Method Article

Wysokoprzepustowe eksperymenty optogenetyczne na drożdżach z wykorzystaniem zautomatyzowanej platformy Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kroki do wykorzystania zautomatyzowanej platformy Lustro do przeprowadzenia wysokoprzepustowej charakterystyki systemów optogenetycznych u drożdży.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka oferuje precyzyjną kontrolę nad zachowaniem komórek, wykorzystując genetycznie kodowane białka wrażliwe na światło. Jednak optymalizacja tych systemów w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności często wymaga wielu cykli projektowania, budowy i testów, co może być czasochłonne i pracochłonne. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy Lustro, platformę, która łączy stymulację światłem z automatyzacją laboratorium, umożliwiając wydajne, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i charakteryzację systemów optogenetycznych.

Lustro wykorzystuje stację roboczą automatyki wyposażoną w urządzenie oświetleniowe, urządzenie do wytrząsania i czytnik płytek. Wykorzystując ramię robota, Lustro automatyzuje ruch płytki mikrodołkowej między tymi urządzeniami, umożliwiając stymulację szczepów optogenetycznych i pomiar ich odpowiedzi. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący stosowania Lustro do charakteryzowania systemów optogenetycznych do kontroli ekspresji genów w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokół obejmuje konfigurację komponentów Lustro, w tym integrację urządzenia oświetleniowego ze stacją roboczą automatyki. Zawiera również szczegółowe instrukcje dotyczące programowania urządzenia oświetleniowego, czytnika płytek i robota, zapewniając płynną pracę i gromadzenie danych w całym procesie eksperymentalnym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka to potężna technika, która wykorzystuje białka wrażliwe na światło do kontrolowania zachowania komórek z dużą precyzją1,2,3. Jednak prototypowanie konstruktów optogenetycznych i określanie optymalnych warunków oświetlenia może być czasochłonne, co utrudnia optymalizację systemów optogenetycznych4,5. Wysokoprzepustowe metody szybkiego badania przesiewowego i charakteryzowania aktywności systemów optogenetycznych mogą przyspieszyć cykl projektowania-budowa-testowanie prototypów konstruktów i badania ich funkcji.

Platforma Lustro została opracowana jako technika automatyzacji laboratorium przeznaczona do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i charakteryzacji systemów optogenetycznych. Integruje czytnik mikropłytek, urządzenie oświetleniowe i urządzenie wytrząsające ze stacją roboczą automatyzacji6. Lustro łączy zautomatyzowaną hodowlę i stymulację świetlną komórek na płytkach mikrodołkowych (Rysunek 1 i Rysunek Uzupełniający 1), umożliwiając szybkie badania przesiewowe i porównanie różnych systemów optogenetycznych. Platforma Lustro jest wysoce elastyczna i można ją uogólnić do pracy z innymi robotami automatyki laboratoryjnej, urządzeniami oświetleniowymi, czytnikami płytek, typami komórek i systemami optogenetycznymi, w tym reagującymi na różne długości fal światła.

Ten protokół demonstruje konfigurację i użycie Lustro do charakteryzowania systemu optogenetycznego. Optogenetyczna kontrola rozszczepionych czynników transkrypcyjnych u drożdży jest używana jako przykładowy system do zilustrowania funkcji i użyteczności platformy poprzez badanie związku między sygnałami świetlnymi a ekspresją fluorescencyjnego genu reporterowego, mScarlet-I7. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą usprawnić optymalizację systemów optogenetycznych i przyspieszyć odkrywanie nowych strategii dynamicznej kontroli systemów biologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepy drożdży użyte w tym badaniu są udokumentowane w Tabeli Materiałów. Szczepy te wykazują silny wzrost w zakresie temperatur od 22 °C do 30 °C i mogą być uprawiane w różnych standardowych pożywkach drożdżowych.

