Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki rzęsate ślimaka są receptorami czuciowymi układu słuchowego. Komórki te znajdują się w narządzie Cortiego, narządzie zmysłu odpowiedzialnym za słuch, w błędniku kostnym ucha wewnętrznego. Komórki rzęsate ślimaka składają się z dwóch anatomicznie i funkcjonalnie odrębnych typów: zewnętrznych i wewnętrznych komórek rzęsatych. Uszkodzenie któregokolwiek z nich powoduje utratę słuchu. Zwłaszcza, że wewnętrzne komórki rzęsate nie mogą się zregenerować, a ich uszkodzenie jest trwałe. W związku z tym hodowla in vitro pierwotnych komórek rzęsatych jest niezbędna do zbadania ochronnego lub regeneracyjnego działania komórek rzęsatych ślimaka. Badanie to miało na celu odkrycie metody izolowania i hodowli mysich komórek rzęsatych.
Po ręcznym usunięciu bocznej ściany ślimaka, nabłonek słuchowy został skrupulatnie wypreparowany z modiolusa ślimakowego pod mikroskopem, inkubowany w mieszaninie składającej się z 0,25% trypsyny-EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C, i delikatnie zawieszony w pożywce hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μL. Zawiesinę komórkową przepuszczono przez filtr komórkowy, filtrat odwirowano, a komórki hodowano na płytkach 24-dołkowych. Komórki rzęsate zidentyfikowano na podstawie ich zdolności do ekspresji kompleksu mechanotransdukcji, miozyny-VIIa, który bierze udział w napięciach motorycznych, oraz poprzez selektywne znakowanie F-aktyny za pomocą falloidyny. Komórki osiągnęły >90% konfluencji po 4 dniach w hodowli. Metoda ta może poszerzyć naszą wiedzę na temat cech biologicznych komórek rzęsatych hodowanych in vitro i wykazać skuteczność hodowli komórek rzęsatych ślimaka, tworząc solidne podstawy metodologiczne dla dalszych badań słuchowych.
Wprowadzenie
Komórki rzęsate ślimaka odgrywają ważną rolę w wykrywaniu dźwięku i przekazywaniu sygnału do nerwu słuchowego. Komórki rzęsate to komórki mechanistyczne, które działają jako podstawowe receptory czuciowe i przekształcają wibracje dźwiękowe w sygnały elektryczne u kręgowców. Nabłonek czuciowy ucha wewnętrznego ssaków składa się z jednego rzędu wewnętrznych komórek rzęsatych i trzech rzędów zewnętrznych komórek rzęsatych. W różnych podstawowych obszarach błony rzęsatej komórki rzęsate odbierają dźwięki o różnych częstotliwościach (od 20 do 2 000 Hz)1. Funkcją zewnętrznych komórek rzęsatych jest aktywny proces mechanicznego wzmacniania, który pomaga precyzyjnie dostroić ucho wewnętrzne ssaków, nadając im wysoką wrażliwość na dźwięk. Wewnętrzne komórki rzęsate są odpowiedzialne za wykrywanie dźwięków. Po stopniowej depolaryzacji informacja akustyczna jest przekazywana do mózgu przez słuchowe włókna nerwowe2.
Utrata słuchu może być spowodowana wadami genetycznymi, starzeniem się, hałasem, urazami lub nadmiernym stosowaniem leków ototoksycznych, które stanowią poważny problem zdrowotny na całym świecie3,4. Ubytek słuchu wynika głównie z nieodwracalnego uszkodzenia komórek rzęsatych5. Jeśli chodzi o ubytek słuchu spowodowany hałasem, chociaż naukowcy osiągnęli konsensus co do kilku szczegółów dotyczących jego etiologii, brakuje pełnego zrozumienia wielu mechanizmów leżących u jego podstaw. Zewnętrzne komórki rzęsate są szczególnie podatne na nadmierną ekspozycję akustyczną6. Mechanowrażliwe komórki rzęsate ślimaka biorą udział w ubytku słuchu związanym z wiekiem; Jednak mechanizmy molekularne i komórkowe leżące u podstaw degeneracji komórek rzęsatych pozostają nieznane. Kilka zmian w procesach molekularnych prowadzi do starzenia się komórek rzęsatych, stresu oksydacyjnego, odpowiedzi na uszkodzenie DNA, autofagii oraz rozregulowania ekspresji i transkrypcji genów związanych ze specjalizacją komórek rzęsatych7.
