Artykuł metodologiczny

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

DOI:

10.3791/65713

⸱

8 września 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), UMR6290 CNRS - Université de Rennes, 2BIOSIT, UAR 3480 US 018, Université de Rennes

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mięśnie szkieletowe to duże syncytia składające się z wielu wiązek włókien mięśniowych, które wytwarzają siły i umożliwiają ruch ciała. Drosophila jest klasycznym modelem do badania biologii mięśni. Połączenie genetyki Drosophila i zaawansowanych metod omicznych doprowadziło do zidentyfikowania kluczowych konserwatywnych cząsteczek, które regulują morfogenezę i regenerację mięśni. Jednak dynamika transkrypcji tych cząsteczek i przestrzenny rozkład ich informacyjnego RNA w syncytii nie mogą być ocenione konwencjonalnymi metodami. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy istniejącą metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA (smFISH), aby umożliwić wykrywanie i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w dorosłych mięśniach lotu i ich komórkach macierzystych mięśni. Jako dowód słuszności koncepcji przeanalizowaliśmy ekspresję i dystrybucję mRNA dwóch ewolucyjnie konserwatywnych czynników transkrypcyjnych, Mef2 i Zfh1 / Zeb. Pokazujemy, że ta metoda może skutecznie wykrywać i określać ilościowo pojedyncze cząsteczki mRNA dla obu transkryptów w komórkach prekursorowych mięśni, dorosłych mięśniach i komórkach macierzystych mięśni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe mięśnie szkieletowe zbudowane są z zróżnicowanych wielojądrowych włókien mięśniowych, których właściwości kurczliwe generują ruchy. Wzrost, utrzymanie i regeneracja mięśni opierają się na progenitorach mięśniowych i komórkach macierzystych mięśni (MuSC), które są określone podczas rozwoju embrionalnego1. Program miogenny jest precyzyjnie kontrolowany przez zestaw podstawowych miogennych czynników transkrypcyjnych (TF) (np. Pax3/7, MYOD, Mef2 i ZEB)2,3,4. Rozszyfrowanie mechanizmów molekularnych regulujących biologię mięśni jest ważne dla wyjaśnienia podstawowych pytań związanych z miologią oraz dla możliwego zastosowania terapeutycznego w leczeniu chorób zwyrodnieniowych mięśni.

Drosophila ma długą historię jako model genetyczny do badania miogenezy5. Niedawno pojawił się jako nowy model do badania regeneracji mięśni6,7,8. Struktura mięśni i podstawowe programy miogenne są wysoce konserwatywne między muchami i ssakami. Na przykład TF Mef2 i Zfh1/ZEB mają zachowaną funkcję w regulacji rozwoju i regeneracji mięśni3,9,10,11. Dorosłe mięśnie Drosophila, takie jak mięśnie lotu pośredniego (IFM), są tworzone z określonej populacji MuSC, znanych jako Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. Te AMP są określane podczas embriogenezy i wiążą się ze strukturami nabłonkowymi, takimi jak dyski skrzydeł i nóg. W stadiach embrionalnych i larwalnych AMP pozostają niezróżnicowane aż do metamorfozy, kiedy angażują się w różnicowanie i fuzję, tworząc IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) ulega ekspresji podczas rozwoju mięśni lotu i jest niezbędny do określenia ich tożsamości strukturalnej15. Mef2 to kolejny ważny miogenny TF, który jest niezbędny do tworzenia mięśni u dorosłych16,17. Jest on wyrażony w AMP i utrzymywany w dorosłych IFMs10,18. Podczas gdy większość AMP różnicuje się w funkcjonalne mięśnie, podzbiór wymyka się różnicowaniu i tworzy dorosłe MuSCs11. Podobnie jak w przypadku kręgowców, TF Zfh1/ZEB jest wymagany, aby zapobiec przedwczesnemu różnicowaniu się dorosłych MuSC i utrzymać ich stemness9,10.

