Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65670

⸱

8 września 2023

 ,  , 
1Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.

Streszczenie

W porównaniu do swojego jednofotonowego odpowiednika, wzbudzenie dwufotonowe jest korzystne dla eksperymentów bioobrazowania ze względu na niższą fototoksyczność, głębszą penetrację tkanek, efektywne działanie w gęsto upakowanych systemach i zredukowaną kątową fotoselekcję fluoroforów. Tak więc wprowadzenie analizy polaryzacji w dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej (2PFM) zapewnia bardziej precyzyjne określenie organizacji molekularnej w próbce w porównaniu ze standardowymi metodami obrazowania opartymi na liniowych procesach optycznych. W niniejszej pracy skupiamy się na wrażliwym na polaryzację 2PFM (ps-2PFM) i jego zastosowaniu w określaniu uporządkowania molekularnego w złożonych biostrukturach - sferulitach amyloidowych. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy Parkinsona, są często diagnozowane poprzez wykrywanie agregatów białkowych amyloidów powstałych w wyniku upośledzonego procesu nieprawidłowego fałdowania białek. Zbadanie ich struktury prowadzi do lepszego zrozumienia ich ścieżki powstawania, a co za tym idzie, do opracowania bardziej czułych metod diagnostycznych. W pracy przedstawiono ps-2PFM przystosowany do wyznaczania miejscowej kolejności włókienek wewnątrz sferulitów insuliny bydlęcej i sferycznych agregatów białek amyloidogennych. Co więcej, udowadniamy, że proponowana technika może rozwiązać trójwymiarową organizację włókienek wewnątrz sferulitu.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, mimo że nastąpił znaczący rozwój licznych technik mikroskopii fluorescencyjnej do bioobrazowania białek i ich agregatów1, tylko kilka z nich zostało wykorzystanych do rozwiązania ich lokalnego uporządkowania w próbce2,3. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji4 została wykorzystana do zbadania wewnętrznej niejednorodności strukturalnej nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Co więcej, ilościowe określenie lokalnego uporządkowania wewnątrz złożonych i gęsto upakowanych biostruktur, takich jak sferulity, można rozwiązać przy użyciu metod wrażliwych na polaryzację3. Jednak standardowe techniki fluorescencji z powierzchowną penetracją tkanek są ograniczone, ponieważ użycie długości fal UV-VIS do wzbudzenia fluoroforów in vivo prowadzi do wysokiego rozpraszania światła w tkankach5. Ponadto takie obrazowanie często wymaga zaprojektowania i powiązania określonych sond fluorescencyjnych z docelową biomolekułą, co zwiększa koszt i ilość pracy potrzebnej do wykonania obrazowania.

Ostatnio, aby rozwiązać te problemy, nasz zespół dostosował czułą na polaryzację mikroskopię fluorescencji wzbudzonej dwoma fotonami (ps-2PFM) do bezznacznikowego obrazowania struktur biologicznych6,7. Ps-2PFM pozwala na pomiar zależności intensywności fluorescencji dwufotonowej od kierunku polaryzacji liniowej wiązki wzbudzenia oraz analizę polaryzacji emitowanej fluorescencji8. Implementacja tej techniki wymaga uzupełnienia standardowej ścieżki wzbudzenia ustawienia mikroskopu wielofotonowego (Rysunek 1) o płytkę półfalową do sterowania płaszczyzną polaryzacji światła. Następnie z sygnałów zebranych przez dwie fotodiody lawinowe, zbierając w ten sposób dwie, wzajemnie prostopadłe składowe polaryzacji polaryzacji fluorescencji wzbudzonej tworzy się wykresy biegunowe, obrazujące zależność intensywności wzbudzonej fluorescencji dwufotonowej od polaryzacji wzbudzonej przez dwa fotony.

Ostatnim krokiem jest proces analizy danych, uwzględniający wpływ elementów optycznych, takich jak zwierciadła dichroiczne czy obiektyw o dużej aperturze numerycznej, na polaryzację. Ze względu na naturę procesu dwufotonowego, metoda ta zapewnia zarówno zredukowaną kątową selekcję zdjęć, jak i zwiększoną rozdzielczość osiową, ponieważ wzbudzenie fluoroforów dwufotonowych poza płaszczyzną ogniskową jest probabilistycznie ograniczone. Udowodniono również, że podobne metody mogą być z powodzeniem wdrożone do obrazowania in vivo sond bliskiej podczerwieni (NIR) do obrazowania tkanek głębokich9. Ps-2PFM został wcześniej zastosowany do obrazowania fluoroforów w błonach komórkowych10 i DNA11,12, a także niestandardowych markerów fluorescencyjnych systemów biologicznych, takich jak nanocząstki złota13. Jednak we wszystkich tych przykładach informacje o organizacji biomolekuł zostały uzyskane pośrednio i wymagały predefiniowanej wzajemnej orientacji między fluoroforem a biomolekułą.