Ponieważ ucho wewnętrzne jest zamknięte w kości skroniowej, głęboko w najtwardszej kości ciała, jest eksperymentalnie niedostępne, co stanowi wyzwanie dla badań nad mechanizmami naprawy i regeneracji komórek rzęsatych. W związku z tym tworzenie kultur in vitro w celu zbadania funkcji komórek rzęsatych stało się idealną metodą badań nad mechanizmami regeneracji i uszkodzeń ucha wewnętrznego. Procedury przygotowania organotypowych kultur ślimakowych zostały opisane we wcześniejszych badaniach8,9,10. Badacze na całym świecie stosują różne techniki mikrodysekcji ślimaka i przygotowania powierzchni. Pomimo utrzymujących się wyzwań, w warunkach in vitro udało się stworzyć różne pierwotne systemy hodowli komórek rzęsatych. Hodowle narządów ślimakowych zawierają różne typy komórek, w tym komórki rzęsate, komórki Deitera, komórki Hensena, komórki filarowe i włókna nerwu słuchowego. Dogłębne zrozumienie zmian w komórkach rzęsatych na poziomie komórkowym i molekularnym po urazie umożliwi opracowanie bardziej zaawansowanych narzędzi badawczych. Badanie to miało na celu zademonstrowanie etapów izolowania narządów ślimakowych od nowonarodzonych myszy i enzymatycznego odłączania obfitych komórek rzęsatych do badań in vitro. Charakter hodowanych komórek potwierdzono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone (nr 2021-847) przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Xi'an Jiaotong.
1. Sterylizacja i przygotowanie materiału
- Wysterylizuj narzędzia preparacyjne za pomocą dezynfekcji parowej w wysokiej temperaturze i pod wysokim ciśnieniem i wysusz je przez noc w inkubatorze o temperaturze 50 °C.
- Przygotować wcześniej 100 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10 mg/ml penicyliny/streptomycyny (dodać 10 ml FBS i 10 μl roztworu podstawowego penicyliny do 90 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (EMEM) firmy Dulbecco i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Wypreparowanie i usunięcie kości skroniowej w celu pobrania nabłonka słuchowego
- Poddaj eutanazji łączną liczbę 10 nowonarodzonych myszy (w wieku od P3 do P5) poprzez ścięcie głowy na lodzie. W razie potrzeby należy zastosować alternatywną, etycznie zatwierdzoną metodologię.
- Przytrzymaj głowę na miejscu, otwórz skórę głowy wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą mikronożyczek operacyjnych, a następnie oddziel i przymocuj skórę głowy obustronnie palcami, jak pokazano na Rysunek 1A.
- Usuń mózg za pomocą małego podnośnika okostnej i przetnij czaszkę podstawną. Przetnij czaszkę nożyczkami i odwróć się do przodu, aby otworzyć czaszkę; Użyj czubka nożyczek, aby zeskrobać mózg i odsłonić podstawę czaszki.
- Obserwuj obustronne kości skroniowe u podstawy czaszki (Ryc. 1C). Użyj nożyczek, aby przeciąć podstawę czaszki wzdłuż linii środkowej, zeskrob skórę i usuń wszelkie zbędne kości (Rysunek 1D,D').
- Zachowaj i przenieś kości skroniowe na sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające świeży zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) (Ryc. 1E).
- Użyj dwóch #5-punktowych kleszczy, aby usunąć pęcherz i otaczającą tkankę z części skalistej kości skroniowej (Rysunek 1E).
