Artykuł metodologiczny

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65713

⸱

8 września 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR), UMR6290 CNRS - Université de Rennes, 2BIOSIT, UAR 3480 US 018, Université de Rennes

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe to duże syncytia składające się z wielu wiązek włókien mięśniowych, które wytwarzają siły i umożliwiają ruch ciała. Drosophila jest klasycznym modelem do badania biologii mięśni. Połączenie genetyki Drosophila i zaawansowanych metod omicznych doprowadziło do zidentyfikowania kluczowych konserwatywnych cząsteczek, które regulują morfogenezę i regenerację mięśni. Jednak dynamika transkrypcji tych cząsteczek i przestrzenny rozkład ich informacyjnego RNA w syncytii nie mogą być ocenione konwencjonalnymi metodami. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy istniejącą metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki RNA (smFISH), aby umożliwić wykrywanie i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w dorosłych mięśniach lotu i ich komórkach macierzystych mięśni. Jako dowód słuszności koncepcji przeanalizowaliśmy ekspresję i dystrybucję mRNA dwóch ewolucyjnie konserwatywnych czynników transkrypcyjnych, Mef2 i Zfh1 / Zeb. Pokazujemy, że ta metoda może skutecznie wykrywać i określać ilościowo pojedyncze cząsteczki mRNA dla obu transkryptów w komórkach prekursorowych mięśni, dorosłych mięśniach i komórkach macierzystych mięśni.

Wprowadzenie

Dorosłe mięśnie szkieletowe zbudowane są z zróżnicowanych wielojądrowych włókien mięśniowych, których właściwości kurczliwe generują ruchy. Wzrost, utrzymanie i regeneracja mięśni opierają się na progenitorach mięśniowych i komórkach macierzystych mięśni (MuSC), które są określone podczas rozwoju embrionalnego1. Program miogenny jest precyzyjnie kontrolowany przez zestaw podstawowych miogennych czynników transkrypcyjnych (TF) (np. Pax3/7, MYOD, Mef2 i ZEB)2,3,4. Rozszyfrowanie mechanizmów molekularnych regulujących biologię mięśni jest ważne dla wyjaśnienia podstawowych pytań związanych z miologią oraz dla możliwego zastosowania terapeutycznego w leczeniu chorób zwyrodnieniowych mięśni.

Drosophila ma długą historię jako model genetyczny do badania miogenezy5. Niedawno pojawił się jako nowy model do badania regeneracji mięśni6,7,8. Struktura mięśni i podstawowe programy miogenne są wysoce konserwatywne między muchami i ssakami. Na przykład TF Mef2 i Zfh1/ZEB mają zachowaną funkcję w regulacji rozwoju i regeneracji mięśni3,9,10,11. Dorosłe mięśnie Drosophila, takie jak mięśnie lotu pośredniego (IFM), są tworzone z określonej populacji MuSC, znanych jako Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. Te AMP są określane podczas embriogenezy i wiążą się ze strukturami nabłonkowymi, takimi jak dyski skrzydeł i nóg. W stadiach embrionalnych i larwalnych AMP pozostają niezróżnicowane aż do metamorfozy, kiedy angażują się w różnicowanie i fuzję, tworząc IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) ulega ekspresji podczas rozwoju mięśni lotu i jest niezbędny do określenia ich tożsamości strukturalnej15. Mef2 to kolejny ważny miogenny TF, który jest niezbędny do tworzenia mięśni u dorosłych16,17. Jest on wyrażony w AMP i utrzymywany w dorosłych IFMs10,18. Podczas gdy większość AMP różnicuje się w funkcjonalne mięśnie, podzbiór wymyka się różnicowaniu i tworzy dorosłe MuSCs11. Podobnie jak w przypadku kręgowców, TF Zfh1/ZEB jest wymagany, aby zapobiec przedwczesnemu różnicowaniu się dorosłych MuSC i utrzymać ich stemness9,10.

