Bezkomórkowa ekstrakcja DNA z próbek ciała szklistego i cieczy wodnistej w diagnostyce i monitorowaniu chłoniaka szklistkowo-siatkówkowego

Podsumowanie

Procedura ekstrakcji bezkomórkowego DNA z ciała szklistego i cieczy wodnistej w celu przeprowadzenia badań molekularnych w celu diagnozowania chłoniaka szklistego jest tutaj. Metoda ta daje możliwość jednoczesnej ekstrakcji DNA ze składnika komórkowego próbki lub zarezerwowania go do badań pomocniczych.

Streszczenie

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) reprezentuje agresywnego chłoniaka, często klasyfikowanego jako pierwotny chłoniak rozlany z dużych komórek B ośrodkowego układu nerwowego. Aby zdiagnozować VRL, pobiera się próbki, takie jak ciecz ciała szklistego, a ostatnio ciecz wodnista. Testy diagnostyczne w kierunku VRL na tych próbkach obejmują cytologię, cytometrię przepływową i testy molekularne. Jednak zarówno cytopatologia, jak i cytometria przepływowa, wraz z badaniami molekularnymi z wykorzystaniem DNA komórkowego, wymagają nienaruszonych całych komórek. Wyzwanie polega na tym, że ciało szkliste i wodnista zazwyczaj mają niską komórkowość, a wiele komórek ulega zniszczeniu podczas pobierania, przechowywania i przetwarzania. Co więcej, próbki te stwarzają dodatkowe trudności w testach molekularnych ze względu na wysoką lepkość ciała szklistego i małą objętość zarówno ciała szklistego, jak i cieczy wodnistej. W badaniu tym zaproponowano metodę ekstrakcji bezkomórkowego DNA z próbek szklistych i wodnych. Podejście to uzupełnia ekstrakcję DNA komórkowego lub pozwala na wykorzystanie składnika komórkowego tych próbek do innych metod diagnostycznych, w tym cytologii i cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) jest agresywnym chłoniakiem związanym z pierwotnym chłoniakiem rozlanym z dużych komórek B ośrodkowego układu nerwowego^1,2,3. VRL jest zazwyczaj śmiertelny ze względu na jego udział w ośrodkowym układzie nerwowym^1,2. Chociaż rzadko^1,4, VRL często objawia się objawami podobnymi do zapalenia tylnego odcinka błony naczyniowej oka i innych chorób szklistkowo-siatkówkowych^4,5. W związku z tym pacjenci wykazujący objawy zapalenia błony naczyniowej oka wymagają diagnozy w celu potwierdzenia lub wykluczenia VRL.

Niedawno opublikowano kryteria konsensusu dotyczące diagnozowania VRL, które obejmują połączenie badania klinicznego i wyników laboratoryjnych⁶. Próbki powszechnie używane do diagnozowania VRL obejmują ciało szkliste, a ostatnio ciecz wodnistą⁷. Ciało szkliste uzyskuje się za pomocą zabiegu chirurgicznego zwanego witrektomią pars plana, który umożliwia dostęp do tylnego odcinka oka⁸.

W prezentowanym protokole, zarówno próbki cieczy wodnistej, jak i ciała szklistego zostały pobrane do ekstrakcji komórkowej i cfDNA. Po znieczuleniu pacjentów i umieszczeniu trokarów w odległości około 4 mm od rąbka rogówki, uzyskano próbkę cieczy wodnistej o objętości około 100-200 μl za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml w rąbku rogówki. U pacjentów z pseudofakią nierozcieńczone ciało szkliste otrzymywano poprzez wprowadzenie do naparu sterylnego powietrza, umożliwiającego pobranie większej ilości nierozcieńczonego ciała szklistego (do 3,5 ml). U pacjentów z fakijami usunięto około 500 do 1000 μl nierozcieńczonego ciała szklistego przed włączeniem naparu ze zrównoważonym roztworem soli. W niektórych przypadkach wtórnie rozcieńczone ciało szkliste (500 do 2 000 μl) pobrano poprzez zamianę naparu na płyn i umieszczenie witrektora w osłonie ciała szklistego w celu uzyskania tej próbki. Najbardziej rozcieńczoną frakcję ciała szklistego pobrano poprzez zakonserwowanie worka kasetowego (rysunek uzupełniający 1) pod koniec operacji. Gdy ten worek dotarł do oddziału patologii, rozcieńczone ciało szkliste uzyskano z spuszczenia płynu z tego worka do stożkowych probówek w celu późniejszej ekstrakcji DNA.

