Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Streszczenie

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) o nieskończonej zdolności do samoproliferacji mają zastosowanie w wielu dziedzinach, w tym w wyjaśnianiu rzadkich chorób patologicznych, opracowywaniu nowych leków i medycynie regeneracyjnej mającej na celu odbudowę uszkodzonych narządów. Mimo to społeczne wdrażanie hiPSC jest nadal ograniczone. Wynika to częściowo z trudności w odtworzeniu zróżnicowania w kulturze, nawet przy użyciu zaawansowanej wiedzy i wyrafinowanych umiejętności technicznych, ze względu na wysoką wrażliwość iPSC na drobne zmiany środowiskowe. Zastosowanie zautomatyzowanego systemu hodowli może rozwiązać ten problem. Eksperymentów o wysokiej odtwarzalności, niezależnych od umiejętności badacza, można oczekiwać zgodnie z procedurą wspólną dla różnych instytutów. Chociaż wcześniej opracowano kilka zautomatyzowanych systemów hodowli, które mogą utrzymywać kultury iPSC i indukować różnicowanie, systemy te są ciężkie, duże i kosztowne, ponieważ wykorzystują humanizowane, wieloprzegubowe ramiona robotów. Aby rozwiązać powyższe problemy, opracowaliśmy nowy system wykorzystujący prosty system szyn ślizgowych osi x-y-z, dzięki czemu jest on bardziej kompaktowy, lżejszy i tańszy. Ponadto użytkownik może łatwo modyfikować parametry w nowym systemie, aby opracowywać nowe zadania manipulacyjne. Po ustaleniu zadania wszystko, co użytkownik musi zrobić, to przygotować iPSC, wcześniej dostarczyć odczynniki i materiały eksploatacyjne potrzebne do wykonania żądanego zadania, wybrać numer zadania i określić czas. Potwierdziliśmy, że system może utrzymywać iPSC w stanie niezróżnicowanym przez kilka przejść bez komórek zasilających i różnicować się w różne typy komórek, w tym kardiomiocyty, hepatocyty, progenitory nerwowe i keratynocyty. System umożliwi przeprowadzanie wysoce powtarzalnych eksperymentów w różnych instytucjach bez konieczności zatrudniania wykwalifikowanych badaczy i ułatwi społeczne wdrażanie hiPSC w szerszym zakresie dziedzin badawczych poprzez zmniejszenie przeszkód dla nowych uczestników.

Wprowadzenie

Ten artykuł ma na celu przedstawienie rzeczywistych i szczegółowych procedur postępowania z automatycznym systemem hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które wyprodukowaliśmy współpracując z firmą, oraz pokazanie reprezentatywnych wyników.

Od czasu publikacji artykułu w 2007 roku, iPSC przyciąga uwagę na całym świecie¹. Ze względu na jego największą cechę, jaką jest zdolność do różnicowania się w dowolny typ komórki somatycznej, oczekuje się, że znajdzie zastosowanie w różnych dziedzinach, takich jak medycyna regeneracyjna, wyjaśnianie przyczyn trudnych do opanowania chorób i opracowywanie nowych leków terapeutycznych^2,3. Ponadto wykorzystanie ludzkich komórek somatycznych pochodzących z iPSC może ograniczyć liczbę eksperymentów na zwierzętach, które podlegają znacznym ograniczeniom etycznym. Chociaż do badań nad nowymi metodami z wykorzystaniem iPSC stale potrzebne są liczne jednorodne komórki iPS, zarządzanie nimi jest zbyt pracochłonne. Co więcej, obsługa iPSC jest trudna ze względu na jego wysoką wrażliwość, nawet na subtelne zmiany kulturowe i środowiskowe.

Aby rozwiązać ten problem, oczekuje się, że zautomatyzowane systemy hodowli będą wykonywać zadania zamiast ludzi. Niektóre grupy opracowały kilka zautomatyzowanych systemów hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do utrzymania i różnicowania komórek i opublikowały swoje osiągnięcia^4,5,6. Systemy te wyposażone są w wieloprzegubowe ramiona robotyczne. Ramiona robotyczne mają nie tylko zaletę polegającą na tym, że w dużym stopniu naśladują ruchy ludzkiego ramienia, ale także na tym, że wymagają wyższych kosztów za ramię (ramiona), większego i cięższego opakowania systemu oraz czasochłonnych wysiłków edukacyjnych inżynierów w celu uzyskania ukierunkowanych ruchów^7,8. Aby ułatwić wprowadzenie aparatury do większej liczby placówek badawczych w punktach ekonomicznych, kosmicznych i zużycia zasobów ludzkich, opracowaliśmy nowatorski zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania iPSC na różne typy komórek⁹.