W jednym z naszych ostatnich artykułów wykazaliśmy, że ps-2PFM może być z powodzeniem stosowany do określania lokalnej polaryzacji autofluorescencji nadbudówek amyloidu i fluorescencji tioflawiny T, barwnika specyficznego dla amyloidu, związanego z włókienkami amyloidu w sferulitach6. Co więcej, w innym wykazaliśmy możliwość wykorzystania ps-2PFM do wykrywania orientacji włókienek amyloidowych wewnątrz sferulitów amyloidowych w reżimie wielkości submikronowej, co zostało potwierdzone przez korelację z obrazowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)7. Osiągnięcie tego wyniku było możliwe dzięki: i) autofluorescencji wewnętrznej sferulitów-amyloidów, wzbudzonych jednym lub dwoma fotonami, wykazują autofluorescencję wewnętrzną z maksimami emisyjnymi zlokalizowanymi w zakresie od 450 do 500 nm i dwufotonowymi przekrojami czynnymi absorpcji porównywalnymi ze standardowymi barwnikami fluorescencyjnymi14, ii) modele matematyczne wprowadzone wcześniej w celu opisania, w jaki sposób ps-2PEF barwników znakujących błony biologiczne i struktury DNA można zastosować do fluorescencji wykazywanej przez sferulity i barwniki z nimi związane8,11,15. Dlatego przed przystąpieniem do analizy zalecamy zapoznanie się z wymaganą teorią opisaną zarówno w tekście głównym, jak i w informacjach pomocniczych naszego pierwszego artykułu na ten temat6. W tym miejscu przedstawiamy protokół zastosowania techniki ps-2PFM do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu sferulitów insuliny bydlęcej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie preparatów mikroskopowych z w pełni wykształconymi sferulitami

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli materiałów. Wszystkie roztwory przygotowano z wodą dejonizowaną (18,2 MΩ·cm przy 25 °C) pochodzącą z systemu oczyszczania wody.

  1. Inkubować sferulity amyloidowe zgodnie z protokołem opisanym przez Krebsa i wsp.16. z pewnymi modyfikacjami, opisanymi poniżej.
    1. Odważyć 10 mg proszku insulinowego do probówki 1,5 mL.
    2. Rozpuścić proszek w 1 mL alikwocie roztworu dejonizowanej H2O/HCl (pH 1,5).
    3. Uszczelnić próbkę taśmą i umieścić w mikserze termicznym w celu inkubacji przez 24 h w temperaturze 70 °C (0 rpm).
      UWAGA: Aby przeprowadzić obrazowanie amyloidów w ich natywnym (tzn. uwodnionym) środowisku i zapobiec deformacji próbki wskutek odwodnienia, konieczne jest przygotowanie preparatów mikroskopowych zgodnie z poniższym opisem (schemat przedstawiono na Ryc. 2).
  2. Dokładnie umyć szkiełko mikroskopowe wodą.
  3. Zanurzyć szkiełka w metanolu i pozostawić do wyschnięcia w warunkach otoczenia na bezpyłowej chusteczce.
  4. Pobrać 100 µL alikwotu roztworu sferulitów z probówki za pomocą pipety automatycznej (krok 1.1.2) i nanieść go na wgłębienie znajdujące się w centralnej części szkiełka mikroskopowego.
  5. Przykryć roztwór szkiełkiem nakrywką, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
  6. Nanieść medium montażowe wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywki na szkiełko za pomocą pipety automatycznej, aby uszczelnić natywny roztwór sferulitów.
    UWAGA: Bardzo ważne jest naniesienie medium montażowego zarówno na powierzchnię szkiełka nakrywki, jak i szkiełka podstawowego. Czynność tę należy wykonywać pod wyciągiem z powodu toksyczności lotnego rozpuszczalnika (ksylenu). Patrz wstawka na Ryc. 2.
  7. Pozostawić preparat mikroskopowy w warunkach otoczenia do czasu stwardnienia medium montażowego.
    UWAGA: Proces twardnienia zależy od temperatury i wilgotności, ale powinien zakończyć się w ciągu 12 h.
  8. Sprawdzić, czy sferulity insulinowe utworzyły się prawidłowo, używając polaryzacyjnego mikroskopu optycznego (POM) z krzyżowymi polaryzatorami. Przeskanować próbkę w poszukiwaniu charakterystycznego wzoru jasnych obszarów, zwanego krzyżem maltańskim, jak pokazano na Ryc. 3.
    UWAGA: Sferulity amyloidowe można zdefiniować jako sferyczne superstruktury charakteryzujące się heterogenną morfologią o strukturze rdzeń-otoczka. Szczegółowo składają się one z amorficznego rdzenia i radialnie rosnących włókien amyloidowych16. Ze względu na anizotropowy charakter struktur sferulitycznych mogą one w charakterystyczny sposób oddziaływać z polaryzowanym światłem (np. poprzez refrakcję) i zmieniać jego fazę, co można łatwo zaobserwować pod POM z krzyżowymi polaryzatorami. Metoda ta była stosowana do badania wyłącznie w pełni rozwiniętych sferulitów charakteryzujących się modelowym wzorem krzyża maltańskiego. W konsekwencji agregaty lub strukturalnie zdeformowane sferulity zostały wykluczone z dalszych badań.

