Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapnia w stymulowanych elektrycznie płaskich siatkówkach

DOI:

10.3791/65705

⸱

18 sierpnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Ciències Fotòniques (ICFO), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2), CSIC and BIST, Campus UAB, 3Institut de Física d'Altes Energies (IFAE), The Barcelona Institute of Science and Technology, Campus UAB, 4Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protezy siatkówki mają zdolność generowania percepcji wzrokowej. Aby przyspieszyć rozwój nowych protez, potrzebne są metody ex vivo do testowania urządzeń przed implantacją. W tym artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki poddanych stymulacji elektrycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dystrofie siatkówki są główną przyczyną ślepoty na całym świecie. Trwają intensywne prace nad opracowaniem zaawansowanych protez siatkówki, które mogą ominąć upośledzone komórki fotoreceptorów światłoczułych w zdegenerowanej siatkówce, mając na celu częściowe przywrócenie wzroku poprzez indukcję percepcji wzrokowej. Jednym z powszechnych kierunków badań jest projektowanie i produkcja wszczepialnych urządzeń o elastycznej strukturze fizycznej, zawierających dużą liczbę elektrod. Umożliwia to sprawne i precyzyjne generowanie percepcji wizualnych. Jednak wraz z każdym postępem technologicznym pojawia się zapotrzebowanie na niezawodną i łatwą w obsłudze metodę ex vivo w celu weryfikacji funkcjonalności urządzenia przed przejściem do eksperymentów in vivo, w których w grę wchodzą czynniki wykraczające poza działanie urządzenia. W artykule przedstawiono kompleksowy protokół badania aktywności wapnia w warstwie komórek zwojowych siatkówki (GCL) po stymulacji elektrycznej. W szczególności przedstawiono następujące kroki: (1) fluorescencyjne znakowanie siatkówki szczura za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, (2) przechwytywanie sygnału fluorescencji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy zastosowaniu wyraźnych wzorców stymulacji elektrycznej oraz (3) ekstrakcja i analiza śladów wapnia z poszczególnych komórek w GCL. Postępując zgodnie z tą procedurą, naukowcy mogą skutecznie testować nowe protokoły stymulacji przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka zawiera fotoreceptory, które są komórkami odpowiedzialnymi za wykrywanie światła. Wychwytują fotony i przekształcają je w impulsy nerwowe. Impulsy te są następnie przetwarzane w siatkówce i przekazywane do kory wzrokowej, co skutkuje powstaniem obrazu wizualnego1. Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) to choroby zwyrodnieniowe charakteryzujące się postępującą utratą fotoreceptorów. Te retinopatie są jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie1, dotykając miliony osób i powodując znaczące konsekwencje medyczne, osobiste i społeczno-ekonomiczne dla pacjentów, systemów opieki zdrowotnej i społeczeństwa jako całości. Co więcej, wraz ze starzeniem się populacji przewiduje się, że liczba przypadków AMD wzrośnie o 15% do 2050 roku2.

Obecnie prowadzone są liczne badania mające na celu przywrócenie wzroku pacjentom dotkniętym tymi schorzeniami3. Jednym z obiecujących podejść jest zastosowanie protez siatkówki, które wykazały skuteczność w częściowym przywracaniu wzroku4,5. Urządzenia te wychwytują światło ze sceny wizualnej i przekształcają je w impulsy elektryczne. Impulsy te są dostarczane przez elektrody w układzie mikroelektrod (MEA) wszczepionym do oka, stymulując neurony, które przeżyły, i omijając funkcję utraconych fotoreceptorów. Aktywowane komórki zwojowe siatkówki (RGC) przekazują dane wyjściowe do mózgu, gdzie są interpretowane jako percepcja wzrokowa. Jednak główne ograniczenia obecnych implantów leżą w rozdzielczości interfejsu elektroda-tkanka6 oraz nieselektywnej stymulacji różnych typów komórek. Dlatego, aby zoptymalizować konstrukcję nowych urządzeń wszczepialnych w celu bardziej efektywnego przywracania wzroku, kluczowe jest zrozumienie, w jaki sposób można opracować paradygmaty stymulacji w celu selektywnej aktywacji komórek w bliskiej odległości od elektrod.

Obrazowanie wapnia jest powszechnie stosowaną techniką badania aktywności neuronalnej, oferującą kilka zalet w porównaniu z metodami nieoptycznymi7,8. Po pierwsze, zapewnia rozdzielczość komórkową i subkomórkową. Po drugie, markery wapnia mogą być ukierunkowane na określone typy komórek. Po trzecie, pozwala na długoterminowe śledzenie, a po czwarte, umożliwia obserwację całych populacji komórek przy jednoczesnym rozróżnieniu komórek aktywnych i nieaktywnych. Metoda ta dostarcza pośrednich dowodów na aktywność komórkową z rozdzielczością czasową w zakresie setek milisekund. Genetycznie kodowane fluorescencyjne wskaźniki wapnia, takie jak czujniki GCaMP, ulegają zmianie konformacyjnej po związaniu z wapniem, co skutkuje zwiększoną fluorescencją9. Rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) są skutecznym sposobem transdukcji komórek siatkówki za pomocą GCaMP10.