Naszym uzasadnieniem dla nowego systemu było przyjęcie systemu szyn osi X-Y-Z zamiast wieloprzegubowych ramion robotycznych⁹. Aby zastąpić złożone funkcje przypominające dłoń w ramionach robotycznych, zastosowaliśmy nowy pomysł w tym systemie, który może automatycznie zmieniać trzy typy określonych funkcjonalnych końcówek ramion. W tym miejscu wskazujemy również, w jaki sposób użytkownicy mogą łatwo tworzyć harmonogramy zadań za pomocą prostych zamówień w oprogramowaniu ze względu na brak wymagań dotyczących wkładu inżynierów w całym procesie.

Jeden z systemów hodowli robotycznej zademonstrował tworzenie ciał embrionalnych przy użyciu 96-dołkowych płytek jako agregatów komórek 3D do różnicowania⁴. Opisany tutaj system nie obsługuje płytek 96-dołkowych. Jeden z nich osiągnął obecną ocenę dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP) przy użyciu linii komórkowej, chociaż nie była to ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta ⁵. Opisany tutaj zautomatyzowany system hodowli został opracowany w konkretnym celu, jakim jest pomoc w eksperymentach laboratoryjnych (Rysunek 1). Ma jednak wystarczająco dużo systemów, aby utrzymać poziom czystości równoważny szafie bezpieczeństwa poziomu IV.

Protokół

Komisja Etyki Uniwersytetu Medycznego Kansai zatwierdziła wytwarzanie i używanie zdrowych iPSC pochodzących od ochotników o nazwie KMUR001 (zatwierdzenie nr 2020197). Dawca, który został otwarcie zrekrutowany, wyraził formalną świadomą zgodę i zgodził się na naukowe wykorzystanie komórek.

UWAGA: Obecny interfejs (specjalne oprogramowanie o nazwie "ccssHMI" działające pod systemem operacyjnym Windows XP) jest podstawowym ekranem operacyjnym. Pod wspomnianym interfejsem rozmieszczony jest szereg zakładek, które pozwalają użytkownikom inicjować różne operacje.

1. Operacje wczytywania

1. Kliknij przycisk Ładowanie na górnym ekranie oprogramowania. Kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do wczytywania.
2. Umieść naczynia lub talerze, które mają zostać wprowadzone do urządzenia, w odpowiednim miejscu w urządzeniu.
   UWAGA: Informacje niezbędne do identyfikacji naczynia powinny być umieszczone na każdej pokrywie.
3. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
4. Wybierz rodzaj i ilość naczyń lub talerzy w oprogramowaniu.
5. Kliknij przycisk Przygotowanie do załadunku zakończone. Kliknij przycisk Wczytywanie Start.
6. Po załadowaniu anteny do systemu wybierz w oprogramowaniu informacje na czaszy, takie jak z komórkami iPS lub bez komórek iPS. Rejestruj notatki dotyczące każdej potrawy w oprogramowaniu.
7. Kliknij przycisk Rejestracja na końcu, aby zakończyć operację ładowania.

2. Operacja rozładunku

1. Kliknij przycisk Rozładuj na górnym ekranie oprogramowania. Wybierz naczynia do usunięcia w oprogramowaniu.
2. Po wybraniu potraw kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do rozładunku. Kliknij przycisk Rozpoczęcie rozładowywania.
3. Po przeniesieniu szalki (naczyń) z inkubatora na stół warsztatowy w systemie, naciśnij przycisk Wyjmowanie naczynia.
4. Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i wyjmij naczynia. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.

