Artykuł metodologiczny

Izolacja docelowych neuronów podwzgórza do badań regulacji hormonalnej, metabolicznej i elektrycznej

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65674

⸱

4 sierpnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli określonych podtypów komórek podwzgórza w hodowli. Komórki mogą być wybierane na podstawie odpowiednich/unikalnych markerów błonowych i wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w testach immunofluorescencyjnych, elektrofizjologicznych i biochemicznych.

Streszczenie

Podwzgórze reguluje podstawowe procesy metaboliczne, kontrolując funkcje tak różnorodne, jak przyjmowanie pokarmu, temperatura ciała i uwalnianie hormonów. Ponieważ funkcje podwzgórza są kontrolowane przez określone podzbiory populacji neuronów, zdolność do ich izolowania stanowi główne narzędzie do badania mechanizmów metabolicznych. W związku z tym złożoność neuronalna podwzgórza stanowi wyjątkowe wyzwanie.

Z tych powodów zbadano nowe techniki, takie jak Magnetycznie Aktywowane Sortowanie Komórek (MACS). W artykule opisano nowe zastosowanie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) przy użyciu technologii mikrokulek do izolowania docelowej populacji neuronów z mózgów myszy w okresie prenatalnym. Technika jest prosta i gwarantuje wysoce czystą i żywotną pierwotną hodowlę neuronów podwzgórza o wysokiej odtwarzalności. Podwzgórze jest delikatnie dysocjowane, neurony są selektywnie izolowane i oddzielane od komórek glejowych, a na końcu, przy użyciu specyficznego przeciwciała jako markera powierzchni komórki, wybierana jest populacja będąca przedmiotem zainteresowania.

Po wyizolowaniu, neurony docelowe mogą być używane do badania ich cech morfologicznych, elektrycznych i endokrynnych oraz ich reakcji w normalnych lub patologicznych warunkach. Co więcej, biorąc pod uwagę różnorodne role podwzgórza w regulacji karmienia, metabolizmu, stresu, snu i motywacji, bliższe przyjrzenie się neuronom docelowym i specyficznym dla regionu może zapewnić wgląd w ich zadania w tym złożonym środowisku.

Wprowadzenie

Podwzgórze to wielopłaszczyznowy obszar mózgu, który pośredniczy w funkcjach endokrynologicznych, autonomicznych, trzewnych i behawioralnych, w tym karmieniu, metabolizmie, śnie, temperaturze ciała, zachowaniach społecznych i popędzie seksualnym 1,2,3,4,5. Niejednorodność funkcjonalna osiąga się dzięki synergicznemu połączeniu mechanizmów biochemicznych i elektrycznych: neurony podwzgórza wypalają potencjały czynnościowe oraz wydzielają i uwalniają hormony i neuropeptydy w celu modulowania obszarów mózgu i narządów ciała. Wreszcie, neurony podwzgórza tłumaczą homeostatyczne wiadomości z organizmu, odpowiadając długo- i krótkoterminową informacją zwrotną oraz regulacjami sprzężenia zwrotnego6.

Złożone środowisko neuronalne podwzgórza obejmuje magnokomórkowe neurony endokrynne, uwalniające oksytocynę i wazopresynę; neurony parwokomórkowe, głównie zaangażowane w ogólnoustrojową regulację hormonalną, uwalniając na przykład hormon uwalniający tyreotropinę (TRH) i hormon uwalniający kortykotropinę (CRH) do przysadki mózgowej; duże peptydergiczne neurony projekcyjne, uwalniające oreksynę i hormon koncentracji melaniny (MCH); oraz parwokomórkowe neurony peptydergiczne Jądro łukowate (ARC) uwalniające POMC (proopiomelanokortynę) i AgRP (białko związane z agouti), nazwane odpowiednio ARCPOMC i ARCAgRP. Wraz z komórkami wydzielniczymi, inne neurony pobudzające i hamujące, w tym neurony dopaminergiczne, glutaminergiczne i GABA-ergiczne 7, są zaangażowane w tworzenie obwodów wewnątrzpodwzgórzowych i pozapodwzgórzowych, tworząc w ten sposób skoordynowane sieci na dużą skalę o znacznej niejednorodności komórkowej8.

Różnorodność podwzgórza była wyzwaniem, które badacze próbowali przezwyciężyć przez ostatnie 50 lat. Aby zbadać tę niejednorodność w rozwijającym się, dojrzewającym i starzejącym się podwzgórzu, badacze z jednej strony stosują sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki do badania organizacji neuronów, a także sygnatur molekularnych i transkryptomicznych. Wysiłek ten dostarczył wnikliwego spojrzenia na różnorodne role neuronów podwzgórza i zajął się powiązaniami między tożsamością komórkową a jej możliwą rolą w systemie fizjologicznym8,9,10. Z drugiej strony, funkcje neuronalne zostały zbadane za pomocą manipulacji optogenetycznych i podejść behawioralnych opartych na fotometrii światłowodowej, co pozwoliło na dokładne przyjrzenie się strukturze obwodów. W ciągu ostatnich dwóch dekad technologia rekombinazy Cre pozwoliła naukowcom ontogenetycznie stymulować lub hamować docelową grupę neuronów, jednocześnie obserwując zmiany w zachowaniach i reakcjach organizmu6,11,12.

Jednak te podejścia badają funkcje podwzgórza z ogólnej perspektywy, bez zagłębiania się w konkretne mechanizmy komórkowe lub biologiczne podstawy ich roli w złożonym środowisku podwzgórza. Aby temu zaradzić, bardzo niewiele badań koncentrowało się na badaniu właściwości molekularnych, biochemicznych i elektrycznych z wykorzystaniem heterogenicznych pierwotnych kultur podwzgórza. Badania te miały na celu przeanalizowanie określonych procesów neuronalnych w złożonym środowisku i wygenerowanie integracyjnych modeli mechanizmów fizjologicznych13,14,15. Niemniej jednak kultury niespecyficzne stanowią poważne wyzwanie. Na przykład fizjologiczna łączność neuronów i ich anatomiczna dystrybucja są zakłócane przez posiewanie neuronów z różnych regionów podwzgórza, które normalnie nie wchodziłyby w interakcje, tworząc efekty mylące. Ponadto każdy region ma inne role i różnorodne populacje neuronów, co utrudnia badanie prostych procesów biologicznych.