Udowodniono, że dynamika ekspresji genów reguluje różne procesy biologiczne mięśni19,20. Pojawienie się wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder umożliwiło kompleksowe zbadanie tej dynamiki transkrypcji21,22. Jednym z istotnych ograniczeń tych podejść jest ich niezdolność do zapewnienia przestrzennego rozkładu cząsteczek mRNA w wielojądrowych włóknach mięśniowych. Cechy te można badać za pomocą jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (smFISH), która ujawnia dwa typy ciał mRNA: 1. Pojedyncze cząsteczki mRNA rozproszone w cytoplazmie i reprezentujące dojrzały RNA oraz 2. Maksymalnie dwa jasne ogniska jądrowe odpowiadają powstającemu transkryptowi i ujawniają aktywne transkrypcyjnie allele 23. W związku z tym smFISH jest metodą z wyboru do kwantyfikacji poszczególnych cząsteczek mRNA, badając ich rozmieszczenie przestrzenne i dostarczając migawek dynamiki transkrypcji genów.

Metoda smFISH opiera się na zestawie krótkich fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych, specjalnie zaprojektowanych tak, aby były komplementarne do docelowego transkryptu. Po wyżarzaniu generuje źródła punktowe o wysokiej intensywności, co pozwala na wykrycie mRNA na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii konfokalnej24. Metoda ta jest coraz częściej stosowana w przypadku wielu różnych typów komórek, w tym tkanek mięśniowych ssaków19,20. Jednak u Drosophila, podobnie jak w innych modelach zwierzęcych, większość wiedzy na temat ekspresji genów mięśni dorosłych pochodzi z masowych testów molekularnych, w których brakuje informacji ilościowych na temat lokalizacji przestrzennej cząsteczek mRNA. Tutaj zoptymalizowaliśmy metodę wykonywania smFISH na komórkach prekursorowych mięśni i dorosłych mięśniach Drosophila23,25. Protokół ten obejmuje w pełni zautomatyzowany potok analityczny do segmentacji jąder oraz zliczania i lokalizacji mRNA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sekcja i przygotowanie dysku skrzydłowego i mięśni dorosłych

UWAGA: Oczyść stół separacyjny i wszystkie narzędzia do sekcji roztworem inhibitora RNAzy (Tabela materiałów). Podczas całej procedury doświadczalnej należy nosić rękawice laboratoryjne.

  1. Tarcza skrzydłowa
    1. Umieść larwy L3 w zimnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Rysunek 1A).
    2. Opłucz larwy 3x 1x PBS i trzymaj je w tym roztworze przez 5 minut.
    3. Za pomocą dwóch par ostrych kleszczy przytrzymaj larwę od przedniej części i pociągnij i wyrzuć resztę tkanek ciała (około 2/3).
    4. Przytrzymaj zarówno pierwszą 1/3 larwy jedną parą kleszczy, jak i haczyki do ust drugą parą. Schowaj haczyki gębowe wewnątrz larwy, aż zostanie całkowicie odwrócona.
      UWAGA: Wypreparuj około 30 larw na eksperyment, aby zapewnić odpowiednią wielkość próbki do analizy.
    5. Zauważ, że krążki skrzydeł są ściśle związane z dwiema głównymi gałęziami tchawicy, które biegną wzdłuż każdej strony larwy.
    6. Usuń wszystkie inne elementy larwalne (krążki nóg i mózg), aby uzyskać czystą, odwróconą tuszę larwalną z parą krążków skrzydeł przyczepionych do tchawicy (Ryc. 1B).
    7. Umieścić próbki w probówce wirówkowej o pojemności 1 ml i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w 1x PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
      UWAGA: Mieszanie próbki uzyskuje się za pomocą mieszadła oscylacyjnego (Tabela materiałów).
    8. Przemyć próbki 3 x 5 minut 70% etanolem (EtOH, rozcieńczonym w wodzie wolnej od RNAzy) i przechowywać je w tym samym roztworze myjącym w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 dni i do 1 tygodnia.
  2. Pośrednie mięśnie lotu
    1. Znieczulij dorosłe muchy na moskitierze CO2 i usuń głowy, brzuchy, nogi i skrzydła.
    2. Umieść wypreparowane klatki piersiowe w zimnym 1x PBS i kontynuuj to, aż wszystkie próbki zostaną wycięte (Rysunek 1D).
    3. Umieść klatkę piersiową w 4% PFA (1% Trytonie) na 20 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    4. Przepłukać próbki 3 x 5 minut 1x roztworem płuczącym PBT (1% Triton w 1x PBS).
    5. Umieść klatkę piersiową na dwustronnej taśmie (Tabela materiałów) na szklanym szkiełku podstawowym i przetnij je na pół ostrym ostrzem mikrotomu, aby uzyskać dwie półklatki piersiowe (Rysunek 1E,F).
    6. Utrwalić próbki w 4% PFA (1% Tryton) przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    7. Umyć 2 x 20 min 1x roztworem myjącym PBT (1% Triton, 1x PBS) w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    8. Umieść półpiersi w zimnym 1x PBS i użyj kleszczy, aby delikatnie odizolować IFM od półklatki piersiowej (Rysunek 1G).
      UWAGA: Aby to osiągnąć, ważne jest, aby usunąć naskórek tak dokładnie, jak to możliwe.
    9. Aby przeniknąć próbki, należy przechowywać wyizolowane IFM w 70% roztworze EtOH przez co najmniej 2 dni i do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Odizoluj IFM od około 10 klatki piersiowej na eksperyment, aby zapewnić odpowiednią wielkość próbki do analizy.