3. Uzupełnienie materiałów eksploatacyjnych: pipety, probówki i medium

1. Aby uzupełnić materiały eksploatacyjne, takie jak pipety, probówki i nośniki, kliknij przycisk Materiały eksploatacyjne na górnym ekranie oprogramowania, a następnie wybierz artykuł, który chcesz uzupełnić.
   1. Pipety
      1. Kliknij przycisk Pipeta. Wybierz przycisk Uzupełnij.
      2. Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
      3. Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na pipety na stole warsztatowym jest otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij pipety.
      4. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
      5. Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.
      6. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
   2. Rury
      1. Kliknij przycisk Rura. Wybierz przycisk Uzupełnij.
      2. Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
      3. Po potwierdzeniu, że stojak przesunął się na górę, kliknij przycisk Uzupełnij rurkę.
      4. Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij rurki.
      5. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
      6. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
      7. Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Kliknij przycisk Zamknij.
   3. Średni
      1. Kliknij przycisk Średni. Wybierz przycisk Uzupełnij w oprogramowaniu.
      2. Wybierz jeden stojak z trzech, który użytkownicy chcą uzupełnić. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
      3. Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na nośnik została otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i uzupełnij nośnik.
      4. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
      5. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
      6. Kliknij przycisk Uzupełnij i wprowadź informacje o nośniku, w tym nazwę i ilość nośnika. W razie potrzeby wprowadź dodatkowe komentarze.
      7. Kliknij przycisk Rejestracja.
      8. Kliknij przycisk Zamknij.

4. Wybór zadania

1. Kliknij przycisk Zadanie na górnym ekranie oprogramowania.
2. Wybierz przycisk Ustawienia zadania. Wybierz żądane zadanie z listy zadań i kliknij przycisk Następny krok.
3. Określ datę i godzinę wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Wybierz danie lub talerz do wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.
4. Po ponownym potwierdzeniu wybranego zadania kliknij przycisk Rejestracja. Upewnij się, że zadanie zostało zarejestrowane na następnym ekranie.
5. W razie potrzeby ustaw następne zadanie w ten sam sposób.
6. Kliknij przycisk Start na końcu. Następnie zadanie rozpocznie się automatycznie w określonym dniu i godzinie.
   UWAGA: Natychmiast po zakończeniu każdego zadania automatycznie włączają się lampy UV (umieszczone po dwóch stronach okapu), a po 5-30 minutach, zgodnie z ustawieniem pomocniczym, są wyłączane, aby utrzymać okap w stanie aseptycznym. Aby zatrzymać, użytkownicy mogą kliknąć przycisk Start.
7. Jeśli użytkownicy chcą anulować zaplanowane zadanie z wyprzedzeniem, kliknij przycisk Zatrzymaj.
8. Po wybraniu zadania, które ma zostać przerwane, kliknij przycisk Edytuj zadanie.
9. Kliknij przycisk Anuluj zadanie. Upewnij się, że zadanie zostało usunięte na następnym ekranie.

5. Sprawdź zdjęcia komórek

1. Każde zadanie obejmuje obserwacje mikroskopowe (robienie zdjęć) przed i po pracy nad zadaniem. Obserwuj postęp hodowli komórkowej na zdjęciach, włączając zadanie fotografii mikroskopowej przed lub po każdym zadaniu.
2. Wybierz wstępnie ustawione programy zadań, w tym wybór wielu określonych lokalizacji naczynia lub płytki studzienki z wyprzedzeniem w celu obserwacji w stałym punkcie w celu monitorowania tej samej lokalizacji w czasie.

6. Przejście i różnicowanie

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcjach 1-5 i ustaw automatyczny system hodowli komórkowej tak, aby przeprowadzał pasażowanie i różnicowanie. Ustawienia przyrządów do pasażowania, różnicowania kardiomiocytów, różnicowania hepatocytów, różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych i różnicowania keratynocytów przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5.