1. Konfiguracja stacji roboczej automatyzacji

  1. Wyposaż zautomatyzowaną stację roboczą w zrobotyzowane ramię chwytakowe (RGA, patrz tabela materiałów) zdolne do przesuwania płytek mikrodołkowych (Rysunek 1).
  2. Zainstaluj wytrząsarkę do mikropłytek (patrz tabela materiałów) w zautomatyzowanej stacji roboczej (Rysunek 1(1)) z automatycznym mechanizmem blokującym płytkę, który zapewnia dostęp RGA.
  3. Umieść czytnik mikropłytek w pobliżu zautomatyzowanej stacji roboczej (Rysunek 1(2)), zapewniając dostępność RGA.
  4. Dołącz urządzenie do oświetlania mikropłytek ( Rysunek 1(3)), które umożliwia wygodny dostęp do RGA. Przykładami są optoPlate8 (użyty w tym badaniu) lub LITOS9 (patrz Tabela materiałów).

2. Przygotowanie urządzenia oświetleniowego

  1. Zbuduj i skalibruj optoPlate (lub alternatywne urządzenie oświetleniowe) zgodnie z ustalonymi metodami8,10,11.
  2. Użyj adaptera na urządzeniu oświetleniowym, aby umożliwić dostęp do RGA.
  3. Zaprogramuj optoPlate za pomocą arkusza kalkulacyjnego input10 lub interfejsu graficznego12. Wykonaj krok 3, aby uruchomić programy stymulacji światłem.

3. Projektowanie programu stymulacji światłem

  1. Określ pożądane warunki oświetleniowe dla eksperymentu.
  2. Wprowadź żądane warunki oświetleniowe, w tym natężenie światła, czas rozpoczęcia światła, długość impulsu, numer impulsu i czas trwania impulsu, w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA: Wprowadź te informacje do optoPlate, korzystając z instrukcji podanych w repozytorium GitHub: github.com/mccleanlab/Optoplate-96. Należy pamiętać, że płytka próbki nie będzie świecić, gdy znajduje się w czytniku mikropłytek lub na wytrząsarce grzałki. Czas trwania i częstotliwość tych zdarzeń może wymagać optymalizacji w oparciu o określone wymagania eksperymentalne.
  3. Uwzględnij ciemne warunki dla każdej odmiany, aby umożliwić prawidłowe pomiary tła.
  4. Do wstępnych eksperymentów charakteryzacyjnych w celu oceny funkcjonalności transformantu należy użyć światła o wysokim natężeniu.
    UWAGA: Natężenie światła powinno być zoptymalizowane dla bardziej czułych eksperymentów, ponieważ nadmierne światło może być fototoksyczne dla drożdży13.