Ten protokół przedstawia efektywną metodę, która wykorzystuje obrazowanie wapnia do testowania protokołów stymulacji implantów siatkówki. W szczególności koncentrujemy się na tkance siatkówki szczura ex vivo i zapewniamy szczegółowe instrukcje krok po kroku, od pobrania próbki po analizę danych. Oferując ten obszerny przewodnik, naukowcy z różnych środowisk mogą bez obaw rozpocząć eksperymenty ze stymulacją elektryczną.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardowymi wytycznymi etycznymi dla zwierząt (Dyrektywa Wspólnot Europejskich 86/609/UE) i zatwierdzone przez lokalne komisje etyczne ds. zwierząt. Do niniejszego badania wykorzystano 8-tygodniowe szczury rasy Long Evans. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie nośników i montaż płaski

  1. Podłoże Amesa (1 L)
    1. W szklanej butelce o pojemności 1 l wymieszaj proszek Ames' Medium, 1,9 g/l NaHCO3, 10 ml penicyliny/streptomycyny 100x i 1 l wody dejonizowanej (patrz tabela materiałów). Dostosuj pH do 7,4, a osmolarność do 280 mOsm za pomocą wody dejonizowanej lub NaHCO3. Wysterylizuj roztwór, filtrując go przez filtr o wielkości porów 0,2 μm pod kapturem.
      UWAGA: Wysterylizowane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie pozostaje stabilne i może być używane przez okres do 1 miesiąca.
  2. Membrany montażowe
    1. Przymocuj jedną porowatą membranę PTFE (patrz Tabela materiałów) do podkładki za pomocą małych kropli kleju. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 15 minut.
    2. Aby uzyskać przezierność, zanurz membrany w 70% etanolu na 1 minutę.
    3. Przepłucz membrany dwukrotnie wodą dejonizowaną, aby całkowicie usunąć etanol. Przechowuj je w wodzie dejonizowanej, aby zapobiec zmętnieniu.

2. Oznakowanie GCL i płaski montaż siatkówki szczura

UWAGA: Ta metoda etykietowania nie odróżnia RGC od przemieszczonych komórek amakrynowych. Jeśli pożądane jest selektywne znakowanie RGC, rozważ użycie AAV z promotorami specyficznymi dla RGC11 i/lub wstecznym znakowaniem przez nerw wzrokowy12. Aby rozróżnić klasy RGC ON- i OFF-center, sklasyfikuj RGC na podstawie ich reakcji na światło13,14 i wykorzystaj nowsze wersje genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, które oferują zwiększoną czułość i możliwość pomiaru potencjałów pojedynczej czynności15.

