Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.

Streszczenie

W porównaniu do swojego jednofotonowego odpowiednika, wzbudzenie dwufotonowe jest korzystne dla eksperymentów bioobrazowania ze względu na niższą fototoksyczność, głębszą penetrację tkanek, efektywne działanie w gęsto upakowanych systemach i zredukowaną kątową fotoselekcję fluoroforów. Tak więc wprowadzenie analizy polaryzacji w dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej (2PFM) zapewnia bardziej precyzyjne określenie organizacji molekularnej w próbce w porównaniu ze standardowymi metodami obrazowania opartymi na liniowych procesach optycznych. W niniejszej pracy skupiamy się na wrażliwym na polaryzację 2PFM (ps-2PFM) i jego zastosowaniu w określaniu uporządkowania molekularnego w złożonych biostrukturach - sferulitach amyloidowych. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy Parkinsona, są często diagnozowane poprzez wykrywanie agregatów białkowych amyloidów powstałych w wyniku upośledzonego procesu nieprawidłowego fałdowania białek. Zbadanie ich struktury prowadzi do lepszego zrozumienia ich ścieżki powstawania, a co za tym idzie, do opracowania bardziej czułych metod diagnostycznych. W pracy przedstawiono ps-2PFM przystosowany do wyznaczania miejscowej kolejności włókienek wewnątrz sferulitów insuliny bydlęcej i sferycznych agregatów białek amyloidogennych. Co więcej, udowadniamy, że proponowana technika może rozwiązać trójwymiarową organizację włókienek wewnątrz sferulitu.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, mimo że nastąpił znaczący rozwój licznych technik mikroskopii fluorescencyjnej do bioobrazowania białek i ich agregatów¹, tylko kilka z nich zostało wykorzystanych do rozwiązania ich lokalnego uporządkowania w próbce^2,3. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji⁴ została wykorzystana do zbadania wewnętrznej niejednorodności strukturalnej nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Co więcej, ilościowe określenie lokalnego uporządkowania wewnątrz złożonych i gęsto upakowanych biostruktur, takich jak sferulity, można rozwiązać przy użyciu metod wrażliwych na polaryzację³. Jednak standardowe techniki fluorescencji z powierzchowną penetracją tkanek są ograniczone, ponieważ użycie długości fal UV-VIS do wzbudzenia fluoroforów in vivo prowadzi do wysokiego rozpraszania światła w tkankach⁵. Ponadto takie obrazowanie często wymaga zaprojektowania i powiązania określonych sond fluorescencyjnych z docelową biomolekułą, co zwiększa koszt i ilość pracy potrzebnej do wykonania obrazowania.

Ostatnio, aby rozwiązać te problemy, nasz zespół dostosował czułą na polaryzację mikroskopię fluorescencji wzbudzonej dwoma fotonami (ps-2PFM) do bezznacznikowego obrazowania struktur biologicznych^6,7. Ps-2PFM pozwala na pomiar zależności intensywności fluorescencji dwufotonowej od kierunku polaryzacji liniowej wiązki wzbudzenia oraz analizę polaryzacji emitowanej fluorescencji⁸. Implementacja tej techniki wymaga uzupełnienia standardowej ścieżki wzbudzenia ustawienia mikroskopu wielofotonowego (Rysunek 1) o płytkę półfalową do sterowania płaszczyzną polaryzacji światła. Następnie z sygnałów zebranych przez dwie fotodiody lawinowe, zbierając w ten sposób dwie, wzajemnie prostopadłe składowe polaryzacji polaryzacji fluorescencji wzbudzonej tworzy się wykresy biegunowe, obrazujące zależność intensywności wzbudzonej fluorescencji dwufotonowej od polaryzacji wzbudzonej przez dwa fotony.

