Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

DOI:

10.3791/65662

⸱

8 września 2023

 ,  ,  , 
1Facultad de Ingeniería, Diseño y Ciencias Aplicadas, Universidad Icesi, 2Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC), Department of Biological Sciences, Universidad de los Andes, 3BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S, Universidad Icesi

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus koronawirusa zespołu ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) dramatycznie wpłynął na ludzkie zdrowie. Nadal stanowi zagrożenie dla współczesnego społeczeństwa, ponieważ wiele osób umiera w wyniku infekcji. Chorobę diagnozuje się za pomocą testów serologicznych i molekularnych, takich jak złoty standard reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Ten ostatni ma kilka wad, ponieważ wymaga specjalistycznej infrastruktury, kosztownego sprzętu i wyszkolonego personelu. W tym miejscu przedstawiamy protokół przedstawiający kroki wymagane do wykrycia wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) w próbkach ludzkich. Protokół zawiera instrukcję projektowania starterów in silico, przygotowania odczynników, amplifikacji i wizualizacji. Po standaryzacji metodę tę można łatwo wdrożyć i dostosować do dowolnego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem w ciągu 60 minut, przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu. Jest przystosowany do wykrywania różnych patogenów. W związku z tym może być potencjalnie stosowany w terenie i w ośrodkach zdrowia do prowadzenia terminowego nadzoru epidemiologicznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) powoduje chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19). W dniu 30 stycznia 2020 r. Światowa Organizacja Zdrowia ogłosiła stan zagrożenia zdrowia publicznego o zasięgu międzynarodowym, a w dniu 11 marca 2020 r. pandemię. Pandemia spowodowała ponad 760 milionów przypadków i 6,87 miliona zgonów w dniu napisania tego artykułu1.

Wpływ tego wirusa uwypuklił potrzebę lepszych, dokładniejszych, szybszych i szerzej dostępnych narzędzi do nadzoru, aby poprawić wykrywanie i kontrolę chorób zakaźnych2,3. W czasie pandemii testy diagnostyczne SARS-CoV-2 opierały się na wykrywaniu kwasów nukleinowych, przeciwciał i białek, ale wykrywanie kwasu nukleinowego metodą RT-PCR jest złotym standardem4. RT-PCR ma jednak pewne ograniczenia; Wymaga specjalistycznego sprzętu, infrastruktury i personelu przeszkolonego w zakresie biologii molekularnej, ograniczając jego zastosowanie do specjalistycznych laboratoriów. Co więcej, jest to czasochłonne (4-6 godzin), nie wliczając czasu na transport próbek do laboratorium, który może zająć dni5. Ograniczenia te uniemożliwiają efektywne przetwarzanie próbek i uzyskiwanie informacji wymaganych do planowania awaryjnego i zarządzania epidemiologicznego.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP) ma kilka zalet w porównaniu z RT-PCR, co czyni ją atrakcyjną strategią do projektowania przyszłych testów diagnostycznych w miejscu opieki nad pacjentem (POCT), szczególnie w warunkach ograniczonych zasobów6. Po pierwsze, jest bardzo specyficzny, ponieważ wykorzystuje od czterech do sześciu starterów, które rozpoznają od sześciu do ośmiu obszarów w sekwencji docelowej, niezależnie od tego, czy jest to DNA, czy RNA7,8. Po drugie, ponieważ działa w stałej temperaturze, nie wymaga zaawansowanego sprzętu, takiego jak termocyklery w czasie rzeczywistym, aby wygenerować wzmocnienie, ani nie wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu do jego obsługi. Po trzecie, czas reakcji jest bardzo krótki (~60 min), a do tego stosowane są odczynniki, które nie są zbyt specjalistyczne, co czyni go opłacalnym narzędziem6. Biorąc pod uwagę powyższe oraz stan zagrożenia zdrowia spowodowany pandemią COVID-19, technika ta może być postrzegana jako alternatywna metoda diagnostyczna, która jest szybka, niedroga i prosta do wdrożenia w dowolnym laboratorium badawczym9.