2. Hybrydyzacja, barwienie immunologiczne i montowanie

UWAGA: Podobna procedura hybrydyzacji jest stosowana zarówno dla próbek z dysków skrzydeł, jak i IFM. Bardzo ważne jest, aby odizolować krążki skrzydeł od tusz larwalnych i umieścić je w 200 μl buforu A przed rozpoczęciem hybrydyzacji.

  1. Zawiesić sondy w 400 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) dla końcowego roztworu podstawowego 12,5 μM.
  2. Przenieść próbki do probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml zawierającej bufor A (tabela materiałów).
    UWAGA: Zmniejszając objętość pojemnika, łatwiej jest uwidocznić próbki i uniknąć ich utraty podczas procesu mycia.
  3. Przemywać próbki 2 x 20 minut buforem A.
  4. Odessać bufor A, zastąpić go 400 μl buforu hybrydyzacyjnego (tabela materiałów) i wstępnie hybrydyzować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w mieszalniku termicznym (tabela materiałów).
  5. Rozcieńczyć sondy do końcowego stężenia 125 nM dla krążków skrzydeł i 200 nM dla dorosłych mięśni, w buforze hybrydyzacyjnym i dodać przeciwciało pierwszorzędowe.
    UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał różni się w zależności od konkretnego stosowanego przeciwciała (Tabela materiałów). Dodanie przeciwciał jest opcjonalne. Użytkownicy mogą zdecydować się na rezygnację z barwienia białek i zamiast tego użyć podobnego protokołu smFISH, który nie obejmuje dodawania przeciwciał.
  6. Odessać bufor hybrydyzacyjny i zastąpić go 100 μl buforu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę i przeciwciało.
  7. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 16 godzin przy mieszaniu z prędkością 300 obr./min w mieszalniku termicznym.
  8. Podgrzać porcję buforu A w temperaturze 37 °C.
  9. Myć próbki przez 3 x 10 minut w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 °C i mieszaniu 300 obr./min.
  10. Podczas ostatniego płukania rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (1/200) i DAPI (1/10 000) w buforze A i inkubować próbki w tym roztworze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  11. Przemywać próbki przez 3 x 20 minut buforem B (tabela materiałów).
  12. Ostrożnie przenieść próbki na szkiełko mikroskopowe, zetrzeć resztki buforu B i dodać 30 μl podłoża mocującego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić preparat.
  13. Próbki należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaleca się jednak wykonanie obrazowania tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji sygnału sondy.