  1. Iniekcja doszklistkowa
    1. Znieczulić 8-tygodniowego szczura rasy Long Evans 2% izofluranem/1%O2 do momentu, aż nie wystąpi odruch pedałowania, i utrzymać znieczulenie za pomocą maski nosowej dla szczurów (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Podczas znieczulenia ułóż zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała.
    2. Podać jedną kroplę dostępnych w handlu kropli do oczu (patrz Tabela Materiałów) w celu rozszerzenia źrenicy.
    3. Przed przystąpieniem do operacji należy zbadać oko pod kątem nieprawidłowości za pomocą dna oka i optycznej koherentnej tomografii (OCT) z systemem obrazowania siatkówki in vivo. Nałóż jedną kroplę Methocel 2%, aby ułatwić kontakt rogówki z obiektywem (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Jeśli zostaną wykryte jakiekolwiek nieprawidłowości, nie wykonuj kolejnych kroków dla tego oka.
    4. Zastosuj jedną kroplę Prescaine jako środek znieczulający miejscowo. Przymocuj powiekę i spojówkę rąbkową za pomocą dostępnego w handlu włókna do szwów (patrz Tabela materiałów). Wykonać sklerotomię 1 mm 4 mm od rąbka za pomocą igły 30 G.
      1. Przymocować igłę o sile 36 G do precyzyjnej strzykawki i wstrzyknąć cząstki AAV niosące genetycznie zakodowany wskaźnik wapnia do ciała szklistego przez 30 sekund, pod kątem 45°. W tym badaniu użyliśmy AAV2-CAG-GCaMP5G (7,5 x 1011 GC/ml w HBSS) (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: Konstrukty AAV, które nie kodują potencjalnie rakotwórczych produktów genowych lub cząsteczek toksyn i są wytwarzane bez wirusa pomocniczego, mogą być przetwarzane w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1). W przeciwnym razie, jeśli zostanie uznany za materiał niebezpieczny biologicznie w ramach BSL-2, należy podjąć odpowiednie środki ostrożności16. Kodowanie AAV dla GCaMP jest uważane za BSL-1 i nie wymaga manipulacji w szafach bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Stosować jedną kroplę leku Tobradex (patrz Tabela Materiałów) w celu zapobiegania stanom zapalnym i jako profilaktyka antybiotykowa.
    6. W razie potrzeby powtórz kroki 2, 3 i 4 z drugim okiem.
      UWAGA: Sprawdź zwierzęta 12-24 godziny po zabiegu, aby upewnić się, że nie ma żadnych działań niepożądanych.
    7. Trzy dni po wstrzyknięciu należy zbadać strukturę siatkówki za pomocą dna oka i OCT za pomocą systemu obrazowania siatkówki in vivo (patrz tabela materiałów).
    8. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu GCL powinien wydzielać fluorescencję. Ocena struktury siatkówki i ekspresji AAV za pomocą fluorescencyjnej dna oka przy użyciu systemu obrazowania siatkówki in vivo.
      UWAGA: Według Weitz et al.12, fluorescencja z AAV2-CAG-GCaMP5G staje się zauważalna po 1 tygodniu od wstrzyknięcia i nasila się po 2 tygodniach. Począwszy od czwartego tygodnia, nadekspresja GCaMP indukuje cytochorobowość. Umierające komórki wykazują wysoki wyjściowy sygnał fluorescencyjny w jądrze i cytoplazmie, który nie ulega wahaniom w odpowiedzi na stymulację. W zdrowych komórkach ekspresja GCaMP jest ograniczona do cytoplazmy i wykluczona z jądra7,8,12,17,18. Cechy te można zaobserwować ex vivo podczas obrazowania mikroskopowego. Okno ekspresji genów może się różnić w zależności od wektora wirusowego i wybranego promotora.
  2. Wycięcie siatkówki i montaż płaski
    UWAGA: Dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu, szczury, którym wstrzyknięto dożytkowo, są poddawane eutanazji bezpośrednio przed rozpoczęciem protokołu elektrofizjologicznego, zgodnie ze standardowymi wytycznymi etycznymi (dyrektywa Wspólnot Europejskich 86/609/UE) i zatwierdzone przez lokalne komisje etyczne. Wdychanie dwutlenku węgla (CO2 ) jest stosowane jako metoda eutanazji w tym protokole.
    1. Wyłuszczenie oka
      1. Delikatnie dociśnij zewnętrzną stronę oczodołu za pomocą pary zakrzywionych kleszczy, aby lekko wystawać oko z oczodołu.
      2. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć mięśnie trzymające oko i wyłuszczyć je, uważając, aby nie przebić gałki ocznej.
        UWAGA: Zaczynając od tego kroku, przeprowadź sekcję siatkówki pod mikroskopem stereoskopowym w natlenionym (95% O2 / 5% CO2) pożywce Amesa.
    2. Wycięcie siatkówki
      1. Użyj pary małych zakrzywionych kleszczyków i cienkich nożyczek sprężynowych, aby usunąć całą otaczającą tkankę z gałki ocznej.
      2. Weź kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach około 3 cm x 3 cm i umieść go na pokrywce naczynia o średnicy 3,5 cm. Namocz papier pożywką Amesa.
      3. Umieść gałkę oczną na papierze, tak aby przedni segment był skierowany w stronę operatora. Użyj pary prostych kleszczy, aby przytrzymać gałkę oczną, umieszczając je na górze ora serrata pod kątem około 45° od powierzchni naczynia. Wykonaj małe cięcie ostrzem, wykorzystując przestrzeń między prostymi kleszczami jako odniesienie.
      4. Zwróć uwagę na gałkę oczną do Medium Amesa. Użyj prostych kleszczy i cienkich nożyczek sprężynowych, aby oddzielić przedni i tylny segment oka.
      5. Ostrożnie zdejmij soczewkę za pomocą dwóch par prostych kleszczy. Następnie oddziel siatkówkę od twardówki.
      6. Przetnij twardówkę w kierunku nerwu wzrokowego za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej.
      7. Użyj stereoskopowego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zidentyfikować obszar siatkówki o najlepszym wskaźniku wapnia.
        UWAGA: Zakres rozprzestrzeniania się wirusa zależy od powodzenia wstrzyknięcia do ciała szklistego. Osiągnięcie fluorescencji w dużych częściach siatkówki może wymagać praktyki. Doświadczenie badacza odgrywa kluczową rolę w uzyskiwaniu optymalnych wyników.
      8. Za pomocą plastikowej pipety z odciętą końcówką przenieś wybrany fragment siatkówki na membranę montażową (etapy montażu membran). Użyj pary prostych kleszczy, aby płasko zamontować siatkówkę z GCL skierowanym do góry.
      9. Za pomocą plastikowej pipety przymocowanej do końcówki pipety o pojemności 100 μl usuń pożywkę, aby umożliwić przyleganie elementu siatkówki do porowatej membrany. Odwróć zespół na MEA tak, aby GCL spoczywał na elektrodach.
      10. Wypełnić kąpiel próbki natlenionym roztworem Amesa.

3. Obrazowanie wapnia ex vivo po stymulacji elektrycznej

UWAGA: W tej pracy użyto MEA dowodu koncepcji do eksperymentów ex vivo. Niestandardowe MEA zostały wytworzone z porowatych elektrod na bazie grafenu o średnicy 25 μm na szkle borokrzemianowym o grubości 500 μm ze śladami Ti/Au, a następnie zaizolowane azotkiem krzemu i fotorezystem SU-8 klasa 12. Jednak metody obrazowania wapnia są ważne niezależnie od materiału elektrody użytego do stymulacji.