UWAGA: Na tym etapie błędnik kostny w kości skroniowej myszy nie byłby całkowicie zwapniały i można by go łatwo wypreparować za pomocą kleszczy. - Przytrzymaj kleszcze jedną ręką, aby zamocować półkolistą część kości skroniowej, a drugą ręką wbij dolną stopę kleszczy w okrągłą niszę okienną, aby oddzielić boczną kość ślimaka od przedsionka scala. Ostrożnie usuń skalistą część kości skroniowej, nie dotykając nabłonka OC. Następnie ostrożnie oddziel i usuń kostny błędnik ślimaka od podstawnego końca do końca wierzchołkowego (Ryc. 1F).
- Ostrożnie odizoluj narząd nabłonka czuciowego Cortiego od modiolusa za pomocą kleszczy #5-punktowych (Rysunek 1G).
- Przytrzymaj więzadło spiralne, ostrożnie oddziel je od rozstępu naczyniowego za pomocą mikrokleszczyków operacyjnych i przenieś czysty nabłonek słuchowy do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 3 mm zawierającego HBSS za pomocą pipety o pojemności 200 μl (Rysunek 1H).
- Zbierz 20 próbek od każdego zwierzęcia i szybko przenieś je na sterylną szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą HBSS do następnego etapu przygotowania (Rysunek 1).
3. Dezagregacja enzymatyczna w celu uzyskania słuchowych komórek rzęsatych
- Przenieść nabłonek słuchowy do 10 ml świeżego DMEM zawierającego 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 minut.
- Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl delikatnie oddzielić komórki rzęsate od blaszki podstawnej i innych komórek pod mikroskopem operacyjnym.
- Dodaj kolejne 10 ml pożywki hodowlanej, aby zahamować dezagregację.
- Przefiltrować zawieszone komórki w pożywce przez filtr 70 μm, zebrać filtrat do czystej probówki o pojemności 50 ml i odwirować go przy 300 × g przez 5 minut.
- Zawiesić komórki rzęsate w co najmniej 5 ml pożywki hodowlanej, delikatnie pipetując je w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Unikaj wprowadzania bąbelków.
- Umieść wcześniej szkiełko nakrywkowe na dnie płytki sześciodołkowej. Policz komórki i hoduj je w gęstości 106 komórek/ml na płytkach sześciodołkowych.
- Hoduj przylegające komórki w 2 ml DMEM (zawierającym 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zmieniaj pożywkę każdego dnia.
UWAGA: Należy wspomnieć, że stosowanie tego protokołu nie prowadzi do uzyskania czystych komórek rzęsatych. Opierając się na tej pierwotnej metodzie hodowli komórek, zalecamy użycie komórek d2 lub d3 do dalszych badań, ponieważ komórki rzęsate mogą stanowić około 70% komórek w hodowli i być w dobrym stanie.
4. Barwienie immunofluorescencyjne
- Zebrać wyhodowane komórki od d1 do d6 (jeden dołek dziennie). Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
- Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Usunąć utrwalacz i płukać komórki przez 3 x 3 minuty za pomocą PBS.
- Przepuszczalność komórek za pomocą PBS zawierającego 0,2% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować permeabilizowane komórki z roztworem blokującym składającym się z 10% FBS w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Wybarwić komórki przeciwciałem monoklonalnym anty-miozyny (rozcieńczonym w stosunku 1:200 w PBS) w temperaturze 4 °C przez noc.
- Przemyj komórki 3x sterylnym PBS i inkubuj je z przeciwciałem drugorzędowym (Alexa Fluor 594 kozia anty-królicza MYO7A, rozcieńczona 1:500 w PBS) i falloidyną znakowaną fluoresceiną (Alexa Fluor 488, w celu identyfikacji struktury komórki) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Przepłucz komórki 3x PBS, aby usunąć przeciwciała drugorzędowe.