Udowodniono, że dynamika ekspresji genów reguluje różne procesy biologiczne mięśni19,20. Pojawienie się wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder umożliwiło kompleksowe zbadanie tej dynamiki transkrypcji21,22. Jednym z istotnych ograniczeń tych podejść jest ich niezdolność do zapewnienia przestrzennego rozkładu cząsteczek mRNA w wielojądrowych włóknach mięśniowych. Cechy te można badać za pomocą jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (smFISH), która ujawnia dwa typy ciał mRNA: 1. Pojedyncze cząsteczki mRNA rozproszone w cytoplazmie i reprezentujące dojrzały RNA oraz 2. Maksymalnie dwa jasne ogniska jądrowe odpowiadają powstającemu transkryptowi i ujawniają aktywne transkrypcyjnie allele 23. W związku z tym smFISH jest metodą z wyboru do kwantyfikacji poszczególnych cząsteczek mRNA, badając ich rozmieszczenie przestrzenne i dostarczając migawek dynamiki transkrypcji genów.

Metoda smFISH opiera się na zestawie krótkich fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych, specjalnie zaprojektowanych tak, aby były komplementarne do docelowego transkryptu. Po wyżarzaniu generuje źródła punktowe o wysokiej intensywności, co pozwala na wykrycie mRNA na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii konfokalnej24. Metoda ta jest coraz częściej stosowana w przypadku wielu różnych typów komórek, w tym tkanek mięśniowych ssaków19,20. Jednak u Drosophila, podobnie jak w innych modelach zwierzęcych, większość wiedzy na temat ekspresji genów mięśni dorosłych pochodzi z masowych testów molekularnych, w których brakuje informacji ilościowych na temat lokalizacji przestrzennej cząsteczek mRNA. Tutaj zoptymalizowaliśmy metodę wykonywania smFISH na komórkach prekursorowych mięśni i dorosłych mięśniach Drosophila23,25. Protokół ten obejmuje w pełni zautomatyzowany potok analityczny do segmentacji jąder oraz zliczania i lokalizacji mRNA.

Protokół

1. Sekcja i przygotowanie dysku skrzydłowego i mięśni dorosłych

UWAGA: Oczyść stół separacyjny i wszystkie narzędzia do sekcji roztworem inhibitora RNAzy (Tabela materiałów). Podczas całej procedury doświadczalnej należy nosić rękawice laboratoryjne.

  1. Tarcza skrzydłowa
    1. Umieść larwy L3 w zimnym 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (Rysunek 1A).
    2. Opłucz larwy 3x 1x PBS i trzymaj je w tym roztworze przez 5 minut.
    3. Za pomocą dwóch par ostrych kleszczy przytrzymaj larwę od przedniej części i pociągnij i wyrzuć resztę tkanek ciała (około 2/3).
    4. Przytrzymaj zarówno pierwszą 1/3 larwy jedną parą kleszczy, jak i haczyki do ust drugą parą. Schowaj haczyki gębowe wewnątrz larwy, aż zostanie całkowicie odwrócona.
      UWAGA: Wypreparuj około 30 larw na eksperyment, aby zapewnić odpowiednią wielkość próbki do analizy.
    5. Zauważ, że krążki skrzydeł są ściśle związane z dwiema głównymi gałęziami tchawicy, które biegną wzdłuż każdej strony larwy.
    6. Usuń wszystkie inne elementy larwalne (krążki nóg i mózg), aby uzyskać czystą, odwróconą tuszę larwalną z parą krążków skrzydeł przyczepionych do tchawicy (Ryc. 1B).
    7. Umieścić próbki w probówce wirówkowej o pojemności 1 ml i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w 1x PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
      UWAGA: Mieszanie próbki uzyskuje się za pomocą mieszadła oscylacyjnego (Tabela materiałów).
    8. Przemyć próbki 3 x 5 minut 70% etanolem (EtOH, rozcieńczonym w wodzie wolnej od RNAzy) i przechowywać je w tym samym roztworze myjącym w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 dni i do 1 tygodnia.
  2. Pośrednie mięśnie lotu
    1. Znieczulij dorosłe muchy na moskitierze CO2 i usuń głowy, brzuchy, nogi i skrzydła.
    2. Umieść wypreparowane klatki piersiowe w zimnym 1x PBS i kontynuuj to, aż wszystkie próbki zostaną wycięte (Rysunek 1D).
    3. Umieść klatkę piersiową w 4% PFA (1% Trytonie) na 20 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    4. Przepłukać próbki 3 x 5 minut 1x roztworem płuczącym PBT (1% Triton w 1x PBS).
    5. Umieść klatkę piersiową na dwustronnej taśmie (Tabela materiałów) na szklanym szkiełku podstawowym i przetnij je na pół ostrym ostrzem mikrotomu, aby uzyskać dwie półklatki piersiowe (Rysunek 1E,F).
    6. Utrwalić próbki w 4% PFA (1% Tryton) przez 45 minut w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    7. Umyć 2 x 20 min 1x roztworem myjącym PBT (1% Triton, 1x PBS) w temperaturze pokojowej pod mieszaniem.
    8. Umieść półpiersi w zimnym 1x PBS i użyj kleszczy, aby delikatnie odizolować IFM od półklatki piersiowej (Rysunek 1G).
      UWAGA: Aby to osiągnąć, ważne jest, aby usunąć naskórek tak dokładnie, jak to możliwe.
    9. Aby przeniknąć próbki, należy przechowywać wyizolowane IFM w 70% roztworze EtOH przez co najmniej 2 dni i do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Odizoluj IFM od około 10 klatki piersiowej na eksperyment, aby zapewnić odpowiednią wielkość próbki do analizy.