  1. Ustawić system perfuzyjny w taki sposób, aby natlenione podłoże Amesa stale ukrwiało kąpiel próbki w temperaturze 33 °C przy stałym natężeniu przepływu 5 ml/min.
  2. Za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w lampę fluorescencyjną, kostkę filtra FITC i kamerę CMOS, sprawdź siatkówkę pod kątem obszaru, w którym widoczne są elektrody stymulujące i fluorescencja z komórek wykazujących ekspresję GCaMP. W tym badaniu użyto obiektywu powietrznego 20x NA 0,75.
    UWAGA: Aby skutecznie stymulować (i rejestrować) komórki za pomocą elektrod, siatkówka i elektroda muszą być w bliskim kontakcie. W ten sposób ogniwa znajdują się w widocznej tej samej płaszczyźnie ogniskowej co elektrody. Jeśli tak nie jest, powtórz etapy wycinania siatkówki od kroku 8. W przypadku korzystania z siatkówki ze zdrowych modeli zwierzęcych (z działającymi fotoreceptorami) należy pamiętać, że za każdym razem, gdy lampa fluorescencyjna jest włączana, światło generuje pewne wywołane reakcje, ponieważ siatkówka jest wrażliwa na światło o długości fali używanej do wzbudzania czujnika GCaMP. Te wywołane światłem zmiany wapnia można wykorzystać do oceny stanu zdrowia tkanki. Aby uniknąć mieszania światła z reakcjami wywołanymi elektrycznie, włącz świetlówkę co najmniej 1 minutę przed rozpoczęciem akwizycji obrazu.
  3. Aby wywołać reakcje wywołane elektrycznie w GCL, wybierz elektrodę do wysyłania impulsów sterowanych prądem. Ustaw parametry stymulacji elektrycznej w oprogramowaniu generatora impulsów, takie jak: kształt, amplituda, czas trwania, opóźnienie fazowe i częstotliwość impulsów, które mają być zastosowane.
    UWAGA: Efektywne parametry bodźca mogą się znacznie różnić od szerokości impulsu od 50 μs do 100 ms, przy amplitudach w zakresie od 0,1 μA do 10 μA. Parametry te, wraz z częstotliwością bodźca, polaryzacją bodźca, liczbą impulsów i opóźnieniami międzyfazowymi, mogą wpływać na odpowiedź czasoprzestrzenną obserwowaną przez obrazowanie wapniowe19,20,21,22. Ciąg 40 dwufazowych impulsów dostarczających stymulację 1 ms, 2 μA często generuje widoczną odpowiedź w znakowanych neuronach.
  4. Aby zsynchronizować akwizycję obrazu z dostarczaniem stymulacji, użyj generatora impulsów jako zewnętrznego wyzwalacza do sterowania początkiem akwizycji obrazu. Połącz kamerę (patrz tabela materiałów) z generatorem impulsów za pomocą wyjściowego sygnału wyzwalającego i ustaw "Tryb przechwytywania" w oprogramowaniu kamery na "Zewnętrzny wyzwalacz startowy". Naciśnij przycisk Start w oprogramowaniu aparatu, aby poczekał na uruchomienie zewnętrznego wyzwalacza. Rozpocznij akwizycję obrazu za pomocą oprogramowania generatora impulsów.
    UWAGA: Sterowanie zewnętrznym spustem może być skonfigurowane w różny sposób dla różnych kamer. To badanie zazwyczaj rejestrowało obrazy (512 x 512 pikseli, 16-bitowa skala szarości) z prędkością 10 klatek na sekundę przez 1 minutę, zapewniając jednocześnie impulsy dwufazowych ciągów impulsów co 10 s. Dostarczanie impulsu rozpoczyna się po 10 sekundach, więc pierwsze klatki we wszystkich eksperymentach odpowiadają spontanicznej aktywności. W zależności od czujnika GCaMP i analizy, którą zostanie przeprowadzona, może być konieczne dostosowanie szybkości zapisu zgodnie z czasami narastania i zaniku wskaźnika wapnia8. Weź pod uwagę czułość wykrywania potencjałów czynnościowych pojedynczego wskaźnika wapnia15.
  5. Zapisz obrazy z nazwą pliku, która zawiera zastosowane parametry stymulacji elektrycznej, takie jak [Numer elektrody]_[Amplituda impulsu]_[Czas trwania impulsu]_[Częstotliwość impulsu]_Image001.

4. Analiza danych

  1. ImageJ/FIJI w celu wyodrębnienia profilu intensywności fluorescencji w czasie i współrzędnych przestrzennych z somy komórkowej
    1. Podziel obszar zainteresowania na segmenty (ROI) za pomocą "Narzędzi wyboru obszaru" i dodaj go do Menedżera ROI (Analizuj narzędzia > > Menedżer ROI > Dodaj). Z menu Menedżer ROI zapisz go jako folder .zip (Więcej > Zapisz).
      UWAGA: Zazwyczaj te same ROI można zastosować do wszystkich eksperymentów stymulacyjnych, ponieważ odpowiadają one temu samemu polu widzenia.
    2. Wybierz "Średnią wartość szarości" jako parametr do wyodrębnienia (Analizuj > Ustaw pomiary).
    3. Wyodrębnij "Średnią wartość szarości" z somy komórek, klikając Więcej > wielu miar. Pojawi się okno dialogowe. Włącz opcje Zmierz wszystkie 600 wycinków i Jeden wiersz na wycinek, aby uzyskać pojedynczą tabelę, w której kolumny odpowiadają zwrotom z inwestycji, a wiersze odpowiadają ramom czasowym. Zapisz wygenerowaną tabelę jako .xls arkusz kalkulacyjny.
    4. Wybierz "Centroid" jako parametr do wyodrębnienia (Analizuj > Ustaw pomiary).
    5. Wyodrębnij "Centroid" z ROI, klikając przycisk Zmierz. Wygenerowana tabela odpowiada współrzędnym (X,Y) ROI. Zapisz go jako .xls arkusz kalkulacyjny.
  2. Niestandardowy skrypt do identyfikacji komórek, które reagują na bodźce
    UWAGA: W tym miejscu użyto MATLABA (patrz Tabela materiałów), ale opisane kroki można wykonać w dowolnym języku programowania. Użytkownicy mogą uzyskać nasz niestandardowy skrypt, prosząc o odpowiedniego autora.
    1. Korekcja efektu fotowybielania: Aby złagodzić efekt tła i fotowybielania, weź 15-20 klatek z okresów niestymulujących przed każdą serią i dopasuj je do krzywej liniowej [fit (poly1)].
      UWAGA: W tym przypadku, dla filmu składającego się z 600 klatek, w którym okresowe impulsy były wysyłane co 10 s, klatki 1:90, 170:190, 270:290, 370:390, 470:490, 570:590 zostały uznane za okresy niestymulujące.
    2. Normalizuj za pomocą wzoru: (X-min) / (max-min)
    3. Identyfikacja komórek reagujących
      1. Oblicz średnią kwadratową (RMS) okresów niestymulujących na podstawie znormalizowanych danych. Będzie to traktowane jako sygnał bazowy.
      2. Oblicz maksimum okresów stymulujących (ramy między okresami niestymulującymi). W tym przypadku, dla łącznego filmu składającego się z 600 klatek, w którym okresowe impulsy były wysyłane co 10 sekund, klatki 91:169, 191:269, 291:369, 391:469, 491:569 zostały uznane za okresy stymulujące.
      3. Jeśli maksymalna wartość przekracza sygnał linii bazowej 2,5 raza dla określonego zwrotu z inwestycji, oznacz komórkę jako reagującą na ten okres stymulacji. Jeśli komórka reaguje na trzy z pięciu okresów stymulacji, sklasyfikuj ją jako komórkę reagującą.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym badaniu opiera się na badaniach obrazowania fluorescencyjnego i stymulacji elektrycznej przeprowadzonych przez Weitza i wsp.12. Protokół składa się z trzech głównych części: (1) fluorescencyjnego znakowania GCL i płaskiego montażu siatkówki na MEA ( Rysunek 1 - po lewej), (2) wizualizacji aktywności wapnia w GCL podczas stymulacji elektrycznej ( Rysunek 1 - środkowa) oraz (3) ekstrakcja, przetwarzanie i interpretacja danych obrazowania ( Rysunek 1 - po prawej).

