Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe wrażliwości na leki sferoidalne w liniach komórek macierzystych glejaka

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Badania wrażliwości na leki in vitro są ważnymi narzędziami do odkrywania kombinacji leków przeciwnowotworowych. Komórki hodowane w kulkach aktywują różne szlaki sygnałowe i są uważane za bardziej reprezentatywne dla modeli in vivo niż jednowarstwowe linie komórkowe. Protokół ten opisuje metodę badań przesiewowych in vitro leków w kierunku linii sferoidalnych.

Streszczenie

Badania przesiewowe wrażliwości na leki in vitro są ważnymi narzędziami w odkrywaniu terapii skojarzonych leków przeciwnowotworowych. Zazwyczaj te badania przesiewowe leków in vitro są wykonywane na komórkach hodowanych w monowarstwie. Jednak te dwuwymiarowe (2D) modele są uważane za mniej dokładne w porównaniu z trójwymiarowymi (3D) modelami komórek sferoidalnych; Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku linii komórek macierzystych glejaka. Komórki hodowane w kulkach aktywują różne szlaki sygnałowe i są uważane za bardziej reprezentatywne dla modeli in vivo niż jednowarstwowe linie komórkowe. Protokół ten opisuje metodę badań przesiewowych in vitro leków linii sferoidalnych; Jako przykład podaje się linie komórek macierzystych glejaka mysiego i ludzkiego. Protokół ten opisuje test 3D sferoidalnej wrażliwości na lek i synergii, który można wykorzystać do określenia, czy lek lub kombinacja leków indukuje śmierć komórki i czy dwa leki działają synergicznie. Linie komórek macierzystych glejaka są modyfikowane w celu wyrażenia zapytania ofertowego. Komórki są platerowane na 96 płytkach o niskim przyleganiu z okrągłym dnem studni, a kule pozostawia się do uformowania przez noc. Dodaje się leki, a wzrost jest monitorowany poprzez pomiar sygnału RFP w czasie za pomocą systemu obrazowania na żywo Incucyte, mikroskopu fluorescencyjnego wbudowanego w inkubator do hodowli tkankowych. Połowa maksymalnego stężenia hamującego (IC50), mediana dawki śmiertelnej (LD50) i wynik synergii są następnie obliczane w celu oceny wrażliwości na leki stosowane w monoterapii lub w skojarzeniu. Trójwymiarowy charakter tego testu zapewnia dokładniejsze odzwierciedlenie wzrostu, zachowania i wrażliwości guza na leki in vivo, tworząc w ten sposób podstawę do dalszych badań przedklinicznych.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy to wyniszczający, wysokozaawansowany nowotwór mózgu z 5% pięcioletnim przeżyciem całkowitym1. Glejaki o wysokim stopniu złośliwości (HGG), takie jak glejak, stanowią główną przyczynę śmiertelności związanej z rakiem w populacji pediatrycznej2 i są jednym z najbardziej opornych nowotworów do leczenia również u dorosłych3. Pomimo znacznego postępu w naszym zrozumieniu molekularnych czynników powodujących HGG, opcje leczenia pozostają ograniczone3, podkreślając potrzebę metod badań przesiewowych leków, które dokładniej przewidują wrażliwość terapeutyczną w klinice.

3D hodowle komórkowe były przede wszystkim wykorzystywane do modelowania fizjologicznie istotnych zachowań komórek4. Co więcej, architektura 3D mikrośrodowiska guza może być rekapitulowana in vitro, ustanawiając testy wzrostu 3D5. Wzrost sferoidów aktywuje również różne szlaki sygnałowe i dlatego jest uważany za bardziej reprezentatywny dla modeli in vivo6,7 w porównaniu z kulturą 2D. Pediatryczne komórki macierzyste HGG i nasze mysie linie komórek macierzystych glejaka NF1 naturalnie rosną jako neurosfery i wykorzystały te mysie linie komórkowe glejaka NF1 w średnioprzepustowym badaniu przesiewowym leków8. Użyte tutaj linie pediatryczne wywodzą się z HGG pediatrycznego półkuli, linii środkowej i móżdżku i zostały nabyte i w pełni scharakteryzowane przez Children's Brain Tumor Network (profile mutacji i ekspresji genów)9. Linie te zostały zmodyfikowane w celu ekspresji jądrowego białka czerwonej fluorescencji (RFP), co pozwala na monitorowanie proliferacji i przeżycia za pomocą systemu obrazowania na żywo Incucyte. Intensywność sygnału RFP jest reprezentatywna dla liczby obecnych komórek. Można również zastosować inne fluorofory, takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP).