2. Hybrydyzacja, barwienie immunologiczne i montowanie

UWAGA: Podobna procedura hybrydyzacji jest stosowana zarówno dla próbek z dysków skrzydeł, jak i IFM. Bardzo ważne jest, aby odizolować krążki skrzydeł od tusz larwalnych i umieścić je w 200 μl buforu A przed rozpoczęciem hybrydyzacji.

  1. Zawiesić sondy w 400 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) dla końcowego roztworu podstawowego 12,5 μM.
  2. Przenieść próbki do probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml zawierającej bufor A (tabela materiałów).
    UWAGA: Zmniejszając objętość pojemnika, łatwiej jest uwidocznić próbki i uniknąć ich utraty podczas procesu mycia.
  3. Przemywać próbki 2 x 20 minut buforem A.
  4. Odessać bufor A, zastąpić go 400 μl buforu hybrydyzacyjnego (tabela materiałów) i wstępnie hybrydyzować próbki przez 30 minut w temperaturze 37 °C w mieszalniku termicznym (tabela materiałów).
  5. Rozcieńczyć sondy do końcowego stężenia 125 nM dla krążków skrzydeł i 200 nM dla dorosłych mięśni, w buforze hybrydyzacyjnym i dodać przeciwciało pierwszorzędowe.
    UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał różni się w zależności od konkretnego stosowanego przeciwciała (Tabela materiałów). Dodanie przeciwciał jest opcjonalne. Użytkownicy mogą zdecydować się na rezygnację z barwienia białek i zamiast tego użyć podobnego protokołu smFISH, który nie obejmuje dodawania przeciwciał.
  6. Odessać bufor hybrydyzacyjny i zastąpić go 100 μl buforu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę i przeciwciało.
  7. Próbki inkubować w ciemności w temperaturze 37 °C przez co najmniej 16 godzin przy mieszaniu z prędkością 300 obr./min w mieszalniku termicznym.
  8. Podgrzać porcję buforu A w temperaturze 37 °C.
  9. Myć próbki przez 3 x 10 minut w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 °C i mieszaniu 300 obr./min.
  10. Podczas ostatniego płukania rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (1/200) i DAPI (1/10 000) w buforze A i inkubować próbki w tym roztworze w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  11. Przemywać próbki przez 3 x 20 minut buforem B (tabela materiałów).
  12. Ostrożnie przenieść próbki na szkiełko mikroskopowe, zetrzeć resztki buforu B i dodać 30 μl podłoża mocującego i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm. Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić preparat.
  13. Próbki należy przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaleca się jednak wykonanie obrazowania tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć degradacji sygnału sondy.

3. Obrazowanie

  1. Uzyskuj obrazy w trybie akwizycji xyz za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektywy zanurzeniowe z olejkiem 40x i 63x (tabela materiałów). Sygnał smFISH jest wykrywany przez detektor HyD w trybie zliczania fotonów.
  2. Zlokalizuj próbki za pomocą sygnału DAPI i lampy UV.
  3. Aby zobrazować mięśnie progenitorowe związane z dyskiem skrzydła i IFM (Rysunek 2 i Rysunek 3), zastosuj następującą konfigurację dla linii laserowych i filtrów emisyjnych: wybierz DAPI (wzbudzenie (np.) 405 nm, emisja (em.) 450 nm), Alexa Fluor 488 (np. 496 nm, em. 519 nm) oraz Quasar 670 dla sond smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
  4. Aby zobrazować dorosłe MuSC (Rysunek 2D), zastosuj następującą konfigurację dla linii laserowych i filtrów emisyjnych: wybierz DAPI (np. 405 nm, em. 450 nm), Alexa Fluor 488 (np. 496 nm, em. 519 nm), Alexa Fluor 555 (np. 555 nm, em. 565 nm) i Quasar 670 dla sond smFISH (ex. 647 nm, em. 670 nm).
    UWAGA: Do obrazowania długości fal można dostosować do barwników związanych z przeciwciałami drugorzędowymi i sondami.
  5. Zapisz obrazy konfokalne jako . Pliki TIFF.