4. Przygotowanie czytnika mikropłytek

  1. Skonfiguruj czytnik mikropłytek tak, aby mierzył żądaną ilość zainteresowania przed przeprowadzeniem eksperymentów.
    UWAGA: W tym przykładzie czytnik mikropłytek został skonfigurowany do pomiaru fluorescencji z reportera wyrażonej przez odkształcenie będące przedmiotem zainteresowania. Inne wyjścia, takie jak luminescencja lub gęstość optyczna, mogą być stosowane w zależności od wymagań eksperymentalnych.
  2. Hoduj interesujący nas szczep (wraz z kontrolą niefluorescencyjną) w syntetycznym kompletnym (SC) pożywce14 (lub innym podłożu o niskiej fluorescencji) (patrz Tabela materiałów) do najwyższej gęstości komórek, jaką można zmierzyć. Przenieś kultury na płytkę mikrodołkową o czarnych ściankach ze szklanym dnem (patrz Tabela materiałów) i zmierz je w celu określenia optymalnych ustawień czytnika mikropłytek.
    UWAGA: Zapewnij dokładne odczyty, prawidłowo wprowadzając wymiary płyty i mierząc płytkę od dołu.
  3. Zapoznaj się z bazą danych białek fluorescencyjnych (na przykład fpbase.org), aby uzyskać przybliżone widma absorpcji i emisji dla docelowego białka fluorescencyjnego15.
  4. Określ wartość Z (odległość między płytką a czytnikiem), wykonując skanowanie z na studzienkach zawierających szczepy fluorescencyjne i niefluorescencyjne. Wybierz wartość z, która daje najwyższy stosunek sygnału do szumu.
  5. Zoptymalizuj widma absorpcyjne i emisyjne, przeprowadzając skany absorpcyjne i emisyjne na szczepach fluorescencyjnych i niefluorescencyjnych w celu określenia optymalnego stosunku sygnału do szumu.
  6. Zmierz odkształcenie fluorescencyjne z wzmocnieniem ustawionym na optymalnym poziomie, określając najwyższe wzmocnienie optyczne, które można zastosować bez powodowania błędu pomiaru przepełnienia.
    UWAGA: To wzmocnienie optyczne powinno być ustawiane ręcznie konsekwentnie we wszystkich eksperymentach obejmujących ten sam szczep, aby zapewnić spójność wyników.
  7. Przygotuj skrypt pomiarowy (patrz Rysunek 2) w oprogramowaniu czytnika mikropłytek. Ten skrypt konfiguruje przyrząd do pomiaru gęstości optycznej kultur i widm fluorescencyjnych wszelkich białek fluorescencyjnych, które mają być mierzone.
    UWAGA: Zmierz gęstość optyczną szczepów przy 600 nm, chyba że wykazują ekspresję czerwonych białek fluorescencyjnych. W przypadku szczepów wykazujących ekspresję białek czerwonej fluorescencji należy zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 700 nm, aby uniknąć odchylenia16.
  8. Ustaw skrypt pomiarowy tak, aby utrzymać wewnętrzną temperaturę inkubacji wynoszącą 30 °C podczas pomiarów.
  9. Skonfiguruj skrypt pomiarowy, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego lub plików ASCII, zgodnie z preferencjami.

5. Programowanie robota

  1. Skonfiguruj definicję stołu roboczego w oprogramowaniu zautomatyzowanej stacji roboczej w oparciu o fizyczny układ nośników (np. otrząsarki grzałek, platformy gniazdowe, urządzenia oświetleniowe) i sprzętu laboratoryjnego (np. płytki 96-dołkowej) (patrz tabela materiałów). Utwórz skrypt w oprogramowaniu stacji roboczej automatyzacji, aby wykonać indukcję światła i pomiary (Rysunek 3), postępując zgodnie z poniższymi krokami.
  2. Wyłącz wszystkie wewnętrzne źródła oświetlenia, aby zapobiec aktywacji systemów optogenetycznych w tle.
  3. Ustaw wytrząsarkę grzałki tak, aby utrzymywała temperaturę 30 °C. Gdy płyta nie znajduje się na wytrząsarce grzałki, będzie ona miała temperaturę otoczenia (22 °C).
  4. Wykorzystaj pętle, timer i zmienną zliczającą pętle, aby powtórzyć kroki indukcji i pomiaru komórek w regularnych odstępach czasu.
  5. Przed zapisaniem pomiarów należy wstrząsnąć płytką próbki, aby zapewnić prawidłowe zawieszenie wszystkich komórek. 60-sekundowe wstrząsy przy 1,000 obr./min z orbitalem 2 mm są na ogół wystarczające do ponownego zawieszenia komórek S288C S. cerevisiae i uniknięcia błędu pomiarowego.
  6. Przenieś płytkę próbki do czytnika mikropłytek za pomocą ramienia robota i zdejmij pokrywę (jeśli dotyczy), aby zapobiec odchyleniom w pomiarze gęstości optycznej. Oprogramowanie sterujące automatycznie zdejmie i założy pokrywę do wyznaczonej pozycji, jeśli definicja nośnika czytnika mikropłytek jest ustawiona tak, aby nie zezwalała na pokrywy.
  7. Wykonaj skrypt pomiarowy czytnika mikropłytek zgodnie z opisem w kroku 4.
  8. Załóż pokrywę na płytkę próbki i przesuń płytkę do urządzenia oświetleniowego za pomocą ramienia robota.
  9. Ustaw skrypt tak, aby czekał, aż czasomierz osiągnie określony przedział czasu (np. 30 minut pomnożone przez zmienną zliczającą pętlę), a następnie powtórz całą pętlę dla żądanej liczby iteracji (np. 48 razy dla eksperymentu 24-godzinnego).
  10. Rozwiązywanie problemów z potencjalnymi błędami i zapewnienie prawidłowego działania definicji nośnika i sprzętu laboratoryjnego, a także zdolności RGA do dokładnego podnoszenia i umieszczania płytki poprzez wielokrotne przepuszczanie pustej płytki przez pętlę skryptu.
  11. Skonfiguruj alerty użytkownika, aby powiadamiać użytkownika o wszelkich zmianach stanu urządzenia lub błędach, które mogą wystąpić podczas wykonywania protokołu.