Chemioterapia skojarzona w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci, chłoniaków, nowotworów nabłonkowych i wielu innych nowotworów jest skutecznym sposobem na wyeliminowanie nowotworów i zapobieganie lekooporności na pojedyncze czynniki10,11. Istnieją jednak ograniczone informacje na temat tego, które środki należy łączyć, aby osiągnąć czułość terapeutyczną w HGG, co zachęca do stosowania dokładniejszych modeli sferoidalnych w testach leków in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury protokołu zostały zatwierdzone przez Children's Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (IRB).

1. 3D posiewanie komórek sferoidalnych

  1. Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych glejaka: Aby przygotować podłoże podstawowe, dodaj 50 ml suplementu proliferacyjnego i 5 ml 100-krotnego roztworu penicyliny i streptomycyny (10 000 U/ml) do podłoża podstawowego (500 ml). Aby wytworzyć pożywkę z komórek macierzystych glejaka, dodaj naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) do końcowego stężenia odpowiednio 20 ng / ml i 10 ng / ml, zgodnie z opisem producenta.
    UWAGA: Pożywka z komórek macierzystych glejaka może być używana przez 1 tydzień przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
  2. Dysocjacja komórek wyrażających RFP:
    UWAGA: W tym przykładzie użyto mysiej linii komórek macierzystych NF1 HGG 5746.
    1. Przenieś kulki glejaka do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj kulki glejaka w wirówce (150 x g przez 5 minut). Usunąć supernatant i dodać 300 μl akutazy w celu dysocjacji kulek (inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C).
    2. Dodać 1 ml pożywki z komórek macierzystych glejaka i rozbić kulki przez delikatne pipetowanie. Odwirować zdysocjowane komórki przez 5 minut przy 150 x g, odessać supernatant i rozpuścić osad w 1 ml pożywki z komórek macierzystych glejaka.
  3. Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. W przypadku korzystania z fluorescencyjnego licznika komórek, dodaj 18 μl zawiesiny komórek do 2 μl barwnika pomarańczy akrydynowej / jodku propidyny. Załadować 12 μl tej zawiesiny do hemocytometru, aby policzyć liczbę żywych/martwych komórek obecnych w zawiesinie.
  4. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 2 000 komórek na 100 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka.
    UWAGA: Modyfikacje stężenia komórek mogą być zależne od linii komórkowej i można je odpowiednio dostosować.
  5. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 μl zawiesiny komórek (2 000 komórek na 100 μl) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem i niskim mocowaniem metodą pipetowania odwrotnego.
    UWAGA: Używaj niskich płyt mocujących z okrągłym dnem; Płytki te będą stymulować tworzenie się pojedynczej kuli glejaka w każdej studzience. Odwrotne pipetowanie pozwala uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, które zakłócają rejestrowanie obrazu z systemu analizy żywych komórek.
  6. Odwirować płytki przy 150 x g przez 5 min.
    UWAGA: Wirowanie jest krytycznym krokiem do zainicjowania tworzenia neurosfery 3D.
  7. Inkubuj przez noc, aby w każdej studzience mogła uformować się pojedyncza kula.

