Artykuł metodologiczny

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

DOI:

10.3791/65647

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  , 
1Kindstar Global Technology Inc., 2Yongzhou Central Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia zastosowanie metody wykrywania niskiej częstotliwości opartej na sekwencjonowaniu Sangera w chłoniaku angioimmunoblastycznym. Zapewnij podstawę do zastosowania tej metody do innych chorób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas monitorowania minimalnej choroby resztkowej (MRD) po leczeniu nowotworu, wymagania dotyczące dolnej granicy wykrywalności są wyższe niż podczas wykrywania mutacji oporności na leki i mutacji krążących komórek nowotworowych podczas terapii. Tradycyjne sekwencjonowanie Sangera ma 5%-20% wykrywalność mutacji typu dzikiego, więc jego granica wykrywalności nie może spełnić odpowiednich wymagań. Technologie blokowania typu dzikiego, o których doniesiono, że rozwiązują ten problem, obejmują amplifikację przemieszczenia blokera (BDA), nierozciągliwy zablokowany kwas nukleinowy (LNA), sondy specyficzne dla gorących punktów (HSSP) itp. Technologie te wykorzystują określone sekwencje oligonukleotydowe do blokowania typu dzikiego lub rozpoznawania typu dzikiego, a następnie łączą to z innymi metodami, aby zapobiec amplifikacji typu dzikiego i amplifikacji zmutowanego, co prowadzi do cech takich jak wysoka czułość, elastyczność i wygoda. Protokół ten wykorzystuje BDA, PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera, w celu optymalizacji wykrywania mutacji somatycznych RHOA G17V o niskiej częstotliwości, a czułość wykrywania może osiągnąć 0,5%, co może stanowić podstawę do monitorowania MRD chłoniaka angioimmunoblastycznego z komórek T.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Minimalna choroba resztkowa (MRD) to niewielka liczba komórek rakowych, które są nadal obecne w organizmie po leczeniu. Ze względu na ich niewielką liczbę nie prowadzą do żadnych fizycznych oznak ani objawów. Często pozostają one niewykryte tradycyjnymi metodami, takimi jak wizualizacja mikroskopowa i/lub śledzenie nieprawidłowych białek surowicy we krwi. Dodatni wynik testu MRD wskazuje na obecność resztkowych chorych komórek. Wynik ujemny oznacza, że resztkowe chore komórki są nieobecne. Po leczeniu nowotworowym pozostałe komórki rakowe w organizmie mogą stać się aktywne i zacząć się namnażać, powodując nawrót choroby. Wykrycie MRD wskazuje, że albo leczenie nie było w pełni skuteczne, albo było niekompletne. Innym powodem dodatnich wyników MRD po leczeniu może być to, że nie wszystkie komórki rakowe zareagowały na terapię lub dlatego, że komórki rakowe stały się oporne na stosowane leki1.