2. Budowa i wyrównywanie systemu

UWAGA: Schematyczny rysunek mikroskopu dwufotonowego wrażliwego na polaryzację znajduje się na Rysunku 1.

  1. Zainstaluj laser femtosekundowy z możliwością strojenia długości fali wyjściowej w zakresie 690-1 080 nm, na przykład pracujący na laserze Ti:Szafir z blokadą modów z impulsami ~100 fs i częstotliwością repetycji 80 MHz.
  2. Dodaj do toru wzbudzenia układu płytkę półfalową zamontowaną na stole obrotowym, aby kontrolować polaryzację światła padającego w płaszczyźnie XY próbki w mikroskopie.
  3. Zainstaluj lustro dichroiczne, aby odciąć wiązkę wzbudzenia od optyki detekcyjnej.
    UWAGA: Charakterystyka optyczna lustra dichroicznego powinna pozwalać na odbicie wiązki wzbudzenia (do preparatu) w zakresie bliskiej podczerwieni (NIR) i jednocześnie być przejrzysta dla zakresu długości fal odpowiadających emisji z próbek.
  4. Zainstaluj piezoelektryczny stół skanujący do skanowania rastrowego w płaszczyźnie XY dla wybranej wartości Z.
  5. Zamontuj obiektyw imersyjny o wysokiej aperturze numerycznej (NA), na przykład apochromatyczny obiektyw imersyjny olejowy 100x/1,4 NA.
    UWAGA: Ponieważ cały układ pracuje w trybie epi-fluorescencji, sygnały padające i emitowane przechodzą przez ten sam obiektyw.
  6. W torze emisji dodaj polaryzacyjny dzielnik wiązki, który rozdziela emisję wzbudzoną dwufotonowo na dwie ortogonalnie spolaryzowane składowe (IX i IY).
  7. Zainstaluj dwie fotodiody lawinowe z liczeniem fotonów (APD) w konfiguracji umożliwiającej zbieranie światła odpowiednio przeniesionego i odbitego za pomocą dzielnika wiązki (Rysunek 1).
  8. Zamontuj odpowiednie filtry odcinające zależne od długości fali w torze wzbudzenia i emisji układu, na przykład filtr długoprzepustowy 800 nm bezpośrednio w optycznym torze wzbudzenia oraz filtr krótkoprzepustowy 700 nm w torze emisji.
    UWAGA: Przeanalizuj widma emisji sferulitów, aby za pomocą odpowiednich filtrów emisyjnych wykluczyć ewentualny udział generacji drugiej harmonicznej (SHG) lub światła laserowego. Warto również zauważyć, że system ten powinien umożliwiać pomiary SHG wrażliwe na polaryzację, które można wykorzystać do określenia uporządkowania biomolekuł w próbkach. Należy jednak pamiętać, że analiza danych sygnału SHG różni się od analizy fluorescencji, co zostało szczegółowo opisane przez Aït-Belkacem i współpracowników17.
  9. Wyrównaj cały system (korzystając z trybu wyrównywania wbudowanego w wiele laserów), aż do momentu uzyskania zbliżonych intensywności sygnału w obu fotodiodach.
  10. Sprawdź, czy wiązka wzbudzenia ogniskowana przez obiektyw o wysokiej aperturze NA i obrazowana na kamerze ma koncentryczny kształt kołowy, jak przedstawiono na Rysunku 4A.
  11. Dostosuj czas skanowania i odpowiadającą mu moc, aby zminimalizować uszkodzenia próbki wywołane przez padający laser. Przykładowe punktowe wypalenie przedstawiono na Rysunku 4B. Zmierz moc nominalną za pomocą cyfrowego przenośnego miernika mocy podłączonego do fotodiody z czujnikiem mocy umieszczonym przy wlocie do korpusu mikroskopu.
    UWAGA: Próbki biologiczne mogą zostać łatwo wypalone pod wpływem naświetlania laserem. W tym przypadku zakres mocy 100-900 µW (w punkcie ogniskowania soczewki obiektywu) okazał się doskonałym kompromisem między stabilnością próbki a intensywną emisją.
  12. Przed pomiarem próbki sprawdź jakość wyrównania optyki przy użyciu izotropowej próbki referencyjnej (np. fluoresceiny zawartej w polimerze amorficznym). Aby przeprowadzić kontrolę kalibracji, postępuj zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale 3, używając izotropowej próbki referencyjnej zamiast próbki amyloidu.
    UWAGA: Przy założeniu, że układ mikroskopowy jest idealnie dostrojony do próbki o właściwościach izotropowych, obie składowe emisji 2P (IX i IY) wykrywane przez dwie fotodiody APD powinny charakteryzować się taką samą intensywnością (Rysunek 4C).