Aby sprostać tym wyzwaniom, w ciągu ostatniej dekady zaimplementowano nowe podejścia do izolacji interesujących neuronów, takie jak immunopanning, sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) i sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Immunopanning to strategia stosowana do oczyszczania docelowych komórek za pomocą naczyń pokrytych przeciwciałami w celu przeprowadzenia serii selekcji nieneuronalnych (ujemnych) i neuronalnych (dodatnich). Podczas gdy technika ta może w zasadzie generować wysokowydajne oczyszczone kultury komórkowe, w praktyce jest najczęściej stosowana w przypadku astrocytów i oligodendrocytów, ponieważ komórki te mogą wytrzymać wielogodzinne manipulacje16,17. Technologia FACS to potężne narzędzie do sortowania komórek na podstawie markerów fluorescencyjnych i cech komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej18,19,20. Jednak w bardzo niewielu badaniach stosowano tę metodę do izolowania komórek do hodowli komórkowej. Technika ta jest kosztowna i wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu do obsługi i konserwacji; Ponadto utrzymanie żywotnych i sterylnych komórek po zakończeniu procedury sortowania jest wyzwaniem21. Ogólnie rzecz biorąc, MACS wydaje się być prostą, niekosztowną techniką uzyskiwania wysoce czystych i żywotnych kultur pierwotnych neuronów podwzgórza. Metoda wykorzystuje kulki magnetyczne połączone z komórkami za pomocą przeciwciała. Pozwala to na izolację ogniw za pomocą pola magnetycznego kolumny.

Tutaj opisujemy metodę opartą na technologii MACS, która jest zazwyczaj stosowana w przypadku neuronów korowych. Protokół ten pozwala w zasadzie wyizolować żywotne i wysoce czyste neurony podwzgórza. W tym badaniu przygotowujemy pierwotne hodowle neuronów wyrażających receptor leptyny (LepR), takich jak neurony ARCPOMC i ARCAgRP, które są obecne tylko w jądrze łukowatym. Neurony te reagują na leptynę, hormon anoreksogenny wydzielany przez tkankę tłuszczową, w sposób biochemiczny i elektryczny. Dlatego izolacja tej grupy neuronów w hodowli pozwala na badanie ich właściwości hormonalnych, metabolicznych i elektrycznych in vitro.

Protokół

UWAGA: Ogólny widok procedury eksperymentalnej jest graficznie zilustrowany w Rysunek 1A. Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) naszej instytucji. Użyliśmy 3-miesięcznych myszy C57BL6/J, które były trzymane w wiwarium zatwierdzonym przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC), pod opieką lekarza weterynarii. Myszy żyły w dużych klatkach, z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność i były karmione ad libitum.

1. Weryfikacja poczęcia i ciąży

  1. Umieść myszy o dowolnym pochodzeniu i genotypie do hodowli. Zapisz datę i wagę samicy przed poczęciem.
  2. Po 6 godzinach sprawdź, czy w samicy nie ma płytki nazębnej za pomocą sondy. Jeśli płytka jest obecna, oddziel samicę od samca. Jeśli płytki nazębnej nie ma, trzymaj samicę w klatce do następnego dnia, a następnie oddziel myszy.
  3. W 7, 10 i 14 dniu po zapłodnieniu zważ samicę, aby potwierdzić ciążę.

2. Podłoże, płytka 24-dołkowa i przygotowanie materiału

  1. W dniu izolacji komórek umieścić gotowe do użycia, szklane szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (patrz tabela materiałów) na 24-dołkowej płytce w następujący sposób:
    1. Pod kapturem biologicznym wysterylizuj pojedyncze opakowanie zawierające 15 szkiełek nakrywkowych z 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Otwórz opakowanie i umieść szkiełka nakrywkowe w płytce o średnicy 60 mm. Potrząśnij płytką poziomo, aby oddzielić szkiełka nakrywkowe. Następnie odwróć płytkę, aby pobrać pojedyncze szkiełka nakrywkowe, które należy umieścić w dołkach płytki 24-dołkowej.
  2. Umyj szkiełka nakrywkowe jednorazowo 1,0 ml sterylnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) przez 5 minut.
  3. W międzyczasie przygotuj 20,0 ml pożywki galwanicznej w następujący sposób: do 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle's Salts), uzupełnionych 1,0 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), dodaj 200 μl pirogronianu sodu (z 100x bulionu), 200 μl glutaminy (z 200 nM zapasu) i 100 μl penicyliny/streptomycyny (z 200x zapasu).
  4. Zastąp HBSS w studzienkach 1,0 ml pożywki galwanicznej i umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  5. Za pomocą palnika Bunsena wypoleruj ogniowo trzy pipety Pasteura o zmniejszających się średnicach. Trzymając pipetę jedną ręką, włóż końcówkę do płomienia i szybko ją wyjmij. Powtarzaj proces, aż końcówka wygładzi się, a średnica zostanie zmniejszona do pożądanej średnicy (ocenianej na oko).

3. Przygotowanie odczynnika do dysocjacji tkanek nerwowych, zgodnie ze wskazówkami zestawu do dysocjacji neuronalnej

  1. Po podgrzaniu buforu wytrawiającego 1 w temperaturze pokojowej należy przygotować mieszankę enzymów 1, mieszając 50 μl enzymu 1 z 1,91 ml buforu 1 i mieszankę enzymów 2, mieszając 15 μl enzymu 2 z 30 μl buforu wytrawiającego 2. Mieszanki są wystarczające, aby można je było stosować do tkanki mózgowej wszystkich zarodków.
  2. Przygotuj 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w HBSS, na przykład 0,25 g w 50,0 ml HBSS.