Cytopatologia płynu szklistego jest często uważana za złoty standard⁹. Jednak kilka badań wykazało ograniczoną czułość ze względu na przetwarzanie i minimalną komórkowość^10,11,12. Cytometria przepływowa może pomóc w identyfikacji klonalnych komórek B, ale może być również ograniczona przez niską komórkowość i kruchość dużych komórek chłoniaka^13,14,15. Zarówno cytopatologia, jak i cytometria przepływowa wymagają nienaruszonych całych komórek. Wiele z tych komórek ulega zniszczeniu podczas pobierania, przechowywania i przetwarzania. Kiedy testy molekularne są wykonywane przy użyciu DNA wyekstrahowanego z nienaruszonych komórek (DNA komórkowe), cierpi na to samo ograniczenie. Ponadto podzielenie ograniczonej próbki ciała szklistego do wszystkich tych testów zmniejsza ilość materiału dostępnego dla każdego testu.

Bezkomórkowe DNA (cfDNA) stanowi kolejne źródło DNA, które nie wymaga nienaruszonych komórek. cfDNA z próbek ciała szklistego zostało użyte do wykrywania VRL^16,17 oraz czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej¹⁸. W tym protokole komórkowe i bezkomórkowe DNA jest ekstrahowane z płynu szklistego i wodnego w celu wykrycia VRL.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad ludźmi i za zgodą instytucjonalnej komisji rewizyjnej (IRB) Uniwersytetu Michigan. Uzyskano w tym celu zrzeczenie się świadomej zgody od IRB. Nie ma odpowiednich kryteriów włączenia lub wykluczenia dla pacjentów biorących udział w badaniu.

1. Separacja komponentów komórkowych i bezkomórkowych

UWAGA: Do badań diagnostycznych VRL można otrzymać trzy rodzaje próbek: ciało szkliste (nierozcieńczone; płyn z witrektomii pobrany przed rozpoczęciem infuzji), rozcieńczone ciało szkliste w worku kasetowym (Rysunek 1), oraz ciecz wodnista (płyn z przedniej komory oka).

1. W przypadku nierozcieńczonego płynu szklistego, który jest bardzo lepki, należy rozcieńczyć 3-5 ml PBS w celu ułatwienia pipetowania.
2. W przypadku rozcieńczonego ciała szklistego w torbie kasety (rysunek uzupełniający 1) spuść płyn do stożkowych probówek o pojemności 50 ml (jedna na każde 45 ml płynu).
3. Ciecz wodnista ma bardzo małą objętość (<200 μL). Aby zapewnić maksymalny odzysk komórek, przenieś próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml, przepłucz oryginalną probówkę mikrowirówkową o pojemności 500 μl, w której pobrano próbkę, o równej objętości PBS i dodaj do probówki o pojemności 1,5 ml.
4. Odwirować płyn szklisty lub wodny o sile 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek.

2. Ekstrakcja DNA ze składnika komórkowego

1. Dodać odpowiednią ilość roztworu do lizy komórek (300 μl dla małych granulek, 1 ml lub więcej dla większych osadów) (patrz Tabela materiałów). Mieszać, pipetując w górę i w dół.
2. Po całkowitej lizie dodać 1/3 całkowitej objętości roztworu osadu białkowego (100 μl na 300 μl lizatu) (patrz tabela materiałów).
3. Wiruj energicznie przez 20-30 s. Wiruj przez 3 minuty w temperaturze 3 000 x g w temperaturze pokojowej.
4. Odpipetować 300 μl izopropanolu do czystej probówki do mikrowirówki. Ostrożnie odpipetować supernatant z poprzedniego kroku do probówki z izopropanolem.
5. Dodać 1,5 μl glikogenu 20 mg/ml (dla 300 μl lizy) (patrz tabela materiałów).
6. Dobrze wymieszać przez odwrócenie, a następnie umieścić próbkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 1 godzinę do nocy, aby wspomóc wytrącanie DNA.
7. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml przez 5 minut przy 3 000 x g w temperaturze pokojowej. Odpipetować izopropanol.
8. Dodaj 0,5 ml 70% etanolu i odwróć probówkę, aby umyć granulkę.
9. Wirować przez 1 minutę w temperaturze 3 000 x g w temperaturze pokojowej i zdekantować etanol. Powtórz płukanie etanolem raz.
10. Odwróć rurkę na czystej gazie, aby spuścić roztwór i wysuszyć granulkę lub dekantację. Szybko odwiruj DNA w mikrowirówce i odpipetuj pozostałą kroplę etanolu za pomocą jednorazowej końcówki z cienką końcówką (gdy w probówce nie pozostaną żadne resztki etanolu, DNA powinno być suche i gotowe do uwodnienia w ciągu 5-10 minut).
11. Dodać 45 μl roztworu hydratującego DNA (patrz tabela materiałów) do wysuszonego osadu DNA.
12. Umieścić probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 50 °C i pozostawić do rozpuszczenia przez 1-2 godziny. Pipetować DNA w górę i w dół, aby przyspieszyć proces nawodnienia.
    UWAGA: Dodaj więcej roztworu hydratującego DNA, jeśli próbka wydaje się zbyt lepka.