Angioimmunoblastic T-cell chłoniak (AITL) jest podtypem obwodowego chłoniaka z komórek T (PTCL) wywodzącego się z komórek pomocniczych pęcherzyków T2; jest to najczęstszy typ chłoniaka z komórek T, stanowiący około 15%-20% klasy PTCL3. Jest to grupa pokrewnych nowotworów złośliwych, które wpływają na układ limfatyczny. Komórka pochodzenia jest pęcherzykową komórką T pomocniczą. Klasyfikacja WHO z 2016 r. klasyfikuje go jako angioimmunoblastycznego chłoniaka z komórek T4. W 2022 r. WHO zmieniła jego nazwę na Węzłowy chłoniak T-pęcherzykowy z komórek pomocniczych, typ angioimmunoblastyczny (nTFHL-AI), wraz z węzłowym chłoniakiem T-pęcherzykowym z komórek pomocniczych, typu folikularnego (nTFHL-F) i węzłowym chłoniakiem T-pęcherzykowym z komórek pomocniczych, nieokreślonym inaczej (nTFHL-NOS), zbiorczo określanym jako chłoniak z komórek T (nTFHL-AI) jako chłoniak z komórek T (nTFHL). Dokonano tego w celu zidentyfikowania jego ważnych cech klinicznych i immunofenotypowych oraz podobnych sygnatur ekspresji genu T follicular helper (TFH) i mutantów. Genetycznie nTFHL-AI charakteryzuje się postępującym nabywaniem mutacji somatycznych we wczesnych hematopoetycznych komórkach macierzystych poprzez mutacje TET2 i DNMT3A, podczas gdy mutacje RHOA i IDH2 są również obecne w komórkach nowotworowych TFH5. Kilka badań wykazało, że mutacja RHOA G17V występuje u 50%-80% pacjentów z AITL6,7,8,9. Białko RHOA kodowane przez gen RHOA jest aktywowane przez wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) i inaktywowane przez wiązanie difosforanu guanozyny (GDP). Po aktywacji może wiązać się z różnymi białkami efektorowymi i regulować różne procesy biologiczne. Fizjologicznie RHOA pośredniczy w migracji i polaryzacji limfocytów T, odgrywa rolę w rozwoju tymocytów i pośredniczy w aktywacji sygnalizacji receptora komórek pre-T (pre-TCR)10. Mutacja RHOA G17V jest mutacją powodującą utratę funkcji, która odgrywa główną rolę w patogenezie chłoniaka11. Wykrycie mutacji o niskiej częstotliwości jest pomocne w monitorowaniu MRD AITL.

Sekwencjonowanie Sangera jest używane od ponad 40 lat jako złoty standard wykrywania znanych i nieznanych mutacji. Jednak jego limit wykrywalności wynosi tylko 5%-20%, co ogranicza jego zastosowanie do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości12,13. W sekwencjonowaniu Sangera czułość wykrywania można zmniejszyć do 0,1%, zastępując tradycyjny PCR BDA, technologią dzikiego blokowania14. Technologia BDA głównie dodaje niedopasowany starter komplementarny do typu zmutowanego podczas projektowania konwencjonalnych starterów do konkurowania z typem dzikim, aby osiągnąć cel amplifikacji typu zmutowanego. Kluczem do projektowania podkładu jest niedopasowanie startera i modyfikacja końcówki. Jednocześnie, zgodnie z zasadą strukturalną DNA, różnica między energią swobodną Gibbsa dwóch starterów wynosi od 0,8 kcal/mol do 5 kcal/mol. Kolejnym kluczowym krokiem w tej technice jest tłumienie amplifikacji typu dzikiego poprzez dostosowanie proporcji starterów typu dzikiego i blokującego14,15.