4. Analiza po obrazowaniu

  1. Aby rozpocząć, uruchom ImageJ i przejdź do menu Wtyczki. Stamtąd wybierz Makra | Edytuj, aby otworzyć kod źródłowy makr.
    UWAGA: Umożliwi to dostosowanie parametrów zgodnie z potrzebami, a w razie potrzeby zmodyfikowanie katalogu folderów dla każdego kanału w kodzie źródłowym makra.
  2. Aby postępować zgodnie z tym protokołem i określić ilościowo plamy Mef2 smFISH u larw, użyj następujących ustawień: Log_radius = 3,0 i Log_quality = 20,0. Segmentacja jąder Mef2-dodatnich z rozmyciem = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8,0; nucleus_size = 300.
  3. We włóknach mięśniowych należy zastosować następujące parametry: Log_radius = 2,5; Log_quality = 60,0; rozmycie = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0,0; nucleus_size = 300.
  4. Aby zainicjować makro, po prostu wykonaj polecenie uruchom i poczekaj, aż makro automatycznie załaduje wszystkie obrazy z wyznaczonego folderu i określi je ilościowo w sposób sekwencyjny.
    UWAGA: Należy pamiętać, że czas trwania tego procesu może wahać się od kilku sekund do kilku godzin, w zależności od ilości analizowanych danych.
  5. Poszukaj wyników wyświetlanych w dwóch nowych plikach .csv: file_FISH_results i file_nuclei_results. Pierwsza pokazuje liczbę plamek transkrypcyjnych oraz ich średnią i maksymalną intensywność. Druga podaje zarówno całkowitą liczbę jąder, jak i liczbę plamek wewnątrz każdego jądra.

Wyniki

W niniejszym protokole zastosowano komercyjne sondy skierowane przeciwko mRNA Mef2 oraz zfh1. Sondy zostały zaprojektowane za pomocą narzędzia producenta do projektowania sond FISH (Tabela materiałów). Zestaw dla Mef2 jest skierowany przeciwko egzonom wspólnym dla wszystkich izoform RNA Mef2 (od egzonu 3 do egzonu 10). Zestaw dla zfh1 jest skierowany przeciwko trzeciemu egzonowi wspólnemu dla izoform zfh1-RB i zfh1-RE10. Obie sondy są koniugowane z barwnikiem fluorescencyjnym Quasar 670.

Opracowaliśmy wewnętrznie makro kompatybilne z oprogramowaniem ImageJ do automatycznej analizy surowych danych w formacie .tif. Makro to umożliwia trójwymiarową segmentację jąder komórkowych za pomocą programu Cellpose.26 za pomocą wtyczki BIOP do programu Fiji oraz kwantyfikacji punktów transkrypcyjnych przy użyciu laplasjanu rozkładu Gaussa, zaimplementowanego we wtyczce Trackmate27Wtyczka MorpholibJ28 jest wykorzystywany do postprocessingu (Plik uzupełniający 1).

W pierwszym kroku przeprowadzono smFISH na dyskach wyobraźnych skrzydła, w których wiadomo, że Mef2 i zfh1 są ekspresowane w AMP. Dane te pokazują, że oba transkrypty są jednolicie wykrywane w populacji AMP współbarwionej przeciwciałami przeciwko Mef2 lub Zfh1 (Rysunek 2A,B). Aktywne miejsca transkrypcji (TS) można ujawnić i odróżnić od dojrzałego mRNA za pomocą smFISH, ponieważ mają one tendencję do bycia większymi i wykazują intensywniejsze sygnały niż poszczególne transkrypty cytoplazmatyczne lub dojrzałe transkrypty jądrowe. Konsekwentnie, przy większych powiększeniach AMP można odróżnić ogniska TS od dojrzałego mRNA rozproszonego w cytoplazmie (Rysunek 2A',B'), co potwierdza czułość tego protokołu smFISH. Należy jednak wspomnieć, że zaobserwowano jedno aktywne TS na jądro zarówno dla zfh1 , jak i Mef2 (Rysunek 2A',B'). Dane te dodatkowo potwierdzają poprawność projektu sond, ponieważ wzorce transkrypcyjne Mef2 i zfh1 w AMP kolokalizują z detekcją ich odpowiednich białek (Rysunek 2).

