Artykuł metodologiczny

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

DOI:

10.3791/65715

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cytometry and Biomarkers UTechS, C2RT, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, INSERM U1224, 3Istituto Superiore di Sanità

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza pojedynczych komórek stała się podejściem z wyboru do odkrywania złożoności procesów biologicznych, które wymagają oceny zmienności indywidualnych odpowiedzi komórkowych na leczenie lub infekcję z rozdzielczością pojedynczej komórki.

W ciągu ostatnich 10 lat opracowano wiele technik profilowania molekularnego pojedynczej komórki, a kilka dedykowanych technologii zostało skomercjalizowanych. Profilowanie pojedynczych komórek oparte na kropelkach 10X Genomics to szeroko rozpowszechniona technologia, która oferuje gotowe do użycia odczynniki do transkryptomicznego i wieloomicznego profilowania pojedynczych komórek. Technologia obejmuje procesy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i pojedynczych jąder (odpowiednio scRNA-Seq i snRNA-Seq), scATAC-Seq, profilowania immunologicznego pojedynczej komórki (sekwencjonowanie BCR/TCR) i multiomu. Ten ostatni łączy w sobie informację transkrypcyjną (scRNA-Seq) i epigenetyczną (scATAC-Seq) pochodzącą z tej samej komórki.

Jakość (żywotność, integralność, czystość) zawiesin pojedynczych komórek lub pojedynczych jąder wyizolowanych z tkanek i analizowanych za pomocą któregokolwiek z tych podejść jest kluczowa dla generowania danych wysokiej jakości. W związku z tym protokoły przygotowania próbek powinny być dostosowane do specyfiki każdej tkanki biologicznej i zapewniać wytwarzanie wysokiej jakości zawiesin komórek i jąder.

Ten artykuł opisuje dwa protokoły przygotowania próbek mózgu i szpiku kostnego dla dalszego potoku multiome 10X Genomics. Protokoły są wykonywane etapowo i obejmują dysocjację tkanek, sortowanie komórek, izolację jąder i kontrolę jakości przygotowanej zawiesiny jąder, która jest używana jako materiał wyjściowy do partycjonowania komórek i kodów kreskowych, przygotowania biblioteki i sekwencjonowania. Te ustandaryzowane protokoły tworzą wysokiej jakości biblioteki jąder oraz solidne i wiarygodne dane.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez wiele lat techniki jednokomórkowe były złotym standardem w analizie procesów biologicznych. Początkowo ograniczały się one do fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej i podobnych testów. Przełom w analizie pojedynczych komórek nastąpił wraz z opracowaniem podejść do profilowania molekularnego pojedynczych komórek, w szczególności sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-Seq), które umożliwiło scharakteryzowanie całego transkryptomu poszczególnych komórek. Niezwykle wydajny scRNA-Seq generuje informacje o statusie transkrypcji komórki w określonym stanie i punkcie czasowym. Nie zapewnia jednak wglądu w regulację genów, która napędza transkrypcję, ani w modyfikacje molekularne, które zachodzą w czasie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, włożono wiele wysiłku w opracowanie jednokomórkowych testów multiomicznych, które umożliwiają analizę wielu czynników i procesów z tej samej komórki1,2,3,4. Pierwszy udany pomiar dwóch modalności w pojedynczych komórkach nastąpił dzięki połączeniu wzorców ekspresji białek powierzchniowych multipleksu z pełnym transkryptomem poszczególnych komórek w podejściu CITE-Seq5. Nowsze ewolucje łączą ekspresję genów z dostępnością chromatyny (Test dla chromatyny dostępnej dla transpozazy przy użyciu sekwencjonowania, ATAC-Seq), jednocześnie wychwytując w ten sposób modalności transkryptomiczne i epigenomiczne w tych samych komórkach (np. sci-CAR)6. Pierwsze komercyjne rozwiązania, które pozwoliły na powiązanie transkryptomiki z fenotypem komórki lub ze zmianami epigenetycznymi tej samej komórki, pochodziły od 10X Genomics.