Obecnie powszechne techniki wykrywania mutacji somatycznych o niskiej częstotliwości obejmują PCR (allelowo-specyficzna reakcja łańcuchowa polimerazy, ASPCR), system mutacji opornych na amplifikację PCR (amplifikacyjny-oporny system mutacji-PCR, ARMS-PCR) stosowany do genotypowania SNP za pomocą starterów opornych na leczenie. Projektowanie starterów dla zmutowanych i normalnych alleli pozwala na selektywną amplifikację i cyfrowy PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR), metodę wykonywania cyfrowego PCR, która opiera się na technologii kropelek emulsji wodno-olejowej16. Próbka jest frakcjonowana na 20 000 kropel, a dla każdej kropli przeprowadza się amplifikację PCR cząsteczek matrycy z czułością 1 x 10-5; amplifikacja przemieszczenia blokera (BDA) jest również metodą wzbogacania rzadkich alleli opartą na PCR, stosowaną do dokładnego wykrywania i ilościowego oznaczania SNV i indeli do 0,01% VAF w wysoce multipleksowanym środowisku; technologia zablokowanych kwasów nukleinowych (nierozciągliwy zablokowany kwas nukleinowy, LNA) to klasa analogów RNA o wysokim powinowactwie, w których pierścień rybozy jest zablokowany w idealnej konformacji dla wiązania Watsona-Cricka; Sondy specyficzne dla hotspotów (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), nakładają się na docelową sekwencję startera, zawierają pojedynczą mutację i są modyfikowane za pomocą przekładki C3 na końcu C3', aby zapobiec amplifikacji przez qPCR14,16,17,18. Gdy istnieje mutacja w sekwencji, HSSP konkurencyjnie przyłącza się do mutacji docelowej i zapobiega wiązaniu startera z docelową sekwencją zmutowaną, co zatrzymuje amplifikację sekwencji; NGS (sekwencjonowanie nowej generacji) - wysokoprzepustowe sekwencjonowanie raka oparte na immunoglobulinach (igHTS) Spersonalizowane profilowanie raka przez głębokie sekwencjonowanie (CAAP-seq), jest to metoda oparta na sekwencjonowaniu nowej generacji stosowana do ilościowego oznaczania krążącego DNA w komórkach nowotworowych (czułość wynosi 1 x 10-4); itd. Wśród nich większość metod opiera się na PCR i może wykryć tylko niewielką liczbę miejsc mutacji, a metody oparte na NGS mogą wykryć wiele miejsc, ale koszt jest wysoki, a proces skomplikowany14,16,17,18. Istnieją doniesienia o wykryciu mutacji RHOA G17V o niskiej częstotliwości na podstawie qPCR, ale granica wykrywalności może osiągnąć tylko około 2%19. Brak doniesień na temat wykrycia mutacji RHOA G17V o niskiej częstotliwości na podstawie sekwencjonowania Sangera. Tutaj pokazujemy wzrost czułości osiągnięty przez BDA, PCR blokowy typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera, w celu optymalizacji wykrywania mutacji somatycznych RHOA G17V o niskiej częstotliwości, a czułość wykrywania może osiągnąć 0,5%. Podano również dodatkowe dane dla IDH2 i JAK1.

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół schematu wykrywania niskiej częstotliwości RHOA G17V za pomocą sekwencjonowania Sangera i dostarcza informacji o rozwoju większej liczby detekcji mutacji o niskiej częstotliwości w oparciu o platformę sekwencjonowania Sangera. Metoda ta może być stosowana do wykrywania i monitorowania ewentualnych mutacji oporności na leki i minimalnych pozostałości w nowotworach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję oceny etyki medycznej Szpitala Centralnego w Yongzhou (numer zatwierdzenia: 2024022601). Uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Projekt podkładu

  1. Konwencjonalny projekt podkładu: Zaprojektuj podkłady zgodnie z zgłoszonymi zasadami projektowania podkładu20, projekt podkładu według NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Dla miejsca mutacji RHOA G17V wszystkie sekwencje referencyjne do projektowania konwencjonalnych starterów są zmutowaną sekwencją zasadową. Upewnij się, że zaprojektowane startery z odwróconą amplifikacją zawierają sekwencję miejsca mutacji, a temperatura wyżarzania starterów wynosi około 60 °C.
  2. Konstrukcja podkładu BDA
    1. Zaprojektuj dziki starter blokujący o długości około 20-30 par zasad (bp), zawierający 2-4 zmodyfikowane zasady oraz zmodyfikowane zasady złożone z A i T. Upewnij się, że starter blokujący ma 6-14 pz nakładających się na starter amplifikacji mutacji, używany do konkurowania ze starterem amplifikacji mutacji.
    2. Zaprojektuj starter z temperaturą wyżarzania dla ostatecznie zaprojektowanych starterów amplifikacyjnych mutantów i dzikich starterów blokujących ustawionych na około 60 °C, a różnica w energii swobodnej Gibbsa wynosi 0,8-5 kcal/mol. Szczegółowe zasady obliczeń można znaleźć w literature15.
      UWAGA: Gdy zaprojektowane podkłady nie spełniają powyższych warunków, bazy można dodawać lub odejmować ręcznie w celu regulacji. Ostateczna zaprojektowana lista starterów znajduje się w Tabeli 1 i Tabeli 2.

