Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe wrażliwości na leki sferoidalne w liniach komórek macierzystych glejaka

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Badania wrażliwości na leki in vitro są ważnymi narzędziami do odkrywania kombinacji leków przeciwnowotworowych. Komórki hodowane w kulkach aktywują różne szlaki sygnałowe i są uważane za bardziej reprezentatywne dla modeli in vivo niż jednowarstwowe linie komórkowe. Protokół ten opisuje metodę badań przesiewowych in vitro leków w kierunku linii sferoidalnych.

Streszczenie

Badania przesiewowe wrażliwości na leki in vitro są ważnymi narzędziami w odkrywaniu terapii skojarzonych leków przeciwnowotworowych. Zazwyczaj te badania przesiewowe leków in vitro są wykonywane na komórkach hodowanych w monowarstwie. Jednak te dwuwymiarowe (2D) modele są uważane za mniej dokładne w porównaniu z trójwymiarowymi (3D) modelami komórek sferoidalnych; Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku linii komórek macierzystych glejaka. Komórki hodowane w kulkach aktywują różne szlaki sygnałowe i są uważane za bardziej reprezentatywne dla modeli in vivo niż jednowarstwowe linie komórkowe. Protokół ten opisuje metodę badań przesiewowych in vitro leków linii sferoidalnych; Jako przykład podaje się linie komórek macierzystych glejaka mysiego i ludzkiego. Protokół ten opisuje test 3D sferoidalnej wrażliwości na lek i synergii, który można wykorzystać do określenia, czy lek lub kombinacja leków indukuje śmierć komórki i czy dwa leki działają synergicznie. Linie komórek macierzystych glejaka są modyfikowane w celu wyrażenia zapytania ofertowego. Komórki są platerowane na 96 płytkach o niskim przyleganiu z okrągłym dnem studni, a kule pozostawia się do uformowania przez noc. Dodaje się leki, a wzrost jest monitorowany poprzez pomiar sygnału RFP w czasie za pomocą systemu obrazowania na żywo Incucyte, mikroskopu fluorescencyjnego wbudowanego w inkubator do hodowli tkankowych. Połowa maksymalnego stężenia hamującego (IC50), mediana dawki śmiertelnej (LD50) i wynik synergii są następnie obliczane w celu oceny wrażliwości na leki stosowane w monoterapii lub w skojarzeniu. Trójwymiarowy charakter tego testu zapewnia dokładniejsze odzwierciedlenie wzrostu, zachowania i wrażliwości guza na leki in vivo, tworząc w ten sposób podstawę do dalszych badań przedklinicznych.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy to wyniszczający, wysokozaawansowany nowotwór mózgu z 5% pięcioletnim przeżyciem całkowitym1. Glejaki o wysokim stopniu złośliwości (HGG), takie jak glejak, stanowią główną przyczynę śmiertelności związanej z rakiem w populacji pediatrycznej2 i są jednym z najbardziej opornych nowotworów do leczenia również u dorosłych3. Pomimo znacznego postępu w naszym zrozumieniu molekularnych czynników powodujących HGG, opcje leczenia pozostają ograniczone3, podkreślając potrzebę metod badań przesiewowych leków, które dokładniej przewidują wrażliwość terapeutyczną w klinice.

3D hodowle komórkowe były przede wszystkim wykorzystywane do modelowania fizjologicznie istotnych zachowań komórek4. Co więcej, architektura 3D mikrośrodowiska guza może być rekapitulowana in vitro, ustanawiając testy wzrostu 3D5. Wzrost sferoidów aktywuje również różne szlaki sygnałowe i dlatego jest uważany za bardziej reprezentatywny dla modeli in vivo6,7 w porównaniu z kulturą 2D. Pediatryczne komórki macierzyste HGG i nasze mysie linie komórek macierzystych glejaka NF1 naturalnie rosną jako neurosfery i wykorzystały te mysie linie komórkowe glejaka NF1 w średnioprzepustowym badaniu przesiewowym leków8. Użyte tutaj linie pediatryczne wywodzą się z HGG pediatrycznego półkuli, linii środkowej i móżdżku i zostały nabyte i w pełni scharakteryzowane przez Children's Brain Tumor Network (profile mutacji i ekspresji genów)9. Linie te zostały zmodyfikowane w celu ekspresji jądrowego białka czerwonej fluorescencji (RFP), co pozwala na monitorowanie proliferacji i przeżycia za pomocą systemu obrazowania na żywo Incucyte. Intensywność sygnału RFP jest reprezentatywna dla liczby obecnych komórek. Można również zastosować inne fluorofory, takie jak białko zielonej fluorescencji (GFP).