4. Ekstrakcja zarodków

  1. Autoklaw z dwoma prostymi cienkimi kleszczami, jednym zakrzywionym kleszczem punktowym i jedną parą cienkich nożyczek chirurgicznych i wysterylizuj je 70% etanolem przed użyciem. Następnie napełnij szalki Petriego HBSS.
  2. Poddać eutanazji jedną ciężarną matkę E14-E16 w komorze CO2 i przeprowadzić zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Następujące czynności należy wykonać pod kapturem w sterylnych warunkach:
  3. Wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Rozetnij jamę brzuszną od spojenia łonowego do wyrostka mieczykowatego klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
  4. Wyjmij róg macicy i umieść go na 100-milimetrowej płytce wypełnionej lodowatym HBSS i dokładnie umyj.
  5. Wyciągnij i oddziel wszystkie zarodki od macicy za pomocą drobnych kleszczy. Szybko odetnij zarodki cienkimi nożyczkami chirurgicznymi i/lub kleszczami. Umieść głowy na szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej HBSS.

5. Ekstrakcja, pobieranie i dysocjacja tkanek podwzgórza

  1. Umieść jeden cienki kleszcz w jamie oka, aby przytrzymać mózg. Za pomocą innych cienkich kleszczy usuń skórę i czaszkę, obierając, aż mózg będzie widoczny. Odróżnij mózg od innych tkanek na podstawie jego białego wyglądu. Skóra i czaszka są różowe i bogate w naczynia krwione.
  2. Usuń mózg z czaszki za pomocą zakrzywionych kleszczy punktowych i zgarnij mózg z opuszki węchowej, odwracając go do góry nogami.
  3. Teraz kora jest brzuszna, a podwzgórze jest widoczne grzbietowo na górnej powierzchni (Ryc. 1B). Za pomocą zakrzywionych kleszczy usuń warstwę opon mózgowych i naczyń krwionośnych, aż mózg stanie się biały i czysty.
  4. Za pomocą zakrzywionych kleszczy oddziel obszar podwzgórza od reszty mózgu.
  5. Pokrój podwzgórze na 3-4 małe kawałki i za pomocą pipety przenieś kawałki do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Powtórz te czynności dla pozostałych zarodków, gdy probówka znajduje się na lodzie.
  7. Napełnij probówkę 6,0 ml HBSS i pozwól tkance osiąść, usuń supernatant i dodaj Enzyme Mix 1. Delikatnie wymieszaj i potrząśnij rurką, aby zapobiec powstawaniu tkanki.
  8. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut i mieszać tkankę co 5 minut w celu ponownego zawieszenia tkanki.
  9. Po 15 minutach dodaj 30 μl mieszanki enzymatycznej 2. Dysocjuj tkankę mózgową za pomocą pipety Pasteura o największej średnicy (<1 mm). Pigazować w górę i w dół 10 razy bez tworzenia pęcherzyków.
  10. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Delikatnie poruszaj rurką, aby ponownie zawiesić tkankę co 5 minut.
  11. Po 10 minutach dodaj pozostałe 15 μl mieszanki enzymatycznej 2. Oddziel tkankę 10x od pozostałych dwóch wypolerowanych ogniowo pipet o zmniejszającej się średnicy, w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków.
  12. Do probówki ze zdysocjowaną tkanką natychmiast dodać 10,0 ml HBSS-0,5% BSA i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1,0 ml HBS-0,5% BSA.

6. Liczenie komórek

  1. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 za pomocą HBSS-0,5% BSA.
  2. Umieścić 10 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek w komorze liczącej Neubauera.
  3. Pod mikroskopem jasnego pola policz tylko te komórki, które znajdują się w kwadratach narożnych czterech komór. Oblicz średnią i pomnóż przez 5 × 104.
    UWAGA: Upewnij się, że jest >106 komórek, aby przejść do izolacji komórek; Optymalna liczba komórek to 107.

7. Negatywny wybór

UWAGA: Selekcja negatywna umożliwia użytkownikom uzyskanie czystej pierwotnej kultury neuronów poprzez oddzielenie komórek neuronalnych i nieneuronalnych. Używaj wstępnie schłodzonych roztworów.

  1. Zawiesinę komórkową odwirować w ilości 300 × g przez 3 minuty (wirowanie można przedłużyć do 10 minut). Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad do stężenia 10-7 komórek w 80 μl HBSS-0,5% BSA.
  2. Dodać 20 μl koktajlu biotyny i przeciwciał nieneuronalnych i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Umyj komórki w celu usunięcia wolnego przeciwciała 2,0 ml HBSS-0,5% BSA i odwiruj przy 300 × g przez 3 minuty.
  4. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl HBSS-0,5% BSA. Dodać 20 μl mikrogranulek antybiotyny, dokładnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Dodaj 0,5 ml HBSS-0,5% BSA dla maksymalnie 107 komórek i poczekaj, aż kolumna magnetyczna będzie gotowa.

8. Separacja magnetyczna, selekcja negatywna

UWAGA: Separacja magnetyczna jest kluczowym krokiem, który pozwala na oddzielenie komórek nieneuronalnych od komórek neuronalnych. Próbka zawierająca komórki neuronalne i nieneuronalne jest przepuszczana przez pole magnetyczne, a komórki nieneuronalne, które są związane z kompleksem biotyna-przeciwciało-kulki magnetyczne, są uwięzione w kolumnie (Rysunek 1C). Wolne komórki neuronalne są eluowane przez kolumnę i zbierane w probówce o pojemności 15 ml.