Po pierwsze, jak pokazano w Rysunek 1 - po lewej, szczurom Long Evans wstrzykuje się do ciała szklistego AAV2-CAG-GCaMP5G przed sesją obrazowania. Optymalna ekspresja wirusa dla tego wektora występuje od 2 do 3 tygodni po wstrzyknięciu12,18. Po całkowitym znieczuleniu zwierzęcia wykonuje się otwór pilotowy za pomocą igły 30 G, a następnie powoli wstrzykuje się 5 μl AAV2-CAG-GCaMP5G do ciała szklistego za pomocą igły 36 G przymocowanej do precyzyjnej strzykawki, aby zapobiec refluksowi. Podczas ekspresji wirusa system obrazowania siatkówki in vivo jest używany do oceny stanu siatkówki po operacji, a obrazy OCT zapewniają szczegółową wizualizację warstw siatkówki. Po osiągnięciu ekspresji genów siatkówka jest ostrożnie ekstrahowana z muszli ocznej za pomocą mikroskopu stereoskopowego i precyzyjnych narzędzi preparacyjnych. Od tego momentu tkanka jest manipulowana w natlenionych podłożach w celu zachowania próbki. Wycięta siatkówka, z GCL skierowanym do góry, jest następnie montowana na platformie przeznaczonej do montażu płaskiego, aby zapewnić stabilność i zapobiec unoszeniu się próbki. Próbka jest montowana na powierzchni MEA z GCL skierowanym w stronę elektrod.

Następnie, MEA jest zamontowany na swojej płycie interfejsu na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym (Rysunek 1-środek). Próbka siatkówki jest perfundowana pożywką natlenioną w temperaturze 33 °C przy użyciu systemu perfuzyjnego. Próbka może być utrzymywana w tej konfiguracji przez kilka godzin. Programowany jest żądany schemat stymulacji, a obrazy są pozyskiwane z szybkością 10 klatek na sekundę. Zaleca się nazywanie filmów zgodnie z zastosowanymi parametrami stymulacji elektrycznej. Akwizycja obrazu powinna rozpocząć się przed rozpoczęciem stymulacji, aby uzyskać pewne podstawowe ramy bez stymulacji, które będą służyć jako kontrola negatywna.

Na koniec, jak pokazano w Rysunek 1-po prawej, dane są wyodrębniane z obrazów poklatkowych poprzez segmentację komórek somaty. Efekty fotowybielania są korygowane poprzez dopasowanie danych i identyfikowane są reagujące komórki. Komórki reagujące definiuje się jako te, które mają piki fluorescencji podczas stymulacji, która przekracza ich linię podstawową o 2,5 raza. Jeśli komórka reaguje na trzy z pięciu wybuchów stymulacji, uważa się, że reaguje na ten konkretny ciąg stymulacji.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd badania. Schematyczna ilustracja protokołu (po lewej) fluorescencyjnego znakowania GCL siatkówki i mocowania próbki, (w środku) przygotowania do zapisów ex vivo ze stymulacją elektryczną zapewnianą przez MEA i (po prawej) analizy danych obrazowania wapnia w celu sklasyfikowania komórek reagujących. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Siatkówka z wstrzyknięciem do ciała szklistego
Częstość występowania powikłań związanych z iniekcjami do ciała szklistego jest bardzo niska. Istnieją jednak pewne powikłania, które mogą wyniknąć z samej operacji, niezależnie od wstrzykniętego składnika. Powikłania te obejmują powstawanie zaćmy, krwotok do ciała szklistego, podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego i zapalenie wnętrza gałki ocznej23. Aby ustalić, czy te powikłania są spowodowane operacją, zwierzę musi przejść ocenę przed zabiegiem za pomocą dna oka i OCT. Trzy dni po wstrzyknięciu zwierzęta powinny być poddawane obserwacji. W Rysunek 2A-D, pokazana jest siatkówka zdrowego zwierzęcia, któremu wstrzyknięto implant. Po dwóch tygodniach od wstrzyknięcia, RGC zaczynają wyrażać fluorescencję, którą można uwidocznić za pomocą fluorescencji dna palca (Rysunek 2B, C). Obrazy OCT zapewniają szczegółową wizualizację rozmieszczenia i grubości warstw siatkówki (Rysunek 2D), oferując wyższą rozdzielczość w porównaniu z dnem oka, szczególnie podczas oceny odwarstwienia siatkówki. Gdy siatkówka zostanie zamontowana płasko i zobrazowana za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, możliwe staje się rozróżnienie komórek i wiązek aksonów. W przeciwieństwie do innych wskaźników wapnia, wskaźnik GCaMP jest ograniczony do cytoplasm7, a fluorescencja jest wykluczona z jądra (Rysunek 2E).

