Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) o nieskończonej zdolności do samoproliferacji mają zastosowanie w wielu dziedzinach, w tym w wyjaśnianiu rzadkich chorób patologicznych, opracowywaniu nowych leków i medycynie regeneracyjnej mającej na celu odbudowę uszkodzonych narządów. Mimo to społeczne wdrażanie hiPSC jest nadal ograniczone. Wynika to częściowo z trudności w odtworzeniu zróżnicowania w kulturze, nawet przy użyciu zaawansowanej wiedzy i wyrafinowanych umiejętności technicznych, ze względu na wysoką wrażliwość iPSC na drobne zmiany środowiskowe. Zastosowanie zautomatyzowanego systemu hodowli może rozwiązać ten problem. Eksperymentów o wysokiej odtwarzalności, niezależnych od umiejętności badacza, można oczekiwać zgodnie z procedurą wspólną dla różnych instytutów. Chociaż wcześniej opracowano kilka zautomatyzowanych systemów hodowli, które mogą utrzymywać kultury iPSC i indukować różnicowanie, systemy te są ciężkie, duże i kosztowne, ponieważ wykorzystują humanizowane, wieloprzegubowe ramiona robotów. Aby rozwiązać powyższe problemy, opracowaliśmy nowy system wykorzystujący prosty system szyn ślizgowych osi x-y-z, dzięki czemu jest on bardziej kompaktowy, lżejszy i tańszy. Ponadto użytkownik może łatwo modyfikować parametry w nowym systemie, aby opracowywać nowe zadania manipulacyjne. Po ustaleniu zadania wszystko, co użytkownik musi zrobić, to przygotować iPSC, wcześniej dostarczyć odczynniki i materiały eksploatacyjne potrzebne do wykonania żądanego zadania, wybrać numer zadania i określić czas. Potwierdziliśmy, że system może utrzymywać iPSC w stanie niezróżnicowanym przez kilka przejść bez komórek zasilających i różnicować się w różne typy komórek, w tym kardiomiocyty, hepatocyty, progenitory nerwowe i keratynocyty. System umożliwi przeprowadzanie wysoce powtarzalnych eksperymentów w różnych instytucjach bez konieczności zatrudniania wykwalifikowanych badaczy i ułatwi społeczne wdrażanie hiPSC w szerszym zakresie dziedzin badawczych poprzez zmniejszenie przeszkód dla nowych uczestników.
Wprowadzenie
Ten artykuł ma na celu przedstawienie rzeczywistych i szczegółowych procedur postępowania z automatycznym systemem hodowli ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), które wyprodukowaliśmy współpracując z firmą, oraz pokazanie reprezentatywnych wyników.
Od czasu publikacji artykułu w 2007 roku, iPSC przyciąga uwagę na całym świecie1. Ze względu na jego największą cechę, jaką jest zdolność do różnicowania się w dowolny typ komórki somatycznej, oczekuje się, że znajdzie zastosowanie w różnych dziedzinach, takich jak medycyna regeneracyjna, wyjaśnianie przyczyn trudnych do opanowania chorób i opracowywanie nowych leków terapeutycznych2,3. Ponadto wykorzystanie ludzkich komórek somatycznych pochodzących z iPSC może ograniczyć liczbę eksperymentów na zwierzętach, które podlegają znacznym ograniczeniom etycznym. Chociaż do badań nad nowymi metodami z wykorzystaniem iPSC stale potrzebne są liczne jednorodne komórki iPS, zarządzanie nimi jest zbyt pracochłonne. Co więcej, obsługa iPSC jest trudna ze względu na jego wysoką wrażliwość, nawet na subtelne zmiany kulturowe i środowiskowe.
Aby rozwiązać ten problem, oczekuje się, że zautomatyzowane systemy hodowli będą wykonywać zadania zamiast ludzi. Niektóre grupy opracowały kilka zautomatyzowanych systemów hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do utrzymania i różnicowania komórek i opublikowały swoje osiągnięcia4,5,6. Systemy te wyposażone są w wieloprzegubowe ramiona robotyczne. Ramiona robotyczne mają nie tylko zaletę polegającą na tym, że w dużym stopniu naśladują ruchy ludzkiego ramienia, ale także na tym, że wymagają wyższych kosztów za ramię (ramiona), większego i cięższego opakowania systemu oraz czasochłonnych wysiłków edukacyjnych inżynierów w celu uzyskania ukierunkowanych ruchów7,8. Aby ułatwić wprowadzenie aparatury do większej liczby placówek badawczych w punktach ekonomicznych, kosmicznych i zużycia zasobów ludzkich, opracowaliśmy nowatorski zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania iPSC na różne typy komórek9.