Eksperymenty dotyczące profilowania molekularnego pojedynczej komórki obejmują następujące kroki: (1) dysocjacja tkanek lub przygotowanie zawiesin jednokomórkowych; (2) oczyszczanie komórek i/lub izolacja jąder; (3) partycjonowanie i kodowanie kreskowe; (4) budowa biblioteki i kontrola jakości; 5) sekwencjonowanie nowej generacji; (6) Analiza danych. Chociaż kroki (3)-(6) mogą się znacznie różnić w zależności od zastosowanej technologii, początkowe kroki są na ogół wspólne dla wszystkich z nich. Jakość przygotowanej zawiesiny komórek/jąder będzie miała wpływ na ogólny wynik eksperymentu. W zależności od rodzaju tkanki, uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek/jąder może być trudne. Specyfika niektórych tkanek, takich jak serce, mięśnie, mózg, płuca, jelita i inne, wymaga metod rozbijania tkanek i izolacji jąder dostosowanych do każdego rodzaju próbki, aby zagwarantować produkcję wysokiej jakości jąder do analizy molekularnej7,8,9,10. Metody rozbijania tkanek i protokoły dysocjacji mogą być mechaniczne, enzymatyczne (np. mieszanina kolagenaz i DNazy) lub kombinacja tych dwóch i mogą być wykonywane ręcznie lub za pomocą narzędzi (np. Qiagen DSC-400, gentleMACS).

Techniki jednokomórkowe stały się narzędziem z wyboru w badaniach biomedycznych. W neurobiologii różnorodność komórek w mózgu i złożoność ich funkcji wymagają analizy o wysokiej rozdzielczości i przepustowości w celu wizualizacji rzadkich populacji komórek i oceny ich niejednorodności11,12,13,14. Powiązanie tożsamości komórkowej i mechanizmów regulacji genów poszczególnych komórek dostarcza informacji na temat rozwoju i fizjologii mózgu. Innym przykładem są badania odpowiedzi immunologicznej w kontekście chorób zakaźnych, autoimmunologicznych lub nowotworowych, które w dużym stopniu opierają się na analizach pojedynczych komórek. Niejednorodność podzbiorów komórek odpornościowych oraz złożoność ich aktywności i interakcji z innymi typami komórek wymagają rozdzielczości pojedynczej komórki w celu rozszyfrowania mechanizmów leżących u podstaw odpowiedzi immunologicznej. Komórki odpornościowe wywodzą się ze szpiku kostnego, w którym krwiotwórcze komórki progenitorowe składają się ze stopniowo różnicujących się komórek, które nabywają i tracą markery powierzchni komórek w procesie krokowym przed wyjściem ze szpiku kostnego do domu na obrzeżach. Analiza pojedynczych komórek pozwala na drobiazgową charakterystykę etapów rozwoju komórkowego. Można to osiągnąć poprzez fenotypowanie pojedynczych komórek, konwencjonalnie wykonywane za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Wykazano jednak, że sygnatury transkryptomiczne pojedynczych komórek ujawniają bardziej precyzyjną identyfikację podtypów komórek progenitorowych, ponieważ komórki te są rozmieszczone w klastrach, które wpadają jedna w drugą, a zatem mogą być błędnie zidentyfikowane przy użyciu podejścia opartego na markerach powierzchni komórek gruboziarnistych15. Coraz więcej badań ujawnia modyfikacje epigenetyczne, które hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) mogą nabyć w wyniku ekspozycji na różne czynniki, co ma znaczący wpływ na długoterminową reakcję układu odpornościowego16,17,18,19. Nowatorskie technologie multiomiczne umożliwiają badanie tych procesów z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Wiele protokołów izolacji komórek i jąder zostało opisanych dla brain11,20,21,22 i próbki szpiku kostnego23,24. Aby zminimalizować błąd systematyczny wynikający ze zmienności eksperymentalnej, konieczna jest walidacja zoptymalizowanych protokołów przygotowania pojedynczych jąder do wspólnego sekwencjonowania transkryptomicznego i epigenomicznego pojedynczych komórek, zapewniając w ten sposób odtwarzalność jednokomórkowych testów multiomicznych.

Tutaj opisane są dwa solidne protokoły przygotowania jąder z (1) świeżo zamrożonej tkanki mózgowej i (2) świeżych HSPC szpiku kostnego do dalszej analizy pojedynczej komórki Multiome (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołów izolacji jąder ze świeżo zamrożonych tkanek mózgu i szpiku kostnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie ze ścisłymi przepisami dotyczącymi protokołów zatwierdzonych przez Komitet ds. Etyki w Eksperymentach na Zwierzętach (CETEA). Do izolacji jąder mózgowych wykorzystano 3-miesięczne myszy C57BL/6. Do izolacji szpiku kostnego wykorzystano 8-tygodniowe samice myszy C57BL/6J o masie ciała 18 g.

