obszar z limfocytami, które nie zostały zaatakowane przez komórki nowotworowe (czerwona strzałka). Natomiast w późnym stadium przerzutów LN (D18), mLN jest wypełniony komórkami nowotworowymi, którym towarzyszy angiogeneza guza i małe limfocyty. Aktywowane komórki P14 odzyskane w TdLN wytworzyły wysoki poziom IFN-γ po stymulacji peptydem GP33-419,31. Tutaj procenty aktywowanych komórek P14 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w różnych punktach czasowych, a strategia bramkowania jest pokazana na Rysunek 2. Częstość występowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + we krwi obwodowej we wczesnym stadium (D8) i późnym etapie (D18) wynosi odpowiednio 2,81% i 1,48% (Figura 3A). Doniesiono, że specyficzne dla nowotworu limfocyty T CD8 + ściśle rezydują w dLN podczas nowotworzenia, a niedrenujące LN odzyskały ograniczone komórki dawcy33. Odsetek komórek P14 specyficznych dla antygenu w nLN był stabilny podczas przerzutów LN. Co ciekawe, specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 + w mLN były przejściowo wzmocnione na wczesnym etapie, o czym świadczy wyższa częstotliwość komórek P14 w porównaniu z nLN, podczas gdy gwałtownie spadła w późnym stadium (Figura 3B).

Rysunek 1: Schemat ideowy projektu eksperymentalnego. (A) Myszom C57BL / 6J (CD45.2 +) wszczepia się 5 x 105 komórek nowotworowych B16F10-GP w obustronnej okolicy pachwinowej. Po 7 dniach myszom tym wstrzykuje się dootrzewnowo 4 mg CTX, a następnie następnego dnia następuje adoptywny transfer różnych genetycznie oznaczonych (CD45.1 +) komórek P14. Gdy guzy rosną do około 3-5 mm średnicy (około 7 dni po przeniesieniu komórek P14), guzy pierwotne są wycinane, a następnie 5 x 104 komórek B16F10-GP w 20 μl PBS jest bezpośrednio wstrzykiwane do jednostronnego pachwinowego węzła chłonnego, a pachwinowy węzeł chłonny po drugiej stronie jest wstrzykiwany z równymi objętościami PBS. (B) Reprezentatywne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E,100x) LNs. Skróty: s.c. = podskórnie; CTX = cyklofosfamid; i.v. = dożylnie; Sac = ofiara; nLN = LN bez przerzutów; mLN = przerzutowy LN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania stosowana do identyfikacji aktywowanych limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu pochodzących od dawcy. Skróty: L/D = żywy/martwy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dynamika limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu podczas przerzutów LN. Proporcja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu w (A) krwi obwodowej, (B) nLN i mLN w różnych punktach czasowych. Skróty: nLN = LN bez przerzutów; mLN = przerzutowy LN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.