  1. Przygotuj stojak (dołączony do zestawu) z separatorem i kolumną MS, jak pokazano na Rysunek 1C.
  2. Otwórz kolumnę i ustaw podstawkę tylko wtedy, gdy komórki są gotowe do rozdzielenia.
  3. Przepłukać kolumnę 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Poczekaj, aż roztwór przestanie kapać.
  4. Aby zebrać komórki neuronalne, umieść probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i przepuść 0,5 ml zawiesiny komórek przez kolumnę. Zebrać eluat w probówce, aż przestanie kapać. Aby wychwycić szczątkowe komórki neuronalne, przemyj kolumnę 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
  5. Aby zebrać komórki nieneuronalne, wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej probówce o pojemności 15 ml. Dodaj 1,0 ml HBSS--0,5% BSA do kolumny i użyj tłoka, aby zebrać magnetycznie znakowane komórki nieneuronalne.
  6. Odwirować komórki neuronalne i nieneuronalne w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Policz komórki zgodnie z opisem w sekcji 6.
  7. W razie potrzeby umieść komórki nieneuronalne na 24-dołkowej płytce; w przeciwnym razie je wyrzuć.

9. Pozytywny wybór

UWAGA: Po uzyskaniu czystej zawiesiny komórek neuronalnych, przeprowadzana jest pozytywna selekcja w celu wyizolowania docelowych komórek. Komórki można izolować przy użyciu specyficznego przeciwciała sprzężonego z biotyną dla antygenu powierzchniowego. Przeciwciało jest rozpoznawane przez kulki magnetyczne antybiotyny. Przepływając zawiesinę komórek przez kolumnę, tylko komórki będące przedmiotem zainteresowania są uwięzione w polu magnetycznym.

  1. Odwirować czystą zawiesinę komórek nerwowych w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Delikatnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 μl HBSS-0,5% BSA. Dodać specyficzne przeciwciało zgodnie z instrukcjami producenta i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 min.
    UWAGA: Jeśli poszukuje się komórek wykazujących ekspresję LepR, sugerujemy mysie przeciwciało biotynylowane Leptyny R (patrz tabela materiałów) w stężeniu 0,50 μg/106 komórek.
  2. Nadmiar przeciwciał zmyć 2,0 ml HBSS-0,5% BSA i odwirować przy 300 × g przez 3 minuty.
  3. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 80 μl HBSS-0,5% BSA i dodać 20 μl mikrogranulek antybiotyny. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  4. Na każde 107 komórek dodaj 0,5 ml HBSS-0,5% BSA i poczekaj, aż kolumna magnetyczna będzie gotowa.

10. Separacja magnetyczna, selekcja pozytywna

  1. Przygotuj stanowisko z separatorem i kolumną MS. Przepłukać kolumnę MS 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Poczekaj, aż kapanie przestanie kapać.
  2. Umieścić probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną, przepuścić 0,5 ml zawiesiny komórkowej przez kolumnę i zebrać eluat składający się z niespecyficznych komórek nerwowych. Aby oczyścić kolumnę z resztkowych niespecyficznych komórek neuronalnych, przemyj 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA.
  3. Wyjmij kolumnę z magnesu, umieść ją w nowej probówce o pojemności 15 ml i dodaj 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Użyj tłoka, aby wypłukać docelowe komórki.
  4. Odwirować obie probówki o masie 300 × g przez 3 minuty. Delikatnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 0,5 ml podłoża galwanicznego.
  5. Policz komórki zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 6.
  6. Na 24-dołkowej płytce przygotowanej uprzednio zgodnie z opisem w sekcji 2 należy umieścić obie komórki docelowe jako kontrolę pozytywną, a komórki nieswoiste jako kontrolę ujemną o gęstości 120 000-200 000 komórek/mm3 i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2, 9% O2 i wilgotności 95% przez 12 godzin.

11. Utrzymanie kultur komórkowych

  1. Przygotuj 20 ml pożywki hodowlanej z 19,2 ml pożywki do hodowli neuronalnej, 400 μl suplementu B27 (z 50-krotnego zapasu), 200 μl glutaminy (z 200 μM) i 100 μl penicyliny/streptomycyny (z 200-krotnego bulionu).
  2. Wymień pożywkę galwaniczną z 24-dołkowej płytki zawierającej komórki neuronalne lub nieneuronalne.
  3. Umyć 2 x 1,0 ml HBSS.
  4. Dodać 1,0 ml pożywki hodowlanej.
  5. Odświeżaj pożywkę co 2/3 dni, zastępując 0,5 ml starej pożywki 0,5 ml świeżej pożywki.
    UWAGA: Komórki mogą być utrzymywane w hodowli i używane przez okres do 21 dni in vitro (DIV21).

12. Barwienie immunofluorescencyjne neuronów

  1. Dwanaście godzin przed barwieniem przygotować roztwór składający się z metanolu i acetonu w proporcji 50/50 i schłodzić go w temperaturze -20 °C przez noc.
  2. Umyj neurony na 24-dołkowej płytce 2 x 1,0 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut.
  3. Zastąp roztwór PBS 1,0 ml roztworu 50/50 i inkubuj w lodzie przez 20 minut.
  4. Myć z 1x PBS przez 3 x 5 min.
  5. Zablokuj neurony za pomocą 3% BSA w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciał w 3% BSA w 1x PBS, stosując stężenie przeciwciał podane we wskazówkach producenta. Zastosowane przeciwciała i stężenia są wymienione w Tabeli Materiałów.
  7. Zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Myj komórki przez 3 x 10 min za pomocą 1x PBS.
  9. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciał z 3% BSA w 1x PBS, stosując stężenia przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta. Zastosowane przeciwciała drugorzędowe są wymienione w Tabeli materiałów.
  10. Inkubować komórki z roztworem przeciwciał drugorzędowych w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  11. Myj komórki przez 3 x 10 min za pomocą 1x PBS.
  12. Pozostaw neurony w 1x PBS podczas procedury montowania. Umieścić małą kroplę podłoża montażowego (z lub bez 4',6-diamidino-2-fenyloindolu do identyfikacji jądrowej) na szkiełku mikroskopowym. Wyjmij jedno szklane szkiełko nakrywkowe zawierające neurony za pomocą kleszczy i postukaj w bok szkiełka nakrywkowego o papierową chusteczkę, aby wysuszyć nadmiar PBS. Odwróć szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym, upewniając się, że neurony są skierowane w stronę szkiełek mikroskopowych; Delikatnie dociśnij i usuń nadmiar nośnika montażowego za pomocą bibuły.
  13. Szkiełka mikroskopowe są gotowe do analizy za pomocą mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu konfokalnego.