Protokół standaryzacji i wdrożenia lampy RT-LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 metodami kolorymetrycznymi przy użyciu termocyklera i kąpieli wodnej jest opisany w tym artykule (Rysunek 1). Omówiono punkty krytyczne, ich ograniczenia i alternatywy ich rozwoju.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat protokołu amplifikacji SARS-CoV-2 przy użyciu techniki RT-LAMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyte próbki zostały dostarczone przez laboratorium kliniczne szpitala uniwersyteckiego Fundación Valle del Lili i odpowiadały oczyszczonemu RNA od pacjentów, którzy uzyskali pozytywny wynik testu na COVID-19 za pomocą techniki RT-qPCR. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę na badanie, a badanie to zostało zatwierdzone przez komisję bioetyczną ds. badań na ludziach ze szpitala uniwersyteckiego Fundación Valle del Lili.

1. Projekt i przygotowanie podkładu RT-LAMP

UWAGA: Startery LAMP mogą być używane z różnymi platformami, w tym New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer i LAMP assay versatile analysis (LAVA). W przypadku tego protokołu wykorzystano jednak narzędzie NEB LAMP. Projektowanie starterów można wykonać przy użyciu genomów SARS-CoV-2 uzyskanych z bazy danych NextStrain10. Tabela 1 przedstawia zestaw starterów używany w tym protokole.

  1. Projekt podkładu do LAMP
    1. Uzyskaj sekwencje genomu wirusa.
    2. Wykonaj wyrównanie sekwencji, aby uzyskać sekwencję konsensusu.
    3. Przejdź do narzędzia do projektowania podkładów NEB LAMP platforma11 i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w krótkim przewodniku. To narzędzie daje takie same wyniki jak primer explorer V5, ale jest znacznie bardziej przyjazne dla użytkownika w swoich wynikach. Korzystaj z podręczników użytkownika eksploratora podkładów jako przewodnika przy projektowaniu podkładu.
  2. Ocena termodynamiczna zestawu starterów
    1. Użyj narzędzia Primer-Dimer12, aby przeprowadzić analizę termodynamiczną otrzymanych starterów.
    2. Umieść sekwencje podkładu w narzędziu. Następnie wybierz opcję Analiza multipleksowa i Raport struktury ściemniania.
    3. Wybierz zestawy podkładów, które mają ΔG nie mniejsze niż -5.
  3. Ocena swoistości projektowanych podkładów
    1. Użyj bazy danych kolekcji nukleotydów (nt/nt) w BLAST13, aby przeanalizować każdy starter.
    2. Aby przeprowadzić pierwszą analizę BLAST, należy wybrać Refseq_rna Bazę Danych i przefiltrować wyszukiwanie według grupy rodzajów należących do podrodziny Orthocoronavirinae. Są to: Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) i Deltacoronavirus (taxid:1159901). Ponadto oceń sekwencję w stosunku do innych wirusów, które krążą jako podtyp H1N1 (taxid:114727), wirus grypy A (taxid:11320) i wirus grypy B (taxid:11520).
    3. Aby przeprowadzić drugą analizę BLAST, wybierz Betacoronavirus GenBank i przefiltruj wyszukiwanie według Coronaviridae (taxid:11118) i SARS (taxid:694009). Grupy te zawierają sekwencje wszystkich zidentyfikowanych genomów koronawirusa SARS, w tym genomów znalezionych u nietoperzy, Betacoronavirus (taxid:694002).
    4. W przypadku tego protokołu upewnij się, że startery nie są zgodne z genomami innymi niż genom docelowy, SARS-CoV-2.
  4. Przygotowanie podkładu
    1. Odwirować fiolki zawierające jofilizowane startery za pomocą mikrowirówki (10 000 x g, 1 min w temperaturze pokojowej [RT]), aby uniknąć strat podczas otwierania probówki.
    2. Ponownie uwodnić jjofilizowany proszek w 0,1% wodzie z pirowęglanu dietylu (DEPC) lub wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM (Tabela 2) i dokładnie rozpuścić, pipetując w górę iw dół. Następnie wirować z maksymalną prędkością (10 000 x g, 1 min przy suchej smocie) w mikrowirówce, aby zebrać wszystkie roztwory startera na dnie probówki.
    3. Przygotować 10-krotną mieszankę starterów w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przednim wewnętrznym starterem (FIP), wstecznym wewnętrznym starterem (BIP), przednim zewnętrznym starterem (F3), wstecznym zewnętrznym starterem (B3), pętlowym wstecznym (LB) i pętlowym do przodu (LF), jak podano w Tabeli 2. Aby zapobiec stratom, należy pipetować lub delikatnie zagmatwać roztwór startera przed wykonaniem szybkiego wirowania (10 000 x g, 1 min przy suchej stężeniu względnej) za pomocą mikrowirówki.
    4. Przechowuj 10-krotną mieszankę starterów w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania; jednak przygotuj się na maksymalnie pięć eksperymentów, niezależnie od kilku próbek, aby uniknąć zbyt wielu cykli zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA Jeśli potrzebna jest mniejsza objętość mieszanki podkładowej, dostosuj wartości, obliczając nowe objętości (Tabela 2). Ponadto zestawy RdRp i RdRp/Hel nie zawierają startera LF, ponieważ startery pętlowe nie są wymagane do reakcji RT-LAMP. W rezultacie zastąp objętość startera LF wodą wolną od nukleaz lub 0,1% wodą DEPC.