3. Obrazowanie

  1. Uzyskuj obrazy w trybie akwizycji xyz za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy zanurzeniowe z olejkiem 40x i 63x (tabela materiałów). Sygnał smFISH jest wykrywany przez detektor HyD w trybie zliczania fotonów.
  2. Zlokalizuj próbki za pomocą sygnału DAPI i lampy UV.
  3. Aby zobrazować mięśnie progenitorowe związane z dyskiem skrzydła i IFM (Rysunek 2 i Rysunek 3), zastosuj następującą konfigurację dla linii laserowych i filtrów emisyjnych: wybierz DAPI (wzbudzenie (np.) 405 nm, emisja (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (np. 496 nm, em. 519 nm) oraz Quasar 670 dla sond smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
  4. Aby zobrazować dorosłe MuSC (Rysunek 2D), zastosuj następującą konfigurację dla linii laserowych i filtrów emisyjnych: wybierz DAPI (np. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (np. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (np. 555 nm, em. 565 nm) i Quasar 670 dla sond smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
    UWAGA: Do obrazowania długości fal można dostosować do barwników związanych z przeciwciałami drugorzędowymi i sondami.
  5. Zapisz obrazy konfokalne jako . Pliki TIFF.

4. Analiza po obrazowaniu

  1. Aby rozpocząć, uruchom ImageJ i przejdź do menu Wtyczki. Stamtąd wybierz Makra | Edytuj, aby otworzyć kod źródłowy makr.
    UWAGA: Umożliwi to dostosowanie parametrów zgodnie z potrzebami, a w razie potrzeby zmodyfikowanie katalogu folderów dla każdego kanału w kodzie źródłowym makra.
  2. Aby postępować zgodnie z tym protokołem i określić ilościowo plamy Mef2 smFISH u larw, użyj następujących ustawień: Log_radius = 3,0 i Log_quality = 20,0. Segmentacja jąder Mef2-dodatnich z rozmyciem = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
  3. We włóknach mięśniowych należy zastosować następujące parametry: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; rozmycie = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
  4. Aby zainicjować makro, po prostu wykonaj polecenie uruchom i poczekaj, aż makro automatycznie załaduje wszystkie obrazy z wyznaczonego folderu i określi je ilościowo w sposób sekwencyjny.
    UWAGA: Należy pamiętać, że czas trwania tego procesu może wahać się od kilku sekund do kilku godzin, w zależności od ilości analizowanych danych.
  5. Poszukaj wyników wyświetlanych w dwóch nowych plikach .csv: file_FISH_results i file_nuclei_results. Pierwsza pokazuje liczbę plamek transkrypcyjnych oraz ich średnią i maksymalną intensywność. Druga podaje zarówno całkowitą liczbę jąder, jak i liczbę plamek wewnątrz każdego jądra.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole użyliśmy komercyjnie produkowanych sond ukierunkowanych na mRNA Mef2 i zfh1. Sondy zaprojektowaliśmy we współpracy z projektantem sond FISH (Tabela Materiałów). Zestaw Mef2 jest ukierunkowany na eksony wspólne dla wszystkich izoform RNA Mef2 (od eksonu 3 do eksonu 10). Zestaw zfh1 jest ukierunkowany na trzeci ekson wspólny dla izoform zfh1-RB i zfh1-RE10. Obie sondy są sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym Quasar 670.

Wygenerowaliśmy makro we własnym zakresie, które było kompatybilne z oprogramowaniem ImageJ, aby automatycznie analizować surowe dane .tif. Makro umożliwia segmentację 3D jąder według Cellpose26 za pomocą wtyczki Fiji BIOP oraz kwantyfikację plamki transkrypcyjnej przez Laplace'a lub Gaussa, jak zaimplementowano w Trackmate plugin27. MorpholibJ plugin28 jest używany do przetwarzania końcowego (plik uzupełniający 1).

Jako pierwszy krok, przeprowadziliśmy smFISH na dyskach imaginalnych skrzydeł, gdzie wiadomo, że Mef2 i zfh1 są wyrażane w AMPs. Dane te pokazują, że oba transkrypty są jednolicie wykrywane w populacji AMP barwionych przeciwciałami Mef2 lub Zfh1 (Rysunek 2A,B). Aktywne miejsca transkrypcji (TS) można ujawnić i odróżnić od dojrzałego mRNA przez smFISH, ponieważ są one zwykle większe i mają bardziej intensywne sygnały niż pojedyncze transkrypty cytoplazmatyczne lub dojrzałe transkrypty jądrowe. Konsekwentnie, większe powiększenia AMP rozróżniają ogniska TS i dojrzałe mRNA rozproszone w cytoplazmie ( Rysunek 2A', B'), potwierdzając czułość tego protokołu smFISH. Należy jednak wspomnieć, że zaobserwowaliśmy po jednym aktywnym TS na jądro zarówno dla zfh1, jak i Mef2 (Rysunek 2A',B'). Dane te dodatkowo potwierdzają dokładność projektu sondy, ponieważ wzorce transkrypcyjne Mef2 i zfh1 w AMP kolokalizują się z wykrywaniem odpowiednich białek (Rysunek 2).