- Dodaj 1-2 krople podłoża montażowego z DAPI na szkiełka, zamontuj szkiełka nakrywkowe i umieść je pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym, aby zrobić zdjęcia komórek.
5. Analiza statystyczna
- Wykonaj dwukierunkową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy post hoc Tukey'a, aby przeanalizować zmiany wartości szarości miozyny-VIIa i falloidyny w czasie. Użyj metody oznaczania literowego, aby oznaczyć różnice statystyczne.
- Wykonaj dodatkowe jednokierunkowe ANOVA a następnie testy post-hoc Tukeya, aby porównać stosunek komórek faloidyno-dodatnich między próbkami komórek od dnia 1 do dnia 6 oraz stosunek komórek dodatnich miozyny VII w tych samych dniach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Postępując zgodnie z tym protokołem, dokonaliśmy wysiewu wyizolowanych komórek. Wysiew pierwotnych komórek rzęskowych ślimaka uznano za udany, jeśli komórki nie pływały w pożywce hodowlanej i rozprzestrzeniły się w ciągu 24 h. Liczbę komórek rzęskowych określono po ich przytwierdzeniu i rozprzestrzenieniu się w formie płaskich agregatów na dnie naczynia. Po 1 dniu żywe komórki rzęskowe były silnie przylegające do dna naczynia hodowlanego, a komórki nieprzylegające usunięto poprzez płukanie PBS. Zazwyczaj liczba komórek p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W porównaniu z linią komórkową HEI-OC1, pierwotne hodowle komórek rzęsatych dokładniej odwzorowywały stan fizjologiczny komórek in vivo. W związku z tym metoda pierwotnej hodowli słuchowej opracowana poprzez izolację żywych komórek z narządów ślimakowych i natychmiastowe ich wyhodowanie wydaje się być cennym narzędziem do szeroko zakrojonych badań nad układem słuchowym. Pewne techniki mają kluczowe znaczenie dla udanej kultury. Po pierwsze, zminimalizowanie czasu separacji narządu Cortiego od kości skroniowej zwiększa pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NFSC 82101224 YG). Autorzy serdecznie dziękują dr Teru Kamogashira, MD, PhD (Zakład Otolaryngologii-Chirurgii Głowy i Szyi, Wydział Lekarski, Uniwersytet Tokijski, Japonia) za jego krytyczne intelektualne wskazówki i koncepcyjny wkład w to badanie. Pierwotne ramy badawcze zostały opracowane pod jego kierunkiem, a jego spostrzeżenia głęboko ukształtowały kierunek tej pracy. Jesteśmy głęboko wdzięczni za jego nieustające wsparcie akademickie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 mm BioLite naczynie do hodowli komórkowych | Thermo Fisher Scientific | 130182 | do hodowli |
| 35 mm Naczynie do hodowli komórek Nunc | Thermo Fisher Scientific | 150318 | do hodowli |
| 6-dołkowe podniebienie | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | do hodowli |
| 70 &mikro; m sitka komórkowe | BD Company | 352350 | z zastosowaniem do |
| filtra Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | barwienie immunofluorescencyjne |
| Anty-królicze IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | barwienie immunofluorescencyjne |
| dzień 3-5 mysi noworodek | dostarczone przez Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco" s Zmodyfikowany Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific 11965092 | używany do hodowli | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | do hodowli |
| Kleszcze | Dumont | 5# | używanie do preparacji |
| mikroskop anatomiczny Leica | Niemcy | S9i | używany do preparacji |
| Penicylina/streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | zastosowanie do hodowli |
| Sklejka królika do Myosin VIIa | Firma Abcam | ab92996 | barwienie immunofluorescencyjne |
| Nożyczki | Belevor | 10cm/04.0524.10 | używane do rozwarstwiania |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | barwienie immunofluorescencyjne |
| Trypsyna | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | stosowania do hodowli |
Bibliografia
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385(2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665(2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170(2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342(2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046(2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119(2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