2. Reakcja RT-LAMP

  1. Włącz komorę z przepływem laminarnym zgodnie z instrukcjami producenta i odczekaj co najmniej 3 minuty, aż przepływ powietrza się ustabilizuje.
  2. Gdy przepływ powietrza ustabilizuje się, wyczyść i zdezynfekuj wewnętrzne powierzchnie szafy przy użyciu techniki aseptycznej. Aby to osiągnąć, użyj następujących środków dezynfekujących w następującej kolejności: 1000 ppm czwartorzędowego amoniaku (chlorek benzalkoniowy), 2% podchlorynu, 3% nadtlenku wodoru i 70% etanolu.
    UWAGA: W tym przypadku technika aseptyczna polega na nałożeniu środka dezynfekującego i usunięciu go serwetkami z wnętrza kabiny na zewnątrz bez przechodzenia przez wcześniej oczyszczone powierzchnie.
  3. Używając środków dezynfekujących z kroku 2.2, wyczyść materiały, które wejdą do kabiny, w tej samej kolejności.
    UWAGA: Do szafki należy włożyć mikropipety, pudełka z końcówkami filtrującymi, kolby z probówkami o pojemności 1,5 ml i 0,6 ml, probówki do PCR o pojemności 0,2 ml, stojaki i zlewkę o pojemności 400 ml.
  4. Przynieś do kabiny serwetki i rękawiczki nitrylowe. Następnie wyłącz szafkę i wystaw ją na działanie światła ultrafioletowego (UV) przez 15 minut.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanek i DNA w wyniku długotrwałej ekspozycji na promieniowanie, należy unikać światła UV do momentu upływu czasu ustawionego w kroku 2.4.
    UWAGA Wykonaj montaż pokazany w Rysunek 2 przed rozpoczęciem protokołu i rozpocznij kąpiel wodną po wykonaniu kroku 2.4. Bardzo ważne jest, aby napełnić metalowy pojemnik prawie po brzegi wodą pitną i ustawić temperaturę laboratoryjnej płyty grzewczej żelazka na 90 °C, ponieważ spowoduje to temperaturę w układzie ~66,3 °C, która jest monitorowana termometrem rtęciowym.
  5. Po zakończeniu okresu naświetlania należy ponownie uruchomić komorę i postępować zgodnie z zaleceniami podanymi w kroku 1.1.
  6. Umieść odczynniki (Tabela 3, Tabela 4 i Tabela 5) w lodówce wypełnionej lodem lub małej lodówce polistyrenowej. Umieść pojemnik w szafce po umyciu go 70% etanolem.
  7. W probówce do mikrowirówek o pojemności 0,6 ml przygotuj mieszaninę LAMP genu, który ma być amplifikowany (RdRp, N-A i RdRp/Hel), dodając tylko następujące składniki: 10x bufor, MgSO4, dNTPs, 1x mieszanina starterów i woda wolna od nukleaz lub 0,1% wody DEPC; dobrze wymieszaj pipetując do homogenizacji.
    UWAGA: Ze względu na niewłaściwą obsługę i zachowanie wewnątrz szafy istnieje wysokie ryzyko zanieczyszczenia odczynnikami. Aby złagodzić ten problem, należy przestrzegać następujących zasad: (i) używaj sterylnych i filtrujących końcówek; (ii) używać jednej końcówki do każdego odczynnika; (iii) poruszać się powoli i ostrożnie, aby uniknąć zakłócenia przepływu laminarnego; (iv) utrzymywać porządek i używać jak najmniejszej ilości materiałów; oraz (v) używać różnych rękawiczek do przygotowania mieszanki i dodania materiału genetycznego.
    UWAGA: Wszystkie odczynniki, zwłaszcza enzymy, należy przechowywać na lodzie, ponieważ zmiany temperatury mogą je denaturować i zmieniać aktywność polimerazy.
  8. Umieścić probówkę (probówki) o pojemności 0,6 ml z zakrętką zamkniętą w bloku grzewczym i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut
    UWAGA: Włączyć blok grzewczy dla probówek 1,5-2,0 ml znajdujących się na zewnątrz szafki na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem przygotowania mieszanki LAMP i monitorować temperaturę (95 °C) za pomocą termometru rtęciowego lub alkoholowego.