Naszym uzasadnieniem dla nowego systemu było przyjęcie systemu szyn osi X-Y-Z zamiast wieloprzegubowych ramion robotycznych9. Aby zastąpić złożone funkcje przypominające dłoń w ramionach robotycznych, zastosowaliśmy nowy pomysł w tym systemie, który może automatycznie zmieniać trzy typy określonych funkcjonalnych końcówek ramion. W tym miejscu wskazujemy również, w jaki sposób użytkownicy mogą łatwo tworzyć harmonogramy zadań za pomocą prostych zamówień w oprogramowaniu ze względu na brak wymagań dotyczących wkładu inżynierów w całym procesie.
Jeden z systemów hodowli robotycznej zademonstrował tworzenie ciał embrionalnych przy użyciu 96-dołkowych płytek jako agregatów komórek 3D do różnicowania4. Opisany tutaj system nie obsługuje płytek 96-dołkowych. Jeden z nich osiągnął obecną ocenę dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP) przy użyciu linii komórkowej, chociaż nie była to ludzka pluripotencjalna komórka macierzysta 5. Opisany tutaj zautomatyzowany system hodowli został opracowany w konkretnym celu, jakim jest pomoc w eksperymentach laboratoryjnych (Rysunek 1). Ma jednak wystarczająco dużo systemów, aby utrzymać poziom czystości równoważny szafie bezpieczeństwa poziomu IV.
Protokół
Komisja Etyki Uniwersytetu Medycznego Kansai zatwierdziła wytwarzanie i używanie zdrowych iPSC pochodzących od ochotników o nazwie KMUR001 (zatwierdzenie nr 2020197). Dawca, który został otwarcie zrekrutowany, wyraził formalną świadomą zgodę i zgodził się na naukowe wykorzystanie komórek.
UWAGA: Obecny interfejs (specjalne oprogramowanie o nazwie "ccssHMI" działające pod systemem operacyjnym Windows XP) jest podstawowym ekranem operacyjnym. Pod wspomnianym interfejsem rozmieszczony jest szereg zakładek, które pozwalają użytkownikom inicjować różne operacje.
1. Operacje wczytywania
- Kliknij przycisk Ładowanie na górnym ekranie oprogramowania. Kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do wczytywania.
- Umieść naczynia lub talerze, które mają zostać wprowadzone do urządzenia, w odpowiednim miejscu w urządzeniu.
UWAGA: Informacje niezbędne do identyfikacji naczynia powinny być umieszczone na każdej pokrywie. - Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
- Wybierz rodzaj i ilość naczyń lub talerzy w oprogramowaniu.
- Kliknij przycisk Przygotowanie do załadunku zakończone. Kliknij przycisk Wczytywanie Start.
- Po załadowaniu anteny do systemu wybierz w oprogramowaniu informacje na czaszy, takie jak z komórkami iPS lub bez komórek iPS. Rejestruj notatki dotyczące każdej potrawy w oprogramowaniu.
- Kliknij przycisk Rejestracja na końcu, aby zakończyć operację ładowania.
2. Operacja rozładunku
- Kliknij przycisk Rozładuj na górnym ekranie oprogramowania. Wybierz naczynia do usunięcia w oprogramowaniu.
- Po wybraniu potraw kliknij przycisk Rozpoczęcie przygotowania do rozładunku. Kliknij przycisk Rozpoczęcie rozładowywania.
- Po przeniesieniu szalki (naczyń) z inkubatora na stół warsztatowy w systemie, naciśnij przycisk Wyjmowanie naczynia.
- Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i wyjmij naczynia. Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
3. Uzupełnienie materiałów eksploatacyjnych: pipety, probówki i medium
- Aby uzupełnić materiały eksploatacyjne, takie jak pipety, probówki i nośniki, kliknij przycisk Materiały eksploatacyjne na górnym ekranie oprogramowania, a następnie wybierz artykuł, który chcesz uzupełnić.
- Pipety
- Kliknij przycisk Pipeta. Wybierz przycisk Uzupełnij.
- Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
- Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na pipety na stole warsztatowym jest otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij pipety.
- Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa. Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
- Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.
- Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
- Rury
- Kliknij przycisk Rura. Wybierz przycisk Uzupełnij.
- Wybierz stojak, który użytkownik chce uzupełnić w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
- Po potwierdzeniu, że stojak przesunął się na górę, kliknij przycisk Uzupełnij rurkę.
- Ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i w razie potrzeby uzupełnij rurki.
- Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
- Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
- Kliknij przycisk Ustawienia uzupełniania zapasów i wprowadź informacje dotyczące uzupełnienia, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Kliknij przycisk Zamknij.
- Średni
- Kliknij przycisk Średni. Wybierz przycisk Uzupełnij w oprogramowaniu.
- Wybierz jeden stojak z trzech, który użytkownicy chcą uzupełnić. Kliknij przycisk Uzupełnij Start.
- Po upewnieniu się, że pokrywa schowka na nośnik została otwarta, ręcznie otwórz przednie okno przesuwne i uzupełnij nośnik.
- Ręcznie zamknąć przednią szybę przesuwną i nacisnąć mechaniczny przycisk potwierdzenia bezpieczeństwa.
- Kliknij przycisk Uzupełnienie zakończone.
- Kliknij przycisk Uzupełnij i wprowadź informacje o nośniku, w tym nazwę i ilość nośnika. W razie potrzeby wprowadź dodatkowe komentarze.
- Kliknij przycisk Rejestracja.
- Kliknij przycisk Zamknij.
- Pipety
4. Wybór zadania
- Kliknij przycisk Zadanie na górnym ekranie oprogramowania.
- Wybierz przycisk Ustawienia zadania. Wybierz żądane zadanie z listy zadań i kliknij przycisk Następny krok.
- Określ datę i godzinę wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja. Wybierz danie lub talerz do wykonania zadania, a następnie kliknij przycisk Rejestracja.
- Po ponownym potwierdzeniu wybranego zadania kliknij przycisk Rejestracja. Upewnij się, że zadanie zostało zarejestrowane na następnym ekranie.
- W razie potrzeby ustaw następne zadanie w ten sam sposób.
- Kliknij przycisk Start na końcu. Następnie zadanie rozpocznie się automatycznie w określonym dniu i godzinie.
UWAGA: Natychmiast po zakończeniu każdego zadania automatycznie włączają się lampy UV (umieszczone po dwóch stronach okapu), a po 5-30 minutach, zgodnie z ustawieniem pomocniczym, są wyłączane, aby utrzymać okap w stanie aseptycznym. Aby zatrzymać, użytkownicy mogą kliknąć przycisk Start. - Jeśli użytkownicy chcą anulować zaplanowane zadanie z wyprzedzeniem, kliknij przycisk Zatrzymaj.
- Po wybraniu zadania, które ma zostać przerwane, kliknij przycisk Edytuj zadanie.
- Kliknij przycisk Anuluj zadanie. Upewnij się, że zadanie zostało usunięte na następnym ekranie.
5. Sprawdź zdjęcia komórek
- Każde zadanie obejmuje obserwacje mikroskopowe (robienie zdjęć) przed i po pracy nad zadaniem. Obserwuj postęp hodowli komórkowej na zdjęciach, włączając zadanie fotografii mikroskopowej przed lub po każdym zadaniu.
- Wybierz wstępnie ustawione programy zadań, w tym wybór wielu określonych lokalizacji naczynia lub płytki studzienki z wyprzedzeniem w celu obserwacji w stałym punkcie w celu monitorowania tej samej lokalizacji w czasie.
6. Przejście i różnicowanie
- Postępuj zgodnie z instrukcjami w sekcjach 1-5 i ustaw automatyczny system hodowli komórkowej tak, aby przeprowadzał pasażowanie i różnicowanie. Ustawienia przyrządów do pasażowania, różnicowania kardiomiocytów, różnicowania hepatocytów, różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych i różnicowania keratynocytów przedstawiono odpowiednio w Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5.
Wyniki
Utrzymanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
Wykorzystaliśmy trzy linie hPSC (RIKEN-2F, 253G1 oraz KMUR001). Zoptymalizowaliśmy protokół utrzymania poprzez codzienne eksperymenty wykonywane ręcznie, a następnie dodatkowo zoptymalizowaliśmy szczegółowe programy poprzez siedem wstępnych eksperymentów przeprowadzonych przez system. Na przykład naprężenia ścinające wywołane prędkością przepływu cieczy z różnych pipet obsługiwanych przez ludzi i system są bardzo różne; dlatego zoptymalizowaliśmy czas trwania trawienia enzymatycznego oraz liczbę cykli pipetowania w celu dyspersji komórek przez system.