1. Oczyszczanie jąder z mózgu myszy

UWAGA: Nosić rękawiczki lateksowe lub nitrylowe przez cały czas trwania zabiegu. Zdecydowanie zaleca się, aby eksperyment wykonywały dwie osoby, aby kroki od 1 do 3 (tj. przygotowanie zawiesiny pojedynczych jąder) zostały wykonane przez jedną osobę, a krok 4 (tj. przygotowanie sortera) został wykonany równolegle przez inną osobę. Ponieważ protokół jest bardzo wrażliwy na czas, bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas przetwarzania próbki poprzez przygotowanie sortownika zaraz po przygotowaniu zawiesiny pojedynczych jąder.

  1. Przygotowanie odczynników i materiałów
    1. Narzędzia do preparowania należy ostrożnie wysterylizować w autoklawie (w temperaturze 121 °C przez 20 min) i umyć je etanolem 70% tuż przed użyciem. Przygotuj jedną szalkę Petriego na próbkę, wypełnioną 2-3 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS).
    2. Schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C, napełnić wiadro lodem i umieścić szklany homogenizator odbitkowy na lodzie.
    3. Przygotować bufor do lizy jąder, dodając digitoninę do końcowego stężenia 0,01%, 10 ml na próbkę.
    4. Przygotować bufor barwiący, dodając inhibitory RNazy do buforu do barwienia komórek do uzyskania końcowego stężenia 0,2 U/μL, 20 ml na próbkę.
    5. Przygotować DPBS 0,04% BSA, dodając inhibitory RNazy do końcowego stężenia 0,2 U/μL, 2 ml na próbkę.
    6. Przygotować 1 ml rozcieńczonego buforu jąder zgodnie z protokołem Multiome25.
    7. Wszystkie odczynniki i próbki należy przechowywać na lodzie.
  2. Sekcja tkanek
    1. Składaj ofiary na myszach, korzystając z protokołów zatwierdzonych przez instytucję. W tym protokole myszy zostały pozbawione głów po przedawkowaniu ketaminy/ksylazyny.
    2. Odetnij głowę myszy nożyczkami i usuń mózg z czaszki, jak opisano w Meyerhoff et al.26. Natychmiast przenieś mózg na szalkę Petriego przygotowaną za pomocą lodowatego 1x DPBS pod mikroskopem stereoskopowym oświetlonym diodami elektroluminescencyjnymi (LED).
    3. Przetnij tkankę mózgową skalpelem, aby oddzielić obszary zainteresowania mózgu (np. Kora śródwęchowa, hipokamp, kora przedczołowa) i przenieś każdy region na osobną szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1x DPBS. Trzymaj na lodzie.
    4. Za pomocą skalpela zmiel tkankę na kawałki o długości <0,5 cm, aby ułatwić homogenizację w następnym kroku.
    5. Za pomocą mikropipety P1000 przenieś tkankę mieloną i 1x DPBS z szalki Petriego do probówki o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że używasz probówek wykonanych z tworzywa sztucznego o niskim poziomie wiązania białka. Pozwól, aby kawałki tkanki rozdzieliły się grawitacyjnie. Ostrożnie usunąć nadmiar 1x DPBS za pomocą mikropipety P1000.
      UWAGA: Po tym etapie możliwe jest szybkie zamrożenie tkanki mielonej poprzez przeniesienie probówek o niskiej wiązalności białka do suchego lodu, a następnie przechowywanie w temperaturze -80 °C do czasu przystąpienia do izolacji jąder.
  3. Izolacja jąder
    1. Napełnij szklankę 2 ml lodowatego buforu do lizy jąder z 0,01% digitoniną. Dodaj kawałki tkanki w dounce.
      UWAGA: w przypadku pracy ze świeżo zamrożoną tkanką dodać zmieloną zamrożoną tkankę bezpośrednio do buforu do lizy jąder 0,01% digitoniny; Nie pozwól, aby tkanka wcześniej się rozmroziła.
    2. Homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego ze szkła 25 razy tłuczkiem A, a następnie 25 razy tłuczkiem B. Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml.
    3. Dodać dodatkowe 2 ml lodowatego buforu do lizy jąder z 0,01% digitoniną i inkubować na lodzie przez 5 minut. Odwirować jądra w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i dodać 4 ml lodowatego buforu do lizy jąder z 0,01% digitoniną. Inkubować na lodzie przez 5 minut i przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm.
    5. Odwirować jądra przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