Ostatnim krokiem jest proces analizy danych, uwzględniający wpływ elementów optycznych, takich jak zwierciadła dichroiczne czy obiektyw o dużej aperturze numerycznej, na polaryzację. Ze względu na naturę procesu dwufotonowego, metoda ta zapewnia zarówno zredukowaną kątową selekcję zdjęć, jak i zwiększoną rozdzielczość osiową, ponieważ wzbudzenie fluoroforów dwufotonowych poza płaszczyzną ogniskową jest probabilistycznie ograniczone. Udowodniono również, że podobne metody mogą być z powodzeniem wdrożone do obrazowania in vivo sond bliskiej podczerwieni (NIR) do obrazowania tkanek głębokich⁹. Ps-2PFM został wcześniej zastosowany do obrazowania fluoroforów w błonach komórkowych¹⁰ i DNA^11,12, a także niestandardowych markerów fluorescencyjnych systemów biologicznych, takich jak nanocząstki złota¹³. Jednak we wszystkich tych przykładach informacje o organizacji biomolekuł zostały uzyskane pośrednio i wymagały predefiniowanej wzajemnej orientacji między fluoroforem a biomolekułą.

W jednym z naszych ostatnich artykułów wykazaliśmy, że ps-2PFM może być z powodzeniem stosowany do określania lokalnej polaryzacji autofluorescencji nadbudówek amyloidu i fluorescencji tioflawiny T, barwnika specyficznego dla amyloidu, związanego z włókienkami amyloidu w sferulitach⁶. Co więcej, w innym wykazaliśmy możliwość wykorzystania ps-2PFM do wykrywania orientacji włókienek amyloidowych wewnątrz sferulitów amyloidowych w reżimie wielkości submikronowej, co zostało potwierdzone przez korelację z obrazowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)⁷. Osiągnięcie tego wyniku było możliwe dzięki: i) autofluorescencji wewnętrznej sferulitów-amyloidów, wzbudzonych jednym lub dwoma fotonami, wykazują autofluorescencję wewnętrzną z maksimami emisyjnymi zlokalizowanymi w zakresie od 450 do 500 nm i dwufotonowymi przekrojami czynnymi absorpcji porównywalnymi ze standardowymi barwnikami fluorescencyjnymi14, ii) modele matematyczne wprowadzone wcześniej w celu opisania, w jaki sposób ps-2PEF barwników znakujących błony biologiczne i struktury DNA można zastosować do fluorescencji wykazywanej przez sferulity i barwniki z nimi związane^8,11,15. Dlatego przed przystąpieniem do analizy zalecamy zapoznanie się z wymaganą teorią opisaną zarówno w tekście głównym, jak i w informacjach pomocniczych naszego pierwszego artykułu na ten temat⁶. W tym miejscu przedstawiamy protokół zastosowania techniki ps-2PFM do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu sferulitów insuliny bydlęcej.

Protokół

1. Przygotowanie preparatów mikroskopowych z w pełni rozwiniętymi sferulitami

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i sprzętu użytego w tym protokole. Wszystkie roztwory przygotowano z wodą dejonizowaną (18,2 MΩ·cm w temperaturze 25 °C) uzyskaną z systemu oczyszczania wody.

