Artykuł metodologiczny

Oznaczanie aktywności prokoagulacyjnej pęcherzyka zewnątrzkomórkowego (EV) za pomocą czasu krzepnięcia aktywowanego przez EV (EV-ACT)

DOI:

10.3791/65661

⸱

4 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół bada użycie osocza bogatego w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) jako wskaźnika zdolności krzepnięcia EV. Osocze bogate w EV uzyskuje się w procesie wirowania różnicowego, a następnie ponownego zwapnienia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w różnych chorobach zyskuje coraz większą uwagę, szczególnie ze względu na ich silne działanie prokoagulacyjne. Istnieje jednak pilna potrzeba przeprowadzenia testu przyłóżkowego w celu oceny aktywności prokoagulacyjnej EV w warunkach klinicznych. W badaniu tym zaproponowano wykorzystanie czasu aktywacji trombiny w osoczu bogatym w EV jako miary aktywności prokoagulacyjnej EV. Zastosowano standardowe procedury w celu uzyskania pełnej krwi z cytrynianem sodu, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania osocza bogatego w EV. Osocze bogate w EV i chlorek wapnia dodano do kubka testowego, a zmiany lepkosprężystości monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora. Określono naturalny czas krzepnięcia osocza bogatego w EV, określany jako EV-ACT. Wyniki wykazały znaczny wzrost EV-ACT, gdy EV został usunięty z osocza uzyskanego od zdrowych ochotników, podczas gdy znacznie zmniejszył się, gdy EV został wzbogacony. Co więcej, EV-ACT został znacznie skrócony w próbkach ludzkich ze stanu przedrzucawkowego, złamania szyjki kości udowej i raka płuc, co wskazuje na podwyższony poziom EV w osoczu i promowanie nadkrzepliwości krwi. Dzięki prostej i szybkiej procedurze, EV-ACT jest obiecującym testem przyłóżkowym do oceny funkcji krzepnięcia u pacjentów z wysokim poziomem EV w osoczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakrzepica, która jest spowodowana nadkrzepliwością, odgrywa znaczącą rolę w różnych chorobach, w tym urazach mózgu1, stanie przedrzucawkowym2, guzy3, oraz pacjenci ze złamaniami4. Mechanizm leżący u podstaw nadkrzepliwości jest złożony, a ostatnio położono nacisk na rolę pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w zaburzeniach krzepnięcia. EV to ciała przypominające pęcherzyki o dwuwarstwowej strukturze, które odłączają się od błony komórkowej, o średnicy od 10 nm do 1000 nm. Są one związane z różnymi procesami chorobowymi, w szczególności zaburzeniami krzepnięcia5. Kilka badań zidentyfikowało EV jako obiecujący predyktor ryzyka zakrzepicy6,7. Aktywność prokoagulantyczna EV zależy od ekspresji czynników krzepnięcia, przede wszystkim czynnika tkankowego (TF) i fosfatydyloseryny (PS). EV o silnej aktywności prokoagulacyjnej znacznie zwiększają wydajność katalityczną kompleksu tenazy i protrombiny, promując w ten sposób fibrynogen za pośrednictwem trombiny i miejscową zakrzepicę8. Podwyższony poziom EV i ich związek przyczynowy z nadkrzepliwością zaobserwowano w wielu chorobach9. W związku z tym standaryzacja wykrywania EV i raportowanie ich aktywności prokoagulacyjnej jest ważnym obszarem badań10.

Do tej pory dostępnych jest tylko kilka komercyjnych zestawów do wykrywania aktywności prokoagulacyjnej pojazdów elektrycznych. Test MP-Activity i test MP-TF, wyprodukowane przez firmę komercyjną, są testami funkcjonalnymi stosowanymi do pomiaru aktywności prokoagulantu EV w klasie plasma11. Testy te wykorzystują zasadę podobną do testów immunoenzymatycznych do wykrywania PS i TF na EV. Jednak zestawy te są drogie i ograniczone do kilku instytucji badawczych wysokiego poziomu. Proces ten jest złożony i czasochłonny, co sprawia, że wdrożenie ich w warunkach klinicznych jest trudne. Dodatkowo, komercyjnie opracowany test prokoagulantu fosfolipidowego (PPL) miesza osocze wolne od PS z osoczem testowym, mierząc czas krzepnięcia w celu ilościowego wykrycia poziomów PS-dodatnich EVs12. Jednak testy te koncentrują się przede wszystkim na PS i TF na EV, pomijając inne szlaki krzepnięcia, w które mogą być zaangażowane krążące EV12.

