Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany impaktor do modelu kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65656

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy tutaj nowatorskie zautomatyzowane urządzenie do leczenia urazów rdzenia kręgowego dla myszy, które może dokładnie tworzyć modele urazów rdzenia kręgowego w różnym stopniu.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) spowodowany urazami, takimi jak wypadki samochodowe i upadki, jest związany z trwałą dysfunkcją rdzenia kręgowego. Tworzenie modeli stłuczeń urazu rdzenia kręgowego poprzez oddziaływanie na rdzeń kręgowy skutkuje podobnymi patologiami do większości urazów rdzenia kręgowego w praktyce klinicznej. Dokładne, powtarzalne i wygodne modele zwierzęce urazów rdzenia kręgowego są niezbędne do badania urazów rdzenia kręgowego. Przedstawiamy nowatorskie zautomatyzowane urządzenie do leczenia urazów rdzenia kręgowego dla myszy, inteligentny system urazów rdzenia kręgowego Uniwersytetu Guangzhou Jinan, który może tworzyć modele urazów rdzenia kręgowego z dokładnością, powtarzalnością i wygodą. System precyzyjnie tworzy modele uszkodzenia rdzenia kręgowego o różnym stopniu za pomocą laserowych czujników odległości w połączeniu ze zautomatyzowaną platformą mobilną i zaawansowanym oprogramowaniem. Użyliśmy tego systemu do stworzenia trzech poziomów modeli myszy z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, określiliśmy ich wyniki w skali myszy Basso (BMS) i przeprowadziliśmy testy behawioralne i barwienia, aby wykazać jego dokładność i odtwarzalność. Pokazujemy każdy etap opracowywania modeli urazów za pomocą tego urządzenia, tworząc ustandaryzowaną procedurę. Metoda ta pozwala na uzyskanie powtarzalnych modeli kontuzji rdzenia kręgowego u myszy i redukuje czynniki manipulacyjne u ludzi dzięki wygodnym procedurom obsługi. Opracowany model zwierzęcy jest wiarygodny w badaniu mechanizmów urazów rdzenia kręgowego i związanych z nimi podejść do leczenia.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego zazwyczaj powoduje trwałą dysfunkcję rdzenia kręgowego poniżej uszkodzonego segmentu. Jest to najczęściej spowodowane przez obiekty uderzające w kręgosłup i nadmierny wyprost kręgosłupa, takie jak wypadki drogowe i upadki1. Ze względu na ograniczoną dostępność skutecznych opcji leczenia urazów rdzenia kręgowego, wyjaśnienie patogenezy urazów rdzenia kręgowego przy użyciu modeli zwierzęcych będzie przydatne dla opracowania odpowiednich podejść do leczenia. Model kontuzji rdzenia kręgowego spowodowany uderzeniem w rdzeń kręgowy skutkuje rozwojem modeli zwierzęcych z podobnymi patologiami do większości klinicznych przypadków urazów rdzenia kręgowego2,3. Dlatego ważne jest, aby stworzyć dokładne, powtarzalne i wygodne modele zwierzęce do urazów rdzenia kręgowego.