3. Pomiar sferulitów insuliny bydlęcej

UWAGA: Do przeprowadzenia wszystkich opisanych pomiarów ps-2PF wykorzystano autorskie oprogramowanie, które steruje pozycjami stolika piezoelektrycznego i płytki półfalowej oraz zbiera sygnał z obu fotodiod, co umożliwia wykreślanie skanów XY (skanów rastrowych) z wybranych obszarów na szkiełkach mikroskopowych, a także wykresów polarnych z konkretnych współrzędnych próbki. Do protokołu dodano również dodatkowe uwagi, które pozwolą użytkownikom na przeprowadzenie pomiaru bez tego oprogramowania, ponieważ zarówno stolik piezoelektryczny, jak i stolik obrotowy służący do obracania płytki półfalowej mogą być sterowane za pomocą ich własnych kontrolerów lub odpowiedniego oprogramowania. Mimo to zdecydowanie zaleca się napisanie algorytmu łączącego kąt obrotu płytki półfalowej z intensywnością 2PEF zbieraną przez obie fotodiodu, ponieważ ta korelacja (wykresy polarne) ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej analizy danych prowadzącej do uzyskania informacji strukturalnych.

  1. Zamocuj preparat ze sferulitami na stole piezoelektrycznym (unieruchom szkiełko za pomocą taśmy). Upewnij się, że jest on zamontowany tak, aby cienka strona szkiełka (lamella) była zwrócona w stronę obiektywu, ponieważ obiektywy o wysokiej aperturze numerycznej charakteryzują się stosunkowo krótką odległością roboczą.
    UWAGA: Ponieważ stosowana jest imersja olejowa, przed zamocowaniem preparatu i ustawieniem ostrości należy nanieść małą kroplę oleju mineralnego na obiektyw.
  2. Zmieniając pozycje XY i Z za pomocą pokręteł mikroskopu, ustaw ostrość obiektywu na jeden ze sferulitów znajdujących się w roztworze, pamiętając, że ze względu na to, iż średnice sferulitów wynoszą zazwyczaj od kilkunastu do kilkudziesięciu µm, należy ustawić ostrość w obszarze centralnym całej struktury. Szukaj czarnych i białych aureoli wokół konkretnego sferulitu jako oznak odpowiednio niedostatecznego i nadmiernego ustawienia ostrości. Dostosuj oś „Z” tak, aby znajdowała się pomiędzy tymi ekstremami.
    UWAGA: Ważne jest znalezienie izolowanej próbki bez defektów strukturalnych. Bardzo małe sferulity mogą zostać zniesione z powodu naprężeń materiałowych wprowadzonych przez obiektyw, natomiast największe struktury są prawdopodobnie zagregowane lub silnie zniekształcone.
  3. Wycentruj sferulit w polu widzenia obserwowanej płaszczyzny mikroskopowej i określ rozmiar skanu XY, sprawdzając, ile kroków stołu piezoelektrycznego w kierunkach X i Y (wyświetlanych na kontrolerze stołu piezoelektrycznego lub w jego oprogramowaniu) jest potrzebnych do pokrycia obszaru całej struktury.
    UWAGA: Zaleca się ustawić system w taki sposób, aby początek skanu XY znajdował się w pobliżu jednego z narożników sferulitu i pokrywał się z pozycją zerową stołu (X i Y = 0).
  4. Dostosuj następujące parametry skanowania:
    1. Ustaw polaryzację wiązki wzbudzenia i obróć płytkę półfalową, aby uzyskać polaryzację odpowiadającą osiom „X” i „Y” płaszczyzny próbki mikroskopowej.
      UWAGA: Można to zrobić poprzez pomiar wykresów polarnych izotropowego ośrodka fluorescencyjnego, takiego jak fluoresceina. Dla takich materiałów maksymalna intensywność fluorescencji jest równoległa do polaryzacji wiązki wzbudzenia; zatem obracanie płytki półfalowej dostosowuje polaryzację do osi X i Y w płaszczyźnie obserwacyjnej, oznaczonych również jako osie X i Y na wykresach polarnych, jak na Rysunku 4C. Pełne wykresy polarne można zmierzyć, zbierając zmierzoną intensywność 2PEF na obu fotodiodach przy obrocie płytki półfalowej o 180° (obrót polaryzacji światła wzbudzenia o 360°) i korelując intensywność z kątem polaryzacji światła wzbudzenia. Można to wykonać ręcznie, mierząc intensywność emisji osobno dla każdego kąta płytki półfalowej, a następnie składając ją w wykres polarny w oprogramowaniu do analizy danych, lub automatycznie, korzystając z dedykowanego lub własnego oprogramowania.