1. Inkubuj sferulity amyloidowe w oparciu o protokół opisany przez Krebs et al¹⁶. z pewnymi modyfikacjami, jak opisano poniżej.
   1. Odważyć 10 mg insuliny w proszku w probówce o pojemności 1,5 ml.
   2. Rozpuścić proszek w 1 ml podwielokrotności dejonizowanego roztworu_H2O/HCl (pH 1,5).
   3. Uszczelnić próbkę taśmą i umieścić ją w mieszalniku termicznym do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 70 °C (0 obr./min).
      UWAGA: Aby wykonać obrazowanie amyloidów w ich naturalnym (tj. uwodnionym) środowisku i zapobiec deformacji próbki na skutek odwodnienia, konieczne jest przygotowanie preparatów mikroskopowych zgodnie z poniższym opisem (schemat pokazany w Rysunek 2).
2. Dokładnie umyj szkiełko mikroskopu wodą.
3. Zanurz szkiełka w metanolu i pozostaw je do wyschnięcia w warunkach otoczenia na bezpyłowej chusteczce.
4. Pobrać 100 μl porcji roztworu sferulitu z probówki za pomocą pipety automatycznej (krok 1.1.2) i dodać ją do studzienki znajdującej się w centralnej części szkiełka mikroskopowego.
5. Przykryj roztwór szkiełkiem nakrywkowym, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
6. Umieść mocowanie wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym za pomocą automatycznej pipety, aby uszczelnić natywny roztwór sferulitów.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby mocowanie szkiełek ślizgowych było osadzane zarówno na szkiełku nakrywkowym, jak i na powierzchniach prowadnicy. Zrób to pod dymiącym kapturem ze względu na toksyczność lotnego rozpuszczalnika (ksylenu). Zobacz wstawkę w Rysunek 2.
7. Pozostaw próbkę mikroskopu w warunkach otoczenia, aby substancja mocująca stwardniała.
   UWAGA: Proces utwardzania jest zależny od temperatury i wilgotności, ale powinien zakończyć się w ciągu 12 godzin.
8. Sprawdź, czy sferulity insuliny zostały prawidłowo uformowane za pomocą spolaryzowanego mikroskopu optycznego (POM) ze skrzyżowanymi polaryzatorami. Przeskanuj próbkę w poszukiwaniu charakterystycznego wzoru jasnych obszarów, zwanego krzyżem maltańskim, jak pokazano na Rysunek 3.
   UWAGA: Sferulity amyloidowe można zdefiniować jako kuliste nadbudowy charakteryzujące się niejednorodną morfologią o strukturze rdzeń-powłoka. W szczegółach składają się z amorficznego rdzenia i promieniście rosnących włókien amyloidowych¹⁶. Ze względu na anizotropowy charakter struktur sferulitowych, mogą one wyraźnie oddziaływać ze światłem spolaryzowanym (np. poprzez załamanie) i zmieniać swoją fazę, co można łatwo zaobserwować pod POM z polaryzatorami skrzyżowanymi. Metodę tę wykorzystano do badania tylko w pełni rozwiniętych sferulitów charakteryzujących się modelowym wzorem krzyża maltańskiego. W związku z tym agregaty lub sferulity zniekształcone strukturalnie zostały wyłączone z dalszych badań.

2. Budowa i dostosowywanie systemu

UWAGA: Schematyczne przedstawienie mikroskopu dwufotonowego wrażliwego na polaryzację można znaleźć w Rysunek 1.