    6. Dodać 4 ml buforu barwiącego do przepłukania jąder i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić osad w 4 ml buforu barwiącego.
    7. Przefiltrować przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 1 ml PBS z 0,04% BSA.
    8. Policz jądra, aby zapewnić spójność przygotowania tkanki/jąder w różnych próbkach. Oczekuje się, że uzyska podobną liczbę jąder z tych samych regionów mózgu:
      1. Dodaj 10 μl 0,4% błękitu trypanowego do pustej probówki o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl jąder i wymieszać 5x pipetując.
      2. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z zaleceniami dostawcy. Trzymaj jądra na lodzie.
    9. Przygotować jądra do sortowania.
      UWAGA: Wyekstrahowane jądra zawierają 7-AAD, a to barwienie służy do ich oczyszczania przez sortownik komórek aktywowany fluorescencją (FACS).
      1. Przenieść 100 μl jąder do probówki FACS w celu przeprowadzenia niebarwionej kontroli. Dodać 10 μl 7-AAD do pozostałych jąder i przechowywać przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      2. Posortuj co najmniej 0,5 x 106 jąder według FACS, aby wyeliminować dublety i zanieczyszczenia.
  4. Sortowanie jąder za pomocą FACS
    UWAGA: Podczas gdy sortowanie jąder może być wykonywane na wielu różnych sortownikach komórek, procedura korzystania z instrumentów BD FACSAria Fusion lub BD FACSAria III jest opisana tutaj. Zdecydowanie zaleca się, aby kalibracja i konfiguracja sortownika komórek była wykonywana pod nadzorem lub przez doświadczonego użytkownika urządzenia. Aby skrócić czas przetwarzania próbki, bardzo ważne jest, aby sorter był gotowy zaraz po przygotowaniu zawiesiny pojedynczych jąder.
    1. Kalibracja przyrządu FACS
      1. Włącz sortownik komórek i komputer. Po podłączeniu oprogramowania do przyrządu uruchom procedurę uruchamiania fluidycznego. Wybierz Cytometer > Fluidic start-up w menu głównym i postępuj zgodnie z czterema krokami. Kliknij Gotowe po zakończeniu każdego z nich.
      2. Włóż dyszę 70 μm, włącz strumień i pozostaw strumień do ustabilizowania się na 15 minut. Dostosuj amplitudę, aby uzyskać formację kropli i kliknij Sweet Spot.
      3. Umieść filtr o neutralnej gęstości (ND) 1.0 i otwórz interfejs konfiguracji i śledzenia cytometru (CST).
      4. Codzienna kontrola jakości: Rozcieńczyć kulki CST w podłożu FACS (patrz zalecenia dostawcy) i przeprowadzić kontrolę CST. Po zakończeniu zastąp ND 1.0 ND 2.0.
      5. Rozcieńczyć Accudrops w podłożu FACS (patrz zalecenia dostawcy) i wykonać opóźnienie upuszczenia zgodnie z opisem w krokach od 6 do 10.
      6. W szablonie eksperymentu wybierz eksperyment Accudrop Drop Delay i otwórz Sorting Layout dla probówki.
      7. W dolnym oknie kamery kliknij Napięcie, a następnie Filtr optyczny, aby umożliwić nałożenie ładunku na płytki odchylające i użycie określonego filtra optycznego przed kamerą. Upewnij się, że kwadrant po prawej stronie wskazuje 100. W razie potrzeby wyreguluj czerwoną laserową, aby zoptymalizować wpływ lasera.
      8. Dostosuj natężenie przepływu, aby osiągnąć prędkość od 1 000 do 3 000 zdarzeń na sekundę.
      9. Kliknij Sortuj i Anuluj. Upewnij się, że lewy kwadrant jest równy 100, a prawy kwadrant ma wartość 0. Jeśli lewy kwadrant jest mniejszy niż 95, wykonaj automatyczne opóźnienie.
      10. Kliknij Napięcie, a następnie Sortowanie testowe. Kontroluj jakość strumieni bocznych osadzających się w probówkach zbiorczych. W razie potrzeby dostosuj położenie strumieni bocznych, przesuwając suwaki.
    2. Konfiguracja przyrządu FACS do sortowania jąder.
      1. Rozpocznij pozyskiwanie niebarwionych jąder. Służą one do definiowania rozproszeń czołowych i bocznych oraz napięcia detektora dla parametru 7-ADD. Ustaw parametry tak, aby sygnał 7-AAD niebarwionej próbki przypadał w pierwszej dekadzie skali logarytmicznej na wykresie kropkowym.
      2. Rozpocznij pozyskiwanie probówki jąder barwionych 7-AAD i zdefiniuj populacje jąder, stosując strategię bramkowania opartą na (1) FSC-A / SCC-A, a następnie FSC-H / SSC-H dla rozmiaru i ziarnistości, (2) FSC-H / FSC-A dla dyskryminacji dubletów i (3) SSC-A / 7-AAD dla jąder 7-AAD dodatnich (patrz Rysunek 2A).