6. Ustawianie płytki próbkowania

  1. Hoduj szczepy drożdży na płytkach z bogatymi mediami, takimi jak YPD agar17 (patrz Tabela materiałów). Uwzględnij kontrolę niefluorescencyjną (negatywną).
  2. Wybierz kolonie z płytek i zaszczep je w 3 ml pożywki SC 14 (lub innej pożywki o niskiej fluorescencji, takiej jak LFM18) w szklanych probówkach hodowlanych. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 °C na bębnie rolkowym, trzymając je w ciemności lub w warunkach braku reakcji na światło (np. światło czerwone w przypadku systemów reagujących na światło niebieskie).
  3. Zmierzyć gęstość optyczną kultur nocnych, rozcieńczając 200 μl każdej kultury w 1 ml pożywki SC i rejestrując gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru lub czytnika mikropłytek.
  4. Rozcieńczyć każdą nocną kulturę do OD600 0,1 w szklanych probówkach hodowlanych. W celu przeprowadzenia testów odkształceń o wyższej przepustowości należy wykonać automatyczne rozcieńczenia w płytkach mikrodołkowych.
  5. Odpipetować rozcieńczone kultury do płytki 96-dołkowej. Należy uwzględnić trzy studzienki dla każdego warunku (tj. trzy identyczne studzienki o tym samym naprężeniu i warunkach światła), aby uwzględnić różnice techniczne. Uwzględnij studzienki z ślepymi pożywkami i komórkami niefluorescencyjnymi jako kontrole ujemne do pomiaru fluorescencji tła i gęstości optycznej.
  6. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C, wytrząsając przez 5 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu z indukcją światła. W razie potrzeby dostosuj ilości rozcieńczenia i czasy inkubacji, aby zoptymalizować je pod kątem określonych szczepów i warunków eksperymentalnych.

7. Przeprowadzanie eksperymentu

  1. Umieść sample płytki na wytrząsarce grzałki i zainicjuj skrypt automatyzacji, jak opisano w kroku 5.
  2. Rozpocznij program stymulacji światłem zgodnie z opisem w kroku 3 po zarejestrowaniu początkowego pomiaru na czytniku płytek.
  3. Jeśli stanowisko pracy automatyki nie znajduje się w ciemnym pomieszczeniu, zakryj je zasłoną zaciemniającą, aby uniknąć oświetlenia tła.