2. Przygotowanie próbki i ekstrakcja DNA

UWAGA: Wszystkie eksperymentalne próbki weryfikacyjne pochodzą z krwi obwodowej, szpiku kostnego lub guzów litych od pacjentów z ludzkim chłoniakiem. Było 10 próbek dodatnich: 3 były próbkami guzów litych, 4 były próbkami szpiku kostnego, a 3 były próbkami krwi obwodowej. Pobrano 30 próbek ujemnych od osób zdrowych.

  1. Ekstrakcja próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej
    1. Dodać 400 μl próbki szpiku kostnego lub krwi obwodowej i odczynników do odpowiednich probówek zgodnie z wymaganiami i ekstrahować zgodnie z procedurą ekstrakcji producenta.
    2. Przygotuj nowe probówki na próbki i probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ponumeruj probówki z próbkami od 1 do 24. Oznacz pokrywy probówek o pojemności 1,5 ml nazwą próbki i datą ekstrakcji w kolejności nazw na odpowiednich probówkach do pobierania krwi. Zaznacz 1-24 z boku probówki mikrowirówki w celu sprawdzenia zgodności jeden do jednego.
    3. Dodać 40 μl roztworu proteinazy K do probówki z próbką i dodać 400 μl próbki krwi pełnej (dla objętości mniejszych niż 400 μl napełnić do 400 μl PBS).
    4. Umieść probówkę z próbką (1-24), końcówkę pipety (wraz z osłoną pipety) i probówkę zbiorczą w odpowiednich pozycjach. Ekstrakcja DNA zgodnie z procedurą producenta.
  2. Ekstrakcja próbek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)
    1. Umieścić próbki i odczynniki w odpowiednich probówkach zgodnie z wymaganiami i ekstrahować zgodnie z procedurą ekstrakcji producenta.
    2. Dodać 1,1 ml buforu spichrzającego proteinazę K (roztwór PK) do suchego proszku proteinazy K, odwirować i dobrze wymieszać, aby uzyskać roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Wyjmij roztwór proteinazy K i rozpuść go całkowicie w temperaturze pokojowej. Uruchom suchy termostat i ustaw temperaturę na 55 °C.
    4. Weź probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i napisz na niej nazwę próbki. Weź mniej niż 30 mg tkanki i umieść ją w probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj do probówki 500 μl buforu parafinowego i 20 μl roztworu proteinazy K.
    5. Po mieszaniu wirowym przez co najmniej 10 sekund umieścić probówkę mikrowirówki w suchym termostacie i utrzymywać ją w cieple w temperaturze 55 °C przez 90 minut.
    6. Upewnij się, że kolumna wirująca pasuje do rurki filtra. Po zakończeniu inkubacji przenieść próbkę, w tym ciecz i tkankę, do kolumny wirowej. Wirować przy 16 500 x g przez 5 minut, aby odwirować całą ciecz do rurki filtracyjnej.
    7. Weź 1 probówkę na próbkę (bez nakrętki) dołączoną do zestawu i napisz na niej nazwę próbki. Przenieść ciecz z rurki filtracyjnej o pojemności 400 μl do probówki z próbką.
    8. Po zakończeniu obróbki wstępnej i przygotowania próbki należy umieścić odpowiednie materiały eksploatacyjne i odczynniki w odpowiednich pozycjach i przeprowadzić ekstrakcję DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Kontrola jakości DNA
    1. Zmierzyć stężenie i czystość wyekstrahowanego DNA i upewnić się, że stężenie DNA wynosi ≥ 25 ng/μl. Zapisać stężenie DNA w każdej próbce i natychmiast użyć do późniejszego wykrycia lub zamrożenia w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Wartości OD260/OD280 są zwykle używane do testowania czystości próbek DNA. Normalna wartość OD260/OD280 wynosi około 1,7-1,9, co wskazuje, że czystość DNA jest dobra; jeżeli wartość OD260/OD280 wynosi ≤1,7, oznacza to, że może dojść do zanieczyszczenia białkami; jeśli wartość OD260/OD280 wynosi ≥2,0, oznacza to, że może dojść do zanieczyszczenia RNA lub degradacji DNA.