1. Zainstaluj laser femtosekundowy z możliwością przestrajania długości fali wyjściowej w zakresie 690-1,080 nm, na przykład działający na laserze Ti: Sapphire z synchronizacją modów z impulsami ~100 fs o częstotliwości powtarzania 80 MHz.
2. Dodaj płytkę półfalową zamontowaną na stoliku obrotowym do ścieżki wzbudzenia zestawu, aby kontrolować polaryzację padającego światła w płaszczyźnie próbki mikroskopu XY.
3. Zamontuj zwierciadło dichroiczne, aby odciąć wiązkę wzbudzenia od optyki wykrywającej.
   UWAGA: Charakterystyka optyczna zwierciadła dichroicznego powinna pozwalać na odbicie wiązki wzbudzenia (do próbki) w zakresie długości fal NIR i jednocześnie być przezroczysta dla zakresu długości fal odpowiadającego emisji z próbek.
4. Zainstaluj piezoelektryczny stolik skanujący do skanowania rastrowego w płaszczyźnie XY dla wybranego Z.
5. Zamontuj obiektyw zanurzeniowy o wysokim NA, na przykład apochromatyczny obiektyw immersyjny z olejkiem 100x/1,4 NA.
   UWAGA: Ponieważ cała konfiguracja działa w trybie epi-fluorescencji, incydent i emitowane sygnały przechodzą przez ten sam cel.
6. Na ścieżce emisji dodaj polaryzacyjny rozdzielacz wiązki, który rozdziela dwufotonową emisję wzbudzoną na dwie ortogonalnie spolaryzowane składowe (I,_X i_{I, Y})
7. Zainstaluj dwie fotodiody lawinowe zliczające fotony (APD) w konfiguracji umożliwiającej im zbieranie światła przenoszonego i odbijanego za pomocą rozdzielacza wiązki, odpowiednio, (Rysunek 1).
8. Na ścieżce wzbudzenia i emisji układu należy zamontować odpowiednie filtry odcinające zależne od długości fali, na przykład filtr długoprzepustowy 800 nm bezpośrednio w ścieżce optycznej wzbudzenia i filtr krótkoprzepustowy 700 w ścieżce emisji.
   UWAGA: Przeanalizuj widma emisyjne sferulitu, aby można było wykluczyć potencjalny wkład generacji drugiej harmonicznej (SHG) lub światła laserowego za pomocą odpowiednich filtrów emisyjnych. Warto również zauważyć, że system ten powinien również umożliwiać pomiary wrażliwego na polaryzację SHG, który mógłby być wykorzystany do ustalenia kolejności biomolekuł w próbkach. Jednak analiza danych sygnału SHG różni się od fluorescencji, która bardziej szczegółowo została opisana przez Aït-Belkacem i wsp.¹⁷.
9. Wyrównaj cały układ (korzystając z trybu wyrównania wbudowanego w wiele laserów), aż do uzyskania podobnych intensywności sygnału za pomocą obu fotodiod.
10. Sprawdź, czy wiązka wzbudzenia skupiona przez obiektyw o wysokim NA i zobrazowana przez kamerę ma koncentryczny okrągły kształt, jak pokazano na Rysunek 4A.
11. Dostosuj czas skanowania i odpowiednią moc, aby zminimalizować uszkodzenia wywołane przez laser padający na próbkę. Przykładowe wypalanie punktowe przedstawiono w Rysunek 4B. Zmierz moc nominalną za pomocą cyfrowego ręcznego miernika mocy podłączonego do czujnika mocy fotodiody umieszczonego przy wejściu do korpusu mikroskopu.
    UWAGA: Próbki biologiczne można łatwo spalić dzięki oświetleniu laserowemu. W tym przypadku stwierdzono, że zakres mocy 100 -900 μW (w ognisku soczewki obiektywu) stanowi doskonały kompromis między stabilnością próbki a intensywną emisją.
12. Przed pomiarem próbki należy sprawdzić jakość ustawienia optyki z izotropową próbką referencyjną (np. fluoresceiną zawartą w polimerze amorficznym). Aby przeprowadzić kontrolę kalibracji, należy postępować zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 3, używając izotropowego wzorca zamiast próbki amyloidu.
    UWAGA: Przy założeniu, że układ mikroskopowy jest idealnie dostosowany do próbki o właściwościach izotropowych, obie składowe emisji 2P (I_X i_{I Y}) wykryte za pomocą dwóch APD powinny charakteryzować się tą samą intensywnością (Rysunek 4C).

3. Pomiar sferulitów insuliny bydlęcej

UWAGA: Do wykonania wszystkich opisanych pomiarów ps-2PF użyto ręcznie napisanego oprogramowania, które kontroluje pozycje stopnia piezoelektrycznego i płytki półfalowej oraz zbiera sygnał z obu fotodiod, co pozwala na wykreślanie skanów XY (skanów rastrowych) z wybranych obszarów na szkiełkach mikroskopowych, a także wykresów biegunowych z określonych współrzędnych próbki. Do protokołu dodano również dodatkowe uwagi, które pozwolą użytkownikom na wykonanie pomiaru bez niego, ponieważ zarówno stopień piezoelektryczny, jak i stopień obrotowy używane do obracania płytki półfalowej mogą być sterowane za pomocą własnych sterowników lub odpowiedniego oprogramowania. Mimo to zdecydowanie zaleca się napisanie algorytmu łączącego kąt obrotu płytki półfalowej z intensywnością 2PEF zebraną za pomocą obu fotodiod, ponieważ ta korelacja (wykresy biegunowe) ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej analizy danych prowadzącej do uzyskania informacji strukturalnych.