W drugim kroku zbadaliśmy miejsce transkrypcji oraz dystrybucję mRNA Mef2 i zfh1 w zróżnicowanych dorosłych IFM oraz powiązanych z nimi komórkach macierzystych (Ryc. 2C,D). Dane te wyraźnie obrazują miejsca transkrypcji (TS) Mef2 w syncytialnych jądrach mięśniowych oraz dystrybucję mRNA Mef2 w całej cytoplazmie (Ryc. 2C,C'). Zfh1 specyficznie znakuje populację MuSC10,11. Stosując ten protokół smFISH, skutecznie wykryliśmy transkrypcję zfh1 w komórkach MuSC znakowanych ekspresją Zfh1-Gal4 > GFP. Większe powiększenie obrazuje detekcję zarówno TS zfh1, jak i pojedynczych cząsteczek mRNA w cytoplazmie (Ryc. 2D').

Na koniec wykorzystaliśmy opracowaną we własnym zakresie makrę ImageJ do ilościowej analizy dynamiki transkrypcyjnej i rozmieszczenia przestrzennego Mef2. Potok obliczeniowy pozwala na efektywne wykrywanie i segmentację punktów Mef2 oraz jąder mięśniowych (Rysunek 3A-C). Jednak ze względu na problemy ze stosunkiem sygnału do szumu, w niektórych przypadkach niektóre punkty mogą nie zostać wykryte (Rysunek 3A',B'). Użyliśmy tej zautomatyzowanej metody, aby zbadać, czy poziom mRNA Mef2 różni się pomiędzy komórkami prekursorowymi mięśni (AMP) a zróżnicowanymi dorosłymi IFM. Nasza analiza wykazuje, że liczba cząsteczek mRNA Mef2 na jądro w dorosłych IFM oraz w AMP nie różni się znacząco (Rysunek 3D).

Aby uzyskać wgląd w rozmieszczenie przestrzenne transkryptów Mef2 w mięśniach IFM osobników dorosłych, określiliśmy frakcję cytoplazmatycznych i jądrowych punktów mRNA Mef2 (Rycina 3E,F). Za pomocą naszego programu policzyliśmy zarówno całkowitą liczbę punktów mRNA Mef2, jak i liczbę punktów mRNA Mef2 nakładających się na barwienie jąder (Mef2). Odjęcie liczby mRNA związanej z jądrami od całkowitej liczby mRNA pozwala wyznaczyć liczbę cytoplazmatycznych punktów mRNA. Nasze wyniki wykazują, że około 92% mRNA Mef2 znajduje się w cytoplazmie, podczas gdy pozostałe 8% jest związane z jądrami mięśniowymi, co pokazano na Rycynie 3E,F.