Wyniki

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji wybranych neuronów podwzgórza (Ryc. 1). Celem metody jest badanie specyficznych charakterystyk neuronalnych w kontrolowanym i izolowanym kontekście. W tym celu z organizmów ciężarnych samic myszy pobrano embriony w dniach E14-E16. Usunięto opony mózgowe, a następnie podwzgórze odizolowano od reszty mózgu. Tkankę delikatnie dysocjowano przy użyciu dwóch mieszanin enzymów, świeżo przygotowanych z zastosowaniem wspomnianego zestawu do dysocjacji. W pierwszym etapie oddzielono komórki nieneuronalne od komórek neuronalnych – glej, mikroglej oraz neurony zostały zebrane w jednej zawiesinie jednokomórkowej. W tym celu komórki nieneuronalne znakowano koktajlem przeciwciał rozpoznających nieneuronalne epitopy powierzchniowe. Po inkubacji kompleksy przeciwciało-komórka sprzęgnięto z magnetycznymi mikrokulkami, a następnie przepuszczono przez kolumnę magnetyczną w celu wychwycenia komórek nieneuronalnych.

Krok ten pozwolił na uzyskanie dwóch zawiesin komórkowych: jednej zawierającej komórki nieneuronalne, a drugiej komórki neuronalne. Obie zawiesiny można było wysiać bezpośrednio. Alternatywnie, zawiesinę komórek neuronalnych można było poddać dalszej obróbce w celu wyodrębnienia subpopulacji neuronalnej (zawiesina docelowa) z pozostałej części, stosując tę samą strategię. W zależności od realizowanego eksperymentu, komórki neuronalne można wysiać w zagęszczeniu od 125 000 do 200 000 komórek/mm3. Kultury o mniejszej gęstości mogą być wykorzystywane do analizy neuronów w rozdzielczości pojedynczej komórki: od rozwoju aksonów, tworzenia i przewodzenia synaptycznego, po elektrofizjologię. Kultury gęstsze mogą być stosowane do analiz biochemicznych, w tym ekstrakcji DNA i RNA, western blot, Southern blot, Northern blot, real-time PCR oraz sekwencjonowania RNA.

W niniejszym badaniu zastosowano LepR w celu wyizolowania neuronów zaangażowanych w system melanokortynowy, takich jak neurony ARCPOMC oraz ARCAgRP. Komórki wysiewano w zagęszczeniach od 120 000 cells/mm3 dla neuronów LepR+ do 200 000 cells/mm3 dla ogólnych populacji neuronalnych. Po 48 h neurony LepR+ zaczęły tworzyć neuryty (Rysunek 2). W 4. dobie in vitro (DIV4) odnotowano postęp w wydłużaniu aksonów, podczas gdy zaczęły pojawiać się wypustki dendrytyczne. W DIV6 neurony były dostatecznie rozwinięte, a zatem gotowe do analizy. Eksperymenty immunofluorescencyjne na neuronach LepR+ wykazały 99% ekspresję LepR (kolor zielony, Rysunek 3A). Nie zaobserwowano komórek glejowych ani innych komórek nieneuronalnych, co potwierdziło czystość pierwotnej hodowli neuronalnej. Neuronalny charakter komórek potwierdzono barwieniem na białko 2 związane z mikrotubulami (MAP2), identyfikując aksony i wypustki dendrytyczne (Rysunek 3B). W DIV10 30% komórek LepR+ wykazywało ekspresję POMC (kolor czerwony). Jest to wynik spodziewany, ponieważ większość komórek LepR+ wykazuje ekspresję albo POMC, albo AgRP. Rysunek 3C,D ilustruje kolokalizację sygnałów POMC i LepR. Należy zauważyć, że kolokalizacja była wyraźna w jądrze i wokół niego, zgodnie z oczekiwaniami.

Do kontroli wykorzystano ogólne hodowle zawierające heterogeniczne populacje neuronów podwzgórza. Immunofluorescencja wykazała łączność i funkcjonalność synaptyczną, ocenianą za pomocą podwójnego barwienia Synapsin-1 (zielony) i PSD 95 (czerwony) (Rysunek 4A,B). Liczba neuronów LepR+ obecnych w ogólnej hodowli wynosiła ~5%, co jest wartością zgodną z założeniem, że większość neuronów wykazujących ekspresję LepR została wyselekcjonowana podczas procesu separacji magnetycznej (reprezentatywne komórki LepR+ przedstawiono na Rysunku 4C,D). Wszystkie dane wygenerowane lub analizowane podczas niniejszego badania są dostępne pod adresem https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c.