Ludzkie indukowane pluripotencyjne komórki macierzyste utrzymywano na szalkach 10 cm pokrytych macierzą hodowlaną dla komórek w stężeniu 0,5 µg/cm2 w pożywce do hodowli hiPSC (np. Neutristem lub StemFit AK02N). W celu pasażowania system zaprogramowano tak, aby trzykrotnie przemyć hiPSC 5 mL soli fizjologicznej bez wapnia (PBS[-]), a następnie poddać działaniu 3 mL enzymu TrypLE express uzupełnionego o 10 µM inhibitora kinazy Rho (Y-27632) przez 15 min w temperaturze 37 °C. Następnie system dodał do płytki 9 mL PBS(-) z 0,15% albuminy surowiczego bydlęcego frakcji V (BSA) i wykonał dwa cykle ruchów polegające na odessaniu 10 mL cieczy zawierającej komórki i rozprowadzeniu jej z końcówki pipety ruchem zygzakowatym po górnej części płytki, która była nachylona pod kątem 20° w stronę powierzchni płytki; powyższą sekwencję operacji powtórzono z płytką nachyloną pod kątem 20° w przeciwną stronę. Następnie system zebrał pożywkę zawierającą komórki do probówki 15-mL i ją zamknął, po czym odwirowano ją przy 115 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek. Po tym system odessał supernatant i rozbił osad komórkowy do pojedynczych komórek, używając 10 mL pożywki hodowlanej z 10 µM Y-27632 poprzez dziesięciokrotne pipetowanie. System przeniósł 1 mL roztworu błękitu trypanu do nowej probówki 15-mL, a następnie dodał 1 mL zawiesiny komórkowej i wymieszał je poprzez pięciokrotne pipetowanie. Po tym odessano 100 µL roztworu komórek barwionych błękitem trypanu i wprowadzono do okienka wlotowego jednorazowego hemocytometru w uchwycie. System przeniósł uchwyt hemocytometru do obszaru obserwacji mikroskopowej i wykonał zdjęcie, które zostało natychmiast przeanalizowane przez oprogramowanie, a uzyskana koncentracja komórek została zastosowana w kolejnym kroku. W celu utrzymania iPSC system wysiał komórki w gęstości 15 000 komórek/cm2 w nowych plastikowych płytkach o średnicy 10 cm pokrytych macierzą hodowlaną dla komórek w stężeniu 0,5 µg/cm2. W eksperymentach różnicowania system wysiał komórki w wymaganej gęstości w pożywce przygotowanej dla każdego typu komórek somatycznych w płytkach 6-dołkowych pokrytych macierzą hodowlaną rozcieńczoną 1/100. Na koniec system wykonał pięciokrotne blokowanie krzyżowe przed przeniesieniem płytek do inkubatora. Do systemu wprowadzono trzy nowe płytki 10-cm zawierające iPSC oraz trzy płytki uprzednio pokryte macierzą hodowlaną, a także przygotowano inne niezbędne elementy zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. Jeden cykl hodowli utrzymującej składa się z zadania pasażowania w dniu 1., a następnie codziennej wymiany pożywki hodowlanej przez 3 dni. Przez cały czas trwania eksperymentu ustawiono pięć takich cykli. Dodatkowo na bieżąco uzupełniano materiały eksploatacyjne.
Zgodnie z zaplanowanym harmonogramem, system pomyślnie przeprowadził pięć cykli hodowli podtrzymującej. Na podstawie zdjęć komórek wykonanych automatycznie podczas każdego zadania potwierdzono, że komórki proliferowały stabilnie w czasie. Przyrost komórek (n = 3) obliczono i przedstawiono na Rysunku 2. Aby potwierdzić, czy niezróżnicowany stan iPSC pozostaje niezmienny nawet po hodowli podtrzymującej w automatycznym systemie hodowlanym, przeprowadzono analizę immunocytometryczną (Oct3/4 i SSEA4) z wykorzystaniem pozostałych próbek przy każdym pasażowaniu (Rysunek 3A). Ponadto, po pięciu cyklach, trzy naczynia zostały wyjęte z systemu, a następnie przeprowadzono analizę immunohistochemiczną (Oct3/4, SSEA4 oraz Tra1-81) (Rysunek 3B). Obie analizy z wykorzystaniem fluorescencyjnego barwienia immunologicznego wykazały, że zachowano niezróżnicowany stan komórek iPS. Przed i po hodowli podtrzymującej w automatycznym systemie hodowlanym wykonano również kariotypowanie iPSC. Chociaż przed rozpoczęciem hodowli podtrzymującej zaobserwowano nieprawidłowość w jednym allelu chromosomu 17, po 5 cyklach hodowli w systemie nie stwierdzono żadnych istotnych zmian, w tym w obrębie wspomnianej nieprawidłowości (Rysunek 3C). Ustawienia zastosowane do podtrzymania iPSC zestawiono w Tabeli 1.