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy siatkówki wstrzykniętej do ciała szklistego. (A) dno krwi, (B) fluorescencyjne dno oka, (C) powiększenie fluorescencji dna oka, (D) obraz OCT i (E) epi-fluorescencyjny obraz wyciętej siatkówki zamontowany na niestandardowym MEA z elektrodami na bazie grafenu na szkle borokrzemianowym o grubości 500 μm. W (E) czarne linie odpowiadają śladom Ti/Au. Podziałki: 115 μm (D) i 100 μm (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Elektrody i kontakt GCL
Aby skutecznie wywołać reakcje neuronalne, ważne jest, aby upewnić się, że płasko zamontowana siatkówka jest w bliskim kontakcie z powierzchnią MEA. Prostym sposobem sprawdzenia tego jest wizualne potwierdzenie, czy ogniwa i elektrody znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej (Rysunek 3A). Jeśli ogniwa nie znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co elektrody (Rysunek 3B), oznacza to, że kontakt jest nieoptymalny, co spowoduje mniej skuteczną stymulację.

figure-results-3
Rysunek 3: Elektrody i kontakt GCL. (A) Ogniwa i elektroda (gwiazdka) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. (B) Ogniwa i elektrody nie znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co wskazuje na nieoptymalny kontakt dla stymulacji elektrycznej w tym obszarze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie wapnia ex vivo po stymulacji elektrycznej dostarczonej przez MEA
Dane uzyskane z obrazowania wapnia składają się z obrazów poklatkowych, które monitorują aktywność neuronalną setek komórek w odpowiedzi na stymulację elektryczną. Bodźce nadprogowe powodują napływ wapnia do somy komórkowej, co skutkuje nagłą zmianą intensywności fluorescencji (Wideo 1). Protokół ten umożliwia określenie, czy elektroda, MEA i/lub algorytm stymulacji wywołuje pożądaną odpowiedź w tkance nerwowej. Rozmiar i rozstaw elektrod na MEA, a także proporcja badanej tkanki, określą odpowiednie powiększenie obiektywu do wyboru. Zazwyczaj do badań stymulacji pojedynczą elektrodą o średnicach od 5 μm do 100 μm odpowiednie jest powiększenie obiektywu 20-25x (Rysunek 4A), zapewniając pole widzenia około 600 μm x 600 μm. W przypadku eksperymentów obejmujących stymulację wieloma elektrodami może być konieczne powiększenie obiektywu 4-10x, aby ocenić szerszy obszar o wymiarach około 2 mm x 2 mm. Responsywne komórki można łatwo zidentyfikować, generując projekcję obrazu z odchyleniem standardowym filmu poklatkowego (Rysunek 4B i Wideo 1).

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazowanie GCL metodą wapnia ze stymulacją elektryczną dostarczaną przez elektrodę o średnicy 25 μm. (A) Maksymalna projekcja filmu poklatkowego z 60 sekund oraz (B) projekcja odchylenia standardowego wyraźnie przedstawiająca komórki, które reagują na bodźce elektryczne z porowatej elektrody na bazie grafenu o średnicy 25 μm. Elektroda stymulująca jest oznaczona gwiazdką. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza dynamiki wapnia w czasie po kontrolowanej stymulacji
Dla każdej zidentyfikowanej somy komórkowej wyodrębniono średnie wartości intensywności w czasie. Rysunek 5A pokazuje skorygowane fotowybielaniem ślady wapnia z komórek reagujących. W tym przykładzie pięć serii dwufazowych ciągów impulsów (katodowy pierwszy, 40 cykli, czas trwania 1 ms, amplituda 2 μA) było dostarczanych co 10 s (oznaczone czarnymi liniami) podczas 60-sekundowej akwizycji obrazu. W ramach danego eksperymentu stosuje się te same pięć ciągów impulsów w celu zbadania spójności odpowiedzi. Klatki uchwycone w okresach niestymulujących (podświetlone na czerwono) są używane do wykonania dopasowania liniowego, korygując efekt fotowybielania.