    2. Dostosuj parametry stołu piezoelektrycznego: prędkość skanowania, krok i zakres, aby objąć obszar całego sferulitu.
      UWAGA: Zakres skanowania musi być większy niż średnica sferulitu, aby w pełni ująć całą superstrukturę w skanie rastrowym. Niska prędkość skanowania i mały krok pozwalają uzyskać obrazy wysokiej jakości; może to jednak prowadzić do wypalenia próbki. Dlatego konieczny jest kompromis zależny od rozmiaru sferulitu. Parametry te nie mogą być stosowane uniwersalnie. Przykładowe parametry użyte na Rysunku 5A: zakres skanowania 45 x 45 µm, krok skanowania 1 µm i prędkość skanowania 2 µm/s.
  5. Otwórz migawkę, włącz fotodiody i zbierz składowe emisji 2P Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, schemat naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne. oraz Wzór na równowagę statyczną, równanie ΣIy=2PEFy, schemat analizy mechanicznej. dla każdego pojedynczego kroku wybranego obszaru skanowania – dla wiązki wzbudzenia spolaryzowanej odpowiednio wzdłuż osi X, a następnie Y. Przykładowe skany rastrowe dwufotonowej autofluorescencji (2PAF) sferulitów insuliny przedstawiono na Rysunku 5A.
    UWAGA: Pomiar skanów rastrowych wymaga korelacji współrzędnych stołu piezoelektrycznego ze zebranymi składowymi emisji Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, schemat naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne. oraz Wzór na równowagę statyczną, równanie ΣIy=2PEFy, schemat analizy mechanicznej., co można wykonać ręcznie, mierząc intensywność w każdym pojedynczym punkcie wybranego obszaru, a następnie składając ją w macierz 2D, lub automatycznie za pomocą własnego oprogramowania. Skany rastrowe mogą być przedstawione jako suma intensywności składowych emisji Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, schemat naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne. i Wzór na równowagę statyczną, równanie ΣIy=2PEFy, schemat analizy mechanicznej. lub oddzielnie dla konkretnej składowej emisji. Ponieważ są one silnie zależne od struktury, zniekształcenia strukturalne wewnątrz sferulitów są łatwo widoczne. Jednakże, ze względu na ruch stołu mikroskopowego, niektóre próbki mogą odpłynąć z pola widzenia. Dlatego obrazy muszą być sprawdzane pod kątem artefaktów. Konieczne jest sprawdzenie pozycji sferulitu przed i po skanowaniu.
  6. Aby przeprowadzić pełną analizę polaryzacyjną w konkretnym punkcie próbki, wyłącz wiązkę wzbudzenia.
  7. Następnie wybierz konkretne współrzędne stołu piezoelektrycznego odpowiadające wybranej lokalizacji na sferulicie, w której wymagane są informacje o orientacji cząsteczek z rozdzielczością sub-µm.
  8. Ustaw stół piezoelektryczny tak, aby wycentrować pole widzenia w wskazanym punkcie (X, Y).
  9. Włącz wiązkę wzbudzenia i przeprowadź pełną (360°) analizę polaryzacyjną emisji Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, schemat naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne. oraz Wzór na równowagę statyczną, równanie ΣIy=2PEFy, schemat analizy mechanicznej. poprzez włączenie obrotu płytki półfalowej (obrót o 180°). Przedstaw składowe 2PF Ix i Iy w formie wykresu polarnego (jak pokazano na Rysunku 5B).
    ​UWAGA: Krok ten można powtórzyć w różnych miejscach próbki, aby zebrać wystarczającą ilość danych.