  9. Po zakończeniu inkubacji umieść probówki w wypełnionej lodem chłodziarce polistyrenowej na 5 minut.
  10. Umieść probówki z powrotem w komorze laminarnej i zakończ przygotowanie mieszanki LAMP, dodając enzymy polimerazę DNA (Bst 3.0), odwrotną transkryptazę i polimerazę DNA o wysokiej wierności (Tabela 3, Tabela 4 i Tabela 5). W przypadku stosowania detekcji kolorymetrycznej należy dodać barwnik błękit hydroksynaftolowy (HNB).
  11. Po dodaniu tych odczynników należy bardzo dobrze wymieszać odczynniki LAMP, pipetując je w celu rozpuszczenia enzymów i barwnika.
  12. Napełnij każdą probówkę PCR 22,0 μl mieszanki, uważając, aby nie tworzyć bąbelków. Następnie dodać 3,0 μl 0,1% wody DEPC lub wody wolnej od nukleaz do kontroli ujemnej lub probówki bez próbki matrycowej (NTC) i odłożyć na bok pozostałą probówkę (probówki) do dodania (materiału genetycznego).
    UWAGA: Probówki do PCR należy przechowywać w lodówce wypełnionej lodem do czasu dodania próbki, aby uniknąć aktywacji enzymu Bst 3.0 i przedwczesnego rozpoczęcia reakcji.
  13. Usuń wszystkie materiały z szafki i użyj 70% etanolu do czyszczenia powierzchni. Następnie wyłącz go zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. W oddzielnym miejscu dodaj 3 μl próbki do każdej probówki PCR i dokładnie ją homogenizuj. W tym celu należy użyć mikropipety o pojemności 20 μl i końcówek filtrujących.
    UWAGA: Mikropipeta używana do dodawania materiału genetycznego musi być używana wyłącznie do tego celu i nie może być używana do przygotowania mieszanki. W ten sposób unika się zanieczyszczenia odczynników. Dodatkowo próbki RNA należy zawsze utrzymywać na lodzie, aby zmniejszyć możliwość degradacji RNA. Do dodania próbki należy użyć następujących środków ochrony osobistej (PPE): jednorazowy fartuch, czapka, maska N95, legginsy, gogle laboratoryjne i rękawice nitrylowe.
  15. Przed wykonaniem reakcji kolorymetrycznej należy sfotografować probówki PCR za pomocą wysokiej jakości aparatu. Kolorem wyjściowym z HNB jest fioletowy.
  16. Reakcję należy przeprowadzić w następującym układzie lub urządzeniu: (i) termocyklerze i (ii) łaźni wodnej.
    1. Termocykler: Umieść probówki w bloku reakcyjnym i ustaw termoprofil (patrz Tabela 6) na urządzeniu.
    2. Kąpiel wodna: Umieść rurki w okrągłych pojemnikach i bardzo dobrze je wyreguluj, aby zapobiec ich wydostaniu się. Następnie umieść pojemniki w łaźni wodnej (Rysunek 2A, B) w temperaturze podanej w tabeli 6.
  17. W przypadku łaźni wodnej, gdy rurki znajdą się wewnątrz systemu, uruchom timer na 60 minut (Tabela 6).
  18. Po upływie czasu reakcji wyjąć probówki z termocyklera lub łaźni wodnej i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia procesu elektroforetycznego lub w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  19. Jeśli przeprowadzono reakcję kolorymetryczną, należy sfotografować probówki PCR za pomocą wysokiej jakości aparatu. Końcowy kolor z HNB to błękit nieba.

3. Analiza produktów amplifikacji w żelu agarozowym

UWAGA: Te kroki są sugerowane jako dodatkowe kontrole reakcji kolorymetrycznej lub kontroli wydajności podczas etapu standaryzacji. Dzieje się tak, ponieważ technika ta może stwarzać ogromne ryzyko zanieczyszczenia dla laboratorium wykonującego te testy.