System krzepnięcia plazmy jest skomplikowany i składa się zarówno z "niewidocznych", jak i "widocznych" komponentów, w tym koagulantów, antykoagulantów, systemów fibrynolitycznych i EV zawieszonych w osoczu. Fizjologicznie składniki te utrzymują dynamiczną równowagę. W stanach patologicznych znacznie zwiększone EV w krążeniu przyczyniają się do nadkrzepliwości, szczególnie u pacjentów z urazami mózgu, stanem przedrzucawkowym, złamaniami i różnymi rodzajami raka13. Obecnie ocena stanu krzepnięcia w laboratoriach klinicznych obejmuje przede wszystkim ocenę układu krzepnięcia, układu przeciwzakrzepowego i fibrynolizy14,15,16,17. Czas protrombinowy, czas częściowej tromboplastyny po aktywacji, czas trombinowy i międzynarodowy współczynnik znormalizowany są powszechnie używane do oceny poziomów czynnika krzepnięcia w systemie krzepnięcia18. Jednak ostatnie badania wykazały, że testy te nie odzwierciedlają w pełni nadkrzepliwości niektórych chorób19. Inne metody testowe, takie jak tromboelastometria (TEG), rotacyjna TEG i analiza Sonoclot, mierzą zmiany lepkosprężyste krwi pełnej20,21. Ponieważ próbki krwi pełnej zawierają liczne komórki krwi i płytki krwi, testy te z większym prawdopodobieństwem wskażą stan krzepnięcia próbki jako całości. Niektórzy badacze donosili o roli komórek krwi i płytek krwi w aktywności prokoagulantu22,23. Niedawne badanie wykazało również, że poprzednie testy funkcji krzepnięcia napotykają trudności w wykrywaniu zmian w aktywności prokoagulacyjnej mikrocząstek24. W związku z tym zaproponowano hipotezę, że funkcję prokoagulacyjną EV można ocenić za pomocą lepkosprężystych pomiarów czasu krzepnięcia aktywnego (ACT) w osoczu bogatym w EV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie próbek od ludzi zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Medycznej Szpitala Ogólnego Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Pobieranie ludzkiej krwi żylnej ściśle przestrzegało wytycznych wydanych przez Narodową Komisję Zdrowia Chin, a mianowicie wytycznych WS/T 661-2020 dotyczących pobierania próbek krwi żylnej. Krótko mówiąc, krew pobrano od zdrowych osób za świadomą zgodą z żyły przedniej części ramiennej, a próbki zmieszano przy użyciu 3,2% antykoagulantu cytrynianu sodu w stosunku 1:9. Gdy pobrano tylko próbki antykoagulantu cytrynianu sodu, pierwsze naczynie zbiorcze zostało odrzucone. Przepływ przetwarzania został zainicjowany w ciągu 0,5 godziny od pobrania próbki. Dorośli zdrowi ochotnicy zostali zrekrutowani do pobrania próbki po uzyskaniu świadomej zgody. Kryteriami wykluczenia pacjentów były: (1) niedawno przebyta zakrzepica wewnątrznaczyniowa, (2) upośledzenie czynności wątroby i nerek, (3) nadciśnienie, hiperlipidemia, cukrzyca i inne choroby przewlekłe, (4) aspiryna lub leki przeciwzakrzepowe, (5) miesiączka i ciąża.

1. Izolacja plazmy bogatej w EV

  1. Odwirować próbki o masie 120 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia krwinek. Supernatantem jest osocze bogatopłytkowe. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej za pomocą pipety.
  2. Odwirować osocze bogatopłytkowe o stężeniu 1500 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia płytek krwi. Supernatantem jest osocze ubogie w płytki krwi. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej.
  3. Odwirować osocze ubogie w płytki krwi o sile 13000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórek. Supernatantem jest plazma bogata w EV. Następnie przenieść górną 1/2 supernatantu do nowej probówki wirówkowej w celu przeprowadzenia dalszych badań.