4. Wyznaczenie lokalnego uporządkowania fibryli wewnątrz sferulitów insuliny bydlęcej

UWAGA: Wszystkie obliczenia numeryczne związane z analizą danych zostały wykonane w języku programowania Python z wykorzystaniem funkcji dostępnych w bibliotekach NumPy i SciPy. Do wykreślania danych wymagana jest biblioteka Matplotlib. Wszystkie obliczenia oparto na wzorach przedstawionych w informacjach uzupełniających w jednej z prac Obstarczyk i wsp.6.

  1. Symulowanie intensywności fluorescencji dwufotonowej wzbudzanej dla określonego rozkładu cząsteczek z wybranym kierunkiem polaryzacji światła padającego (oznaczonym jako α)
    UWAGA: Przedstawione wzory opierają się na założeniu równoległych momentów dipolowych absorpcji i emisji fluoroforu. Omówienie innych przypadków (np. różnych kierunków momentów dipolowych absorpcji i emisji, transferu energii między fluoroforami) znajduje się w pracy Le Floc'h et al8.
    1. Wyznaczenie parametrów uwzględniających zmienność pola elektrycznego w wyniku mieszania polaryzacji oraz efektów depolaryzacji spowodowanych przez lustro dichroiczne zamontowane w układzie:
      1. γ reprezentuje czynnik amplitudy pomiędzy współczynnikiem odbicia światła spolaryzowanego reprezentacja równania matematycznego p(rₚ) dla analizy rozkładu prawdopodobieństwa. a Równanie równowagi statycznej, s(rs), w formule skupionej na koncepcjach równowagi mechanicznej. z lustra dichroicznego.
      2. δ reprezentuje przesunięcie fazowe (eliptyczność) pomiędzy światłem spolaryzowanym reprezentacja równania matematycznego p(rₚ) dla analizy rozkładu prawdopodobieństwa. a Równanie równowagi statycznej, s(rs), w formule skupionej na koncepcjach równowagi mechanicznej..
        UWAGA: Prawidłowe zdefiniowanie tych dwóch parametrów jest kluczowe dla skutecznej charakterystyki strukturalnej ze względu na ich silny wpływ na kształt mierzonych wykresów polarnych11,18. W przypadku prezentowanego systemu oba parametry zostały wyznaczone podczas pomiarów elipsometrycznych lustra dichroicznego zastosowanego w układzie.
    2. Obliczanie wektorów padającego pola elektrycznego propagujących w osiach X i Y dla każdego kąta mierzonego podczas pomiaru ps-TPFM przy użyciu równań (1-5).
      Równanie do analizy właściwości optycznych; całka ze zmiennych cosinusowych; formuła badawcza. (1)
      Analiza równania całki eliptycznej, \(E_{YYYY}(\alpha, \delta) = \int_0^{2\pi} (\sin(\alpha)\cos(\rho + \delta))^4 d\rho\). (2)
      Równanie całki równowagi statycznej, E_xxyy(a,γ,δ), formuła matematyczna do analizy badawczej. (3)
      Równanie zaawansowanej optyki; całka z funkcji trygonometrycznych; formuła analizy optycznej. (4)
      Formuła równowagi statycznej, Ey, równanie całkowe, zastosowanie badawcze, analiza matematyczna. (5)
      UWAGA: Jeśli intensywność jest mierzona w pełnym zakresie 360° z krokiem 1°, oblicz wektory pola elektrycznego dla wszystkich 360°. Wszystkie kąty powinny być podane w radianach. Parametr ρ jest powiązany z częstotliwością optyczną ω symulowanego pola elektrycznego (ρ=ω·t) i jest całkowany od 0 do 2π podczas obliczeń wektorów padającego pola elektrycznego propagujących w osiach X i Y dla każdego kąta α mierzonego podczas pomiaru ps-TPFM.
    3. Zdefiniowanie funkcji dla dipoli przejścia w kierunkach trzech osi układu kartezjańskiego zgodnie z równaniami (6-8):
      Równanie polaryzacji: μx(Φ,θ,φ)=-sin(Φ)sin(θ)sin(φ)+cos(Φ)cos(θ); diagram edukacyjny. (6)
      Wyrażenie matematyczne dla trójwymiarowych współrzędnych sferycznych, μy(Φ,θ,φ)=cos(Φ)sin(θ)sin(φ)+sin(Φ)cos(θ) (7)
      Równanie momentu magnetycznego, μz(θ,φ)=-sin(θ)cos(φ), analiza zależności kątowej. (8)
      UWAGA: φ jest kątem orientacji długiej osi fibryli amyloidu w ramce XY próbki. Kąty θ i ϕ to kąty polarne i azymutalnie używane do zdefiniowania orientacji momentu dipolowego przejścia fluoroforu.
    4. Wykorzystanie funkcji zdefiniowanych w kroku 4.1.3. do zdefiniowania funkcji dla Jx (Φ,θ,ϕ) oraz JY (Φ,θ,ϕ), które uwzględniają wkład silnego ogniskowania światła za pomocą obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej w detekcji polaryzacji fluorescencji w kierunkach X i Y przy użyciu równań (9, 10).
      Równanie do analizy równowagi statycznej; formuła symboliczna; odniesienie edukacyjne. (9)
      Równanie matematyczne dla sił dynamicznych w równowadze statycznej, zawierające zmienne i stałe. (10)
      UWAGA: Czynniki K1, K2, K3 są powiązane z obiektywem mikroskopowym używanym podczas pomiaru ps-TPFM. W tych eksperymentach użyto apochromatycznego obiektywu immersyjnego olejowego 100x/1,4 NA, a czynniki K1, K2, K3 wynosiły odpowiednio 2,945, 0,069 i 1,016.
    5. Zdefiniowanie funkcji dla f(Ω), która jest kątowym rozkładem cząsteczkowym, zależnym od połowy apertury stożka fluoroforu Ψ, z jego zmienną szerokością ΔΨ; należy użyć równania (11). Graficzna reprezentacja wszystkich trzech kątów dotyczących fibryli amyloidu przedstawiona jest na Rysunku 6.