Różnicowanie
Kardiomiocyty
W niniejszej pracy zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji10. System wysiał nieróżnicowane hiPSC (KMUR001) z gęstością 30 000 komórek/cm2 na 6-dołkowych płytkach powlekanych matrycą do hodowli komórkowej w pożywce do hodowli hiPSC uzupełnionej o 10 µM Y-27632. Po 3 dniach (1. dzień różnicowania) system zmienił pożywkę na pożywkę dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z dodatkiem 6 µM inhibitora GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL Aktywiny A oraz 10 ng/mL BMP4. W 3. dniu różnicowania system przeszedł na pożywkę CDM3: RPMI 1640, 500 µg/mL rekombinowanej ludzkiej albuminy oraz 213 µg/mL L-fosforanu askorbiniowego 2 z dodatkiem 2 µM Wnt-C59. W 5. dniu różnicowania system zmienił pożywkę na świeżą CDM3; następnie powtarzano wymianę na świeżą pożywkę CDM3 co drugi dzień. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w kardiomiocyty podsumowano w Tabeli 2.
Hepatocyty
W niniejszej pracy zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji11. Niedzifferencjowane hiPSC (RIKEN2F) wysiano z gęstością 25 000 komórek/cm2 na płytkach 6-dołkowych powlekonych macierzą do hodowli komórkowej w medium do hodowli hiPSC uzupełnionym o 10 µM Y-27632. Po 2 dniach (dzień różnicowania 1) zmieniono medium na RPMI-1640 z dodatkiem 2% B27 Minus Insulin (RPMI-B27), zawierające 100 ng/mL Activin A, 6 µM CHIR-99021 oraz 1% suplementu glutaminy (np. GlutaMAX) na 24 h. W dniu różnicowania 2 zmieniono medium na RPMI-B27 z 50 ng/mL Activin A. W dniu różnicowania 5 zmieniono medium na RPMI-B27 zawierające 1% suplementu glutaminy i 10 ng/mL BMP-4. W dniu różnicowania 9 zmieniono medium na medium do dojrzewania hepatocytów: medium Leibovitz's L-15 zawierające 8,3% tryptose phosphate broth, 10 µM 21-hemisukcynianu hydrokortyzonu, 50 µg/mL L-askorbinianu sodu, 100 nM deksametazonu, 0,58% insulin-transferrin-selenium, 2 mM suplementu glutaminy, 8,3% płodowej surowicy bydlęcej oraz 100 nM rac-1,2-dihexadecylglycerol. Następnie medium wymieniano na świeże co drugi dzień. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w hepatocyty podsumowano w Tabeli 3.
Komórki prekursorowe neuronów
Zastosowano protokół różnicowania opisany w poprzedniej publikacji12. Niezróżnicowane hiPSC (RIKEN2F) wysiano z gęstością 25 000 komórek/cm2 na płytkach 6-dołkowych powleczonych macierzą błony podstawnej w pożywce DMEM/F12 i pożywce Neurobasal (1:1) uzupełnionej o 10% Knockout serum replacement, 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy z dodatkiem 10 µM inhibitora receptora TGF-beta (SB431542), 10 µM inhibitora sygnału BMP (dorsomorfina) oraz 10 µM Y-27632 (1. dzień różnicowania). W 5. dniu różnicowania zmieniono pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 10 µM SB431542 oraz 10 µM dorsomorfiny. W 9. dniu różnicowania zmieniono pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego oraz 1 µM all-trans kwasu retinowego. Od 13. do 16. dnia różnicowania pożywkę zmieniano codziennie na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal 1:1 uzupełnioną o 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM suplement glutaminy, 1% suplementu N-2, 1% suplementu B-27, 50 µg/mL 2-fosforanu kwasu askorbinowego, 10 ng/mL bFGF i 10 ng/mL EGF. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w komórki prekursorowe neuronów podsumowano w Tabeli 4.