1. Zamontuj próbkę ze sferulitami na stoliku piezoelektrycznym (unieruchomij szkiełko taśmą). Pamiętaj, aby zamontować go w taki sposób, aby cienka szklana strona (szkiełko nakrywkowe) była skierowana w stronę obiektywu, ponieważ wysokie obiektywy numeryczne charakteryzują się stosunkowo krótkimi odległościami roboczymi.
   UWAGA: W przypadku stosowania zanurzenia w olejku, przed zamontowaniem próbki i ustawieniem ostrości na obiektyw należy nałożyć niewielką kroplę oleju mineralnego.
2. Zmieniając pozycje XY i Z za pomocą pokręteł mikroskopu, ustaw ostrość obiektywu na jednym ze sferulitów znajdujących się w roztworze, ale należy pamiętać, że ponieważ średnice sferulitów są zwykle w zakresie kilkudziesięciu μm, należy skupić się na centralnym obszarze całej struktury. Szukaj czarnych i białych aureoli wokół określonego sferulitu jako oznak odpowiednio niedostatecznego i górnego ogniskowania. Dostosuj oś "Z" tak, aby znajdowała się między tymi skrajnościami.
   UWAGA: Ważne jest, aby znaleźć izolowaną próbkę bez wad strukturalnych. Ekstremalnie małe sferulity mogą odpływać z powodu naprężeń materiałowych wprowadzanych przez obiektyw, podczas gdy największe struktury są prawdopodobnie zagregowane lub silnie zniekształcone.
3. Wyśrodkuj sferulit w polu widzenia obserwowanej płaszczyzny mikroskopowej i określ rozmiar skanu XY, patrząc na to, ile kroków piezostage w kierunkach X i Y (wyświetlanych na sterowniku piezostage lub w jego oprogramowaniu) jest potrzebnych do pokrycia obszaru całej konstrukcji.
   UWAGA: Zaleca się ustawienie systemu w taki sposób, aby początek skanowania XY znajdował się w pobliżu jednego z rogów sferulitu i pokrywał się z położeniem zerowym stolika (X i Y = 0)
4. Dostosuj następujące parametry skanowania:
   1. Wyreguluj polaryzację wiązki wzbudzenia i obróć płytkę półfalową, aby uzyskać polaryzację odpowiadającą osiom "X" i "Y" płaszczyzny próbki mikroskopu.
      UWAGA: Można to zrobić, mierząc wykresy biegunowe izotropowego ośrodka fluorescencyjnego, takiego jak fluoresceina. W przypadku takich materiałów maksymalna intensywność fluorescencji jest równoległa do polaryzacji wiązki wzbudzenia; w ten sposób obracanie płytki półfalowej dostosowuje polaryzację z osiami X i Y na płaszczyźnie obserwacyjnej, oznaczanej również jako oś X i Y na wykresach biegunowych, jak w Rysunek 4C. Pełne wykresy biegunowe można zmierzyć, zbierając zmierzoną intensywność 2PEF na obu fotodiodach dla obrotu płytki półfalowej o 180 ° (obrót o 360 ° polaryzacji światła wzbudzenia) i korelując intensywność z kątem polaryzacji światła wzbudzenia. Można to zrobić ręcznie, mierząc intensywność emisji dla każdego kąta półfalowego płytki osobno, a następnie składając ją w wykres biegunowy w oprogramowaniu do analizy danych lub automatycznie, za pomocą dedykowanego lub samodzielnie napisanego oprogramowania.
   2. Dostosuj parametry piezostage: prędkość skanowania, krok i zakres, aby pokryć obszar całego sferulitu.
      UWAGA: Zakres skanowania musi być większy niż średnica sferulitu, aby w pełni wykadrować całą nadbudowę w obrębie skanu rastrowego. Niska prędkość skanowania i krok pozwalają użytkownikom uzyskać obrazy wysokiej jakości; Może to jednak spowodować spalenie próbki. Dlatego konieczny jest kompromis zależny od wielkości sferulitu. Parametry te nie mogą być powszechnie stosowane. Przykładowe parametry użyte w Rysunek 5A: zakres skanowania 45 x 45 μm, krok skanowania 1 μm, prędkość skanowania 2 μm/s.
5. Otwórz migawkę, włącz fotodiody i zbierz i Składowe emisji 2P dla każdego kroku wybranego obszaru skanowania - dla wiązki wzbudzenia spolaryzowanej odpowiednio do osi X, a następnie Y. Przykładowe skany rastrowe sferulitów insuliny z autofluorescencją wzbudzoną dwufotonową (2PAF) przedstawiono w Rysunek 5A.
   UWAGA: Pomiar skanów rastrowych wymaga skorelowania współrzędnych stolika piezoelektrycznego z i zebrane składniki emisji, co można zrobić ręcznie, mierząc intensywność w każdym punkcie wybranego obszaru, a następnie składając ją w matrycę 2D lub automatycznie, za pomocą samodzielnie napisanego oprogramowania. Skany rastrowe mogą być przedstawione jako suma i intensywności składników emisji lub charakterystycznie dla konkretnego składnika emisji. Ponieważ są one w dużym stopniu zależne od struktury, zniekształcenia strukturalne w sferulitach są łatwo widoczne. Jednak ze względu na ruch stolika mikroskopu niektóre próbki mogą zejść z pola widzenia. W związku z tym obrazy muszą być sprawdzane pod kątem artefaktów. Konieczne jest sprawdzenie położenia sferulitu przed i po skanowaniu.
6. Aby przeprowadzić pełną analizę polaryzacji z określonego miejsca na próbce, wyłącz wiązkę wzbudzenia.
7. Następnie wybierz konkretne współrzędne piezoetapu odpowiadające wybranemu miejscu na sferulicie, w którym wymagana jest informacja o orientacji cząsteczek z rozdzielczością poniżej μm.
8. Dostosuj piezoelektryczny stage, aby wyśrodkować pole view we wskazanym (X, Y).
9. Włącz wiązkę wzbudzenia i wykonaj pełną (360°) analizę polaryzacji i emisję, włączając obrót płyty półfalowej (obrót o 180°). Przedstaw składowe 2PF Ix i Iy w postaci wykresu biegunowego (jak pokazano na rysunku Rysunek 5B).
   UWAGA: Ten krok można powtórzyć w różnych miejscach w próbce, aby zebrać wystarczającą ilość danych.