      Równanie pokazujące rozkład prawdopodobieństwa; zawiera funkcje sinusoidalne i wykładnicze; formuła matematyczna. (11)
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas zapisywania wykładnika – potęga 2 odnosi się do argumentu funkcji, a nie do całej funkcji!
    6. Zdefiniowanie wszystkich czynników fWWIJKL zgodnie z równaniami (12-21).
      Równanie wyświetlające formułę całki, prawdopodobnie związaną z momentem kątowym w mechanice kwantowej. (12)
      Równanie mechaniki kwantowej dla całkowania funkcji falowej Ψ; koncepcja fizyki matematycznej. (13)
      Równowaga statyczna; równanie ΣF=0; formuła matematyczna; badania edukacyjne; analiza fizyczna. (14)
      Formuła rozproszenia dla całkowania przekroju czynnego, rachunek całkowy, równania naukowe. (15)
      Równanie całkowe mechaniki statystycznej, formuła rozkładu w przestrzeni fazowej, analiza matematyczna. (16)
      Równanie kwantowego rozproszenia w fotonice; diagram formuły całkowej; analiza optyczna. (17)
      Równanie formuły całkowania mechaniki kwantowej, zastosowanie w badaniach naukowych, analiza matematyczna. (18)
      Równanie równowagi statycznej, formuła całkowa; analiza matematyczna w badaniach fizycznych. (19)
      Równanie analizy widmowej, ustawienie całki, sformułowanie matematyczne w kontekście badania optycznego. (20)
      Równanie całkowania matematycznego, analiza naukowa, zaawansowane formuły badawcze. (21)
    7. Obliczanie intensywności fluorescencji wzbudzanej dwufotonowo Równowaga statyczna, ΣFx=0, równanie, zastosowanie edukacyjne. oraz Równanie równowagi statycznej ΣFx=0, diagram z ilustracją koncepcji sił równowagi. dla każdego zmierzonego kąta (podobnie jak w punkcie 4.1.2) przy użyciu równań (22, 23).
      Równanie równowagi statycznej \(I_{x, sim}^{2PEF}(\theta)\) formuła dla diagramu wzbudzenia optycznego. = Równania równowagi statycznej ΣFx=0, MA=0; analiza formuły matematycznej; obliczenia naukowe. (22)
      Równanie intensywności fluorescencji dwufotonowej I<sub>y,sim</sub><sup>2PEF</sup>(θ), diagram. = Równanie obliczania składnika tensora elastyczności, zawierające wiele indeksów i sumowanie. (23)
    8. Weryfikacja poprawności działania symulacji przy użyciu następujących wartości zmiennych (podanych w legendzie do Rysunku 7) i porównanie uzyskanych wyników z Rysunkiem 7A-C.
      UWAGA: Wszystkie stopnie powinny być zapisane w radianach.
  2. Dopasowanie symulowanych intensywności do intensywności autofluorescencji wzbudzanej dwufotonowo sferulitów insuliny bydlęcej zebranej podczas pomiarów ps-2PFM.
    UWAGA: Rozwiązanie struktury sferulitu na podstawie pomiarów ps-2PFM wymaga zastosowania równań opisanych w protokole do symulacji teoretycznej intensywności fluorescencji wzbudzanej dwufotonowo i dopasowania wszystkich parametrów związanych z uporządkowaniem fluoroforu cząsteczkowego. Wymaga to wielokrotnych iteracji dla różnych wartości Φ (kąta opisującego rotację fibryli w płaszczyźnie XY próbki mikroskopowej) oraz ΔΨ (aberracji stożkowego rozkładu dipola emisji Ψ wynikających z rotacji cząsteczek w filamentach dla stałego Ψ) aż do osiągnięcia najwyższego możliwego współczynnika R2 pomiędzy znormalizowaną intensywnością sygnału fluorescencji wzbudzanej dwufotonowo zebraną podczas pomiaru a znormalizowanymi intensywnościami symulowanymi zgodnie z krokiem 4.1 protokołu.
    1. Wyznaczenie połowy kąta Ψ.
      UWAGA: Dla sferulitów insuliny bydlęcej powinno on wynosić Ψ = 29°6.
    2. Przebieg dopasowania:
      1. Wybierz wartość Φ z zakresu od 0° do 180° (na Rysunku 8A i 8B Φ wynosi odpowiednio 16° i 127°).
      2. Wybierz wartość ΔΨ z zakresu od 0° do 90° (na Rysunku 8A,B ΔΨ wynosi odpowiednio 24° i 1°).
      3. Oblicz Równanie równowagi statycznej \(I_{x, sim}^{2PEF}(\theta)\) formuła dla diagramu wzbudzenia optycznego. (równanie 22) oraz Równanie intensywności fluorescencji dwufotonowej I<sub>y,sim</sub><sup>2PEF</sup>(θ), diagram.(równanie 23) dla całego zmierzonego zakresu kątów θ przy użyciu wybranych wartości Φ i ΔΨ.
      4. Porównaj intensywności obliczone podczas symulacji (obie znormalizowane do wartości maksymalnej z
      5. Oblicz Równanie równowagi statycznej \(I_{x, sim}^{2PEF}(\theta)\) formuła dla diagramu wzbudzenia optycznego.) z znormalizowanymi intensywnościami z
      6. Oblicz Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, diagram naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne. oraz Formuła równowagi statycznej, równanie ΣIy=2PEFy, diagram analizy mechanicznej. (obie znormalizowane do wartości maksymalnej z Równowaga statyczna, ΣFx=0; równanie równowagi, diagram naukowy; koncepcje badawcze i inżynieryjne.) zmierzonych podczas pomiaru ps-2PFM.
        UWAGA: W przedstawionych eksperymentach współczynniki korelacji iloczynowo-momentowej Pearsona obliczono przy użyciu funkcji „corrcoef” z biblioteki NumPy w języku Python.