      3. Upewnij się, że strumień i ugięcie są stabilne.
      4. W kamerze strumienia bocznego włącz sortowanie testowe, napięcie włączone i potwierdź dokładne sortowanie kroplowe w probówce o pojemności 1.5 ml zamontowanej po lewej stronie.
      5. W oknie Sortowanie układu wybierz populację, która Cię interesuje, zgodnie z definicją w kroku 2 (powyżej). W polu Zdarzenia docelowe wybierz próg w polu Ciągły, aby uzyskać co najmniej 0,5 x 106 jąder na próbkę. W obszarze Precyzja wybierz opcję Czystość 4-drożna.
      6. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk Sortuj i OK, aby rozpocząć sortowanie jąder.
  5. Kontrola jakości i liczenie oczyszczonych jąder
    UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko podczas eksperymentu pilotażowego w celu optymalizacji etapów przygotowania próbki, w celu zbadania czystości posortowanych jąder, które mają być załadowane na 10-krotny chip chromowy. Gdy protokół jest w pełni zoptymalizowany, nie zaleca się wykonywania tego etapu kontroli jakości w kolejnych eksperymentach, aby uniknąć niepotrzebnego marnotrawstwa pobranych jąder, które mogą być dostępne w małych ilościach.
    1. Kontrola czystości za pomocą cytometrii przepływowej
      1. Przenieść 10 μl posortowanych jąder do nowej probówki FACS zawierającej 90 μl DPBS z 2% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (HI-FBS).
      2. Zbieraj i rejestruj dane po sortowaniu, aby zweryfikować czystość i żywotność sortowania. Upewnij się, że co najmniej 98% jąder znajduje się w bramce zainteresowania, jak zdefiniowano w 4.2 (patrz Rysunek 2B).
    2. Liczenie oczyszczonych jąder
      1. Odwirować posortowane jądra przez 5 minut w temperaturze 500 x g i w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie całkowicie usunąć supernatant za pomocą mikropipety. Zawiesić w 100 μl rozcieńczonego buforu jąder.
      2. Dodaj 10 μl 0,4% błękitu trypanowego do pustej probówki o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl posortowanych jąder i wymieszać 5x pipetując.
      3. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z zaleceniami dostawcy. Dostosuj stężenie jąder do 3,5 x 106/ml, tj. 16 000 jąder na 5 μl.
    3. Kontrola jakości oczyszczonych jąder za pomocą mikroskopii
      UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko podczas eksperymentu pilotażowego w celu optymalizacji etapów przygotowania próbki w celu zbadania jakości jąder, które mają być załadowane na 10-krotny chip chromowy. Gdy protokół jest w pełni zoptymalizowany, nie zaleca się wykonywania tego etapu kontroli jakości w kolejnych eksperymentach, aby uniknąć niepotrzebnego marnotrawstwa pobranych jąder, które mogą być dostępne w małych ilościach.
      1. Upewnij się, że szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe są czyste i wolne od kurzu. W razie potrzeby umyj i spłucz szkiełka nakrywkowe absolutnym etanolem i osusz je niestrzępiącymi się chusteczkami.
      2. Rozprowadzić 25 μl poli-l-lizyny w studzienkach szkiełkowych, które będą używane i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed kurzem.
      3. Usunąć nadmiar poli-l-lizyny i dodać 10 μl oczyszczonej zawiesiny jąder. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed kurzem.
      4. Dodaj kroplę podłoża montażowego do każdej studzienki, unikając pęcherzyków.
      5. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu dołków z nasionami. Przykryj chusteczkami papierowymi i mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar nośnika montażowego. Uważaj, aby nie przesunąć szkiełka nakrywkowego i nie czyścić nadmiaru medium montażowego.
      6. Wykonaj kilka zdjęć za pomocą odwróconego mikroskopu ze światłem jasnego pola i minimalnym powiększeniem 40x.
  6. Wykonaj test wieloomowy.
    1. Przejdź natychmiast do Podręcznika użytkownika Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 - Rev F)25.