Wyniki

Utrzymanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych
Wykorzystaliśmy trzy linie hPSC (RIKEN-2F, 253G1 i KMUR001). Zoptymalizowaliśmy protokół konserwacji poprzez codzienne eksperymenty wykonywane ręcznie i dodatkowo zoptymalizowaliśmy szczegółowe programy poprzez siedem wstępnych eksperymentów przeprowadzonych przez system. Na przykład naprężenia ścinające spowodowane prędkościami cieczy przepływającej przez rożen z różnych pipet obsługiwanych przez ludzi i system są zupełnie różne; W związku z tym zoptymalizowaliśmy czas trawienia enzymatycznego i liczbę pipetowania w celu dyspersji komórek przez system.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste były utrzymywane na 10 cm naczyniu pokrytym matrycą hodowli komórkowej 0,5 μg/^cm2 z pożywką hiPSC (np. Neutristem lub StemFit AK02N). W celu przejścia system został zaprogramowany tak, aby trzykrotnie przemywać hiPSC 5 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego bez wapnia (PBS [-]), a następnie traktować 3 ml enzymu ekspresowego TrypLE uzupełnionego 10 μM inhibitora kinazy Rho (Y-27632) przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Następnie system dodał 9 ml PBS (-) z 0,15% albuminą surowicy bydlęcej frakcji V (BSA) do płytki i wykonał dwa zestawy ruchów, które zasysały 10 ml płynu zawierającego komórki i dozowały płyn z końcówki pipety ruchem zygzakowatym po górnej części płytki, która była pochylona o 20° bliżej powierzchni płytki, i powtórzyć powyższą sekwencję operacji z płytą przechyloną pod kątem 20° po przeciwnej stronie. Następnie system zebrał pożywkę zawierającą komórki w probówce o pojemności 15 ml i zakrył ją, po czym odwirowano przy 115 x g przez 5 minut w celu zdeponowania komórek. Następnie system zasysał supernatant i rozpraszał osad komórkowy na pojedyncze komórki przy użyciu 10 ml pożywki hodowlanej z 10 μM Y-27632 przez 10-krotne pipetowanie. System przeniósł 1 ml roztworu błękitu trypanowego do nowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodał 1 ml zawiesiny komórek i wymieszał je przez pięciokrotne pipetowanie. Następnie odessano 100 μl roztworu komórek barwionych na niebiesko trypana i dozowano je do okienka wlotowego jednorazowego hemocytometru w uchwycie. System przeniósł uchwyt hemocytometru do obszaru obserwacji mikroskopowej i wykonał zdjęcie, które zostało natychmiast przeanalizowane przez oprogramowanie, a uzyskane stężenie komórek zastosowano do następnego kroku. W celu utrzymania iPSC system rozsiał komórki o gęstości 15 000 komórek/^cm2 na nowych płytkach z tworzywa sztucznego o średnicy 10 cm, pokrytych matrycą do hodowli komórkowych 0,5 μg/^cm2. Na potrzeby eksperymentów różnicowania system wysiał komórki o wymaganej gęstości komórek w pożywce przygotowanej dla każdego typu komórek somatycznych na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą do hodowli komórkowej rozcieńczoną do 1/100. Na koniec system pięciokrotnie zablokował krzyżowo płytki przed przeniesieniem ich do inkubatora. Do systemu załadowano trzy nowe 10-centymetrowe płytki zawierające iPSC oraz trzy płytki z matrycą do hodowli komórkowych, a także przygotowano inne niezbędne elementy zgodnie z odpowiednimi procedurami wymienionymi powyżej. Jeden cykl hodowli konserwacyjnej składa się z zadania pasażowania w dniu 1, po którym następuje zmiana pożywki raz dziennie przez 3 dni. Przez cały czas trwania eksperymentu cykl ten był ustawiony na pięć cykli. Ponadto z kolei uzupełniano materiały eksploatacyjne.

Zgodnie z zamówionym harmonogramem, pięć cykli kultury konserwacji zostało pomyślnie przeprowadzonych zgodnie z planem systemu. Na podstawie zdjęć komórek wykonanych automatycznie podczas każdego zadania potwierdzono, że komórki rozprzestrzeniały się płynnie w czasie. Ekspansja komórek (n = 3) została obliczona i pokazana w Rysunek 2. Aby potwierdzić, czy niezróżnicowany stan iPSC pozostaje niezmieniony nawet po hodowli podtrzymującej w zautomatyzowanym systemie hodowli, przeprowadzono analizę immunocytometryczną (Oct3/4 i SSEA4) przy użyciu pozostałych próbek przy każdym pasażowaniu (Figura 3A). Ponadto, po pięciu cyklach, trzy szalki zostały wyładowane z systemu, a także przeprowadzono analizę immunohistochemiczną (Oct3/4, SSEA4 i Tra1-81) (Rysunek 3B). Obie analizy z zastosowaniem fluorescencyjnego barwienia immunologicznego wykazały, że niezróżnicowany stan komórek iPS został zachowany. Kariotypowanie iPSC przeprowadzono również przed i po hodowli konserwacyjnej w zautomatyzowanym systemie hodowli. Chociaż nieprawidłowość zaobserwowano w allelu chromosomu 17 przed rozpoczęciem hodowli podtrzymującej, po 5 hodowlach podtrzymujących system nie zaobserwował żadnej szczególnej zmiany, w tym nieprawidłowości (Figura 3C). Ustawienia stosowane do konserwacji iPSC podsumowano w tabeli 1.