3. Amplifikacja PCR

  1. Przygotowanie podkładów
    1. Przygotowanie roztworu podstawowego podkładu
      1. Wyjmij suchy proszek startera i odwiruj przy 5400-8400 x g przez 2-3 minuty. Sprawdź wartość nmol startera i powoli otwórz pokrywę. Za pomocą pipety z odpowiednią objętością podwójnie destylowanej wody (ddH2O), która jest 10x wartości nM, powoli dodawać ją wzdłuż ścianki probówki ze starterem.
      2. Przygotować startery o stężeniu 0,1 nM/μl lub 100 μM roztworze podstawowym (np. wartość nM wynosi 21,1; odpowiednio, woda, którą należy dodać, wynosi 211 μL). Dokładnie wymieszaj, a następnie krótko odwiruj, aby upewnić się, że roztwór dotrze do dna każdej studzienki. Napisz nazwę startera, dane konfiguracyjne i osobę konfiguracyjną na nasadce probówki. Umieść go w odpowiednim miejscu przechowywania roztworu podstawowego.
    2. Przygotowanie roztworu roboczego podkładu
      1. Odpipetować 5 μl startera do przodu, 5 μl startera wstecznego, 50 μl roztworu podstawowego startera typu dzikiego i 40 μl ddH2O w czystej probówce do mikrowirówki. Pipetuj wielokrotnie 2x-3x, wiruj, aby wymieszać i natychmiast odwiruj.
      2. Napisz nazwę startera, datę konfiguracji i osobę, która go skonfigurowała na nasadce probówki i umieść go w odpowiednim miejscu przechowywania roztworu roboczego.
  2. Procedura amplifikacji PCR
    1. Do każdej reakcji dodać 5 μl głównej mieszanki enzymu amplifikacji PCR, 1 μl roztworu roboczego startera i 1 μl matrycy DNA (ilość wejściowa matrycy musi osiągnąć 400 ng, jeśli stężenie DNA nie jest wystarczające; zwiększyć objętość DNA i zmniejszyć objętość dodanego ddH2O) i 3 μl ddH2O. Wirować, aby natychmiast wymieszać i odwirować.
    2. Umieść probówkę reakcyjną PCR na wstępnie ustawionym przyrządzie do PCR w celu amplifikacji PCR. Ustaw program cyklu termicznego przyrządu do PCR w następujący sposób i uruchom:
      95 °C przez 3 min; 20 cykli po 95 °C przez 30 s, 68 °C przez 15 s (spadek o 0,5 °C na cykl), 72 °C przez 1 min; 16 cykli po 95 °C przez 30 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 1 min; i 72 °C przez 10 min.
  3. Wykonaj elektroforezę żelową na produkcie PCR z 2% agarozą, aby sprawdzić, czy docelowy fragment jest amplifikowany.
  4. Oczyszczanie produktów PCR
    1. Doprowadź purificase I i purificase II do temperatury pokojowej i natychmiast odwiruj. Przygotować reakcję oczyszczania produktu PCR w następujący sposób: 1 μl produktu oczyszczającego I, 0,5 μl produktu oczyszczającego II, 3 μl produktu PCR i 3,5 μl produktu ddH2O.
    2. Umieść probówkę reakcyjną PCR na wstępnie ustawionym przyrządzie do PCR w celu amplifikacji PCR. Ustaw program cyklu termicznego przyrządu do PCR w następujący sposób i uruchom maszynę:
      37 °C przez 30 min, 95 °C przez 15 min.