3. Ekstrakcja DNA bez komórek

1. Ilość supernatantu z kroku 1.5 jest zmienna. Dodać 70 μl buforu kondycjonującego (patrz tabela materiałów) na każdy mililitr supernatantu.
2. Dobrze wymieszaj kulki czyszczące przez wirowanie. Dodać 10 μl kulek czyszczących w przypadku przetwarzania <14 ml bezkomórkowego supernatantu, 20 μl w przypadku przetwarzania 14-40 ml.
3. Dobrze wymieszaj mieszaninę próbki/kulki przez wirowanie. Wirować przy 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Nie naruszając osadu, odpipetować supernatant, pozostawiając 100 μl, jeśli stosuje się 10 μl kulek czyszczących, i 200 μl, jeśli stosuje się 20 μl kulek czyszczących.
5. Dodać równą objętość buforu do wytrawiania osadów moczu (patrz Tabela materiałów) do osadu i dobrze zawiesić osad przez wirowanie lub pipetowanie.
6. Dodaj proteinazę K (5% (v/v)) do zawieszonego osadu (np. dodaj 10 μl proteinazy K do 200 μl mieszaniny) i dobrze wymieszaj, delikatnie wirując.
7. Inkubować mieszaninę osadów w temperaturze 55 °C przez 30 minut.
8. Dodać jedną objętość genomowego buforu do lizy (patrz tabela materiałów) do mieszaniny wytrawiającej (np. 210 μl buforu do lizy genomowej na 210 μl mieszaniny wytrawiającej) i wymieszać przez wirowanie.
9. Przenieść dostępną w handlu kolumnę wirującą (patrz Tabela materiałów) do nowej probówki zbiorczej.
10. Dodać 200 μl buforu do przygotowania DNA moczu do kolumny wirowej, odwirować przy ≥16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.
11. Dodać 700 μl buforu do przemywania DNA moczu do kolumny, odwirować przy ≥16 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odlać przepływ.
12. Powtórz ten krok z 200 μl buforu do przemywania DNA moczu.
13. Przenieść kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej wolnej od DNaz/RNaz.
14. Dodać odpowiednią objętość buforu elucji DNA (w oparciu o testy molekularne, które należy wykonać) bezpośrednio na matrycę kolumny i pozostawić na 3-5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W przykładowych przypadkach użyto 30 μl buforu elucyjnego. Jeśli wymagane są dodatkowe badania, stosuje się więcej buforu elucyjnego.
15. Wirować przy ≥16 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby uzyskać bezkomórkowe DNA.

Wyniki

Te metody ekstrakcji zostały przeprowadzone na ograniczonej liczbie przypadków, aby zapewnić odpowiednią wydajność i amplifikowalność bezkomórkowego DNA w porównaniu z DNA komórkowego z próbek szklistych (cztery) i wodnych (cztery). Z tych próbek wyniki DNA z bezkomórkowego składnika tych płynów są podobne do plonów ze składnika komórkowego (Tabela 1). Komórkowe i cfDNA z tych próbek oceniano również za pomocą testów molekularnych, takich jak mutacja MYD88 L265P związana z VRL. Specyficzny dla alleli PCR w czasie rzeczywistym dla MYD88 L265P (Rysunek 1) ilustruje wykrycie tej mutacji związanej z VRL zarówno w komórkowym DNA, jak i cfDNA. W tym przykładzie obciążenie chorobą wydaje się być wyższe w komponencie bezkomórkowym, co ilustruje niższy (próg cyklu (Ct). Dane te ilustrują, że cfDNA wyekstrahowane z ciała szklistego i cieczy wodnistej przy użyciu tej metody daje źródło DNA, które można również zastosować do diagnostycznych testów molekularnych.