Schemat ekstrakcji mózgu zarodka myszy, izolacji podwzgórza i magnetycznej separacji komórek.
Rysunek 1: Schemat przepływu i konfiguracja eksperymentalna. (A) Graficzna reprezentacja procedury eksperymentalnej. Punkt kontrolny (Go-no-go): do izolacji komórek niezbędne jest ≥106 komórek; optymalna liczba komórek wynosi 107. (B) Reprezentatywny obraz mózgu zarodka w stadium E16. Wskazano podwzgórze oraz opony mózgowe. (C) Konfiguracja MACS wykorzystana do separacji i izolacji docelowych komórek. Wskazano statyw magnetyczny, separator magnetyczny oraz kolumnę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat różnicowania neuronalnego przedstawiający neurony podwzgórza dodatnie pod kątem LepR oraz neurony generyczne, DIV2-6.
Rysunek 2: Kultura neuronalna między DIV2 a DIV6. (A) Komórki LepR+ uzyskane w drodze selekcji pozytywnej wykazują zmniejszoną gęstość komórkową i łączność, ale prawidłowy rozwój neurytów (czerwone strzałki), aksonów (niebieskie strzałki) i dendrytów (zielone strzałki). Komórki wysiano z gęstością 120 000 cells/mm3. Pasek skali = 100 μm. (B) Generyczne neurony podwzgórza, wysiane z gęstością 200 000 cells/mm3, wykazują prawidłowe cechy rozwojowe, wzrostu oraz łączność (czarne strzałki). Pasek skali = 100 μm. Skróty: DIV = dni in vitro; LepR = receptor leptyny. Wszystkie dane wygenerowane lub przeanalizowane w celu przygotowania tego rysunku są dostępne pod adresem https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Obrazowanie komórek neuronalnych z LepR, DAPI, MAP2, POMC; analiza mikroskopowa fluorescencyjna.
Rysunek 3: Neurony hodowlane LepR+ odzwierciedlają cechy neuronów in vivo.(A) Reprezentatywne obrazy hodowli neuronów wykazujących ekspresję LepR (kolor zielony; DAPI kolor niebieski). Dziewięćdziesiąt dziewięć procent komórek wykazywało ekspresję LepR. Neurony wysiano z gęstością 120 000 cells/mm3. W 7. dniu in vitro (DIV7) neurony wykazywały wydłużone aksony, dojrzewanie dendrytów oraz łączność neuronalną (strzałki). Pasek skali = 40 μm. (B) Do potwierdzenia neuronalnego charakteru komórek zastosowano immunofluorescencję z przeciwciałem anty-MAP2. Przedstawiono specyficzne dla neuronów morfologie, takie jak aksony, dendryty i wypustki (strzałki). Pasek skali = 40 μm. (C) Powiększenie komórek LepR+. LepR w kolorze zielonym i DAPI w kolorze niebieskim. Pasek skali = 10 μm. (D) Podwójne barwienie na LepR (zielony) i POMC (czerwony). Około 30% neuronów LepR+ było immunoreaktywnych wobec POMC, który wykryto na poziomie jądra (czerwone strzałki). Pasek skali = 10 μm. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; MAP2 = białko 2 związane z mikrotubulami; POMC = proopiomelanokortyna; LepR = receptor leptyny. Wszystkie dane wygenerowane lub przeanalizowane w celu przygotowania tego rysunku są dostępne pod adresem https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza immunofluorescencji neuronów z obrazowaniem DAPI, Synapsin1, PSD95, LepR, DIV7; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 4: In vivo komórki te zostały odtworzone przy użyciu hodowlanych, generycznych neuronów podwzgórzowych. (A) Reprezentatywne obrazy generycznej hodowli neuronów podwzgórza barwionych synapsyną 1 (zielony), PSD95 (czerwony) i DAPI (niebieski). Neurony wykazywały dobrze rozwiniętą łączność oraz funkcjonalność synaptyczną (strzałki). Pasek skali = 40 μm. (B) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w (A), wykazujące kolokalizację synapsyny 1 (kolor zielony) i PSD95 (kolor czerwony, strzałki). Pasek skali = 20 μm. (C,D) Reprezentatywne obrazy przedstawiające komórki LepR+ w kulturze ogólnej. Komórki LepR+ (zielone) stanowiły ok. 5% całkowitej liczby komórek. Reprezentatywne komórki LepR+ wskazano strzałkami. Pasek skali = 40 μm. (E,F) powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami w (C,D) wykazujące zielone punkty receptorów leptyny zlokalizowanych w somie. Pasek skali = 20 μmWszystkie dane wygenerowane lub przeanalizowane w celu stworzenia tego rysunku są dostępne pod adresem https://doi.org/10.5061/dryad.cnp5hqc9c. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Dyskusja

Badanie właściwości biochemicznych i elektrycznych neuronów podwzgórza jest kluczem do zrozumienia molekularnych podstaw metabolizmu, termoregulacji, zarządzania nastrojem, zachowań żywieniowych i nie tylko. Jednak niejednorodność neuronalna podwzgórza sprawia, że wysiłek ten jest trudny i potrzebne są metody izolowania i badania określonych subpopulacji podwzgórza.

Techniki in vivo wykorzystują rekombinazę CRE, optogenezę, fotometrię światłowodową i obrazowanie wapnia. Podejścia te pozwalają przede wszystkim na badanie właściwości elektrycznych neuronów podwzgórza, a obecnie dostępnych jest bardzo niewiele metod badania ich atrybutów nieelektrycznych. Technologia MACS opracowana w tym badaniu może zapewnić technikę umożliwiającą izolację określonych subpopulacji neuronów podwzgórza in vitro, umożliwiając w ten sposób ukierunkowane leczenie i analizy. Hodowle neuronów są łatwiejsze w zarządzaniu w porównaniu z kokulturami różnych populacji neuronów. Ponadto czyste kultury unikają mylących efektów wynikających z obecności gleju i mikrogleju. W ten sposób neurony z tego samego regionu i typu podwzgórza mogą być badane w odpowiedzi na określone bodźce metaboliczne i hormonalne.