Chemioterapia skojarzona w leczeniu ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci, chłoniaków, nowotworów nabłonkowych i wielu innych nowotworów jest skutecznym sposobem na wyeliminowanie nowotworów i zapobieganie lekooporności na pojedyncze czynniki10,11. Istnieją jednak ograniczone informacje na temat tego, które środki należy łączyć, aby osiągnąć czułość terapeutyczną w HGG, co zachęca do stosowania dokładniejszych modeli sferoidalnych w testach leków in vitro.

Protokół

Wszystkie procedury protokołu zostały zatwierdzone przez Children's Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (IRB).

1. 3D posiewanie komórek sferoidalnych

  1. Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych glejaka: Aby przygotować podłoże podstawowe, dodaj 50 ml suplementu proliferacyjnego i 5 ml 100-krotnego roztworu penicyliny i streptomycyny (10 000 U/ml) do podłoża podstawowego (500 ml). Aby wytworzyć pożywkę z komórek macierzystych glejaka, dodaj naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) do końcowego stężenia odpowiednio 20 ng / ml i 10 ng / ml, zgodnie z opisem producenta.
    UWAGA: Pożywka z komórek macierzystych glejaka może być używana przez 1 tydzień przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C.
  2. Dysocjacja komórek wyrażających RFP:
    UWAGA: W tym przykładzie użyto mysiej linii komórek macierzystych NF1 HGG 5746.
    1. Przenieś kulki glejaka do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwiruj kulki glejaka w wirówce (150 x g przez 5 minut). Usunąć supernatant i dodać 300 μl akutazy w celu dysocjacji kulek (inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C).
    2. Dodać 1 ml pożywki z komórek macierzystych glejaka i rozbić kulki przez delikatne pipetowanie. Odwirować zdysocjowane komórki przez 5 minut przy 150 x g, odessać supernatant i rozpuścić osad w 1 ml pożywki z komórek macierzystych glejaka.
  3. Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek lub hemocytometru. W przypadku korzystania z fluorescencyjnego licznika komórek, dodaj 18 μl zawiesiny komórek do 2 μl barwnika pomarańczy akrydynowej / jodku propidyny. Załadować 12 μl tej zawiesiny do hemocytometru, aby policzyć liczbę żywych/martwych komórek obecnych w zawiesinie.
  4. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 2 000 komórek na 100 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka.
    UWAGA: Modyfikacje stężenia komórek mogą być zależne od linii komórkowej i można je odpowiednio dostosować.
  5. Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 μl zawiesiny komórek (2 000 komórek na 100 μl) do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem i niskim mocowaniem metodą pipetowania odwrotnego.
    UWAGA: Używaj niskich płyt mocujących z okrągłym dnem; Płytki te będą stymulować tworzenie się pojedynczej kuli glejaka w każdej studzience. Odwrotne pipetowanie pozwala uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, które zakłócają rejestrowanie obrazu z systemu analizy żywych komórek.
  6. Odwirować płytki przy 150 x g przez 5 min.
    UWAGA: Wirowanie jest krytycznym krokiem do zainicjowania tworzenia neurosfery 3D.
  7. Inkubuj przez noc, aby w każdej studzience mogła uformować się pojedyncza kula.