W drugim kroku zbadaliśmy miejsce transkrypcji i dystrybucję mRNA Mef2 i zfh1 w zróżnicowanych dorosłych IFM i powiązanych komórkach macierzystych (Rysunek 2C,D). Dane te wyraźnie ilustrują Mef2 TS w jądrach mięśni syncytialnych i rozmieszczeniu mRNA Mef2 w cytoplazmie (Rysunek 2C, C'). Zfh1 specjalnie oznacza populację MuSCs10,11. Korzystając z tego protokołu smFISH, udało nam się wykryć transkrypcję zfh1 w MuSC oznaczonych ekspresją Zfh1-Gal4 > GFP. Większe powiększenie ilustruje wykrywanie zarówno zfh1 TS, jak i cytoplazmatycznych pojedynczych mRNA (Rysunek 2D').

Na koniec, użyliśmy naszego autorskiego makra ImageJ do ilościowej analizy dynamiki transkrypcji Mef2 i rozkładu przestrzennego. Potok obliczeniowy może skutecznie wykrywać i segmentować plamki Mef2 i jądra mięśniowe ( Rysunek 3A-C). Jednak ze względu na problemy ze stosunkiem sygnału do szumu, niektóre miejsca mogą nie zostać wykryte w niektórych przypadkach (Rysunek 3A',B'). Użyliśmy tej zautomatyzowanej metody, aby zbadać, czy obfitość mRNA Mef2 różni się między komórkami prekursorowymi mięśni (AMP) a zróżnicowanymi dorosłymi IFM. Nasza analiza pokazuje, że liczba mRNA Mef2 na jądra w dorosłych IFM i AMP nie różni się znacząco (Rysunek 3D).

Aby uzyskać wgląd w przestrzenny rozkład transkryptów Mef2 w dorosłych mięśniach IFM, określiliśmy ilościowo frakcję cytoplazmatycznych i jądrowych plamek mRNA Mef2 (Rysunek 3E,F). Za pomocą naszego programu policzyliśmy zarówno całkowitą liczbę plamek mRNA Mef2, jak i liczbę plamek mRNA Mef2 nakładających się na barwienie jąder (Mef2). Odjęcie mRNA związanego z jądrami od całkowitej liczby mRNA daje liczbę cytoplazmatycznych plamek mRNA. Nasze odkrycia pokazują, że około 92% mRNA Mef2 jest obecne w cytoplazmie, podczas gdy pozostałe 8% jest związane z jądrami mięśniowymi, jak pokazano w Rysunek 3E,F.