Różnicowanie
Kardiomiocyty
Protokół różnicowania z poprzedniej publikacji został zastosowany tutaj¹⁰. System wysiewał niezróżnicowane hiPSC (KMUR001) o gęstości 30 000 komórek/^cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą hodowli komórkowych w pożywce hodowlanej hiPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632. System zmienił pożywkę na pożywkę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z 6 μM inhibitora GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/ml aktywiny A i 10 ng/ml BMP4 po 3 dniach (dzień różnicowania 1). W 3. dniu różnicowania system zmienił się na pożywkę CDM3: RPMI 1640, 500 μg/ml rekombinowanej albuminy ludzkiej i 213 μg/ml 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego z 2 μM Wnt-C59. W 5 dniu różnicowania system zmienił się na nową pożywkę CDM3; następnie powtarzał zmianę na świeżą pożywkę CDM3 co drugi dzień. Ustawienia stosowane do różnicowania kardiomiocytów iPSC podsumowano w Tabeli 2.

Hepatocyty
Protokół różnicowania z poprzedniej publikacji został zastosowany tutaj¹¹. System wysiewał niezróżnicowane hiPSC (RIKEN2F) o gęstości 25 000 komórek/^cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą hodowli komórkowych w pożywce hodowlanej hiPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632. Po 2 dniach (dzień różnicowania 1) system zmienił pożywkę na RPMI-1640 plus 2% B27 Minus Insulina (RPMI-B27) zawierająca 100 ng/ml aktywiny A, 6 μM CHIR-99021 i 1% suplementu glutaminy (np. GlutaMAX) przez 24 godziny. W 2 dniu różnicowania zmieniliśmy pożywkę na RPMI-B27 z 50 ng/ml aktywiny A. W 5 dniu różnicowania system zmienił pożywkę na RPMI-B27, zawierającą 1% suplementu glutaminy i 10 ng/ml BMP-4. W 9 dniu różnicowania system zmienił pożywkę na pożywkę do dojrzewania hepatocytów: pożywkę L-15 Leibovitza zawierającą 8,3% bulionu fosforanu tryptozy, 10 μM hydrokortyzonu 21-hemibursztynian, 50 μg/ml L-askorbinianu sodu, 100 nM deksametazonu, 0,58% insuliny-transferyny-selenu, 2 mM suplementu glutaminy, 8,3% płodowej surowicy bydlęcej i 100 nM rac-1,2-diheksadydecyloglicerolu. Następnie system powtarzał zmianę pożywki na świeżą co drugi dzień. Ustawienia stosowane do różnicowania iPSC w hepatocytach podsumowano w Tabeli 3.

Neuronalne komórki prekursorowe
Protokół różnicowania z poprzedniej publikacji został zastosowany tutaj¹². System wysiał niezróżnicowane hiPSC (RIKEN2F) o gęstości 25 000 komórek/^cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco i pożywce neuropodstawowej (1:1) uzupełnionej 10% zamiennikiem surowicy Knockout, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM suplementu glutaminy z inhibitorem receptora 10 μM TGF-beta (SB431542), Inhibitor sygnału 10 μM BMP (dorsomorfina) i 10 μM Y-27632 (dzień różnicowania 1). W 5 dniu różnicowania system zmienił pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę neurobazalną 1:1 uzupełnioną 0,1 mM aminokwasami endogennymi, 1 mM suplementem glutaminy, 1% suplementem N-2, 1% suplementem B-27, 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinowego, 10 μM SB431542 i 10 μM dorsomorfiną. W 9 dniu różnicowania system zmienił pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę neurobazalną 1:1 uzupełnioną 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM suplementu glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinowego i 1 μM kwasu all-trans retinowego. W dniach różnicowania 13-16 system codziennie zmieniał pożywkę za pomocą DMEM/F12 i pożywki neuropodstawowej 1:1 uzupełnionej 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM suplementu glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 μg/ml 2-fosforanu askorbinowego oraz 10 ng/ml bFGF i 10 ng/ml EGF. Ustawienia stosowane do różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych iPSC podsumowano w Tabeli 4.