4. Sekwencjonowanie produktów PCR po oczyszczeniu

  1. Sekwencjonowanie
    1. Doprowadź główną mieszankę enzymu amplifikacji sekwencjonowania, bufor i ddH2O do temperatury pokojowej. Po upłynnieniu odczynnika natychmiast odkręcić.
    2. Przygotować układ reakcji sekwencjonowania w następujący sposób: 1,8 μl buforu sekwencjonującego, 0,4 μl głównej mieszaniny enzymów amplifikacji sekwencjonowania, 1 μl startera sekwencjonującego, 0,8 μl oczyszczonego produktu PCR i 6 μl ddH2O.
    3. Umieść probówkę reakcyjną PCR na wstępnie ustawionym przyrządzie do PCR w celu amplifikacji PCR. Ustaw program cyklu termicznego przyrządu do PCR w następujący sposób i uruchom: 96 °C przez 3 minuty; 28 cykli po 96 °C przez 25 s, 56 °C przez 15 s, 60 °C przez 4 min.
    4. Po zakończeniu reakcji sekwencjonowania należy usunąć produkt z przyrządu do PCR. Produkty reakcji należy przechowywać w lodówce, chronić przed światłem.
  2. Oczyszczanie produktów sekwencjonowania
    1. Dokładnie wymieszaj koraliki magnetyczne. Do płytki 96-dołkowej dodać 10 μl kulek magnetycznych i 40 μl 80% alkoholu i uszczelnić płytkę folią.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę z kulkami magnetycznymi i alkoholem na wytrząsarce wirowej na 10 sekund, aby całkowicie zawiesić i wymieszać kulki magnetyczne (obserwując, czy na dnie nie wytrąca się kulka magnetyczna i uważaj, aby płyn nie dostał się na folię uszczelniającą). Umieść go na oscylatorze poziomym i zawiąż gumką, aby wibrował przez 3-5 minut (maksymalny bieg).
    3. Po oscylacji połóż płytkę PCR na stojaku magnetycznym, zwróć uwagę na jej mocne dociśnięcie. Utrzymuj stojak w temperaturze 4 °C dla adsorpcji statycznej przez 3 minuty, a po zaadsorbowaniu wszystkich kulek magnetycznych na ścianie usuń folię uszczelniającą i wylej płyn odpadowy.
    4. Dodać 40 μl 80% alkoholu do płytki PCR, opłukać kulki i odlać odpadowy płyn. Umieść płytkę na chłonnym papierze i delikatnie ją wklep (nie pozwól, aby płytka PCR oddzieliła się od dysku). Powtórz 1x.
    5. Włóż papier chłonny do góry nogami wraz z płytką magnetyczną do wirówki o gramaturze 120 x g, aby szybko odwirować.
    6. Włóż płytkę PCR zawierającą kulki magnetyczne po wyjęciu alkoholu do piekarnika w temperaturze 60 °C na 3-5 minut. Całkowicie wysusz kulki.
      UWAGA: Jeśli nie ma piekarnika, umieść talerz w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    7. Po wysuszeniu dodać 40 μl czystej wody. Umieść folię uszczelniającą na płycie i potrząsaj nią na wytrząsarce wirowej przez 3-5 sekund. Umieść płytkę na wytrząsarce poziomej, mocno ją zawiąż i potrząsaj nią przez 3-5 minut, aby rozpuścić oczyszczony produkt do sekwencjonowania.
    8. Rozpuszczony produkt sekwencjonowania należy odwirować przy 180 x g i użyć produktu do analizy genomowej za pomocą elektroforezy kapilarnej21 (Należy pamiętać, że dysk nośny musi zostać dodany do płytki próbki).
  3. Analiza wyników sekwencjonowania
    1. Uzyskaj wyniki sekwencjonowania z oprogramowania. Zapoznaj się z instrukcją oprogramowania, aby uzyskać szczegółowe procedury obsługi. Użyj sekwencji referencyjnej z NCBI.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównaj sekwencję próbki testowej z sekwencją referencyjną, aby uzyskać status mutacji próbki testowej. Technologia WBT-PCR oparta na BDA może wykryć znaną mutację RHOA G17V i inne mutacje o niskiej częstotliwości w przedziale amplifikacji starterów przed i za nim. Zobacz Rysunek 1. Dwa dodatkowe geny, a mianowicie IDH2 i JAK1, zostały również przeanalizowane przy użyciu tej metody, odpowiednio Rysunek 2 i Rysunek 3. Wyniki pokazują, że metoda ta jest dość czuła w wykrywaniu mutacji o niskiej częstotliwości.