Od czasu wynalezienia przez Allena pierwszego zwierzęcego modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego w 1911 roku, nastąpił znaczny postęp w rozwoju narzędzi do tworzenia zwierzęcych modeli urazów rdzenia kręgowego4,5. Na podstawie mechanizmów urazów, modele urazów rdzenia kręgowego są klasyfikowane jako stłuczenie, kompresja, rozproszenie, zwichnięcie, przecięcie lub chemia6. Wśród nich modele kontuzji, które wykorzystują siły zewnętrzne do przemieszczenia i uszkodzenia rdzenia kręgowego, są najbliższe etiologii klinicznej większości pacjentów z urazami rdzenia kręgowego. W związku z tym model kontuzji był używany przez wielu badaczy w badaniach nad urazami rdzenia kręgowego3,7. Do opracowania modeli kontuzji rdzenia kręgowego wykorzystuje się różne instrumenty. Wieloośrodkowe badania nad urazami rdzenia kręgowego (MASCIS) Uniwersytetu Nowojorskiego (NYU) powodują stłuczenia rdzenia kręgowego za pomocą urządzenia do obniżania wagi8. Po kilku zaktualizowanych wersjach, impaktor MASCIS jest szeroko stosowany do tworzenia modeli zwierzęcych kontuzji rdzenia kręgowego9. Jednak gdy pręt uderzeniowy MASCIS upadnie i uderzy w rdzeń kręgowy, może dojść do wielu urazów, co wpływa na stopień urazu w modelach urazów rdzenia kręgowego. Co więcej, osiągnięcie precyzji mechanicznej w celu zapewnienia dokładności przyrządu i powtarzalności modelu produkcyjnego jest również wyzwaniem. Impaktory o nieskończonym horyzoncie powodują stłuczenia, kontrolując siłę przyłożoną do rdzenia kręgowego, a nie ciężkie krople10. Wykorzystuje komputer podłączony do czujnika do bezpośredniego pomiaru siły uderzenia między impaktorem a rdzeniem kręgowym. Po osiągnięciu progu impaktor jest natychmiast chowany, co pozwala uniknąć odbicia ciężaru i poprawia dokładność10,11. Jednak użycie tej modalności motorycznej do zadawania uszkodzeń może skutkować niespójnymi uszkodzeniami i deficytami funkcjonalnymi6. Urządzenie Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU) kompresuje grzbietową powierzchnię rdzenia kręgowego w tempie przejściowym za pomocą sterownika elektromagnetycznego12,13. To urządzenie jest podobne do impaktorów nieskończonego horyzontu, ponieważ wykorzystuje uciski na krótkie odległości do powodowania urazów rdzenia kręgowego. Ma jednak różne ograniczenia polegające na tym, że początkowe określenie punktu zerowego spowoduje błędy ze względu na obecność płynu mózgowo-rdzeniowego6,14. Podsumowując, istnieje wiele instrumentów, które można wykorzystać do opracowania modeli zwierzęcych urazów rdzenia kręgowego, ale wszystkie mają pewne ograniczenia, które prowadzą do niewystarczającej dokładności i odtwarzalności modeli zwierzęcych. Dlatego, aby dokładniej, wygodniej i powtarzalniej tworzyć mysie modele kontuzji rdzenia kręgowego, potrzebny jest zautomatyzowany i inteligentny impaktor urazu rdzenia kręgowego.

Prezentujemy nowatorski impaktor do leczenia urazów rdzenia kręgowego, inteligentny system urazów rdzenia kręgowego Uniwersytetu Guangzhou Jinan (G smart SCI system; Rysunek 1), do tworzenia modeli kontuzji rdzenia kręgowego. Urządzenie wykorzystuje dalmierz laserowy jako urządzenie pozycjonujące, w połączeniu ze zautomatyzowaną platformą mobilną do automatyzacji uderzeń zgodnie z ustawionymi parametrami uderzenia, w tym prędkością uderzenia, głębokością uderzenia i czasem przebywania. Zautomatyzowana operacja zmniejsza czynnik ludzki i poprawia dokładność oraz odtwarzalność modeli zwierzęcych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Jinan.

1. Znieczulenie zwierząt i laminektomia kręgosłupa T10

  1. Do tego badania wykorzystaj 8-tygodniowe samice młodych dorosłych myszy C57 / 6J. Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i diazepamu (5 mg/kg). Sprawdź, czy znieczulenie jest skuteczne, na co wskazuje utrata odruchu bólowego. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
  2. Ogol włosy z tyłu myszy za pomocą golarki, aby odsłonić skórę. Zdezynfekuj skórę trzema naprzemiennymi rundami jodoforu i alkoholu.
  3. Wykonaj 2,5 cm przyśrodkowe nacięcie podłużne w skórze grzbietowej za pomocą skalpela i odsłoń kręgosłup na poziomie T9-T11 za pomocą pęsety.
  4. Obustronnie zamocuj fasety T10 za pomocą stabilizatora kręgosłupa. Upewnij się, że grzbiet jest stabilnie zamocowany. Upewnij się, że mięśnie przykręgosłupowe są obnażone i usuń wyrostek kolczysty, a także blaszki za pomocą wiertła do mikroszlifowania, aby odsłonić rdzeń kręgowy segmentu T10.