Schemat sekcji Drosophila przedstawiający przygotowanie klatki piersiowej larw i dorosłych osobników do analizy mikroskopowej.
Rycina 1: Procedura sekcji i przygotowania krążków skrzydłowych oraz próbek IFM do smFISH. (A) Larwy w stadium L3. (B) Zsekcjonowany i odwrócony przedni koniec larwy. Strzałki wskazują krążki skrzydłowe. (C) Wyizolowany krążek skrzydłowy. (D) Zsekcjonowane klatki piersiowe dorosłych osobników. (E) Klatka piersiowa dorosłego osobnika umieszczona na dwustronnej taśmie przed podziałem na pół (linia przerywana). (F) Hemitoraks dorosłego osobnika. (G) Wyizolowane IFM. (H) Schemat protokołu smFISH. Skróty: IFMs = pośrednie mięśnie lotne; smFISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA; EtOH = etanol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna markerów Mef2 i Zfh1 w tkankach Drosophila; analiza ekspresji białek.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy smFISH dla Mef2 i zfh1 w dyskach skrzydłowych i dorosłych IFMs. (A,B) mRNA Mef2 i zfh1 (fioletowe) są wykrywane równomiernie w AMPs i kolokalizują odpowiednio z (A,A') białkami Mef2 oraz (B,B') białkami Zfh1 (zielone). (A'',B'') Większe powiększenie AMPs. (C) mRNA Mef2 i białko Mef2 są wykrywane w dorosłych IFMs. (C') Większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w C. (D) Ekspresja Zfh1-Gal4 >UAS-mCD8GFP (zielona) znakuje dorosłe MuSCs. RNA zfh1 jest wykrywane w dorosłych MuSCs. (D') Większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w D. Miejsca startu transkrypcji Zfh1 oraz pojedyncze cząsteczki mRNA są wskazane odpowiednio strzałkami i grotami strzałek. Barwienie DAPI (niebieskie). Paski skali = 50 µm (A,B,A',B'), 10 µm (A",B",C,D), 5 µm (C',D'). Skróty: IFMs = pośrednie mięśnie lotne; smFISH = hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA z fluorescencją; AMPs = dorosłe progenitory mięśniowe; MuSCs = komórki macierzyste mięśni; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; GFP = zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykrywanie punktów transkrypcyjnych Mef2; obrazy mikroskopowe, segmentacja jąder, histogramy do analizy danych.
Rycina 3: Ilościowe określenie transkrypcji Mef2 i akumulacji mRNA w cytoplazmie za pomocą smFISH. (A) Rozkład transkryptów Mef2 (fioletowy) i białka Mef2 (zielony) w dorosłych IFM typu dzikiego. (A') Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką w A. Miejsca rozpoczęcia transkrypcji i pojedyncze cząsteczki mRNA są wskazane odpowiednio strzałkami i grotami strzałek. (B,C) Automatyczne wykrywanie punktów Mef2 i segmentacja jąder. Cytoplazmatyczne i jądrowe mRNA Mef2 są zaznaczone odpowiednio na zielono i purpurowo. (B',C') Powiększenia obszarów zaznaczonych ramką w B i C. Gwiazdki wskazują punkty, które nie zostały policzone przez makro. (D) Przykład kwantyfikacji punktów Mef2 w AMP i dorosłych IFM, w stosunku do całkowitej liczby jąder. (p = 0,0785, test t Studenta, krążki skrzydeł (n = 4), IFM (n = 11)). (E) Przykład kwantyfikacji rozkładu punktów Mef2 w dorosłych IFM. (*** p < 0,0007, test t Studenta, n = 5). (F) Procent punktów mRNA Mef2 wykrytych wewnątrz i na zewnątrz jąder (n = 5). Paski skali = 10 µm (A,A'). Skróty: IFM = pośrednie mięśnie lotne; smFISH = fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA; AMP = dorosłe progenitory mięśniowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Makro użyte do postprocessingu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zastosowanie metody smFISH zyskało w ostatnim czasie na popularności, a jej zastosowanie rozszerzyło się na różne typy komórek i organizmy modelowe. Jednak w przypadku Drosophila większość wiedzy na temat ekspresji genów mięśniowych dorosłych osób pochodzi z masowych testów molekularnych, które nie dostarczają informacji ilościowych na temat dokładnej lokalizacji przestrzennej cząsteczek mRNA. Aby wypełnić tę lukę, zoptymalizowaliśmy metodę wykonywania smFISH na komórkach prekursorowych mięśni i dorosłych mięśniach Drosophila . Podejście to zostało zaadaptowane z wcześniej opublikowanego protokołu23 i zoptymalizowane pod kątem tkanek mięśniowych Drosophila .

Główną przeszkodą w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów smFISH jest grubość dorosłych mięśni, co utrudnia optymalną penetrację sond. Dlatego tak ważne jest, aby oddzielić dorosłe mięśnie od pozostałych tkanek zwierzęcia i przeprowadzić proces hybrydyzacji z łagodnym pobudzeniem. Ten szczególny krok zapewnia skuteczną przepuszczalność tkanek.

Innym krytycznym aspektem jest to, że stosunek sygnału do szumu może spowodować, że potok obliczeniowy nie będzie w stanie wykryć niektórych plamek mRNA. Odkryliśmy, że zwiększenie stosunku sygnału do szumu można osiągnąć poprzez znalezienie optymalnego stężenia sond. Optymalne rozcieńczenie może się różnić w zależności od składu każdego zestawu sond, w tym sprzężonego barwnika i składu oligonukleotydów. Zalecamy wypróbowanie różnych rozcieńczeń; końcowe rozcieńczenie 200 nM dało najlepszy stosunek sygnału do szumu dla tkanek dorosłych w tych eksperymentach.