2. Dodawanie leków do testu synergicznego (Rysunek 1)

  1. Upewnij się, że każda studzienka na 96-dołkowej płytce otrzymuje określone stężenie zarówno narkotyków 1, jak i 2. Utwórz siatkę, w której każde stężenie leku 1 jest łączone z każdym stężeniem leku 2 w dwóch egzemplarzach.
  2. Wykonaj seryjne rozcieńczanie dwóch leków, dla których zostanie określona synergia (5 rozcieńczeń leku 1 i 7 rozcieńczeń leku 2) przy użyciu pożywki z komórek macierzystych glejaka (Rysunek 1A).
    UWAGA: W tym badaniu stosuje się 50% serię rozcieńczeń seryjnych; Można jednak wykorzystać dowolną serię rozcieńczeń.
    1. Seria rozcieńczeń powinna być 7 razy bardziej skoncentrowana niż pożądane stężenie końcowe w każdym dołku. Na przykład, jeśli najwyższe stężenie końcowe dla leku 1 wynosi 1 μM, należy wykonać pierwsze stężenie z serii rozcieńczeń dla leku 1, 7 μM (1 ml, probówka B lub I w Rysunek 1A).
    2. Dodać 500 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka do każdej dodatkowej probówki z serii rozcieńczeń (probówki C-H i J-M, jak pokazano na Rysunek 1).
    3. Aby utworzyć serię rozcieńczeń, należy odessać 500 μl mieszaniny leków z probówki B lub probówki I i dodać ją do następnej probówki z serii rozcieńczeń, odpowiednio probówki C lub probówki J (zawierającej 500 μl pożywki z komórek macierzystych glejaka). Dobrze wymieszać i powtórzyć do następnej probówki z serii rozcieńczeń. Wykonaj kontrolę DMSO (rura A) i upewnij się, że stężenie DMSO jest takie samo we wszystkich warunkach.
      UWAGA: Można dokonywać modyfikacji stężeń leków i serii rozcieńczeń. Należy upewnić się, że w pliku uzupełniającym 1 znajdują się prawidłowe stężenia leku, jeśli seria rozcieńczeń zostanie zmieniona.
  3. Do każdej studzienki z 96 dołków dodać 20 μl leku 1 i 20 μl leku 2 przez odwrócone pipetowanie, jak pokazano w Rysunek 1B, dla końcowej objętości 140 μL na studzienkę; kombinacje leków są oceniane w dwóch egzemplarzach. W przypadku korzystania z dostarczonej analizy końcowej dla IC50 i LD50, użyj układu leku, jak pokazano w Rysunek 1B.
    1. W tym teście mierzy się również działanie każdego leku osobno (bez obecności drugiego leku). Upewnij się, że dodałeś 20 μl pożywki kontrolnej DMSO (probówka A w Rysunek 1B) do tych pojedynczych dołków lekowych, aby doprowadzić końcową objętość każdej studzienki do 140 μl.
    2. Upewnij się, że studzienki nie zawierają pęcherzyków, ponieważ wpłynie to na obrazowanie.
      UWAGA: Dopuszcza się modyfikacje w ostatecznej wersji tomu; Należy jednak upewnić się, że dostosowano stężenia określone w pkt 2.2.
  4. Umieść płytki w kamerze na żywo i monitoruj wzrost każdej kuli w każdej studzience za pomocą modułu sferoidalnego, ustawienia pojedynczej sfery, obrazowania zarówno jasnego pola, jak i RFP przy 4-krotnym powiększeniu.
  5. Monitoruj płytki przez 72 godziny, obrazując każdą studzienkę płytki w regularnych odstępach czasu, zwykle 2 godziny < br / > UWAGA: Prześlij poprawną mapę tablicową; zapewni to właściwą analizę dalszych etapów (Rysunek 1C).