chromatogram sekwencjonowania DNA; Tradycyjny PCR vs. WBT-PCR pokazujący porównanie wykrywania mutacji RHOA.
Rysunek 1: Wynik sekwencjonowania dla RHOA. Od góry do dołu rysunek przedstawia mutację zasadową miejsca RHOA G17 amplifikowaną przez WBT-PCR oraz wyniki sekwencjonowania po tradycyjnej amplifikacji PCR odpowiadające RHOA G17 typu dzikiego. Środkowy rysunek przedstawia wyniki sekwencjonowania mutacji c.50G>T po amplifikacji starterami WBT-PCR, gdy czułość detekcji wynosi 0,5%. Dolny rysunek przedstawia wyniki sekwencjonowania mutacji c.49-50delinsTT po amplifikacji starterami WBT-PCR, gdy czułość wykrywania wynosi 0,5%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównanie chromatogramu WBT-PCR i tradycyjnego PCR, wykrywanie mutacji c.515G>A, gen IDH2.
Rysunek 2: Wynik sekwencjonowania dla IDH2. Od góry do dołu powyższy rysunek przedstawia mutację zasadową miejsca IDH2 R172 amplifikowaną przez WBT-PCR oraz wyniki sekwencjonowania po tradycyjnej amplifikacji PCR odpowiadające IDH2 R172 typu dzikiego. Górne zdjęcie przedstawia wyniki sekwencjonowania mutacji c.515G>A po amplifikacji starterami WBT-PCR, gdy czułość wykrywania wynosi 0,5%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównanie sekwencjonowania DNA, WBT-PCR vs tradycyjny PCR dla wykresu analizy mutacji JAK1.
Rysunek 3: Wynik sekwencjonowania dla JAK1. Od góry do dołu powyższy rysunek przedstawia mutację zasadową miejsca JAK1 S703 amplifikowaną przez WBT-PCR oraz wyniki sekwencjonowania po tradycyjnej amplifikacji PCR odpowiadające JAK1 S703 typu dzikiego. Górne zdjęcie przedstawia wyniki sekwencjonowania mutacji c.2108G>T po amplifikacji starterami WBT-PCR, gdy czułość detekcji wynosi 0,5%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

podkładSekwencja podkładowa
RHOA-VFATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-VRGCTGAAGACTATGAGCAAGCA
RHOA-WTBAGCAAGCATGTCTCTCCACAGGCAAAA
Elementarz sekwencjonowania ATAACCTTTTGGTGCCAGGT

Tabela 1: Ostateczna zaprojektowana lista podstaw RHOA.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
Podkład IDH2 R172
podkładSekwencja podkładowa
IDH2-VFCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VRTACCTGGTCGCCATGGGC powiedział:
IDH2-WTB (Przekaźnik Przemysłowy)GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
Elementarz sekwencjonowaniaCTGGTTGAAAGATGGCGGCT
Starter genu JAK1
podkładSekwencja podkładowa
JAK1-VFACTCTGAGGCCGAGTAGTGT
JAK1-VRCCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTBGGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
Elementarz sekwencjonowaniaACTCTGAGGCCGAGTAGTGT