  1. Umieść złoże w komorze elektroforetycznej tak, aby gumy krawędziowe stykały się ze ściankami, tworząc szczelną przestrzeń do dodania agarozy (komora wewnętrzna) (Rysunek 3A, B).
  2. Po wykonaniu kroku 3.1 zważyć niezbędną ilość agarozy w zlewce o pojemności 500 ml, aby uzyskać 2% żel. Następnie dodaj wymaganą objętość 0,5x buforu tris-acetate EDTA (TAE) i mikrofaluj przez 1-2 min.
    UWAGA: Agaroza jest całkowicie stopiona, gdy jest półprzezroczysta i pozbawiona grudek po wyjęciu z piekarnika. Jeśli nie zostanie to potwierdzone, mogą pozostać słabo zżelowane obszary, powodując zmianę przebiegu elektroforetycznego i wizualizacji produktów amplifikacji.
  3. Wyjmij zlewkę z piekarnika i wlej agarozę do wewnętrznej komory utworzonej w kroku 3.1 (Rysunek 3C). Następnie sprawdź, czy nie ma pęcherzyków, a jeśli są, usuń je za pomocą końcówki do mikropipet.
  4. Ułóż grzebień tak, aby uformował dołki i pozostaw agarozę do zżelowania na około 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Po tym czasie dodaj 5 ml 0,5x buforu TAE, aby ułatwić usunięcie grzebieni i łoża zawierającego żel. Następnie umieść żel w taki sposób, aby studzienki znajdowały się w anodzie (Rysunek 3D).
  6. Napełnij komorę elektroforezy buforem 0,5x TAE do pojemności określonej przez producenta, upewniając się, że elektrody stykają się z buforem.
  7. Dodać 3 μl markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka żelu i dodać 9 μl NTC i każdą próbkę do następnych studzienek. Dokonać ich przez połączenie 7 μl produktu amplifikacji z 3 μl buforu ładującego; następnie załadować 9 μl tej mieszaniny do studzienek żelu.
  8. Przykryj komorę elektroforezy pokrywą i podłącz do portów zasilania w kolorze wzorze. Ustaw źródło zasilania na następujące parametry: 100 V i stałe natężenie prądu przez 120 min.
  9. Po zakończeniu przebiegu elektroforetycznego umieścić żel w pojemniku z roztworem barwiącym (bromek etydyny) i inkubować przez 30 minut.
  10. Po inkubacji usuń żel z roztworu barwiącego i umieść go w woreczku z zamkiem błyskawicznym. Zapobiega to zanieczyszczeniu sprzętu, który będzie używany do wizualizacji amplikonów.
  11. Wizualizacja żelu na transiluminatorze lub imagerze, takim jak Amersham Imager 600.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Implementacja protokołu rozpoczyna się od zaprojektowania zestawu starterów dla każdego genu docelowego zgodnie z protokołem opisanym powyżej. W czerwcu 2020 r. z bazy danych NextStrain uzyskano 5 000 genomów SARS-CoV-2, z 10% reprezentatywnością genomów kolumbijskich. Sekwencje te zostały wyrównane w celu uzyskania sekwencji konsensusu, która została wykorzystana w procesie projektowania startera. W tabeli 1 przedstawiono zestaw starterów dobranych dla starterów RdRp/Hel i RdRp. Zestaw starterów do ampl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż RT-LAMP jest uważana za uzupełniającą metodologię przeprowadzania diagnostyki molekularnej, ma również pewne ograniczenia i krytyczne kroki, które należy wziąć pod uwagę, gdy protokół jest standaryzowany i wdrażany.