Rysunek 1: PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu MYD88 L265P. Reprezentatywny wykres amplifikacji przedstawiający PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu MYD88 L265P dla DNA komórkowego i bezkomórkowego (każda reakcja PCR wykonywana w dwóch egzemplarzach). Próg progu cyklu (Ct) jest oznaczony zieloną linią. Punkty, w których amplifikacja cfDNA (niebieskie i brązowe ślady) oraz DNA komórkowego (czerwone i zielone ślady) - każdy wykonany w dwóch egzemplarzach - osiągają próg, są oznaczane. Fluorescencja tła występuje w pobliżu 1.00e-003. Większe obciążenie mutacjami występuje w komponencie bezkomórkowym, o czym świadczy niższy Ct. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. Rozdział szt. TGLI pkt. pkt. szt. pkt.

	komórka	Bez komórek
Ciało szkliste 1	130,5 pkt.	67,5
Ciało szkliste 2	337,5	105
Ciało szkliste 3	150	Rozdział 168
Ciało szkliste 4	Rok 1816	654
Wodny 1	58,5	40,5
Wodny 2	Rozdział 153	225
Wodny 3	Rozdział 117	454,5
Wodny 4	Tl	27 Rozdział 27

Tabela 1: Wydajność ekstrakcji DNA w komórkach i bez komórek. Wydajność DNA (w ng) dla czterech nierozcieńczonych płynów szklistych i czterech cieczy wodnistych (komora przednia) od czterech różnych osób na podstawie fluorometrycznej oceny ilościowej DNA. TL = zbyt niskie, aby określić ilościowo.

Rysunek uzupełniający 1: Worek kasetowy z ciałem szklistym. Przykład worka kasetowego do ciała szklistego zawierającego rozcieńczony płyn szklisty. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Chłoniak szklistkowo-siatkówkowy (VRL) jest agresywnym chłoniakiem z dużych komórek B ^1,2,3, którego objawy mogą naśladować inne choroby witreoretinalne ^4,5. Badania molekularne ciała szklistego, a ostatnio także cieczy wodnistej, stały się kluczową metodą diagnozy VRL lub jej wykluczenia. Jednak płyny te mają bardzo małą objętość i często mają niską komórkowość. Wiele komórek w tych płynach może również ulec uszkodzeniu podczas zbierania, przechowywania i przetwarzania 13,14,15. W rezultacie plony DNA z tych próbek są często niskie. Ponadto komórki z tych płynów muszą być współdzielone z innymi metodami diagnostycznymi, w tym cytopatologią i cytometrią przepływową. Bezkomórkowe DNA (cfDNA) w tych płynach stanowi kolejne źródło DNA, które nie wymaga nienaruszonych komórek.

Protokół ten oddziela komórkowe i bezkomórkowe składniki płynu szklistego lub wodnego. Płyn szklisty rozcieńcza się PBS, aby umożliwić pipetowanie ze względu na jego lepkość. Płyn wodny jest traktowany w celu zapewnienia maksymalnego odzysku tego płynu o bardzo małej objętości.

Porównanie wydajności DNA tych dwóch składników pokazuje, że ze składnika bezkomórkowego można uzyskać znaczne dodatkowe kwasy nukleinowe. Testy molekularne cfDNA, takie jak PCR w czasie rzeczywistym specyficzny dla allelu MYD88 L265P, pokazują, że VRL można wykryć w bezkomórkowym komponencie ciała szklistego i wodnistego, a także w komponencie komórkowym. W wielu przypadkach względna ilość VRL jest wyższa w komponencie bezkomórkowym niż w komponencie komórkowym (ryc. 1).

Ekstrakcja bezkomórkowego składnika płynu szklistego i wodnego umożliwia ocenę molekularną składnika tych płynów, który w przeciwnym razie zostałby wyrzucony. Ponieważ VRL jest reprezentowany w komponentach komórkowych i bezkomórkowych, DNA komórkowe i cfDNA można połączyć, aby zmaksymalizować dostępne DNA z tych ograniczonych próbek. Alternatywnie, bezkomórkowy składnik tych płynów może być używany do testów molekularnych, a składnik komórkowy może być używany do testów, które wymagają nienaruszonych komórek, tj. cytopatologii i cytometrii przepływowej. Takie podejście pozwoliłoby uniknąć przydzielania oddzielnych podwielokrotności tych płynów do każdego testu, co mogłoby zagrozić czułości każdego testu pod kątem wykrywania VRL. Biorąc pod uwagę sukces tej metody w próbkach szklistych i wodnych, metoda ta może być również przydatna w innych ograniczonych płynach w celu zwiększenia ilości DNA dostępnego do badań molekularnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-Propanol (Izopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Czysty & Koncentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Roztwór do lizy komórek	Qiagen	158906
Gentra Puregene Roztwór do hydratacji DNA	Qiagen	158916
Gentra Puregene Roztwór do wytrącania białek	Qiagen	158912
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Zestaw do moczu	Zymo Research	D3061	Bufor kondycjonujący; zawiera również kulki czyszczące, proteinazę K i kolumny wirowe
Ultraczysty glikogen, 20 i mikro; g/&mikro; L (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010