W tym protokole wybraliśmy neurony podwzgórza wyrażające LepR. Wyizolowane komórki LepR+ wyhodowano w celu zbadania ich cech komórkowych, morfologicznych i molekularnych, które są trudne do zbadania in vivo. Czystość kultur wynosiła 99%, co potwierdza dokładność metody. Ponadto komórki LepR + były zdrowe i żywotne w DIV7 do DIV21.

Ta technika ma jednak pewne ograniczenia. Czyste kultury neuronów E18 lub starsze są trudne do utrzymania. W związku z tym okno ekstrakcji jest ograniczone do E14-E16. Oznacza to, że zmiany komórkowe zachodzące po E16 są pomijane. Na przykład ekspresja receptora leptyny w neuronach ARC wzrasta we wczesnym okresie poporodowym22. Procedura izolacji musi być wykonana tak szybko, jak to możliwe, aby zmniejszyć stres i śmierć komórkową oraz poprawić wydajność. Zabieg może trwać do 5 godzin; Dlatego tak ważne jest utrzymanie sterylnych warunków i ograniczenie manipulacji do niezbędnego minimum. Selekcja pozytywna może prowadzić do niskiej wydajności ze względu na małą ilość dostępnej tkanki, co ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić za pomocą jednego preparatu. Zaobserwowano podwyższoną śmierć neuronów, prawdopodobnie z powodu niskiej gęstości komórek i zmniejszonej łączności neuronalnej i wsparcia wewnątrzneuronalnego.

Co więcej, przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi będącemu przedmiotem zainteresowania musi związać się z powierzchnią komórki, aby zagwarantować prawidłowe oddzielenie; zwykle przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej są odpowiednie dla techniki MACS. Jeśli przeciwciało nie było wcześniej używane w metodach separacji komórek, konieczne są eksperymenty walidacyjne i miareczkowania w celu określenia idealnego użycia i stężenia. Ekstrakcja docelowych komórek wymaga markera powierzchni komórki. W tym przypadku użyliśmy przeciwciała biotynylowanego, ale w zasadzie można również zastosować przeciwciała sprzężone z innymi cząsteczkami, takimi jak FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) i PE (oczyszczona antyfikoerytryna). Technologia MACS może być również stosowana do neuronów wykazujących ekspresję fluoroforu, takiego jak GFP lub inne białko Tag, potencjalnie zwiększając swoistość i wydajność. Jeśli fluorofor nie jest stosowany, alternatywą byłoby potwierdzenie ekspresji interesującej cząsteczki za pomocą immunofluorescencji przed przeprowadzeniem eksperymentów na żywych komórkach. Przyszłe badania przetestują zasadność tych alternatyw.

Jednym z ważnych aspektów, do którego nie odniesiono się w tym badaniu, jest "wierność" populacji subneuronalnych. Ustaliliśmy, że hodowane neurony LepR + wyrażają POMC, co jest sygnaturą natywnych neuronówARC POMC . Konieczne będą jednak dalsze testy, aby stwierdzić, że kultury neuronalne LepR+ podsumowują swoje rodzime odpowiedniki in vivo . Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół izolacji neuronów MACS może stanowić ważną i skuteczną metodę badania mechanizmów podwzgórza in vitro , które w innym przypadku byłyby trudne do zbadania in vivo.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Figury graficzne zostały stworzone za pomocą BioRender.com. Prace te były wspierane przez grant NIA (R01AG060919) oraz grant NSF (2030348) dla FS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekstrakcja zarodków
1 zakrzywione kleszcze punktoweFine Science Tools11270-20Dumont
1 cienkie nożyczki chirurgiczneFine Science Tools14058-11Dumont
100 mm szalka PetriegoCorning430167
2 proste kleszcze drobneFine Science Tools11254-20Dumont
Szalka Petriego 60 mmCorning430196
70% etanoluDecon Laboratories, INC.2801Etanol 190 Proof
Mikrokulki antybiotyny 1 mlMiltenyi Biotec130-115-390
Przeciwciało anty-MAP2Abcamab53921 : 800
Podkładki na ławkę Albumina
surowicy bydlęcej Sigma-AldrichA9418-50G
Bufor YMiltenyi Biotec130-094-802
Bufor ZMiltenyi Biotec130-094-802
Cell Culture
MicroBeads 1mLMiltenyi Biotec130-115-390
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-AldrichA9418-50G
Bufor YMiltenyi Biotec130-094-802
Bufor ZMiltenyi Biotec130-094-802
Enzym AMiltenyi Biotec130-094-802
Enzym PMiltenyi Biotec130-094-802
GG-12-1.5, średnica 12 mm średnica #1,5 grubość 100 szt. testowane kultury komórkowe Niemieckie okulary nakrywkoweNeuvitro CorporationGG-12-15
Gibco B-27 Suplement 10 mlThermoFisher 17504-044
Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL ThermoFisher21010046(+) Earle's Soles, (-) L-glutamina 
Gibco HBBS (1x) Zrównoważony roztwór soli Hanksa  500 mlThermoFisher14025092Wapń, Magnez, Bez czerwieni fenolowej
Gibco HI FBS 100 mlThermoFisher16140-063
Gibco L-Glutamina 200 mM (100x)ThermoFisher25030-081
Gibco Penicylina/Streptomicyna ThermoFisher15140-12210 000 U/ml
pirogronianu sodu Gibco (100 mM) 100 mlThermoFisher11360070
MiniMACS Separator i zestaw startowyMiltenyi Biotec130-042-102
Mysie przeciwciało biotynylowane Leptyna RR& D Systems ABAF4970,25 μ g/106 komórek
Kolumna MSMiltenyi Biotec130-042-201
Neaubeaur-Improved Brightline 100 µ m IzbaHausser Scientific 3120
Zestaw do dysocjacji tkanek nerwowych - Neurony postnatalneMiltenyi Biotec130-094-802
Pożywka do hodowli neuronów 500 ml ThermoFisher88283
Mysz koktajlowa z przeciwciałami biotynowymi i nieneuronalnymi 1 mlMiltenyi Biotec130-115-389
Mikroskop stereoskopowy Olympus SZ61 zoom Olympus Life ScienceSZ61/SZ51 
Pierce Primary Neuron Isolation KitThermoFisher88280Y
Staining
Anti-MAP2 Anti-MAP2Abcamab53921 : 800
Przeciwciało wtórne anty-myszy IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488ThermoFisherA327661 : 500
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi IgG (H+L) osła, Alexa Fluor Plus 488ThermoFisherA327901 : 500
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) Sigma Aldrich 
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-IgY (H + L) z adsorbcją, Alexa Fluor Plus 647ThemoFisherA329331 : 500
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 594ThermoFisherA110371 : 200
Rekombinowane przeciwciało monoklonalne królika z receptorem leptyny Invitrogen (JA73-01)ThermoFisherMA5-326851 : 500
Mysie przeciwciało biotynylowane Leptyna RR& D Systems ABAF4971 : 500
POMC Rabbit mAb Technologia sygnalizacji komórkowejD3R1U1 : 500
PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAbTechnologia sygnalizacji komórkowejD74D3#34091 : 500
Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 594ThermoFisherS112271 : 500
Przeciwciało monoklonalne Synapsin 1 (7H10G6)ThermoFisherMA5-319191 : 500
Vectashield Plus Antifade Mountina Medium z DAPI 10 mlLaboratoria Wektorowe H-2000
Anti-BiotininMFCD00131855

