Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organoidy nerkowe mogą być generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) za pomocą różnych metod. Te organoidy są bardzo obiecujące w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku procedurę tworzenia organoidów nerkowych z iPSC, począwszy od tylnej prążka pierwotnej (PS) do mezodermy pośredniej (IM). Podejście to opiera się na pożywce APEL 2, która jest zdefiniowaną, wolną od składników pochodzenia zwierzęcego. Jest uzupełniany wysokim stężeniem agonisty WNT (CHIR99021) przez okres 4 dni, a następnie czynnikiem wzrostu fibroblastów 9 (FGF9)/heparyną i niskim stężeniem CHIR99021 przez dodatkowe 3 dni. Podczas tego procesu kładzie się nacisk na wybór optymalnej gęstości komórek i stężenia CHIR99021 na początku iPSC, ponieważ czynniki te mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytwarzania organoidów nerkowych. Ważnym aspektem tego protokołu jest hodowla zawiesiny w płytce o niskiej przyczepności, co pozwala IM stopniowo przekształcać się w struktury nefronowe, obejmujące kłębuszkowe, proksymalne rurkowe i dystalne struktury rurkowe, wszystkie przedstawione w wizualnie zrozumiałym formacie. Ogólnie rzecz biorąc, ten szczegółowy protokół oferuje wydajną i specyficzną technikę wytwarzania organoidów nerkowych z różnych iPSC, zapewniając pomyślne i spójne wyniki.
Wprowadzenie
Nerka odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu fizjologicznej homeostazy, w zależności od jej jednostki funkcjonalnej. Nefrony, które wydalają produkty przemiany materii, mogą regulować skład płynów ustrojowych. Przewlekła choroba nerek (PChN), spowodowana dziedzicznymi mutacjami lub innymi czynnikami wysokiego ryzyka, ostatecznie przekształci się w schyłkową niewydolność nerek (ESKD)1,2. ESKD jest najwyraźniej spowodowane ograniczoną zdolnością regeneracji nefronów. W związku z tym konieczna jest terapia nerkozastępcza. Ukierunkowane różnicowanie ludzkich iPSC umożliwia generowanie in vitro specyficznych d....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Materiały iPS użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane z komercyjnego źródła. Komórki utrzymywano za pomocą pożywki mTeSR na dostępnych na rynku płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (patrz Tabela materiałów). Tabela 1 zawiera wszystkie kompozycje pożywek wykorzystanych w badaniu.
1. Poszycie iPSC dla różnicowania i indukowania tylnych prążków pierwotnych (PS)
- Przemyć iPSC na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą membranową za pomocą 2 ml DPBS. Zassać DPBS za pomocą pipety.
- Dodać 1 ml dostępnego w handlu roztworu do oddzielania komórek (patrz tabela mater....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Produkcję IM uzyskuje się poprzez aktywację kanonicznego szlaku sygnałowego WNT przy użyciu inhibitora GSK3 CHIR99021, a następnie FGF9/heparyną. Od dnia 0 do dnia 4 iPSCs szybko namnażają się i przyjmują kształty romboidalne lub trójkątne. Konfluencja osiąga 90%-100% i narasta równomiernie aż do dnia 7. W hodowli zawiesinowej, po dysocjacji w dniu 7, agregaty spontanicznie tworzą struktury nefronowe. Organoidy nerek wytworzone w hodowli zawiesinowej wykazują struktury rurkowe, które są łatwo widoczne w obrazach w świetl.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano szczegółowy protokół generowania organoidów nerkowych z iPSC, obejmujący niewielkie modyfikacje podłoża podstawowego, początkowej gęstości komórek i stężenia CHIR99021. W różnych eksperymentach stwierdzono, że krytycznymi czynnikami dla pomyślnego wytworzenia organoidów nerkowych są początkowe różnicowanie mezodermy pośredniej (IM) i stan komórki w dniu 7. Co więcej, różne linie iPSC wykazywały różnice w potencjale proliferacji i różnicowania komórek, co skutkowało różnymi optymalnymi gęstościami komórek i stężen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłosili potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Jesteśmy niezmiernie wdzięczni wszystkim członkom Mao i Hu Lab, byłym i obecnym, za interesujące dyskusje i wielki wkład w projekt. Dziękujemy Narodowemu Centrum Badań Klinicznych nad Zdrowiem Dziecka za ogromne wsparcie. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidana Hu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (nr 1). LQ22C070004 do Lidan Hu) oraz Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (dotacje nr. BK20210150 do Gang Wang).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 96 Płytka do hodowli komórkowych dołków, płaskodenna | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Przeciwciała | |||
| Alkohol benzylowy | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzoesan benzylu | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Kot Haier | #HR40  A2 | |
| Biotyna anty-ludzka LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Komórki jednojądrzaste krwi hiPS-B1 (iPSc, samica) | N/A | N/A | |
| Wytrząsarka poziomu dwutlenku węgla | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemikalia, peptydy i białka | |||
| CHIR99021 (aktywator szlaku Wnt) | STEMCELL Technologie | Cat #72054 | |
| Costar Wielokrotna 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6-dołkowa płytka | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| Roztwór do barwienia DAPI | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Surowica osła stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Inkubator do suchej kąpieli | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Koza IgG Anty-Królika (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Koza IgG Anty-Królika (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Koza IgG Anty-Królika (1:400) | Kot Earthox | #E032620 | |
| Modele eksperymentalne: Linie komórkowe | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Inkubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Naczynia hodowlane ze szklanym dnem | NEST | Kot #801002 | |
| Koza anty-ludzka CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Roztwór heparyny (suplement do hodowli komórkowych) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Ludzki rekombinowany FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Mikroskop odwrócony | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Mikrowirówka | |||
| HENGNUO | Kot #2-4B | ||
| Mysz anty-ludzka CD31 (1:300) | BD Biosciences | Kot #555444 | |
| Mysz anty-ludzka ECAD (1:300) | BD Biosciences | Kot #610182 | |
| Mysz anty-ludzka Integryna beta 1 (1:300) | Abcam | Kot #ab30394 | |
| Mysz anty-ludzka MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Kot #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Alkohol poliwinylowy 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Suplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc Fiolki CryoTube | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Inne | |||
| Królik anty-ludzki GATA3 (1:300) | Technologia sygnalizacji komórkowej | Kot #5852S | |
| Królik anty-ludzki LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Królik anty-ludzki Synaptopodin (1:300) | Abcam | Kot #ab224491 | |
| Królik anty-ludzki WT1 (1:300) | Abcam | Kot #ab89901 | |
| Królik anty-mysz PDGFR (1:300) | Kot Abcam | #ab32570 | |
| Rekombinowana albumina surowicy ludzkiej (rHSA) | YEASEN | Kot #20901ES03 | |
| Owca anty-ludzki NPHS1 (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptawidyna Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (dichlorowodorek) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Bibliografia
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