Keratynocyty<br /> Protokół różnicowania z poprzedniej publikacji został zastosowany tutaj¹³. System wysiewał niezróżnicowane hiPSC (253G1) o gęstości 15 000 komórek/^cm2 na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą hodowli komórkowych w pożywce hodowlanej hiPSC z 10 μM Y-27632. Po 2 dniach od daty różnicowania system zmienił pożywkę na zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle (DMEM)/F12 i pożywkę Neurobasal (1:1) z 0,1 mM aminokwasów endogennych, 1 mM glutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 1% suplementu N-2, 2% suplementu B-27, 50 μg/ml 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 0,05% albuminy surowicy bydlęcej, i 100 ng/ml FGF-basic. W 3. dniu różnicowania, a następnie pożywkę zmieniono na pożywkę dla ludzkich keratynocytów (bez suplementu w 3. dniu i z suplementem w dniu 5 / później) z dodatkiem 0,5 μg/ml hydrokortyzonu, 1 μM kwasu all-trans retinowego, 25 ng/ml hBMP-4, 2,4 μg/ml adeniny, 1,37 ng/ml trójjodotyroniny, 0,3 mM 2-fosforanu askorbinowego, i 2 μM forskoliny, co 2 dni przez system. Ustawienia stosowane do różnicowania keratynocytów w iPSC podsumowano w Tabeli 5.

Jak wspomniano powyżej, cały proces został przeprowadzony przy użyciu wyłącznie zautomatyzowanego sprzętu do hodowli, począwszy od wysiewu komórek iPS, a skończywszy na kolejnych seriach protokołów różnicowania. Oceniono ekspresję charakterystycznych markerów w każdej komórce (Rysunek 4). Wykazano, że różnicowanie można wywołać jedynie za pomocą zautomatyzowanego systemu hodowli.

Rysunek 1: Podsumowanie zautomatyzowanego systemu hodowli. (A) Zdjęcie systemu pokazujące rozmiar i układ szkic 1. (B) Zdjęcie stołu warsztatowego i szkicu układu 2. (C) Narzędzia ręczne: naczynie, rurka i pipeta. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando et al.⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zadanie pasażowania i wzrost komórek. (A) Kwadrat ilustruje każdy proces. (B) Ekspansja iPSC obliczona przy użyciu każdej zautomatyzowanej liczby komórek w trzech niezależnych eksperymentach. (C) Reprezentatywne obrazy rejestrowane automatycznie od przejścia do przejścia. Podziałka = 400 μm i 100 μm (wstawka). Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando et al.⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zautomatyzowane długoterminowe utrzymanie iPSC. (A) Wszystkie analizy immunocytometryczne trzech niezależnych eksperymentów dla Oct-3/4 i SSEA-4. Każdy niebieski histogram wskazuje na brak kontroli przeciwciał pierwotnych. Każdy czerwony histogram reprezentuje wskazany sygnał specyficzny dla antygenu. (B) Reprezentatywne obrazy komórek barwionych immunohistochemicznie dla Oct-3/4, SSEA-4 i Tra 1-81. Podziałka = 50 μm. (C) Kariotyp RIKEN2F-iPSC po piątym pasażu. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando et al.⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Barwienie immunohistochemiczne. Obrazy immunohistochemiczne hepatocytów (paski skali = 100 μm), kardiomiocytów (paski skali = 100 μm), neuronalnych komórek progenitorowych (paski skali = 100 μm) i keratynocytów (paski skali = 200 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando et al.⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przygotowanie przejścia i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Preparaty do różnicowania kardiomiocytów i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Preparaty różnicowania hepatocytów i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Preparaty różnicowania komórek prekursorowych neuronów i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Preparaty różnicowania keratynocytów i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Krytycznym krokiem w protokole jest to, że jeśli użytkownik znajdzie jakiekolwiek usterki, kliknij przycisk Anuluj, Zatrzymaj lub Zresetuj w dowolnym momencie i zacznij od pierwszego kroku. Oprogramowanie pozwala uniknąć błędów ludzkich, w tym podwójnej rezerwacji, otwierania drzwi, gdy zadania systemu są aktywne, oraz braku uzupełniania zapasów. Innym krytycznym punktem dla udanego i skutecznego różnicowania do pożądanej komórki somatycznej jest właściwy dobór pluripotencjalnych linii komórek macierzystych, ponieważ każda pluripotencjalna komórka macierzysta ma niekontrolowane odchylenie we właściwościach różnicowania^14,15.