2. Wykrywanie EV-ACT próbki przez analizator

  1. Włącz analizator skrzepów (patrz Tabela materiałów) i rozgrzej przyrząd do 37 °C. Zainstaluj jednorazową sondę i kubek testowy, a następnie rozpocznij procedurę kontroli jakości urządzenia.
    UWAGA: Gdy wartość sygnału rezystancji lepkości na ekranie jest wyświetlana jako linia prosta, oznacza to, że detekcja nie jest zakłócana, a kontrola jakości stanu analizatora jest kwalifikowana. Procedurę testowania można rozpocząć po zakwalifikowaniu autotestu.
  2. Wprowadź przykładowe informacje do systemu. Następnie przenieś 200 μl osocza bogatego w EV do kubka testowego, a następnie 20 mM 170 μl chlorku wapnia. Kliknij przycisk Start. Mieszadło magnetyczne w kubku testowym w pełni wymiesza próbkę i chlorek wapnia. Zamknij pokrywę, a sonda zacznie wykrywać zmianę rezystancji próbki.
    UWAGA: Po zakończeniu testu analizator automatycznie wyświetli komunikat "test zakończony". Czas EV-ACT jest wyświetlany i rejestrowany przez system. Wynik jest wyrażony w jednostce czasu "sekunda". Wyrzuć sondę i przetestuj kubek.

3. Kontrola jakości próbki osocza bogatego w EV oparta na cytometrii przepływowej

  1. EV zostały najpierw zidentyfikowane na podstawie ich rozmiaru (0,1-1 μm). Dostosuj wcześniej parametry cytometru przepływowego i ustaw "bramkę" EV za pomocą dostępnych w handlu kulek polistyrenowych (0,5, 0,9 i 3,0 μm) (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Mieszanina kulek składa się z kulek fluorescencyjnych o różnych średnicach pokrywających zakres wielkości mikropęcherzyków (0,5 i 0,9 μm) i płytek krwi (0,9 μm i 3 μm).
  2. Dostosuj napięcie rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego i upewnij się, że mikrosfery 0,9 μm mieszczą się w odpowiednim obszarze. Obszar EV można narysować zgodnie ze średnicą mikrosfery.
  3. Przenieść 50 μl osocza bogatego w EV do rurki przepływowej, a następnie 450 μl przefiltrowanego buforu fosforanowego soli fizjologicznej. Dokładnie wymieszaj płyn w rurze przepływowej. Na koniec wykryj próbki za pomocą cytometrii przepływowej25.
  4. Użyj cząstek fluorescencyjnych Ultra Rainbow (patrz tabela materiałów), aby określić ilościowo liczbę EVs.In brief, dodaj 10 μl cząstek do próbki przed wykryciem przepływu i oblicz stężenie EV za pomocą następującego wzoru po zakończeniu wykrywania próbki: 10,120 * EV (#) / (mikrogranulki * objętość) * współczynnik rozcieńczenia26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czas aktywacji trombiny w osoczu bogatym w EV został zmierzony za pomocą analizatora metody lepkosprężystej do pomiaru czasu krzepnięcia osocza. Maszyna składa się z czterech głównych elementów: elektronicznego konwertera sygnału, sondy, zbiornika detekcyjnego i elementu grzejnego (Rysunek 1A,B). Sonda wykorzystuje oscylacje o wysokiej częstotliwości i niskiej amplitudzie do wykrywania zmian lepkości plazmy. Codzienna kontrola jakości obejmuje przede wszystkim kontrolę jakości powietr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy opisano sposób otrzymywania osocza bogatego w EV, a także zweryfikowano zasadność metody za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie ponownie zwapnione próbki osocza analizowano pod kątem czasu ACT za pomocą analizatora skrzepów opartego na zasadach lepkosprężystości24. Jak pokazano na rysunku 3A, stwierdzono, że stężenie EV uzyskane w wyniku ultrawirowania skraca czas EV-ACT, podczas gdy supernatant po ultrawirowaniu, który obniżył poziomy EV, wykazywał wydł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy zadeklarowali, że nie ma potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin, grant nr 81930031, 81901525. Ponadto dziękujemy firmie Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. za dostarczenie nam maszyn i wskazówek technicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccuCount Ultra Tęczowe cząstki fluorescencyjne3,8 mikrom; Spherotech, Lake Forest, IL, USADo ilościowego wykrywania MP
Chlorek wapniaWerfen (Chiny)002000680020 mM
Century Analizator skrzepówTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdZasada polega na pomiarze lepkości osocza metodą lepkosprężystą
Jednorazowa sonda i kubek testowyTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
Cytometr przepływowy LSR FortessaBD, USASłuży do wykrywania
kulek polistyrenowych MP MegamixBiocytex, Marsylia, Francja7801Megamix składa się z mieszaniny mikrogranulek o wybranych średnicach: 0,5 i mikro; m, 0,9 i mikro; m oraz 3 &mikro;m.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861(2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714(2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P cherzyki zewn trzkom rkoweplazma bogata w p cherzyki zewn trzkom rkowewirowanie r nicowekrzepni cie krwianalizator krzepni ciastan nadkrzepliwo ciprzy kowy test krzepni cia

Powiązane artykuły