Keratynocyty
Zastosowano protokół różnicowania z poprzedniej publikacji13. System wysiał nieróżnicujące się hiPSC (253G1) w gęstości 15 000 komórek/cm2 w 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą do hodowli komórkowej, w pożywce do hodowli hiPSC z dodatkiem 10 µM Y-27632. Po 2 dniach (1. dzień różnicowania) system zmienił pożywkę na DMEM/F12 i pożywkę Neurobasal (1:1) z 0,1 mM nieistotnych aminokwasów, 1 mM glutaminy, 55 µM 2-merkaptoetanolu, 1% suplementu N-2, 2% suplementu B-27, 50 µg/mL askorbianu 2-fosforanu, 0,05% albuminy surowicy bydlęcej oraz 100 ng/mL FGF-basic. W 3. dniu różnicowania i w kolejnych dniach system co 2 dni zmieniał pożywkę na pożywkę do ludzkich keratynocytów (bez suplementu w 3. dniu i z suplementem od 5. dnia włącznie) z dodatkiem 0,5 µg/mL hydrokortyzonu, 1 µM całkowitego kwasu retinowego, 25 ng/mL hBMP-4, 2,4 µg/mL adeniny, 1,37 ng/mL trijodotyroniny, 0,3 mM askorbianu 2-fosforanu oraz 2 µM forskoliny. Parametry zastosowane do różnicowania iPSC w keratynocyty podsumowano w Tabeli 5.
Jak wspomniano powyżej, cały proces, od wysiewu komórek iPS po kolejne serie protokołów różnicowania, był przeprowadzany wyłącznie przy użyciu zautomatyzowanego sprzętu do hodowli. Oceńiono ekspresję charakterystycznych markerów w każdej komórce (Rysunek 4). Wykazano, że różnicowanie można indukować, stosując jedynie zautomatyzowany system hodowli.
Rysunek 1: Podsumowanie zautomatyzowanego systemu hodowli. (A) Zdjęcie systemu przedstawiające rozmiar i schemat układu 1. (B) Zdjęcie stanowiska pracy i schemat układu 2. (C) Narzędzia ręczne: szalka, probówka i pipeta. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando i wsp.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Zadanie pasażowania i wzrost komórek. (A) Kwadrat ilustruje każdy proces. (B) Ekspansja iPSC obliczona na podstawie każdego zautomatyzowanego liczenia komórek w trzech niezależnych eksperymentach. (C) Reprezentatywne obrazy zarejestrowane automatycznie z pasażu na pasaż. Paski skali = 400 µm i 100 µm (wstawka). Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bando i wsp.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Zautomatyzowana długoterminowa hodowla iPSC. (A) Wszystkie analizy immunocytometryczne z trzech niezależnych eksperymentów dla Oct-3/4 i SSEA-4. Każdy niebieski histogram oznacza kontrolę bez przeciwciał pierwszorzędowych. Każdy czerwony histogram reprezentuje wskazany sygnał specyficzny dla antygenu. (B) Reprezentatywne obrazy komórek barwionych immunohistochemicznie na Oct-3/4, SSEA-4 i Tra 1-81. Paski skali = 50 µm. (C) Kariotyp RIKEN2F-iPSC po piątym pasażu. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Bando i wsp.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Barwienie immunohistochemiczne. Zdjęcia immunohistochemiczne hepatocytów (Paski skali = 100 µm), kardiomiocytów (Paski skali = 100 µm), komórek progenitorowych neuronów (Paski skali = 100 µm) oraz keratynocytów (Paski skali = 200 µm). Rycina została zmodyfikowana za zgodą Bando et al.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Tabela 1: Przygotowanie pasaży i ustawienia systemu. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Preparaty do różnicowania kardiomiocytów i ustawienia systemu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 3: Preparaty do różnicowania hepatocytów i ustawienia systemu. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 4: Przygotowania do różnicowania prekursorowych komórek neuronalnych i ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 5: Preparaty do różnicowania keratynocytów oraz ustawienia systemu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Krytycznym krokiem w protokole jest to, że jeśli użytkownik znajdzie jakiekolwiek usterki, kliknij przycisk Anuluj, Zatrzymaj lub Zresetuj w dowolnym momencie i zacznij od pierwszego kroku. Oprogramowanie pozwala uniknąć błędów ludzkich, w tym podwójnej rezerwacji, otwierania drzwi, gdy zadania systemu są aktywne, oraz braku uzupełniania zapasów. Innym krytycznym punktem dla udanego i skutecznego różnicowania do pożądanej komórki somatycznej jest właściwy dobór pluripotencjalnych linii komórek macierzystych, ponieważ każda pluripotencjalna komórka macierzysta ma niekontrolowane odchylenie we właściwościach różnicowania14,15.