Ten zautomatyzowany system hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych może je utrzymywać i różnicować w różne typy komórek somatycznych. Wymiary tego systemu to 200 cm (szerokość), 110 cm (głębokość) i 233 cm (wysokość), przy masie całkowitej 1,2 tony. Inkubator wbudowany w urządzenie może jednocześnie pomieścić trzydzieści sześć 10-centymetrowych szalek i dziewięć płytek wielodołkowych.

Ulepszenia w stosunku do poprzednich modeli polegają na tym, że po pierwsze, jako ramię manipulacyjne, system szyn osi X-Y-Z został nowo przekształcony z 6-osiowego ramienia przegubowego, które działa poprzez zmianę końcówki ramienia na trzy różne części do naczyń, probówek i pipet. Ramię jest podwieszone pod sufitem systemu i porusza się wzdłuż osi X-Y-Z. Po drugie, wprowadzono system zliczania komórek dla kultur konserwacyjnych bez karmienia i protokołów indukcji różnicowania, które są wykonywane w sposób ciągły od momentu przejścia. Po zmieszaniu roztworu zawiesiny jednokomórkowej z roztworem błękitu trypanowego, przeniesiono go do jednorazowego hemocytometru w celu obserwacji mikroskopowej i obrazowania. Oprogramowanie automatycznie analizuje uzyskany obraz, aby policzyć liczbę żywych komórek i obliczyć objętość wymaganą do zasiewu wymaganej liczby komórek. Dokładność zliczania komórek uzyskana w wyniku tej analizy obrazu była zgodna z dokładnością uzyskaną ręcznie.

System szyn osi X-Y-Z został zastosowany w celu szybszej obsługi każdego zadania niż poprzednia wersja (wieloosiowe ramię przegubowe). Dzięki temu zautomatyzowanemu systemowi hodowli wykonano pięć ciągłych pasaży przez 16 dni, a iPSC rozszerzono 625 ± 93-krotnie. Chociaż dowód wytrzymałości na czas utrzymywania ogniw bez ogniw zasilających był krótszy niż nasza poprzednia demonstracja z ogniwami zasilającymi, ekspansja komórek była bardziej efektywna w porównaniu z poprzednią demonstracją⁶. Skrócony czas zadania wydawał się przyczyniać do zapobiegania wysychaniu komórek podczas wykonywania zadań.

Ponadto zadania różnicowania od hodowli podtrzymującej do różnicowania w kardiomiocyty, hepatocyty, neuronalne komórki prekursorowe i keratynocyty wykonano bez interwencji człowieka. Po serii tych kursów potwierdzono za pomocą barwienia fluorescencyjnego, że komórki uzyskane w samym zautomatyzowanym systemie hodowli zróżnicowały się w pożądane komórki. Dlatego, udostępniając program zadaniowy i korzystając z tego systemu, naukowcy, którzy nie są zaznajomieni z zarządzaniem komórkami iPS, mogą pozyskać komórki somatyczne pochodzące z iPSC do własnych badań. Co więcej, różnice w odtwarzalności między badaczami lub placówkami mogłyby zostać wyeliminowane w jak największym stopniu, co mogłoby zagwarantować, że za każdym razem uzyskuje się komórki o jednorodnej jakości.

Dzięki zastosowaniu nowego systemu szynowego, sprzęt mógł zostać zmniejszony i lżejszy do 1,2 tony, czyli ~200 kg lżejszy niż wcześniej. Co więcej, koszty ustawień części i programów mogą zostać zmniejszone o około 10 000 USD. Szacuje się, że koszty utrzymania i programowania spadną o 13%. Aby zmotywować większą liczbę badaczy do łatwego udziału w badaniach związanych z komórkami iPS, ważne jest również utrzymanie niskich kosztów sprzętu⁶. Mamy nadzieję, że obecne i następne generacje systemów hodowli automatycznych będą jednym z wkładów w dostarczanie iPSC i zróżnicowanych komórek pochodzących z iPSC o bardziej jednolitej jakości.