2. Dodawanie leków do testu synergicznego (Rysunek 1)

  1. Upewnij się, że każda studzienka na 96-dołkowej płytce otrzymuje określone stężenie zarówno narkotyków 1, jak i 2. Utwórz siatkę, w której każde stężenie leku 1 jest łączone z każdym stężeniem leku 2 w dwóch egzemplarzach.
  2. Wykonaj seryjne rozcieńczanie dwóch leków, dla których zostanie określona synergia (5 rozcieńczeń leku 1 i 7 rozcieńczeń leku 2) przy użyciu pożywki z komórek macierzystych glejaka (Rysunek 1A).
    UWAGA: W tym badaniu stosuje się 50% serię rozcieńczeń seryjnych; Można jednak wykorzystać dowolną serię rozcieńczeń.
    1. Seria rozcieńczeń powinna być 7 razy bardziej skoncentrowana niż pożądane stężenie końcowe w każdym dołku. Na przykład, jeśli najwyższe stężenie końcowe dla leku 1 wynosi 1 μM, należy wykonać pierwsze stężenie z serii rozcieńczeń dla leku 1, 7 μM (1 ml, probówka B lub I w Rysunek 1A).
    2. Dodać 500 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka do każdej dodatkowej probówki z serii rozcieńczeń (probówki C-H i J-M, jak pokazano na Rysunek 1).
    3. Aby utworzyć serię rozcieńczeń, należy odessać 500 μl mieszaniny leków z probówki B lub probówki I i dodać ją do następnej probówki z serii rozcieńczeń, odpowiednio probówki C lub probówki J (zawierającej 500 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka). Dobrze wymieszać i powtórzyć do następnej probówki z serii rozcieńczeń. Wykonaj kontrolę DMSO (rura A) i upewnij się, że stężenie DMSO jest takie samo we wszystkich warunkach.
      UWAGA: Można dokonywać modyfikacji stężeń leków i serii rozcieńczeń. Należy upewnić się, że w pliku uzupełniającym 1 znajdują się prawidłowe stężenia leku, jeśli seria rozcieńczeń zostanie zmieniona.
  3. Do każdej studzienki z 96 dołków dodać 20 μl leku 1 i 20 μl leku 2 przez odwrócone pipetowanie, jak pokazano w Rysunek 1B, dla końcowej objętości 140 μL na studzienkę; kombinacje leków są oceniane w dwóch egzemplarzach. W przypadku korzystania z dostarczonej analizy końcowej dla IC50 i LD50, użyj układu leku, jak pokazano w Rysunek 1B.
    1. W tym teście mierzy się również działanie każdego leku osobno (bez obecności drugiego leku). Upewnij się, że dodałeś 20 μl pożywki kontrolnej DMSO (probówka A w Rysunek 1B) do tych pojedynczych dołków lekowych, aby doprowadzić końcową objętość każdej studzienki do 140 μl.
    2. Upewnij się, że studzienki nie zawierają pęcherzyków, ponieważ wpłynie to na obrazowanie.
      UWAGA: Dopuszcza się modyfikacje w ostatecznej wersji tomu; Należy jednak upewnić się, że dostosowano stężenia określone w pkt 2.2.
  4. Umieść płytki w kamerze na żywo i monitoruj wzrost każdej kuli w każdej studzience za pomocą modułu sferoidalnego, ustawienia pojedynczej sfery, obrazowania zarówno jasnego pola, jak i RFP przy 4-krotnym powiększeniu.
  5. Monitoruj płytki przez 72 godziny, obrazując każdą studzienkę płytki w regularnych odstępach czasu, zwykle 2 godziny < br / > UWAGA: Prześlij poprawną mapę tablicową; zapewni to właściwą analizę dalszych etapów (Rysunek 1C).