    3. Na koniec wybierz wartości Φ i ΔΨ prowadzące do najwyższych współczynników korelacji i zbieżności pomiędzy intensywnościami symulowanymi a zmierzonym sygnałem, podobnie jak pokazano na Rysunku 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania nadstruktur amyloidu do badań za pomocą ps-2PFM, budowy układu mikroskopowego oraz pomiarów odpowiedniej próbki. Przed jednak wykonaniem końcowego zestawu pomiarów niezbędne jest prawidłowe wyrównanie detektorów APD za pomocą izotropowego wzorca, co powinno skutkować zarejestrowaniem symetrycznego sygnału o podobnym kształcie i intensywności na obu detektorach (Rysunek 4C). Nawet minimalne różnice między intensyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroskopia dwufotonowa z czułością polaryzacyjną jest cennym narzędziem do badania lokalnego uporządkowania fibryli wewnątrz superstruktur amyloidowych, wymagającym jedynie niewielkich modyfikacji standardowego układu wielofotonowego. Ponieważ opiera się ona na nieliniowych zjawiskach optycznych, można w niej osiągnąć zredukowaną fotoselekcję kątową oraz zwiększoną rozdzielczość osiową w porównaniu z metodami mikroskopii fluorescencyjnej z wzbudzeniem jednofotonowym. Ponadto prowadzi ona do mniejszego rozproszenia świat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez projekt Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finansowany przez Narodowe Centrum Nauki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie próbki
Szkiełka nakrywkowe, 24 x 24 mmChemland04-298.202.04
Uchwyt DPX do histologiiSigma-Aldrich6522Uchwyt do szkiełek
Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, polipropylenChemland02-63102
Eppendorf ThermoMixer  CEppendorfSłuży do inkubacji sferulitu
HLP 5UV System oczyszczania wodyHydrolabŹródło wody djonizowanej używanej do przygotowania próbki
Kwas solny (≥ 37%, APHA ≤ 10),Sigma-Aldrich30721-M
Insulina w proszku z trzustki bydlęcej (≥ 25 jednostek/mg (HPLC))Sigma-AldrichI5500
(klasa HPLC)Sigma-Aldrich270474
Szkiełka mikroskopowe z wklęsłym, 76 x 26 x 1 mmChemland04-296.202.09
Olympus BX60OlympusPolaryzacyjny mikroskop optyczny używany na rysunku 2
Taśma uszczelniająca gwint PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2ChemlandVIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra IICoherent
FELH0800 - Ø Filtr długoprzepustowy 25,0 mmThorlabs
FESH0700 - Ø Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mmThorlabs
lawinowe zliczające fotony Krótkoprzepustowy filtr emisyjny ID Quantique
Multiphoton 720 nm Semrock
Mounted Achromatyczna półfalowa płytka, 690-1200 nmThorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NANikon
piezoelektryczny stolik 3DPiezosystem Jena
Polaryzacyjny rozdzielacz wiązkiThorlabs
S130C - Smukły czujnik mocy fotodiody, Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabs
Software
LabView 2018National InstrumentsWersja 18.0.1f2
BibliotekaWersja 3.3.2
BibliotekaWersja 1.19.2
BibliotekaWersja 1.5.2
Spyder Python 3 IDEWersja 4.1.5
Metanol IDQ100 fotodiody Matplotlib NumPy SciPy

Bibliografia

  1. Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
  2. Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
  3. Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
  4. De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
  5. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  6. Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
  7. Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures - local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
  8. Le Floc'h, V., Brasselet, S., Roch, J. -F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
  9. Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer's disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
  10. Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
  11. Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
  12. Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
  13. Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
  14. Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
  15. Brasselet, S., et al. Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. Mély, Y., Duportail, G. , Springer. Berlin Heidelberg. 311-337 (2013).
  16. Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
  17. Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
  18. Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
  19. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  20. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  21. Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
  22. Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
  23. de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
  24. Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611(2019).
  25. Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829(2012).
  26. Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza polaryzacyjnacharakterystyka amyloiduagregaty bia kowew kna amyloidoweobrazowanie autofluorescencyjnenieliniowa mikroskopia optycznaorganizacja molekularnatechniki obrazowania biologicznegochoroby neurodegeneracyjne
Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.