4. Określenie lokalnej kolejności włókienek wewnątrz sferulitów insuliny bydlęcej

UWAGA: Wszystkie obliczenia numeryczne związane z analizą danych zostały wykonane przy użyciu języka programowania Python i w oparciu o funkcje dostępne w bibliotekach NumPy i SciPy. Wykreślanie danych wymaga biblioteki Matplotlib. Wszystkie obliczenia oparte są na wzorach przedstawionych w informacjach uzupełniających w jednym z artykułów Obstarczyk et al.⁶.

1. Symulacja intensywności fluorescencji dwufotonowej wzbudzonej dla określonego rozkładu cząsteczek z wybranym kierunkiem polaryzacji światła padającego (oznaczonego przez α)
   UWAGA: Przedstawione wzory opierają się na założeniu równoległych absorpcyjnych i emisyjnych momentów dipolowych fluoroforu. Dla omówienia innych przypadków (np. różne kierunki absorpcji i emisyjnych momentów dipolowych, transfer energii między fluoroforami), zobacz artykuł Le Floc'h et al⁸.
   1. Znajdź parametry odpowiadające za zmienność pola elektrycznego przez mieszanie polaryzacji i efekty depolaryzacji powodowane przez zwierciadło dichroiczne zamontowane w konfiguracji:
      1. γ reprezentuje współczynnik amplitudy między współczynnikiem odbicia i spolaryzowane światło z dichroicznego lustra.
      2. δ reprezentuje przesunięcie fazowe (eliptyczność) między i światło spolaryzowane.
         UWAGA: Prawidłowe zdefiniowanie tych dwóch parametrów ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej charakterystyki strukturalnej ze względu na ich silny wpływ na kształt mierzonych wykresów biegunowych^11,18. W przypadku prezentowanego układu oba parametry zostały wyznaczone podczas pomiarów elipsometrycznych zwierciadła dichroicznego zastosowanego w układzie.
   2. Obliczyć wektory padającego pola elektrycznego rozchodzące się w osiach X i Y dla każdego kąta mierzonego podczas pomiaru ps-TPFM za pomocą równań (1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      UWAGA Jeśli natężenie jest mierzone w całym zakresie 360° z krokiem 1°, należy obliczyć wektory pola elektrycznego dla wszystkich 360°. Wszystkie kąty powinny być podane w radianach. Parametr ρ jest powiązany z częstotliwością optyczną ω symulowanego pola elektrycznego (ρ=ω·t) i stosowany w postaci całkowanej od 0 do 2π podczas obliczeń padających wektorów pola elektrycznego rozchodzących się w osi X i Y dla każdego α kąta mierzonego podczas pomiaru ps-TPFM.
   3. Zdefiniuj funkcje dla przejściowych momentów dipolowych w kierunkach trzech osi układu kartezjańskiego według równań (6-8):
      (6)
      (7)
      (8)
      UWAGA: φ jest kątem orientacji długiej osi włókienka amyloidowego w ramce próbki XY. Kąty θ i φ to kąty biegunowe i azymutalne używane do definiowania orientacji przejściowego momentu dipolowego fluoroforu.
   4. Użyć funkcji zdefiniowanych w kroku 4.1.3, aby zdefiniować funkcje dla J_x (Φ,θ,φ) i J_Y (Φ,θ,φ), które uwzględniają udział ciasnego ogniskowania światła przy obiektywie o dużej aperturze numerycznej do wykrywania polaryzacji fluorescencji w kierunku X i Y za pomocą równań (9, 10).
      (9)
      (10)