2. Stłuczenie rdzenia kręgowego T10 za pomocą systemu SCI G smart

  1. Włącz przełącznik i poczekaj, aż urządzenie automatycznie powróci do swojego pierwotnego stanu. Umieść stabilizator kręgosłupa w systemie G smart SCI i zabezpiecz go za pomocą.
  2. Korzystając z ekranu dotykowego obsługi (Rysunek 2A), ustaw parametry obrażeń, w tym prędkość uderzenia (1 m/s), głębokość uderzenia (0,5 mm, 0,8 mm i 1,1 mm dla trzech różnych zestawów myszy) i czas przebywania (500 ms)15.
  3. Ustaw dalmierz laserowy na środku odsłoniętego rdzenia kręgowego, przesuwając platformę. (Rysunek 2B)
  4. Kliknij przycisk Gotowy na ekranie dotykowym (Rysunek 2C). Głowica udarowa automatycznie dostosuje się do określonej wysokości na podstawie parametrów ustawienia. Stół nośny automatycznie przesuwa miejsce uderzenia rdzenia kręgowego poniżej głowicy udarowej.
  5. Ręcznie naciśnij głowicę udarową, aby dokładniej określić miejsce uderzenia. Kliknij przycisk Start, głowica uderzeniowa uderzy w rdzeń kręgowy w oparciu o ustawione parametry.
  6. Wyjmij myszy z urządzenia i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym (20x), aby określić uraz rdzenia kręgowego (Rysunek 3). Aby określić powodzenie opracowania modelu, obserwuj miejscowe przekrwienie, zapaść i pęknięcie błony rdzeniowej.
  7. Zszyj mięśnie, powięź i skórę warstwa po warstwie za pomocą szwów 3-0. Umieść myszy w ciepłym pudełku i poczekaj na ich powrót do zdrowia.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Meloksykam (5 mg/kg) należy wstrzykiwać podskórnie codziennie przez 7 dni po zabiegu. Ręcznie opróżniaj pęcherz co 8 godzin, aż do przywrócenia funkcji pęcherza.
  2. Po 14 dniach od operacji należy usunąć nici szwów.

4. Testowanie skutków urazu kręgosłupa

  1. Oblicz wyniki BMS dla myszy z pierwszego dnia po operacji16,17.
  2. W 30dniu po operacji przeprowadź eksperymenty behawioralne na zwierzętach, w tym na wybiegu, uskoku stopy i rotarod16,17. Wybieg: Rekordowa odległość 45 cm; Maksymalny czas pracy 8 s; Wzmocnienie kamery 28,02; Próg intensywności 0,01. Błąd stopy: Nagraj 60 kroków dla każdej myszy. Rotarod: Prędkość obrotowa 20 obr./min. Zapisz czas upadku myszy i zapisz go jako 120 s przez ponad 120 s.
  3. W 31. dobie po operacji znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg / kg) i diazepamu (5 mg / kg), a następnie poddać myszy eutanazji przez perfuzję przy użyciu 4% PFA. Ostrożnie usuń rdzeń kręgowy i przechwyć 5 mm powyżej i poniżej miejsca urazu w celu osadzenia parafiny. Wykonaj 5 μm przekrój środka urazu rdzenia kręgowego myszy i wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną17.
  4. Do analizy statystycznej używaj komercyjnego oprogramowania. Wyrazić dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) i porównać przy użyciu jednoczynnikowej analizy ANOVA; p < 0,05 uznano za znaczące.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Laminektomię wykonano u 24 myszy żeńskich (w wieku 8 tygodni) zgodnie z powyższym opisem. Myszy w grupie pozorowanej (n=6) nie zostały poddane urazowi rdzenia kręgowego, natomiast pozostałe myszy, w tym grupa 0,5 mm (n=6), grupa 0,8 mm (n=6) oraz grupa 1,1 mm (n=6), zostały poddane uciskowi rdzenia kręgowego na różnych głębokościach. Wyniki w skali BMS regularnie rejestrowano do 1 miesiąca po operacji (Rycina 4). Odnotowano istotne różnice w pooperacyjnych wynikach BMS u myszy z różnych grup...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uraz rdzenia kręgowego może prowadzić do deficytów czuciowych i motorycznych, co może skutkować poważnymi upośledzeniami fizycznymi i psychicznymi. W Chinach częstość występowania urazów rdzenia kręgowego w różnych prowincjach waha się od 14,6 do 60,6 na milion18. Wzrost częstości występowania SCI będzie wywierał większą presję na system opieki zdrowotnej. Obecnie istnieją ograniczone możliwości skutecznego leczenia urazów rdzenia kręgowego, urazów, ponieważ jego patomechanizmy i procesy naprawcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin, nr 82102314 (do ZSJ) i 32170977 (do HSL) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong, nr 2022A1515010438 (do ZSJ) i 2022A1515012306 (do HSL). Badanie to było wspierane przez Program Klinicznej Technologii Pionierskiej Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Jinan w Chinach, nr JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (do HSL). Badanie to było wspierane przez Guangzhou Science and Technology Plan Project, nr 202201020018 (do HSL), 2023A04J1284 (do ZSJ) i 2023A03J1024 (do HSL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,01M PBS (proszek, pH 7,2-7,4)Solarbio Life SciencesP1010
2,2,2-tribromoetanolMacklin 75-80-9
4% paraformaldehyd utrwalacz tkankowyBiosharp life scienceBL539A
BiomikroskopLeicaLCC50 HD
Catwalk Noldus InformationTechnology CatWalk XT 9.1
Szkło osłonoweCITOTEST Scientific10212432C
Maszyna do zatapianiaChangzhou Zhongwei Przyrząd elektronicznyBMJ-A
Absolutny etanolDAMAO64-17-5
FootFaultScanClever Sys Inc.-
Szkiełkoszklane CITOTEST Scientific80302-2104
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozynyBeyotime BiotechnologyC0105S
wiertło do mikroszlifowania FEIYUBIO19-7010
Stabilizator kręgosłupa myszyRWD Life Science68094
Mikrotom parafinowyThermoshandon finezja 325
RotaRod dla myszyUgo Basile47600
Mikroskop stereoskopowyKUY NICESZM-7045
Alkohol tert-amylowyMacklin75-85-4
KsylenChina National Pharmaceutical#10023418