figure-results-1
Rysunek 1: Procedura preparowania i przygotowania krążków skrzydeł oraz próbek IFM dla smFISH. (A) L3 stadium larwy. (B) Wypreparowany i odwrócony przedni koniec larwy. Strzałki wskazują tarcze skrzydeł. (C) Izolowany dysk skrzydła. (D) Wypreparowana klatka piersiowa dorosłego osobnika. (E) Klatka piersiowa osoby dorosłej zorientowana na dwustronnej taśmie przed przecięciem (linia przerywana). (F) Dorosły krwionoś lęgowy. g) izolowane IFM. (H) Przebieg pracy protokołu smFISH. Skróty: IFM = pośrednie mięśnie lotu; smFISH = hybrydyzacja in situ fluorescencji fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA; EtOH = etanol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy Mef2 i zfh1 smFISH w dyskach skrzydeł i dorosłych IFM. (A,B) mRNA Mef2 i zfh1 (fioletowe) są wykrywane jednolicie w AMP i kolokalizują się odpowiednio z białkami (A,A') Mef2 i (B,B') Zfh1 (zielony). (A'',B'') Większe powiększenie AMPs. (C) MRNA Mef2 i białko Mef2 są wykrywane w dorosłych IFM. (C') Większe powiększenie obszaru pudełkowego w C. (D) Ekspresja Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP (zielona) oznacza dorosłe MuSC. zfh1 powiedział: RNA wykrywa się w dorosłych MuSC. (D') Większe powiększenie obszaru pudełkowego w D. Miejsca rozpoczęcia transkrypcji Zfh1 i pojedyncze mRNA są oznaczone odpowiednio strzałkami i grotami strzałek. Barwienie DAPI (niebieskie). Podziałka = 50 μm (A,B,A',B'), 10 μm (A",B",C,D), 5 μm (C',D'). Skróty: IFM = pośrednie mięśnie lotu; smFISH = hybrydyzacja in situ fluorescencji fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA; AMPs = przodkowie dorosłych mięśni; MuSC = komórki macierzyste mięśni; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Kwantyfikacja transkrypcji Mef2 i cytoplazmatycznego akumulacji mRNA przez smFISH. (A) Dystrybucja transkryptów Mef2 (fioletowy) i białka Mef2 (zielony) u dorosłych IFM typu dzikiego. (A') Większe powiększenie obszaru pudełkowego w A. Miejsca rozpoczęcia transkrypcji i pojedyncze mRNA są oznaczone odpowiednio strzałkami i grotami strzałek. (B,C) Automatyczne wyszukiwanie spotów Mef2 i segmentacja jądrowa. Cytoplazmatyczne i jądrowe mRNA Mef2 są oznaczone odpowiednio kolorem zielonym i magenta. (B',C') Większe powiększenia obszarów ramkowych w B i C. Gwiazdki wskazują miejsca, które nie są zliczane przez makro. (D) Przykład kwantyfikacji plamki Mef2 w AMP i dorosłych IFM, w stosunku do całkowitej liczby jąder. (p = 0,0785, test t-Studenta, tarcze skrzydeł (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Przykład kwantyfikacji rozkładu plamek Mef2 u dorosłych IFM. (*** p< 0,0007, test t-Studenta, n = 5). (F) Procent plamek mRNA Mef2 wykrytych wewnątrz i na zewnątrz jąder (n = 5). Podziałka liniowa = 10 μm (A,A'). Skróty: IFM = pośrednie mięśnie lotu; smFISH = hybrydyzacja in situ fluorescencji fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA; AMP = dorośli prekursorzy mięśni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Makro używane do przetwarzania końcowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie metody smFISH zyskało w ostatnim czasie na popularności, a jej zastosowanie rozszerzyło się na różne typy komórek i organizmy modelowe. Jednak w przypadku Drosophila większość wiedzy na temat ekspresji genów mięśniowych dorosłych osób pochodzi z masowych testów molekularnych, które nie dostarczają informacji ilościowych na temat dokładnej lokalizacji przestrzennej cząsteczek mRNA. Aby wypełnić tę lukę, zoptymalizowaliśmy metodę wykonywania smFISH na komórkach prekursorowych mięśni i dorosłych mięśniach Drosophila . Podejście to zostało zaadaptowane z wcześniej opublikowanego protokołu23 i zoptymalizowane pod kątem tkanek mięśniowych Drosophila .

Główną przeszkodą w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów smFISH jest grubość dorosłych mięśni, co utrudnia optymalną penetrację sond. Dlatego tak ważne jest, aby oddzielić dorosłe mięśnie od pozostałych tkanek zwierzęcia i przeprowadzić proces hybrydyzacji z łagodnym pobudzeniem. Ten szczególny krok zapewnia skuteczną przepuszczalność tkanek.

Innym krytycznym aspektem jest to, że stosunek sygnału do szumu może spowodować, że potok obliczeniowy nie będzie w stanie wykryć niektórych plamek mRNA. Odkryliśmy, że zwiększenie stosunku sygnału do szumu można osiągnąć poprzez znalezienie optymalnego stężenia sond. Optymalne rozcieńczenie może się różnić w zależności od składu każdego zestawu sond, w tym sprzężonego barwnika i składu oligonukleotydów. Zalecamy wypróbowanie różnych rozcieńczeń; końcowe rozcieńczenie 200 nM dało najlepszy stosunek sygnału do szumu dla tkanek dorosłych w tych eksperymentach.