Ten zautomatyzowany system hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych może je utrzymywać i różnicować w różne typy komórek somatycznych. Wymiary tego systemu to 200 cm (szerokość), 110 cm (głębokość) i 233 cm (wysokość), przy masie całkowitej 1,2 tony. Inkubator wbudowany w urządzenie może jednocześnie pomieścić trzydzieści sześć 10-centymetrowych szalek i dziewięć płytek wielodołkowych.
Ulepszenia w stosunku do poprzednich modeli polegają na tym, że po pierwsze, jako ramię manipulacyjne, system szyn osi X-Y-Z został nowo przekształcony z 6-osiowego ramienia przegubowego, które działa poprzez zmianę końcówki ramienia na trzy różne części do naczyń, probówek i pipet. Ramię jest podwieszone pod sufitem systemu i porusza się wzdłuż osi X-Y-Z. Po drugie, wprowadzono system zliczania komórek dla kultur konserwacyjnych bez karmienia i protokołów indukcji różnicowania, które są wykonywane w sposób ciągły od momentu przejścia. Po zmieszaniu roztworu zawiesiny jednokomórkowej z roztworem błękitu trypanowego, przeniesiono go do jednorazowego hemocytometru w celu obserwacji mikroskopowej i obrazowania. Oprogramowanie automatycznie analizuje uzyskany obraz, aby policzyć liczbę żywych komórek i obliczyć objętość wymaganą do zasiewu wymaganej liczby komórek. Dokładność zliczania komórek uzyskana w wyniku tej analizy obrazu była zgodna z dokładnością uzyskaną ręcznie.
System szyn osi X-Y-Z został zastosowany w celu szybszej obsługi każdego zadania niż poprzednia wersja (wieloosiowe ramię przegubowe). Dzięki temu zautomatyzowanemu systemowi hodowli wykonano pięć ciągłych pasaży przez 16 dni, a iPSC rozszerzono 625 ± 93-krotnie. Chociaż dowód wytrzymałości na czas utrzymywania ogniw bez ogniw zasilających był krótszy niż nasza poprzednia demonstracja z ogniwami zasilającymi, ekspansja komórek była bardziej efektywna w porównaniu z poprzednią demonstracją6. Skrócony czas zadania wydawał się przyczyniać do zapobiegania wysychaniu komórek podczas wykonywania zadań.
Ponadto zadania różnicowania od hodowli podtrzymującej do różnicowania w kardiomiocyty, hepatocyty, neuronalne komórki prekursorowe i keratynocyty wykonano bez interwencji człowieka. Po serii tych kursów potwierdzono za pomocą barwienia fluorescencyjnego, że komórki uzyskane w samym zautomatyzowanym systemie hodowli zróżnicowały się w pożądane komórki. Dlatego, udostępniając program zadaniowy i korzystając z tego systemu, naukowcy, którzy nie są zaznajomieni z zarządzaniem komórkami iPS, mogą pozyskać komórki somatyczne pochodzące z iPSC do własnych badań. Co więcej, różnice w odtwarzalności między badaczami lub placówkami mogłyby zostać wyeliminowane w jak największym stopniu, co mogłoby zagwarantować, że za każdym razem uzyskuje się komórki o jednorodnej jakości.
Dzięki zastosowaniu nowego systemu szynowego, sprzęt mógł zostać zmniejszony i lżejszy do 1,2 tony, czyli ~200 kg lżejszy niż wcześniej. Co więcej, koszty ustawień części i programów mogą zostać zmniejszone o około 10 000 USD. Szacuje się, że koszty utrzymania i programowania spadną o 13%. Aby zmotywować większą liczbę badaczy do łatwego udziału w badaniach związanych z komórkami iPS, ważne jest również utrzymanie niskich kosztów sprzętu6. Mamy nadzieję, że obecne i następne generacje systemów hodowli automatycznych będą jednym z wkładów w dostarczanie iPSC i zróżnicowanych komórek pochodzących z iPSC o bardziej jednolitej jakości.