Bibliografia

  1. Venkatesh, K., Ghosh, S. K., Mullick, M., Manivasagam, G., Sen, D. Spinal cord injury: pathophysiology, treatment strategies, associated challenges, and future implications. Cell and Tissue Research. 377 (2), 125-151 (2019).
  2. Chiu, C. W., Cheng, H., Hsieh, S. L. Contusion Spinal Cord Injury Rat Model. Bio Protocol. 7 (12), e2337(2017).
  3. Thygesen, M. M., Guldbæk-Svensson, F., Rasmussen, M. M., Lauridsen, H. Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl. Journal of Visualized Experiments. (152), 60337(2019).
  4. Anderson, T. E. A controlled pneumatic technique for experimental spinal cord contusion. Journal of Neuroscience Methods. 6 (4), 327-333 (1982).
  5. Allen, A. R. SURGERY OF EXPERIMENTAL LESION OF SPINAL CORD EQUIVALENT TO CRUSH INJURY OF FRACTURE DISLOCATION OF SPINAL COLUMN: A PRELIMINARY REPORT. Journal of the American Medical Association. LVII (11), 878-880 (1911).
  6. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  7. Yan, R., et al. A modified impactor for establishing a graded contusion spinal cord injury model in rats. Annals of Translational Medicine. 10 (8), 436(2022).
  8. Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 9 (2), 123-126 (1992).
  9. Ghnenis, A. B., et al. Evaluation of the Cardiometabolic Disorders after Spinal Cord Injury in Mice. Biology (Basel). 11 (4), 495(2022).
  10. Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. Jr Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. Journal of Neurotrauma. 20 (2), 179-193 (2003).
  11. Hong, Y. R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Scientific Reports. 12 (1), 3636(2022).
  12. Noyes, D. H. Electromechanical impactor for producing experimental spinal cord injury in animals. Medical & Biological Engineering & Computing. 25 (3), 335-340 (1987).
  13. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury technique with dynamic sensitivity. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  14. Pearse, D. D., et al. Histopathological and behavioral characterization of a novel cervical spinal cord displacement contusion injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 22 (6), 680-702 (2005).
  15. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. Journal of Visualized Experiments. (124), 54988(2017).
  16. Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A Mouse Model of Bilateral Cervical Contusion-Compression Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
  17. Ji, Z. S., et al. Highly bioactive iridium metal-complex alleviates spinal cord injury via ROS scavenging and inflammation reduction. Biomaterials. 284, 121481(2022).
  18. Chen, C., Qiao, X., Liu, W., Fekete, C., Reinhardt, J. D. Epidemiology of spinal cord injury in China: A systematic review of the chinese and english literature. Spinal Cord. 60 (12), 1050-1061 (2022).
  19. Flack, J. A., Sharma, K. D., Xie, J. Y. Delving into the recent advancements of spinal cord injury treatment: a review of recent progress. Neural Regeneration Research. 17 (2), 283-291 (2022).
  20. Khuyagbaatar, B., Kim, K., Kim, Y. H. Conversion Equation between the Drop Height in the New York University Impactor and the Impact Force in the Infinite Horizon Impactor in the Contusion Spinal Cord Injury Model. Journal of Neurotrauma. 32 (24), 1987-1993 (2015).
  21. Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic Spinal Cord Injury: An Overview of Pathophysiology, Models and Acute Injury Mechanisms. Frontiers in Neurology. 10, 282(2019).
  22. Bilgen, M. A new device for experimental modeling of central nervous system injuries. Neurorehabilitation and Neural Repair. 19 (3), 219-226 (2005).
  23. Khan, M., et al. GSNOR and ALDH2 alleviate traumatic spinal cord injury. Brain Research. 1758, 147335(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model urazu kontuzyjnegordzeń kręgowy myszyskala Basso dla myszytesty behawioralnebarwienie hematoksyliną i eozynąlaserowy czujnik odległościtest rotarodtest CatWalk
Zautomatyzowany impaktor do modelu kontuzyjnego uszkodzenia rdzenia kręgowego u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.