Gdy reagujące komórki zostaną zidentyfikowane, a ich współrzędne (x,y) będą znane w stosunku do elektrody stymulującej, można zbadać zależność między prądem wymaganym do aktywacji komórek a odległością od elektrody stymulującej (Rysunek 5B). Zgodnie z oczekiwaniami, ogniwa znajdujące się bliżej elektrody stymulującej wymagają niższych wartości prądu, aby wywołać odpowiedź.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentacja reakcji wywołanych elektrycznie. (A) Ślady wapnia w komórkach po 5 seriach impulsów (dwufazowych, katodowych, 40 cykli, czas trwania 1 ms, amplituda 2 μA) co 10 s (czarne linie) podczas akwizycji obrazu przez 60 sekund. Wyświetlane są okresy niestymulujące (klatki podświetlone na czerwono) i stymulujące (klatki podświetlone na żółto). Ślady przekraczające sygnał wyjściowy (średnia kwadratowa okresów niestymulujących) 2,5-krotnie są uważane za reakcje wywołane. Komórki reagujące w trzech z pięciu okresów stymulacji są klasyfikowane jako komórki reagujące. (B) Mapa rozkładu aktywności wapnia przedstawiająca elektrodę stymulującą (czarne obrysowane kółko) i komórki (szare obrysowane kółko). Kod kolorystyczny reprezentuje minimalną amplitudę impulsu niezbędną do wywołania odpowiedzi komórkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Obrazowanie GCL metodą wapnia ze stymulacją elektryczną dostarczaną przez elektrodę o średnicy 25 μm. Film przedstawia różnice w intensywności fluorescencji spowodowane stymulacją elektryczną z porowatej elektrody na bazie grafenu o średnicy 25 μm. Lewa strona pokazuje oryginalny film, a prawa strona pokazuje projekcję odchylenia standardowego, w której można łatwo zidentyfikować odpowiadające komórki. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół służy do badania dynamiki wapnia występującej w GCL siatkówki szczura po stymulacji elektrycznej dostarczonej MEA. Jest to niezawodna i łatwa do opanowania metoda, ale wymaga pewnego treningu, szczególnie w celu równomiernego i skutecznego oznakowania GCL oraz prawidłowego zamontowania siatkówki w celu zapewnienia optymalnego kontaktu tkanka-elektroda. Protokół ten jest specyficzny dla gryzoni i musi zostać dostosowany, jeśli zostanie zastosowany do innego gatunku laboratoryjnego. Szczegółowo przedstawiono punkty krytyczne, modyfikacje i ograniczenia metodologii.

Iniekcje doszklistkowe
Zastrzyki są szeroko stosowane do dostarczania genów do oka, przy czym preferowaną procedurą są zastrzyki doszklistkowe. Udowodniono, że są one bezpieczniejsze i mniej inwazyjne w porównaniu z iniekcjami podsiatkówkowymi, które wprowadzają interesujące cząsteczki bezpośrednio między fotoreceptory a nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE), ryzykując odwarstwienie siatkówki10. Istnieją jednak ograniczenia, zwłaszcza podczas wykonywania tych iniekcji w modelach gryzoni. Ciało szkliste jest galaretowate, co utrudnia dyfuzję wirusa. Co więcej, soczewka w oczach gryzoni jest duża, dzięki czemu włożenie igły bez jej zarysowania jest nietrywialne. Igły do precyzyjnych strzykawek są delikatne i wymagają częstej wymiany. Aby zapobiec niedrożności, myj je wodą dejonizowaną przed i po każdym użyciu i regularnie wymieniaj. Dodatkowo należy wstrzykiwać zawartość powoli, aby zapobiec refluksowi roztworu i zmianom ciśnienia wewnątrzgałkowego. Uzyskanie dużej i jednolitej fluorescencji w siatkówce może wymagać praktyki.

Transdukcja komórek siatkówki
Wektory wirusowe są doskonałą metodą dostarczania genów in vivo, a AAV są szeroko stosowane do transdukcji komórek siatkówki10. Zostały one zatwierdzone do leczenia niektórych retinopatii powodujących ślepotę u ludzi24. Ich zdolność nośna jest jednak ograniczona do 5 kb, z uwzględnieniem wymaganych elementów regulacyjnych (np. promotora)10,25. Dostępnych jest wiele serotypów, z których każdy ma inny tropizm. Wybierz najbardziej odpowiedni AAV w oparciu o geny, które mają zostać dostarczone, i komórki, które mają zostać transdukowane26. Do oznaczania RGC zaleca się stosowanie AAV227.

Okno ekspresji genów
Optymalna ekspresja wirusa dla AAV2-CAG-GCaMP5G wynosi od 2 do 3 tygodni po wstrzyknięciu12,18. Po przekroczeniu tego czasu jądra z transfekowanych komórek stają się fluorescencyjne, komórki przestają reagować na bodźce i ostatecznie umierają 7,28,29. Wynika to z nadekspresji wskaźnika GCaMP, który ulega translokacji do jądra. Okno czasowe dla optymalnej ekspresji genów będzie się różnić w zależności od wektora wirusowego i wybranego promotora30 i musi zostać określone eksperymentalnie przed przystąpieniem do tego protokołu.

Kontakt tkanka-elektroda
Dla uzyskania optymalnych i powtarzalnych wyników kluczowe znaczenie ma uzyskanie dobrego kontaktu tkanka-elektroda. Słaby kontakt jest zwykle spowodowany naturalną krzywizną siatkówki. Jednym ze sposobów jest pocięcie siatkówki na ćwiartki, zamontowanie i zobrazowanie jednej sekcji na raz. Małe fragmenty siatkówki mogą być lepiej spłaszczone, co skutkuje bardziej efektywnym kontaktem z powierzchnią MEA. Innym potencjalnym powodem słabego kontaktu jest obecność ciała szklistego. Podczas przeprowadzania eksperymentów stymulacyjnych symulujących implant nadsiatkówkowy ważne jest, aby ostrożnie usunąć ciało szkliste podczas wycinania siatkówki, ponieważ może ono działać jako izolator prądu. W tym miejscu opisano prostą metodę sprawdzania, czy kontakt jest wystarczający, poprzez wizualizację elektrody i ogniw w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Alternatywą dla pomiarów siatkówki ex vivo jest hodowanie neuronów bezpośrednio na powierzchni elektrod. Pierwotna hodowla neuronów, takich jak neurony hipokampa31, może być przydatna do wstępnych testów w celu oceny funkcjonalności nowego urządzenia stymulującego. Jednak takie podejście nadal wymaga wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i nie reprezentuje złożoności sieci siatkówkowej, która jest ważna dla oceny odpowiedzi synaptycznych na stymulację.