Tabela 2: Ostateczna zaprojektowana lista podstaw IDH2 i JAK1.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WTB-PCR oparty na technologii BDA, opisany w tym artykule, wprowadza niedopasowany starter komplementarny do typu zmutowanego podczas projektowania konwencjonalnych starterów do konkurowania z typem dzikim, tłumienia typu dzikiego i amplifikacji zmutowanego produktu. Następnie produkty WTB-PCR zsekwencjonowano w celu analizy mutacji. Użyteczność WTB-PCR/Sanger polega na jego prostocie i wysokiej czułości. Zgodnie ze schematem wykrywania ustalonym w tym artykule, większość istniejących testów opartych na metodzie Sangera można dodać ze starterami supresorowymi za pośrednictwem BDA, zwiększając w ten sposób czułość wykrywania. Mutacja RHOA G17V przedstawiona w tym artykule została zsekwencjonowana metodą sekwencjonowania Sangera po WTB-PCR w oparciu o technologię BDA. Gdy wejściowa ilość DNA osiągnie 400 ng, czułość wykrywania może osiągnąć 0,5%, a nawet 0,1%. Czułość wykrywania różnych genów musi być potwierdzona przez ilość wprowadzonego DNA, sekwencję genów itp.

Kluczem do WTB-PCR jest projektowanie starterów, a technologia ta może wykrywać tylko znane mutacje. W artykule opisano zastosowanie tej technologii w sekwencjonowaniu Sangera. Technologia ta może być również stosowana do sekwencjonowania nowej generacji, ilościowego PCR itp., a także może być stosowana w wykrywaniu multipleksów PCR. Ten WTB-PCR może zmniejszyć dolną granicę tych metod wykrywania i może być lepiej stosowany do monitorowania MRD. Większość metod opartych na PCR może wykryć tylko niewielką liczbę miejsc mutacji, a metody oparte na NGS mogą wykryć wiele miejsc, ale koszt jest wysoki, a proces skomplikowany 14,15,16,17,18. WTB-PCR charakteryzuje się wysoką czułością, niskim kosztem i dużą elastycznością, co czyni go idealnym wyborem do wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości, co może znacznie poprawić czułość wykrywania sekwencjonowania Sangera i jego zastosowanie w wykrywaniu MRD.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały zakończone dzięki finansowemu wsparciu Kindstar Global Corporation oraz pomocy liderów Laboratorium Biologii Molekularnej i pokrewnych kolegów. Dziękuję firmie, liderom i odpowiednim współpracownikom za ich wsparcie i pomoc. Ten artykuł jest wykorzystywany wyłącznie do badań naukowych i nie stanowi żadnej działalności komercyjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny ekstraktor DNA9001301DNA Qiagen
Q32854Zestaw
PCR Przyrząd do PCRC4600 Merck
Roztwór proteinazy Kzymo Bufor
D3001-2-Czymo research
Zestaw enzymów do amplifikacji sekwencjonowaniaP7670-FINQiagen
detektor kwasów nukleinowych do amplifikacji Thermo fisher C1000 Touch magazynujący proteinazę K

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd (2019).
  2. Xie, Y., Elaine, S. J. How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).
  3. Mariko, Y., et al. Angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).
  4. Daniel, A. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  5. Rita, A., et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms. Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).
  6. Hae, Y. Y., et al. A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).
  7. Lee, P. H., et al. RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment. Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).
  8. Mamiko, S. Y., et al. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma. Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).
  9. Palomero, T., et al. Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).
  10. Fujisawa, M., et al. Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).
  11. Voena, C., et al. RHO family GTPases in the biology of lymphoma. Cells. 8 (7), 646(2019).
  12. Shendure, J., et al. DNA sequencing an 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  13. Athanasios, C. T., et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications. J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).
  14. Wu, L. R., et al. Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification. Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).
  15. John, S. J., et al. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).
  16. Coren, A. M., et al. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  17. Eliza, M. L., et al. Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research. Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).
  18. Lee, H. J., et al. Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer. Biosensors. 12 (8), 597(2022).
  19. Matsubara, R. N., et al. Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR. PLoS One. 9 (10), e109714(2014).
  20. Dieffenbach, C. W., et al. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  21. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutacja o niskiej cz stotliwo ciwykrywanie mutacji somatycznychminimalna choroba resztkowaamplifikacja z wypieraniem blokeraekstrakcja DNAelektroforeza elowaelektroforeza kapilarnach oniak angioimmunoblastyczny

Powiązane artykuły