3. Obliczanie wyniku IC50, LD50 i synergii (Rysunek 2 i Rysunek 3)

  1. Przeanalizuj intensywność zapytania ofertowego dla każdego odwiertu i każdego punktu czasowego za pomocą oprogramowania do obrazowania na żywo. Zastosowane parametry analizy są wymienione w plikach uzupełniających (plik uzupełniający 2).
    UWAGA: W zależności od preferencji można stosować różne parametry analizy.
  2. Eksportuj dane zapytania ofertowego jako całkowitą intensywność zintegrowanego zapytania ofertowego na czerwono dla każdego odwiertu, upewniając się, że eksportujesz surowe, niezgrupowane dane (Rysunek 2A).
    UWAGA: W przypadku korzystania z dostarczonego szablonu (plik uzupełniający 1) do obliczenia IC50 i LD50 należy przestrzegać punktu 3.2
  3. Określ średnią i odchylenie standardowe dla każdej kombinacji leków (1) zmiany krotności w porównaniu tylko z DMSO (do tego obliczenia wartości 0 h nie są potrzebne) i (2) Log2 zmiany krotności w porównaniu z 0 godziną, wklejając surowe dane do dostarczonego arkusza Excela (Rysunek 2B i zobacz przykład w pliku uzupełniającym 1).
  4. Dostosuj maksymalne stężenie leków 1 i 2 w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 2B).
    UWAGA: Upewnij się, że dostosowałeś stężenia leków 1 i 2; w przeciwnym razie zostaną obliczone nieprawidłowe wartości LD50 i IC50.
  5. Oblicz wartości IC50 za pomocą odpowiedniej aplikacji do analizy danych (w tym przypadku używany jest GraphPad). Do obliczenia wartości IC50 użyj średniej zmiany krotności i zmiany krotności odchylenia standardowego w porównaniu z DMSO określonej tylko w kroku 3.4 i skopiuj tabele IC50 leków 1 i 2 do oprogramowania do analizy danych (Log (inhibitor) a znormalizowana odpowiedź, zmienne nachylenie) (Rysunek 3A).
    1. Do obliczeń IC50 należy używać tylko danych z odwiertów, do których dodano pojedynczy składnik. Użyj Rejestruj wartości stężeń leków w oprogramowaniu do analizy danych, które są automatycznie obliczane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym.
  6. Oblicz wynik synergii:
    1. Użyj średniej zmiany krotności w porównaniu z DMSO tylko dla każdej kombinacji, aby obliczyć wynik synergii za pomocą pakietu oprogramowania lub strony internetowej. Na przykład, https://synergyfinder.fimm.fi/12 (parametry: dopasowanie krzywej LL4, metoda ZIP do obliczania wyniku synergii). Plik uzupełniający 1 automatycznie oblicza wartości potrzebne do utworzenia tabeli wejściowej synergii, do której można przesłać SynergyFinder (Rysunek 3B). Przykładowa tabela danych wejściowych synergii znajduje się w pliku uzupełniającym 3.
      UWAGA: Wynik powyżej 10 oznacza synergię, jeden poniżej -10 oznacza antagonizm, a wartość między -10 a 10 oznacza efekty addytywne.
  7. Oblicz wynik LD50:
    1. Dla każdego stężenia leku 1 oblicz LD50 leku 2. Plik uzupełniający automatycznie oblicza wartość Log2 i odchylenie standardowe dla każdego stężenia (Rysunek 3C).
    2. Wprowadź średnią i odchylenie standardowe zmiany krotności Log2 w porównaniu z 0 godziną, a także liczbę powtórzeń w oprogramowaniu do analizy danych (w tym badaniu 2,) i oblicz wartość LD50 i odchylenie standardowe LD50, określając stężenie przy -1 (Log2 = -1 oznacza wartość log2, dla której 50% sygnału jest tracone w porównaniu z 0 godziną). W tych obliczeniach należy użyć modelu parametrów logarytmu (inhibitora) w funkcji odpowiedzi, zmiennego nachylenia 4.
      UWAGA: Oprogramowanie do analizy danych nie oblicza automatycznie stężenia leku odpowiadającego wartości log2 = -1; jednak wartość tę można dodać do raportowanych obliczeń oprogramowania do analizy danych jako równanie zdefiniowane przez użytkownika (Rysunek 3C). Upewnij się, że używasz wartości stężenia Log w oprogramowaniu do analizy danych, które są automatycznie obliczane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym. Plik uzupełniający 4 przedstawia panele IC50 i LD50 w oprogramowaniu GraphPad.

Wyniki

Jako przykład, oceniono synergię trametynibu (inhibitor MEK) i GDC-0941 (inhibitor PI3K), które hamują dwa szlaki efektorowe RAS w linii komórek macierzystych glejaka myszy 5746 (ekspresja RFP) (Rysunek 4). Rysunek 4A pokazuje tę samą kulę po 0 h i 72 h potraktowaną kombinacją trametynibu i GDC-0941. Obrazy te zostały wyeksportowane bezpośrednio z oprogramowania Live Imager. IC50 i LD50 zostały obliczone zgodnie z opisem w GraphPad (Rysunek 4B,D), synergia została obliczona za pomocą SynergyFinder (Rysunek 4C). Rysunek 4B pokazuje wynik obliczeń IC50; Wartości LogIC50, Hillslope i IC50 są pokazane dla obu leków, a także 95% przedział ufności i dobroć dopasowania. Rysunek 4C pokazuje krzywą dawka-odpowiedź dla każdego leku osobno (stężenie leku w porównaniu z procentowym zahamowaniem), kolorową matrycę pokazującą procentowe zahamowanie wzrostu dla każdej kombinacji leków, oraz wykres 3D wyniku synergii między oboma lekami, w tym przypadku wynik synergii wynosi 22,356. Rysunek 4D pokazuje dane wyjściowe dla wartości LD50 leków pojedynczo lub w połączeniu. Istotne są wartości LogLD50 i LD50 oraz odpowiadające im 95% przedziały ufności. Zgodnie z oczekiwaniami, LD50 dla trametynibu są niższe przy niższych stężeniach GDC-0941. Należy pamiętać, że LD50 jest markerem śmierci komórki i oznacza 50% śmierć komórki w porównaniu z punktem początkowym testu.