Do wizualizacji ogniw pod elektrodą i śladami elektrod można użyć MEA wykonanych z przezroczystych materiałów, takich jak tlenek indu i cyny (ITO) 19,20,32. Oprócz pomiarów optycznych, aktywność GCL po stymulacji elektrycznej można ocenić za pomocą zapisów elektrycznych. MEA może być używany do rejestrowania lokalnego potencjału pola (LFP) tkanki. Wpływa to jednak negatywnie na rozdzielczość przestrzenną, ponieważ każda elektroda przechwytuje aktywność z wielu ogniw jednocześnie (w zależności od wymiarów elektrody). Zapis optyczny pokonuje to ograniczenie i oferuje mapowanie w wyższej rozdzielczości przestrzennej. Jego główną zaletą jest możliwość rozróżnienia komórek aktywnych i nieaktywnych przy jednoczesnym pomiarze dużego pola widzenia z rozdzielczością pojedynczej komórki. Spośród wszystkich reporterów aktywności komórkowej wskaźniki wapnia są dobrze opisane i najczęściej stosowane33.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień, które mogliby dodać do manuskryptu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandrze Ortonobés Larze i Alinie Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) za ich wsparcie techniczne, Annie Duarri (VHIR, Vall d'Hebron Institute of Research) z grupy badawczej Ophthalmology Research za wsparcie przy iniekcjach doszklistkowych i obrazowaniu siatkówki in vivo.

Podmioty finansujące, które wsparły tę pracę to: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Program Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa dla centrów doskonałości w dziedzinie badań i rozwoju (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Generalitat de Catalunya w ramach programu CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr 871124); Fundacja La Caixa (LCF/HR19/52160003); oraz Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20x NA 0,75 S Fluor obiektyw powietrznyNikonCFI Super Fluor 20X-3,5
cm Naczynie do hodowli komórkowychNunc12-565-90-30
G igłaVWR613-5373-36
G igłaWorld Precision InstrumentsNF36BL-2-6
cm Naczynie do hodowli komórkowychNunc
 Vector Biolabs--
Ames' MediumSigma AldrichA1420-Blade
Swann-morton0308-Kamera
HamamatsuORCA Flash v4.0-Carbogen
Air liquide--
Zakrzywione-kleszcze ---
Drobne nożyczki sprężynoweFST91501-09-FITC
kostka filtraNikonStandard
Nikon C-HGFI-Fluorescencyjny
mikroskop stereoskopowy NikonSMZ25-HBSS
KoziorożecHBSS-1A-ImageJ
/FIDŻI NIHv1.50i-System
obrazowania siatkówki in vivo Phoenix Research LaboratoriesMicron III-Odwrócony
mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse
Ti-IsofluoraneArrane Baxter Laboratories--
Long-Evans ratJanvier-
-MATLAB (wersja R2021b) Mathworks-
Filtry mediówMerckmillipore
SCGPS02RE-Methocel 2%Omni Vision--
Matryca mikroelektrod (MEA)-Wykonane
NaHCO3Thermofisher42427-Penicylina
/Streptomycyna 100xThermofisher15140122-
FenylefrynaAlcon Cusí Laboratoria653437.3100 mg/ml
Pipeta plastikowaVWR612-1793-Porowata
membranaMerckmillipore
#JVWP01300-Precyzyjna strzykawkaWorld Precision Instruments10 µ l
Llorens-Chlorohydratoksybuprokainy (2 mg/ml), znieczulenie miejscowe
Maska nosowa dla szczurówXenotecXRK-RA-Małe
zakrzywione kleszcze Bbraun
 FST15040-11-Mikroskop
stereoskopowyZeissStemi 2000-Kleszcze
proste FST11252-20-Nitka
do szwówVitrex Medical4328Nilon monofilament, 7/0, DS12
TobradexAlcon Cusí Laboratoria-Tobramycyna (3 mg / ml) i deksametazon (1 mg / ml)
TropicamidAlcon Cusí Laboratoria65348610 mg/ml
MyjkaThorlabsW8S038-
12-565-94-AAV2-CAG-GCaMP5G series-Świetlówka na zamówienie Nanofil-Prescaina AESCBD311R-Nożyczki-sprężynowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
  2. Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
  3. Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
  4. Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , Elsevier. 469-496 (2013).
  5. Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
  6. Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
  7. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  8. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  9. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
  10. Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135(2021).
  11. Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  12. Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
  13. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
  14. Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
  15. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
  16. Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. NIH Guidelines April 2019. Applied Biosafety. 24, Preprint at https://doi.org/10.1177/1535676019871146 (2019).
  17. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  18. Chang, Y. -C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018(2017).
  19. Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
  20. Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017(2019).
  21. Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002(2016).
  22. Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
  23. Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
  24. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
  25. Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291(2023).
  26. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  27. Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
  28. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
  29. Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504(2018).
  30. Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
  31. Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829(2022).
  32. Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
  33. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki zwojowe siatk wkistymulacja elektrycznasiatk wka zamontowana na p askogenetycznie kodowany wska nik wapniaodwr cony mikroskop fluorescencyjnymacierz mikroelektrodproteza siatk wkisiatk wka ex vivoanaliza w programie ImageJ

Powiązane artykuły