      UWAGA: Czynniki K₁, K₂, K₃ są związane z obiektywem mikroskopu używanym podczas pomiaru ps-TPFM. W tych eksperymentach użyto apochromatycznego obiektywu immersyjnego z olejkiem 100x/1,4 NA, a współczynniki K₁, K₂, K₃ wynosiły odpowiednio 2,945, 0,069 i 1,016.
   5. Zdefiniuj funkcję dla f(Ω), która jest molekularnym rozkładem kątowym, zależnym od połowy apertury stożka fluoroforowego Ψ, o zmiennej grubości ΔΨ; użyj równania (11). Graficzne przedstawienie wszystkich trzech kątów dotyczących fibrylu amyloidowego przedstawiono w Rysunek 6.
      (11)
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pisania wykładnika - potęga liczby 2 działa na argument funkcji, a nie na całej funkcji!
   6. Zdefiniuj wszystkie współczynniki _{f WWIJKL} zgodnie z równaniami (12-21).
      (12)
      (13)
      (14)
      (15)
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. Oblicz intensywności fluorescencji wzbudzonej dwoma fotonami i dla każdego zmierzonego kąta (podobnie jak w punkcie 4.1.2) za pomocą równań (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Sprawdź, czy symulacja działa poprawnie, korzystając z następujących wartości zmiennych (umieszczonych w legendzie do Rysunek 7) i porównaj uzyskane wyniki z Rysunek 7A-C.
      UWAGA: Wszystkie stopnie powinny być zapisane w radianach.
2. Dopasuj symulowane intensywności do intensywności autofluorescencji wzbudzonej dwoma fotonami sferulitów insuliny bydlęcej zebranych podczas pomiarów ps-2PFM.
   UWAGA: Rozdzielenie struktury sferulitu na podstawie pomiarów ps-2PFM wymaga wykorzystania równań zapisanych w protokole do symulacji teoretycznej intensywności dwufotonowej wzbudzonej fluorescencji i dopasowania wszystkich parametrów związanych z porządkowaniem fluoroforu molekularnego. Wymaga to wielokrotnych iteracji po różnych wartościach Φ, kąta opisującego rotację włókienka w próbce mikroskopu XY, i ΔΨ, aberracji stożkowego rozkładu dipola emisyjnego Ψ spowodowanych rotacjami molekularnymi w włóknach dla ustalonego Ψ, aż do osiągnięcia najwyższego możliwego R² Współczynnik między znormalizowaną intensywnością sygnału fluorescencji wzbudzonej dwufotonem zebraną podczas pomiaru a znormalizowanymi intensywnościami symulowanymi zgodnie z krokiem 4.1 protokołu.
   1. Określ kąt połówkowy Ψ.
      UWAGA: W przypadku sferulitów insuliny bydlęcej powinna być równa Ψ = 29°⁶.
   2. Przebieg pracy przy dopasowaniu:
      1. Wybierz wartość Φ od 0° do 180° (w Rysunek 8A i 8B Φ = odpowiednio 16° i 127°).
      2. Wybierz wartość ΔΨ od 0° do 90° (na rysunku 8A,B, ΔΨ = odpowiednio 24° i 1°).
      3. Oblicz (równanie 22) i (równanie 23) dla całego zmierzonego zakresu kątów θ przy użyciu wybranych wartości Φ i ΔΨ.
      4. Porównaj natężenia obliczone podczas symulacji (obie znormalizowane do maksymalnej wartości
      5. Oblicz ) ze znormalizowaną intensywnością
      6. Oblicz and (oba znormalizowane do maksymalnej wartości ) mierzone podczas pomiaru ps-2PFM.
         UWAGA: W prezentowanych eksperymentach współczynniki korelacji iloczyn-moment Pearsona zostały obliczone za pomocą funkcji "corrcoef" z biblioteki NumPy Python.
   3. Na koniec wybierz wartości Φ i ΔΨ prowadzące do najwyższych współczynników korelacji i zbieżności między symulowanymi intensywnościami a mierzonym sygnałem podobnie jak pokazano na Rysunek 8.