figure-results-1
Rysunek 1: Ustawianie 96-dołkowej płytki synergii 2-lekowej. (A) Schematyczne przedstawienie serii 1/2 rozcieńczeń leków 1 i 2. Stężenia leku muszą być 7 razy wyższe niż stężenie końcowe w każdym dołku. (B) Obraz punktu 0 h 96-dołkowej płytki z 5746 kulkami RFP. Serię rozcieńczeń leku 1 dodaje się do każdego rzędu, jak wskazano, co daje łącznie 7 rozcieńczeń i kontrolę DMSO. Serię rozcieńczeń leku 2 dodaje się za każdym razem do 2 kolumn, jak wskazano, co daje łącznie 5 rozcieńczeń i kontrolę DMSO. (C) Przykład mapy tablic wgranej do oprogramowania Live Imager. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Eksport pozyskanych danych. (A) Po 72 godzinach pomiarów, eksportowana jest całkowita intensywność integracji czerwonego obiektu dla każdego dołka i każdego punktu czasowego. Grupowanie jest ustawione na wartość Brak. W opcjach eksportu (po prawej) wybierz opcję Organizuj według replik i Miejsce docelowe do schowka. (B) Wklej wyeksportowane dane we wskazanej komórce arkusza kalkulacyjnego (Plik uzupełniający 1). Zaktualizuj najwyższe stężenie dla każdego leku zgodnie ze wskazaniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przetwarzanie pozyskanych danych. (A) Tabele wejściowe IC50, które można skopiować do oprogramowania do analizy danych (Plik uzupełniający 4, panel IC50). Tabele te są generowane automatycznie w pliku uzupełniającym 1. (B) Tabela danych wejściowych synergii dla programu SynergyFinder może zostać wygenerowana poprzez skopiowanie tabeli żywotności do pliku uzupełniającego 3. Ten plik jest przesyłany do https://synergyfinder.fimm.fi/ ze wskazanymi wyborami. Wynik synergii i macierz są obliczane automatycznie. (C) Tabele wejściowe LD50, które można skopiować do oprogramowania do analizy danych (plik uzupełniający 4, panel LD50) w celu analizy. Tabele te są generowane automatycznie w pliku uzupełniającym 1. Na dole pokazano, w jaki sposób LD50 został dodany do wartości raportowanych w oprogramowaniu do analizy danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykład wyników badania synergii trametynibu i GDC-0941 w 5746 sferach komórek macierzystych glejaka. (A) Obraz po 0 h i 72 h po leczeniu kuli 5746 RFP potraktowanej 10 nM trametynibem i 1000 nM GDC-0941. (B) Dane wyjściowe obliczeń IC50 pokazujące wartość IC50 i odchylenie standardowe IC50. (C) Wyniki programu SynergyFinder. Po lewej: krzywe hamowania, w środku: tabela procentowego hamowania, po prawej: Mapa synergii pokazująca, że trametynib i GDC-0941 mają wynik synergii 22,3. (D) Dane wyjściowe obliczeń LD50, pokazujące wartości LD50 i odchylenie standardowe obliczone na LD50. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Parametry używane do analizy sygnału RFP w Incucyte. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Arkusz kalkulacyjny, w którym przetwarzane są wygenerowane dane i generowane są tabele wejściowe dla GraphPad i SynergyFinder. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Arkusz kalkulacyjny tabeli wejściowej SynergyFinder. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plik GraphPad do obliczania wartości IC50 i LD50 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje testy przesiewowe 3D leków, które zostały skutecznie wykorzystane do oceny podatności leków w sferoidalnych modelach glejaka8. Ten system testów sferoidalnych 3D został specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić dokładniejsze badanie przedkliniczne chemioterapii skojarzonej dla linii komórkowych glejaka hodowanych w kulach. W przypadku HGG metoda ta stanowi ramy do identyfikacji potencjalnych podatności leków na tę wyniszczającą chorobę. Jednak potencjalne zastosowania tego systemu nie ograniczają się do glejaka, a protokół ten może być wykorzystany do oceny nowych terapii w modelach 3D różnych innych schorzeń.