Dzięki metodzie smFISH możliwe jest ilościowe określenie liczby nowo zsyntetyzowanych RNA w ogniskach TS. Kiedy gen jest aktywnie transkrybowany, wiele powstających RNA jest wytwarzanych jednocześnie w TS. W rezultacie, intensywność TS przewyższy intensywność dojrzałego cytoplazmatycznego RNA, a ta cecha, w połączeniu z lokalizacją jądrową, może odróżnić TS od poszczególnych cytoplazmatycznych RNA. W kontekście biologii mięśni wykrywanie i oznaczanie ilościowe TS są szczególnie ważne dla określenia synchronizacji transkrypcji określonego genu między jądrami mięśniowymi w obrębie tego samego syncytium. Jednak ten potok obliczeniowy nie jest przeznaczony do różnicowania cytoplazmatycznych sygnałów mRNA i TS. Jako alternatywę sugerujemy połączenie tej metody smFISH z innymi sprawdzonymi narzędziami do analizy smFISH, takimi jak BayFISH lub FISH-quant29,30. Udowodniono, że narzędzia te ułatwiają automatyczną segmentację i obliczenia intensywności fluorescencji agregatów RNA z niezwykłą precyzją.

Wreszcie, chociaż smFISH wykrywa cząsteczki mRNA z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ogranicza się do jednoczesnej analizy niewielkiej liczby mRNA. Metody wieloskalowe, takie jak merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) umożliwiają jednoczesną analizę dużej liczby różnych mRNA31. Łącząc sondy oligonukleotydowe i kody korygujące błędy, metoda ta ułatwia wykrywanie setek gatunków RNA w pojedynczych komórkach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alainowi Vincentowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Ruth Lehmann za dostarczenie przeciwciała Zfh1. Dziękujemy za pomoc Stephanie Dutertre i Xaviera Pinsona w zakresie mikroskopii konfokalnej na platformie obrazowania MRic. EL jest wspierany przez stypendium doktoranckie od ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. Ameryka Północna jest wspierana przez stypendium doktoranckie AFM-Telethon 23846. TP jest finansowany z grantu Chan Zuckerberg Initiative DAF dla T.P. (2019-198009). HB jest wspierany przez CNRS, program Atip Avenir oraz grant AFM-Telethon na trampolinę 23108.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalny SP8LeicaSP8 DMI 6000
DAPIThermoFisher62248
Taśma dwustronna Taśma tesa 57910-00000
Dumont #55 KleszczeNarzędzia do nauki11255-20
Formaldehyd 16%EuromedexEM-15710
Przeciwciało Mef2DHSBNA
PBS 10xEuromedexET330
RNaseZAPSigma-AldrichR2020
Sondy StellarisLGCNA
Bufor hybrydyzacyjny Stellaris RNA FISHLGCSMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Bufor do płukania ALGCSMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Bufor do płukania BLGCSMF-WB1-20
Swann-Morton BladesFisher scientific0210
ThermoMixerEppendorf5382000015
Triton X-100Euromedex2000
UAS-mCD8::Linia GFPBloomingtonRRID:BDSC_5137
Ultraczysta wodaSigma-Aldrich95284
Szkiełko zegarka, kwadratowe, 1 5/8 cala Przeciwciało Carolina742300
Zfh1Podarowane przez Ruth Leahman
Zfh1-Gal4BloomingtonBDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
  4. Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
  5. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  6. Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112(2021).
  7. Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
  8. Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459(2022).
  9. Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364(2019).
  10. Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954(2018).
  11. Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107(2017).
  12. Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126(2014).
  13. Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
  14. Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497(2015).
  15. Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  16. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
  17. Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
  18. Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
  19. Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388(2021).
  20. Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079(2021).
  21. Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432(2022).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).
  23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  24. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  25. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
  26. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  27. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  28. Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
  29. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  30. Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164(2017).
  31. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

smFISH pojedynczych cz steczekmi nie Drosophilaprzestrzenna dystrybucja mRNAkom rki macierzyste mi nimikroskopia konfokalnaanaliza w ImageJregeneracja mi niekspresja Mef2czynnik transkrypcyjny Zfh1

Powiązane artykuły