Wyniki

Prezentowany protokół zawiera wskazówki krok po kroku przez przygotowanie nadbudówek amyloidu do testowania za pomocą ps-2PFM, budowę systemu mikroskopowego i pomiary właściwej próbki. Jednak przed ostatecznym zestawem pomiarów konieczne jest odpowiednie ustawienie APD z izotropowym odniesieniem, co powinno skutkować zebraniem symetrycznego sygnału o podobnym kształcie i natężeniu na obu detektorach (Rysunek 4C). Nawet minimalne różnice pomiędzy natężeniami mierzonymi na detektorach w osiach X i Y pow...

Dyskusja

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa jest cennym narzędziem do badania lokalnego uporządkowania włókienek wewnątrz nadstruktur amyloidowych, wymagając jedynie niewielkich modyfikacji standardowego układu wielofotonowego. Ponieważ działa na nieliniowe zjawiska optyczne, można osiągnąć zmniejszoną fotoselekcję kątową i zwiększoną rozdzielczość osiową w porównaniu z metodami mikroskopii fluorescencyjnej wzbudzonej jednym fotonem. Ponadto prowadzi to do mniejszego rozpraszania światła, niższej fototoksyczności i głęb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie próbki
Szkiełka nakrywkowe, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
Uchwyt DPX do histologii	Sigma-Aldrich	6522	Uchwyt do szkiełek
Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, polipropylen	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Służy do inkubacji sferulitu
HLP 5UV System oczyszczania wody	Hydrolab		Źródło wody djonizowanej używanej do przygotowania próbki
Kwas solny (≥ 37%, APHA ≤ 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulina w proszku z trzustki bydlęcej (≥ 25 jednostek/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
(klasa HPLC)	Sigma-Aldrich	270474
Szkiełka mikroskopowe z wklęsłym, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polaryzacyjny mikroskop optyczny używany na rysunku 2
Taśma uszczelniająca gwint PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø Filtr długoprzepustowy 25,0 mm	Thorlabs
FESH0700 - Ø Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mm	Thorlabs
lawinowe zliczające fotony	Krótkoprzepustowy filtr emisyjny ID Quantique
Multiphoton 720 nm	Semrock
Mounted Achromatyczna półfalowa płytka, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezoelektryczny stolik 3D	Piezosystem Jena
Polaryzacyjny rozdzielacz wiązki	Thorlabs
S130C - Smukły czujnik mocy fotodiody, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Wersja 18.0.1f2
Biblioteka			Wersja 3.3.2
Biblioteka			Wersja 1.19.2
Biblioteka			Wersja 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Wersja 4.1.5