Celem tego badania jest zwiększenie przewidywalności badań przesiewowych leków in vitro, aby nadać priorytet tym kombinacjom leków, które mają największe prawdopodobieństwo sukcesu w badaniach przedklinicznych, a ostatecznie w klinice. Zwłaszcza w przypadku glejaka identyfikacja silnych kombinacji leków za pomocą badań przesiewowych leków in vitro, które dobrze sprawdzają się w praktyce klinicznej, pozostaje ograniczona. Wynika to częściowo z zastosowania mniej idealnych linii komórkowych glejaka wyhodowanych w surowicy13, zastosowania jednowarstwowych testów 2D4 oraz skupienia się na wartościach IC50 (50% zmniejszony wzrost) zamiast LD50 (50% mniej komórek w porównaniu z początkiem testu)14. Testy wzrostu sferoidalnego komórek macierzystych glejaka in vitro są wykorzystywane do ustalania priorytetów kombinacji leków do oceny w naszych modelach przedklinicznych. W naszym ustalaniu priorytetów kombinacji leków bierze się pod uwagę kilka czynników: 1) Niskie wartości LD50, skupienie się na śmierci komórki, a nie na zmniejszonej proliferacji, zwiększa potencjalny sukces; 2) W idealnym przypadku te wartości LD50 są poniżej wartości Cmax, maksymalnego stężenia w surowicy, które można bezpiecznie osiągnąć podczas badań farmakokinetycznych leków do badań klinicznych, jeśli są dostępne; 3) Wysoki wynik synergii, jeśli oba leki działają synergistycznie, wskazuje to na mechanistyczną współpracę między oboma lekami. Chociaż ten ostatni punkt nie jest wymagany do zidentyfikowania silnych kombinacji leków, synergia może zwiększyć skuteczność leku bez zwiększania jego toksyczności.

Co ważne, oceny wrażliwości leków in vitro pozostają ważnym narzędziem do odkrywania nowych terapii lub kombinacji leków, które mogą zmniejszać guzy. Przedstawiony tutaj protokół pozwala nam określić wrażliwość i synergię leku z systemem testów wzrostu sferoidalnego 3D, który może być wykorzystany do priorytetyzacji kombinacji leków do oceny w modelach przedklinicznych.

Protokół składa się z kilku krytycznych kroków. Mierzymy wzrost pojedynczych kolonii w każdym dołku na 96-dołkowej płytce. Stosowanie płytek studzienkowych z okrągłym dnem o niskim mocowaniu ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że komórki nie przyczepiają się do studzienki i że stymulowane jest tworzenie kuli. Studzienka z okrągłym dnem zapewnia, że pojedyncza kula zawsze znajduje się w tym samym miejscu płytki 96-dołkowej.

Po posianiu komórek płytki należy odwirować, aby upewnić się, że wszystkie posiane komórki spotkają się w najniższym punkcie studzienki o okrągłym dnie i że powstanie pojedyncza kula 3D. Całkowita objętość każdej studzienki musi wynosić 140 μl. Zapewni to prawidłowe końcowe stężenia odpowiednich leków w każdej studzience.

Podczas pipetowania do płytki 96-dołkowej należy stosować technikę pipetowania odwrotnego, co zmniejsza ryzyko powstawania pęcherzyków powietrza w studzienkach. Pęcherzyki powietrza utrudniają kamerze na żywo prawidłowe obrazowanie każdej studzienki, a intensywność fluorescencji będzie nieprawidłowa, co wpłynie na dalszą analizę wyników.

Dostarczony układ tablic i arkusze kalkulacyjne są specyficzne dla opisanego protokołu. W przypadku odstępstwa od poszycia zostaną obliczone nieprawidłowe wartości IC50 i LD50. Arkusz kalkulacyjny automatycznie oblicza rozcieńczenia, gdy podane jest najwyższe stężenie. Dla każdego eksperymentu aktualizuj najwyższe stężenie, w przeciwnym razie zostaną obliczone nieprawidłowe wartości IC50 i LD50.

Graphpad wykorzystuje stężenia logarytmiczne do obliczania wartości IC50 i LD50. Te stężenia logarytmiczne są automatycznie obliczane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym i można je bezpośrednio skopiować do oprogramowania. Niestosowanie stężeń logarytmicznych spowoduje nieprawidłowe wartości IC50 i LD50.