Bibliografia

  1. Cone, R. D. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nature Neuroscience. 8 (5), 571-578 (2005).
  2. Clarke, I. J. Hypothalamus as an endocrine organ. Comprehensive Physiology. 5 (1), 217-253 (2015).
  3. Mignot, E., Taheri, S., Nishino, S. Sleeping with the hypothalamus: emerging therapeutic targets for sleep disorders. Nature Neuroscience. 5 Suppl, 1071-1075 (2002).
  4. Baird, A. D., Wilson, S. J., Bladin, P. F., Saling, M. M., Reutens, D. C. Neurological control of human sexual behaviour: insights from lesion studies. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 78 (10), 1042-1049 (2007).
  5. Caria, A., Dall, O. G. Functional neuroimaging of human hypothalamus in socioemotional behavior: a systematic review. Brain Sciences. 12 (6), 707(2022).
  6. Andermann, M. L., Lowell, B. B. Toward a wiring diagram understanding of appetite control. Neuron. 95 (4), 757-778 (2017).
  7. Romanov, R. A., Alpar, A., Hokfelt, T., Harkany, T. Unified classification of molecular, network, and endocrine features of hypothalamic neurons. Annual Review of Neuroscience. 42, 1-26 (2019).
  8. Hajdarovic, K. H., Yu, D., Webb, A. E. Understanding the aging hypothalamus, one cell at a time. Trends in Neurosciences. 45 (12), 942-954 (2022).
  9. Zhang, Y. H., et al. Cascade diversification directs generation of neuronal diversity in the hypothalamus. Cell Stem Cell. 28 (8), 1483-1499 (2021).
  10. Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-cell RNA-seq reveals hypothalamic cell diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
  11. Ma, C., et al. Neural pathways from hypothalamic orexin neurons to the ventrolateral preoptic area mediate sleep impairments induced by conditioned fear. Frontiers in Neuroscience. 17, 1122803(2023).
  12. Wang, F., et al. A parabrachial to hypothalamic pathway mediates defensive behavior. Elife. 12, e85450(2023).
  13. Cowley, M. A., et al. Leptin activates anorexigenic POMC neurons through a neural network in the arcuate nucleus. Nature. 411 (6836), 480-484 (2001).
  14. Parekh, R. U., et al. Hypothalamic kinin B1 receptor mediates orexin system hyperactivity in neurogenic hypertension. Scientific Reports. 11 (1), 21050(2021).
  15. Schmidt, C. X., Tsang, A. H., Oster, H. Generation of mouse primary hypothalamic neuronal cultures for circadian bioluminescence assays. Bio-protocol. 11 (5), e3944(2021).
  16. Foo, L. C. Purification of rat and mouse astrocytes by immunopanning. 2013 (5), Cold Spring Harbor Protocols. 421-432 (2013).
  17. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. 2013 (9), Cold Spring Harbor Protocols. 854-868 (2013).
  18. Zhao, H., et al. Changes of constituents and activity to apoptosis and cell cycle during fermentation of tea. International Journal of Molecular Sciences. 12 (3), 1862-1875 (2011).
  19. Zhang, Z. M., et al. Down-regulation of human leukocyte antigens class I on peripheral T lymphocytes and NK cells from subjects in region of high-incidence gastrointestinal tumor. Chinese Medical Journal. 124 (12), 1813-1817 (2011).
  20. Drake, S. S., Zaman, A., Simas, T., Fournier, A. E. Comparing RNA-sequencing datasets from astrocytes, oligodendrocytes, and microglia in multiple sclerosis identifies novel dysregulated genes relevant to inflammation and myelination. WIREs Mechanisms of Disease. 15 (2), e1594(2023).
  21. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microbial Cell Factories. 5, 12(2006).
  22. Cottrell, E. C., et al. Developmental changes in hypothalamic leptin receptor: relationship with the postnatal leptin surge and energy balance neuropeptides in the postnatal rat. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296 (3), R631-R639 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja neuron w podwzg rzamagnetyczne sortowanie kom rek MACSukierunkowana populacja neuron wpierwotna hodowla neuron wneurony z receptorem leptynyregulacja metabolicznabarwienie immunofluorescencyjnetechnologia mikrokulekelektrofizjologiaseparacja kom rek glejowych
Izolacja docelowych neuronów podwzgórza do badań regulacji hormonalnej, metabolicznej i elektrycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.