3. Obliczanie wyniku IC50, LD50 i synergii (Rysunek 2 i Rysunek 3)

  1. Przeanalizuj intensywność zapytania ofertowego dla każdego odwiertu i każdego punktu czasowego za pomocą oprogramowania do obrazowania na żywo. Zastosowane parametry analizy są wymienione w plikach uzupełniających (plik uzupełniający 2).
    UWAGA: W zależności od preferencji można stosować różne parametry analizy.
  2. Eksportuj dane zapytania ofertowego jako całkowitą intensywność zintegrowanego zapytania ofertowego na czerwono dla każdego odwiertu, upewniając się, że eksportujesz surowe, niezgrupowane dane (Rysunek 2A).
    UWAGA: W przypadku korzystania z dostarczonego szablonu (plik uzupełniający 1) do obliczenia IC50 i LD50 należy przestrzegać punktu 3.2
  3. Określ średnią i odchylenie standardowe dla każdej kombinacji leków (1) zmiany krotności w porównaniu tylko z DMSO (do tego obliczenia wartości 0 h nie są potrzebne) i (2) Log2 zmiany krotności w porównaniu z 0 godziną, wklejając surowe dane do dostarczonego arkusza Excela (Rysunek 2B i zobacz przykład w pliku uzupełniającym 1).
  4. Dostosuj maksymalne stężenie leków 1 i 2 w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 2B).
    UWAGA: Upewnij się, że dostosowałeś stężenia leków 1 i 2; w przeciwnym razie zostaną obliczone nieprawidłowe wartości LD50 i IC50.
  5. Oblicz wartości IC50 za pomocą odpowiedniej aplikacji do analizy danych (w tym przypadku używany jest GraphPad). Do obliczenia wartości IC50 użyj średniej zmiany krotności i zmiany krotności odchylenia standardowego w porównaniu z DMSO określonej tylko w kroku 3.4 i skopiuj tabele IC50 leków 1 i 2 do oprogramowania do analizy danych (Log (inhibitor) a znormalizowana odpowiedź, zmienne nachylenie) (Rysunek 3A).
    1. Do obliczeń IC50 należy używać tylko danych z odwiertów, do których dodano pojedynczy składnik. Użyj Rejestruj wartości stężeń leków w oprogramowaniu do analizy danych, które są automatycznie obliczane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym.
  6. Oblicz wynik synergii:
    1. Użyj średniej zmiany krotności w porównaniu z DMSO tylko dla każdej kombinacji, aby obliczyć wynik synergii za pomocą pakietu oprogramowania lub strony internetowej. Na przykład, https://synergyfinder.fimm.fi/12 (parametry: dopasowanie krzywej LL4, metoda ZIP do obliczania wyniku synergii). Plik uzupełniający 1 automatycznie oblicza wartości potrzebne do utworzenia tabeli wejściowej synergii, do której można przesłać SynergyFinder (Rysunek 3B). Przykładowa tabela danych wejściowych synergii znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
      UWAGA: Wynik powyżej 10 oznacza synergię, jeden poniżej -10 oznacza antagonizm, a wartość między -10 a 10 oznacza efekty addytywne.
  7. Oblicz wynik LD50:
    1. Dla każdego stężenia leku 1 oblicz LD50 leku 2. Plik uzupełniający automatycznie oblicza wartość Log2 i odchylenie standardowe dla każdego stężenia (Rysunek 3C).
    2. Wprowadź średnią i odchylenie standardowe zmiany krotności Log2 w porównaniu z 0 godziną, a także liczbę powtórzeń w oprogramowaniu do analizy danych (w tym badaniu 2,) i oblicz wartość LD50 i odchylenie standardowe LD50, określając stężenie przy -1 (Log2 = -1 oznacza wartość log2, dla której 50% sygnału jest tracone w porównaniu z 0 godziną). W tych obliczeniach należy użyć modelu parametrów logarytmu (inhibitora) w funkcji odpowiedzi, zmiennego nachylenia 4.
      UWAGA: Oprogramowanie do analizy danych nie oblicza automatycznie stężenia leku odpowiadającego wartości log2 = -1; jednak wartość tę można dodać do raportowanych obliczeń oprogramowania do analizy danych jako równanie zdefiniowane przez użytkownika (Rysunek 3C). Upewnij się, że używasz wartości stężenia Log w oprogramowaniu do analizy danych, które są automatycznie obliczane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym. Plik uzupełniający 4 przedstawia panele IC50 i LD50 w oprogramowaniu GraphPad.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jako przykład, oceniono synergię trametynibu (inhibitor MEK) i GDC-0941 (inhibitor PI3K), które hamują dwa szlaki efektorowe RAS w linii komórek macierzystych glejaka myszy 5746 (ekspresja RFP) (Rysunek 4). Rysunek 4A pokazuje tę samą kulę po 0 h i 72 h potraktowaną kombinacją trametynibu i GDC-0941. Obrazy te zostały wyeksportowane bezpośrednio z oprogramowania Live Imager. IC50 i LD50 zostały obliczone zgodnie z opisem w GraphPad (Rysunek 4B,D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje testy przesiewowe 3D leków, które zostały skutecznie wykorzystane do oceny podatności leków w sferoidalnych modelach glejaka8. Ten system testów sferoidalnych 3D został specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić dokładniejsze badanie przedkliniczne chemioterapii skojarzonej dla linii komórkowych glejaka hodowanych w kulach. W przypadku HGG metoda ta stanowi ramy do identyfikacji potencjalnych podatności leków na tę wyniszczającą chorobę. Jednak potencjalne zastosowania tego syst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 15 mlCELLTREAT22941115 ml polipropylenowe probówki wirówkowe, sterylna
96-dołkowa płytkaS-bioMS9096UZ96-dołkowa okrągłodenna płytka o bardzo niskim nasadce
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Roztwór do odrywania komórek
Barwnik z pomarańczy akrydyny/jodku propidiumLogosBiosystems F23001Żywy/martwy barwnik do liczenia komórek
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Ludzki rekombinowany licznik komórek bFGF
Logos BiosystemsL20001LUNA-FL Wirówka z podwójnym licznikiem komórek fluorescencyjnych
Eppendorf5810ROdwirowywanie komórek i płytek
DMSOPierce20688rozpuszczalnik do związków
EGFSTEMCELL Technologie78006.2Ludzkie rekombinowane
probówki EppendorfaCostar07-200-534Probówki do mikrowirówek
ExcelMicrosoftExcel
SelleckchemS1065Lek 1
GraphPad GraphPadGraphPadPryzmat 9IC50 i LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3Mikroskop fluorescencyjny wbudowany w inkubator kultur tkankowych, który obrazuje każdy studzienek w określonych odstępach czasu.
Oprogramowanie IncucyteSartoriusIncucyte 2022BAnaliza danych dotyczących proliferacji
MediaSTEMCELL Technologies5702Zestaw proliferacyjny NeuroCult (myszy i szczury) zawierający podłoże podstawowe i suplement wzrostu
Penicylina-Streptomycyna Gibco15140122Antybiotyki do dodania do pożywki
TrametynibSelleckchemS2673Lek 2
EGF GDC-0941 Obliczanie logo hemocytometru

Bibliografia

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Przesiewowe badanie leków na sferoidachkomórki macierzyste glejakatest wrażliwości na lekitrójwymiarowe modele komórkoweterapia skojarzona lekamitest śmierci komórkowejwskaźnik synergiiekspresja RFPobrazowanie na żywoobliczanie IC50

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.