Głównymi ograniczeniami tego systemu są ograniczona pojemność lodówki do wstępnego przechowywania kultur oraz jej słabość w radzeniu sobie z niewielkimi ilościami (<100 μl) płynu. Co więcej, brak wyrafinowanej sztucznej inteligencji uniemożliwia automatyczną optymalizację w zależności od stanu ogniwa na czas. Niewielkim ograniczeniem jest wymóg stosowania specjalnych końcówek do pipet dostarczanych przez producentów systemu 4,5. Opracowujemy nową generację systemów hodowlanych, które będą w stanie poradzić sobie z niewielkimi ilościami płynów do pożywek i będą wyposażone w system optymalizacji sprzężenia zwrotnego oparty na wysokowydajnej sztucznej inteligencji (uczenie się systemu). Nasz współpracujący producent9 posiada wystarczające know-how, aby budować systemy na zamówienie zgodnie ze specjalnymi potrzebami użytkowników. Oprócz tego wkrótce na rynku pojawią się systemy nowej generacji wyposażone w bardziej ogólne i szersze funkcje. Rozważamy również wprowadzenie systemu wynajmu opartego na subskrypcji, aby zapewnić wszystkim użytkownikom aktualne systemy.
Oświadczenia
Autor nie ma nic do zdradzienia.
Podziękowania
To badanie zostało wsparte grantem z Centrum Promocji Nowego Biznesu, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japonia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,15% frakcja albuminy surowicy bydlęcej V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm talerze plastikowe | Corning Inc., NY, Stany Zjednoczone | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-merkaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Aktynina mysz | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenina | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumina królik | Dako | A0001 | |
| Kwas all-trans retinowy | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Zautomatyzowany system hodowli | Panasonic | ||
| B-27 suplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, Stany Zjednoczone #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Zdefiniowany keratynocyt-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Ludzkie podłoże keratynocytowe |
| Deksametazon | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Kanada | 13071-60-8 | rac-1,2-diheksadyloglicerol |
| Jednorazowy hemocytometr | CountessTM Szkiełka z komorą do liczenia komórek, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle średni/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | ||
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Niezbędny 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych |
| Surowica bydlęca | Biowest, FL, Stany Zjednoczone | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292. | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific 25030081 | Suplement glutaminy | |
| Kozi IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A koza | Santacruz | 6556 | |
| Hydrokortyzon | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrokortyzon 21-hemibursztynian | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Jedwab | Nippi Inc., Tokio, Japonia | 892 021 | Macierz hodowli komórkowych |
| Insulina-transferyna-selen | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratyna 1 mysz | Santacruz | 376224 | |
| Keratyna 10 królik | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Uniwersytet Medyczny Kansai | Komórki iPS pochodzące od pacjenta | |
| Zamiennik serum nokautującego | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-fosforan L-askorbinowy | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz' s L-15 średni | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | ||
| Mysia IgG(H+L) AlexaFluo488 | Suplement Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mysz | Santacruz | 23927 | |
| Podłoże neuropodstawowe | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament królik | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Gö ttingen, Niemcy | 05-100-1A | pożywka do hodowli komórkowych |
| 3/4 października mysz | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kioto, Japonia | 14249-24 | |
| IgG królika (H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| IgG królika (H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Rekombinowana albumina ludzka | A0237, Merck, Darmstadt, Niemcy | A9731 | |
| Inhibitor kinazy Rho, Y-27632 | Sellec Inc., Tokio, Japonia | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | niezróżnicowane hiPSC |
| Specyfikacja RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| L-askorbinian sodu | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mysz | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokio, Japonia | Pożywka do hodowli komórkowych | AK02 |
| TnT królik | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mysz | Millipore | MAB4381 | |
| Trijodotyronina | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM ekspresowy enzym | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone | 12604013 | |
| Roztwór błękitu trypanowego | Nacalai Tesque, Kioto, Japonia | 20577-34 | |
| Rosół z fosforanu tryptozy | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, Wielka Brytania | 5148 | |
β  Tublin mysz | Promega | G712A |
Bibliografia
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
Przedruki i uprawnienia