8. Analiza danych

  1. Utwórz mapę arkusza kalkulacyjnego na potrzeby eksperymentu, odzwierciedlającą układ 8 x 12 płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że mapa zawiera nazwy odkształceń mierzonych w jednej siatce oraz opisy warunków oświetleniowych używanych w innej siatce.
  2. Wykorzystaj skrypt Pythona lub inny preferowany język programowania do analizy wyeksportowanych danych. Zaimportuj arkusz kalkulacyjny mapy do tablicy, kojarząc nazwy szczepów i nazwy warunków z każdym dołkiem płyty.
    UWAGA: Przykładowy kod do analizy można znaleźć pod adresem: https://github.com/mccleanlab/Lustro. Alternatywnie można użyć aplikacji do analizowania danych z różnych czytników tabliczek19.
  3. Wczytaj dane z wyeksportowanego arkusza kalkulacyjnego eksperymentu do innej tablicy.
  4. Wygeneruj wykresy wartości gęstości optycznej i wartości fluorescencji dla każdego szczepu i stanu w czasie, jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
  5. Zbadaj wykresy gęstości optycznej, aby określić etapy wykładniczego wzrostu lub nasycenia kultur. Informacje te pomogą w wyborze odpowiednich punktów czasowych do porównania pomiarów fluorescencji między szczepami lub warunkami, jak pokazano na rysunku Rysunek 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4A pokazuje wartości fluorescencji w czasie dla szczepu optogenetycznego wykazującego ekspresję fluorescencyjnego reportera kontrolowanego przez indukowany światłem rozszczepiony czynnik transkrypcyjny. Różne warunki oświetleniowe użyte w eksperymencie są odzwierciedlone przez zmiany w cyklu pracy, który reprezentuje procent czasu, w którym światło jest włączone. Obserwuje się, że ogólny poziom fluorescencji jest proporcjonalny do cyklu pracy stymulacji świetlnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół Lustro automatyzuje procesy hodowli, oświetlenia i pomiaru, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe i charakteryzację systemów optogenetycznych6. Osiąga się to poprzez zintegrowanie urządzenia oświetleniowego, czytnika mikropłytek i urządzenia wytrząsającego ze stacją roboczą automatyzacji. Protokół ten w szczególności demonstruje przydatność Lustro do badań przesiewowych różnych konstruktów optogenetycznych zintegrowanych z drożdżami S. cerevisiae ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez R35GM128873 grantów National Institutes of Health oraz granty National Science Foundation 2045493 (przyznane M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. otrzymała nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund. Projekt Z.P.H. otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego NHGRI dla Programu Szkoleniowego Nauk Genomicznych 5T32HG002760. Doceniamy owocne dyskusje z członkami laboratorium McClean, a w szczególności jesteśmy wdzięczni Kieranowi Sweeneyowi za udzielenie komentarzy do manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-dołkowa szklana płyta dolna z  #1,5 szklaną pokrywąCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (wytrząsarka grzałki)QINSTRUMENTS
Stacja robocza Fluent AutomationTecan
LITOS (alternatywne urządzenie oświetleniowe)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (urządzenie oświetleniowe)Bugaj i in. Protokoły natury. 2019
Zrobotyzowane ramię chwytakaTecan
Spark (czytnik płytek)Tecan
Synthetic Complete MediaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (aplikacja ostrzegająca użytkownika)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homologia Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologia  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, homologia Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  3. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
  4. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  5. Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
  6. Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
  7. Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
  8. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  9. Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139(2022).
  10. Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  11. Dunlop, M. J. A supplemental guide to building the optoPlate-96. , https://www.protocols.io/view/a-supplemental-guide-to-building-the-optoplate-96-b2vwqe7e (2021).
  12. Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
  13. Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
  14. Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
  17. YPD media. 2010 (9), Cold Spring Harbor Protocols. (2010).
  18. Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), Cold Spring Harbor. (2016).
  19. Csibra, E., Stan, G. -B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
  20. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363(2016).
  21. Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808(2022).
  22. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  23. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  24. Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363(2022).
  25. Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
  26. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
  27. Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
  28. Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268(2023).
  29. Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic SystemsHigh Throughput ScreeningLaboratory AutomationLight StimulationYeast OptogeneticsSaccharomyces CerevisiaePlate ReaderRobotic AutomationGene Expression ControlFluorescence Measurement

Related Articles