Głównymi ograniczeniami tego systemu są ograniczona pojemność lodówki do wstępnego przechowywania kultur oraz jej słabość w radzeniu sobie z niewielkimi ilościami (<100 μl) płynu. Co więcej, brak wyrafinowanej sztucznej inteligencji uniemożliwia automatyczną optymalizację w zależności od stanu ogniwa na czas. Niewielkim ograniczeniem jest wymóg stosowania specjalnych końcówek do pipet dostarczanych przez producentów systemu ^4,5. Opracowujemy nową generację systemów hodowlanych, które będą w stanie poradzić sobie z niewielkimi ilościami płynów do pożywek i będą wyposażone w system optymalizacji sprzężenia zwrotnego oparty na wysokowydajnej sztucznej inteligencji (uczenie się systemu). Nasz współpracujący producent⁹ posiada wystarczające know-how, aby budować systemy na zamówienie zgodnie ze specjalnymi potrzebami użytkowników. Oprócz tego wkrótce na rynku pojawią się systemy nowej generacji wyposażone w bardziej ogólne i szersze funkcje. Rozważamy również wprowadzenie systemu wynajmu opartego na subskrypcji, aby zapewnić wszystkim użytkownikom aktualne systemy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,15% frakcja albuminy surowicy bydlęcej V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm talerze plastikowe	Corning Inc., NY, Stany Zjednoczone	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-merkaptoetanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Aktynina  mysz	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenina	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumina  królik	Dako	A0001
Kwas all-trans retinowy	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Zautomatyzowany system hodowli	Panasonic
B-27 suplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Albumina surowicy bydlęcej	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, Stany Zjednoczone #HY-10182	252917-06-9
Zdefiniowany keratynocyt-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Ludzkie podłoże keratynocytowe
Deksametazon	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Kanada	13071-60-8	rac-1,2-diheksadyloglicerol
Jednorazowy hemocytometr	CountessTM Szkiełka z komorą do liczenia komórek, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle średni/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Niezbędny 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Surowica bydlęca	Biowest, FL, Stany Zjednoczone	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.
Glutamina	Thermo Fisher Scientific 25030081		Suplement glutaminy
Kozi IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  koza	Santacruz	6556
Hydrokortyzon	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian	Merck	H2882
iMatrix511 Jedwab	Nippi Inc., Tokio, Japonia	892 021	Macierz hodowli komórkowych
Insulina-transferyna-selen	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratyna 1  mysz	Santacruz	376224
Keratyna 10  królik	BioLegend	19054
KMUR001	Uniwersytet Medyczny Kansai		Komórki iPS pochodzące od pacjenta
Zamiennik serum nokautującego	Thermo Fisher Scientific	10828010
2-fosforan L-askorbinowy	A8960, Merck	A8960
Leibovitz' s L-15 średni	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.
Mysia IgG(H+L) AlexaFluo488	Suplement Thermo Scientific	A21202
N-2	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mysz	Santacruz	23927
Podłoże neuropodstawowe	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  królik	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Gö ttingen, Niemcy	05-100-1A	pożywka do hodowli komórkowych
3/4 października  mysz	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kioto, Japonia	14249-24
IgG królika (H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
IgG królika (H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Rekombinowana albumina ludzka	A0237, Merck, Darmstadt, Niemcy	A9731
Inhibitor kinazy Rho, Y-27632	Sellec Inc., Tokio, Japonia	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	niezróżnicowane hiPSC
Specyfikacja RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
L-askorbinian sodu	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mysz	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokio, Japonia	Pożywka do hodowli komórkowych	AK02
TnT królik	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mysz	Millipore	MAB4381
Trijodotyronina	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM ekspresowy enzym	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone	12604013
Roztwór błękitu trypanowego	Nacalai Tesque, Kioto, Japonia	20577-34
Rosół z fosforanu tryptozy	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, Wielka Brytania	5148
β   Tublin  mysz	Promega	G712A