Używamy linii komórkowych, które naturalnie rosną jako kule. Za pomocą tego protokołu można zmusić przylegające komórki do wejścia do kuli; Nie ma jednak gwarancji, że będą w stanie się rozprzestrzeniać. Liczba komórek posianych w każdym dołku może być zależna od linii komórkowej i zależeć od unikalnych cech wzrostu poszczególnych linii komórkowych, które można łatwo dostosować. Proponowane krzywe rozcieńczania są jedynie sugestiami. Można dokonywać modyfikacji stężeń leków i serii rozcieńczeń. Ważne jest jednak, aby w przypadku zmiany serii rozcieńczeń podać prawidłowe stężenia leku w pliku uzupełniającym 1 ; w przeciwnym razie obliczone wartości IC50 i LD50 będą nieprawidłowe. Można zdecydować się na użycie innego układu płyt; Na przykład należy użyć tylko jednej repliki zamiast dwóch. W tym celu użytkownik musi zaktualizować arkusz kalkulacyjny, aby odzwierciedlić tę zmianę.

Po poszyciu w rzadkich przypadkach w jednej studzience tworzy się wiele kul 3D. W takim przypadku powtórzenie kroku wirowania (150 x g) powoduje, że kule te łączą się w jedną kulę. Jeśli zostanie popełniony błąd poszycia, w wyniku którego zostanie zmieniony układ blachy, dostarczony arkusz kalkulacyjny może zostać zmodyfikowany tak, aby odzwierciedlał nową mapę płyt. Jeśli punkt danych jest wartością odstającą i musi zostać usunięty z analizy, dostarczony arkusz kalkulacyjny można zaktualizować.

Głównym ograniczeniem tego systemu jest to, że wykorzystuje on linie komórkowe naturalnie hodowane jako kule, a nie linie przylegające hodowane w monowarstwach. Jeśli linie komórkowe nie mogą tworzyć kul, należy zastosować tradycyjne testy proliferacji 2D. Zaletą wykorzystania testów wzrostu 3D podobnych do organoidów, takich jak ten, w porównaniu z konwencjonalnymi monowarstwami 2D, jest to, że architektura i aktywowane szlaki sygnałowe dokładniej odzwierciedlają te obserwowane w modelach in vivo chorób ludzkich, podkreślając potencjał translacyjny i możliwość zastosowania tych metod.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 15 mlCELLTREAT22941115 ml polipropylenowe probówki wirówkowe, sterylna
96-dołkowa płytkaS-bioMS9096UZ96-dołkowa okrągłodenna płytka o bardzo niskim nasadce
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Roztwór do odrywania komórek
Barwnik z pomarańczy akrydyny/jodku propidiumLogosBiosystems F23001Żywy/martwy barwnik do liczenia komórek
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Ludzki rekombinowany licznik komórek bFGF
Logos BiosystemsL20001LUNA-FL Wirówka z podwójnym licznikiem komórek fluorescencyjnych
Eppendorf5810ROdwirowywanie komórek i płytek
DMSOPierce20688rozpuszczalnik do związków
EGFSTEMCELL Technologie78006.2Ludzkie rekombinowane
probówki EppendorfaCostar07-200-534Probówki do mikrowirówek
ExcelMicrosoftExcel
SelleckchemS1065Lek 1
GraphPad GraphPadGraphPadPryzmat 9IC50 i LD50
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3Mikroskop fluorescencyjny wbudowany w inkubator kultur tkankowych, który obrazuje każdy studzienek w określonych odstępach czasu.
Oprogramowanie IncucyteSartoriusIncucyte 2022BAnaliza danych dotyczących proliferacji
MediaSTEMCELL Technologies5702Zestaw proliferacyjny NeuroCult (myszy i szczury) zawierający podłoże podstawowe i suplement wzrostu
Penicylina-Streptomycyna Gibco15140122Antybiotyki do dodania do pożywki
TrametynibSelleckchemS2673Lek 2
EGF GDC-0941 Obliczanie logo hemocytometru

Bibliografia

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewowe badanie lek w na sferoidachkom rki macierzyste glejakatest wra liwo ci na lekitr jwymiarowe modele kom rkoweterapia skojarzona lekamitest mierci kom rkowejwska nik synergiiekspresja RFPobrazowanie na ywoobliczanie IC50

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.