Dzięki metodzie smFISH możliwe jest ilościowe określenie liczby nowo zsyntetyzowanych RNA w ogniskach TS. Kiedy gen jest aktywnie transkrybowany, wiele powstających RNA jest wytwarzanych jednocześnie w TS. W rezultacie, intensywność TS przewyższy intensywność dojrzałego cytoplazmatycznego RNA, a ta cecha, w połączeniu z lokalizacją jądrową, może odróżnić TS od poszczególnych cytoplazmatycznych RNA. W kontekście biologii mięśni wykrywanie i oznaczanie ilościowe TS są szczególnie ważne dla określenia synchronizacji transkrypcji określonego genu między jądrami mięśniowymi w obrębie tego samego syncytium. Jednak ten potok obliczeniowy nie jest przeznaczony do różnicowania cytoplazmatycznych sygnałów mRNA i TS. Jako alternatywę sugerujemy połączenie tej metody smFISH z innymi sprawdzonymi narzędziami do analizy smFISH, takimi jak BayFISH lub FISH-quant29,30. Udowodniono, że narzędzia te ułatwiają automatyczną segmentację i obliczenia intensywności fluorescencji agregatów RNA z niezwykłą precyzją.

Wreszcie, chociaż smFISH wykrywa cząsteczki mRNA z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ogranicza się do jednoczesnej analizy niewielkiej liczby mRNA. Metody wieloskalowe, takie jak merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) umożliwiają jednoczesną analizę dużej liczby różnych mRNA31. Łącząc sondy oligonukleotydowe i kody korygujące błędy, metoda ta ułatwia wykrywanie setek gatunków RNA w pojedynczych komórkach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Alainowi Vincentowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Ruth Lehmann za dostarczenie przeciwciała Zfh1. Dziękujemy za pomoc Stephanie Dutertre i Xaviera Pinsona w zakresie mikroskopii konfokalnej na platformie obrazowania MRic. EL jest wspierany przez stypendium doktoranckie od ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. Ameryka Północna jest wspierana przez stypendium doktoranckie AFM-Telethon 23846. TP jest finansowany z grantu Chan Zuckerberg Initiative DAF dla T.P. (2019-198009). HB jest wspierany przez CNRS, program Atip Avenir oraz grant AFM-Telethon na trampolinę 23108.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop konfokalny SP8LeicaSP8 DMI 6000
DAPIThermoFisher62248
Taśma dwustronna Taśma tesa 57910-00000
Dumont #55 KleszczeNarzędzia do nauki11255-20
Formaldehyd 16%EuromedexEM-15710
Przeciwciało Mef2DHSBNA
PBS 10xEuromedexET330
RNaseZAPSigma-AldrichR2020
Sondy StellarisLGCNA
Bufor hybrydyzacyjny Stellaris RNA FISHLGCSMF-HB1-10
Stellaris RNA FISH Bufor do płukania ALGCSMF-WA1-60
Stellaris RNA FISH Bufor do płukania BLGCSMF-WB1-20
Swann-Morton BladesFisher scientific0210
ThermoMixerEppendorf5382000015
Triton X-100Euromedex2000
UAS-mCD8::Linia GFPBloomingtonRRID:BDSC_5137
Ultraczysta wodaSigma-Aldrich95284
Szkiełko zegarka, kwadratowe, 1 5/8 cala Przeciwciało Carolina742300
Zfh1Podarowane przez Ruth Leahman
Zfh1-Gal4BloomingtonBDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625

Bibliografia

  1. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
  2. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  3. Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
  4. Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
  5. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  6. Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112(2021).
  7. Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
  8. Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459(2022).
  9. Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364(2019).
  10. Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954(2018).
  11. Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107(2017).
  12. Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126(2014).
  13. Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
  14. Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497(2015).
  15. Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  16. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
  17. Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
  18. Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
  19. Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388(2021).
  20. Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079(2021).
  21. Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432(2022).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).
  23. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  24. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  25. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
  26. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  27. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  28. Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
  29. Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
  30. Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164(2017).
  31. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

smFISH pojedynczych cząsteczekmięśnie Drosophilaprzestrzenna dystrybucja mRNAkomórki macierzyste mięśnimikroskopia konfokalnaanaliza w ImageJregeneracja mięśniekspresja Mef2czynnik transkrypcyjny Zfh1
Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.