Standaryzacja LAMP do wykrywania SARS-CoV-2 oceniła następujące parametry i składniki mieszanki wzorcowej: (a) stężenie i temperaturę wyrównania starterów; b) stężenie enzymów; c) stężenie magnezu; d) czas reakcji; e) włączenie dodatków, takich jak BSA, DMSO, chlorek guanid...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natalia Campillo-Pedroza jest Prezesem Zarządu firmy BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Sistema General de Regalías z Kolumbii, grant numer BPIN 2020000100092, oraz Universidad Icesi - Convocatoria Interna, grant numer CA0413119. MFVT był również finansowany z funduszy adiunktury z Universidad de los Andes. Podmioty finansujące nie brały udziału w projektowaniu, realizacji działań, gromadzeniu i analizie danych oraz przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy Szpitalowi Uniwersyteckiemu Fundación Valle del Lili za wirusowe RNA z próbek Sars-CoV-2 oraz dr Alvaro Barrera-Ocampo za komentarze do manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb Drabinka DNASOLIS BIODYNE07-12-00050Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
50x TAE Bufor do elektroforezyThermoScientificB49Przechowywać w temperaturze pokojowej
Accuris High Fidelity PolymeraseACCURIS ODCZYNNIKI DO NAUKI NATURALNEJPR1000-HF-200Może być stosowany w przypadku, gdy nie można kupić polimerazy Q5 High-Fidelity DNA. Dla enzymu należy przygotować podwielokrotności o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia.
AgarozaPanReacAppliChemA8963,0100N/A
Bst 3.0 Polimeraza DNA 8000 IU/mlNew England BioLabsM0374S/M0374LDla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia.
Zestaw roztworów deoksynukleotydów (dNTP) NewEngland BioLabsN0446SPrzechowywać w temperaturze -20 stopni; C
Pirowęglan dietyluSigma-Aldrich159220-25G Obchodź się z nim ostrożnie pod szafką wyciągową
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, gotowy do użyciaThermoScientificSM0322Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
Hydroksynaftol niebieska sól disodowaSanta Cruz Biotechnologysc-215156BN/A
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wierności 2000 IU / ml New England BioLabsM0491S/M0491LDla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C do momentu użycia.
Odwrotna transkryptaza WarmStart RTx 15000 j.m./mlNew England BioLabsM0380S/M0380LDla enzymu należy przygotować porcje o odpowiedniej objętości i przechowywać w temperaturze -20 ° C do momentu użycia.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
  2. Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13 (11), 1630-1638 (2020).
  3. Rojas-Gallardo, D. M., et al. COVID-19 in Latin America: Contrasting phylodynamic inference with epidemiological surveillance. (Molecular epidemiology of COVID-19 in Latin America). medRxiv. , (2020).
  4. Liu, R., et al. Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020. Clinica Chimica Acta. 505, 172-175 (2020).
  5. Kevadiya, B. D., et al. Diagnostics for SARS-CoV-2 infections. Nature Materials. 20 (5), 593-605 (2021).
  6. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
  7. Li, Y., Fan, P., Zhou, S., Zhang, L. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A novel rapid detection platform for pathogens. Microbial Pathogenesis. 107, 54-61 (2017).
  8. Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., Kanda, H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 53 (1), 1-5 (2015).
  9. Augustine, R., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid, sensitive, specific, and cost-effective point-of-care test for coronaviruses in the context of COVID-19 pandemic. Biology (Basel). 9 (8), 182(2020).
  10. Nextstrain. , https://nextstrain.org/ (2023).
  11. Biolabs, N.E. Neb Lamp, NEB LAMP. , https://lamp.neb.com/ (2023).
  12. PrimerDimer. , http://www.primer-dimer.com/ (2023).
  13. National Center for Biotechnology Information. Blast: Basic local alignment search tool (no date). , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ (2023).
  14. Zhang, Y., et al. Rapid molecular detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) virus RNA using colorimetric LAMP. medRxiv. , (2020).
  15. Lu, R., et al. Development of a novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of SARS-CoV-2. Virologica Sinica. 35 (3), 344-347 (2020).
  16. Najafov, A., Hoxhaj, G. PCR Guru. , Elsevier, Academic Press. (2017).
  17. Zhang, Y., et al. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
  18. Ramírez-Chavarría, R. G., et al. Automatic analysis of isothermal amplification via impedance time-constant-domain spectroscopy: A SARS-CoV-2 case study. Chemosensors. 11 (4), 230(2023).
  19. Haque, M. F. U., et al. A novel RdRp-based colorimetric RT-LAMP assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 in clinical and sewage samples from Pakistan. Virus Research. 302, 198484(2021).
  20. Donia, A., et al. Integration of RT-LAMP and microfluidic technology for detection of SARS-CoV-2 in wastewater as an advanced point-of-care platform. Food and Environmental Virology. 14, 364-373 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie SARS CoV 2RT LAMPamplifikacja z zastosowaniem p tlidiagnostyka molekularnadetekcja kolorymetrycznaprojektowanie starter wtermocyklerb kit hydroksynaftolowynadz r nad patogenamiamplifikacja kwas w nukleinowych

Powiązane artykuły