2. Oczyszczanie jąder z krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego myszy (HSPC)

UWAGA Ten protokół opisuje oczyszczanie jąder z trzech podzbiorów szpiku kostnego HSPC: lineage-c-Kit+Sca-1+ hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), lineage-c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR- wspólne komórki progenitorowe szpiku (CMP) oraz linia- c-Kit+Sca-1-CD34+FcγR+ progenitorzy granulocytów-monocytów (GMP). Przez cały czas trwania zabiegu należy nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe. Protokół ten jest adaptacją 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27. W pierwotnym protokole wprowadzono modyfikacje, aby zmaksymalizować regenerację jąder. Zdecydowanie zaleca się, aby eksperyment wykonywały dwie osoby, aby wykonać kroki 1. do 3. (tj. przygotowanie roztworu jednokomórkowego) wykonywane przez jedną osobę, a krok 4 (tj. przygotowanie sortownika) wykonywany równolegle przez inną osobę. Ponieważ protokół jest bardzo wrażliwy na czas, bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas przetwarzania próbki poprzez przygotowanie sortownika zaraz po przygotowaniu zawiesiny jednokomórkowej.

  1. Przygotowanie odczynników i materiałów
    1. Napełnij wiadro lodem.
    2. Przygotować bufor FACS: DPBS z 2% roztworem HI-FBS (około 500 ml na 6 próbek) i przefiltrować przez filtr 0,2 μm.
    3. Przygotować pożywkę zbiorczą: DPBS z 10% roztworem HI-FBS (500 μl na próbkę) i przefiltrować przez filtr 0,2 μm.
  2. Izolacja komórek szpiku kostnego
    1. Składaj ofiary na myszach, korzystając z protokołów zatwierdzonych przez instytucję. W tym eksperymencie myszy zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy po przedawkowaniu ketaminy/ksylazyny.
    2. Spryskaj brzuch i tylne nogi myszy 70% etanolem.
    3. Użyj sterylnych kleszczy i nożyczek, aby wykonać małe nacięcie na środku dolnej części brzucha i otworzyć otrzewną od podstawy tylnych nóg do przepony (rysunek uzupełniający 1).
    4. Wykonaj dodatkowe nacięcie dla każdej tylnej nogi prostopadłej do otwartej otrzewnej, a następnie chwyć po obu stronach jednego z tych dodatkowych nacięć i rozsuń go, aby zdjąć skórę z obu tylnych nóg obok stawu skokowego, aby odsłonić mięśnie obu tylnych nóg (rysunek uzupełniający 1A).
    5. Ułóż nożyczki wzdłuż kręgosłupa w stawie biodrowym jednej tylnej nogi, aby wyciąć nogę bez przecinania kości udowej (rysunek uzupełniający 1B, C). Powtórz to samo dla drugiej nogi.
    6. Aby wyizolować kość udową, wytnij większość tkanki mięśniowej, a następnie przytrzymaj kość udową i piszczelową w każdej ręce z opuszkami palców w stawie (rysunek uzupełniający 1D, E). Delikatnie złóż nogę w kierunku naturalnego zgięcia, aby zwichnąć kość piszczelową od kości udowej (rysunek uzupełniający 1E), a następnie ostrożnie przeciąć tkankę łączną nożyczkami, aby oddzielić kość udową i piszczelową.
    7. Użyj nożyczek lekkimi ruchami skręcającymi, aby przemieścić kawałek kręgosłupa z górnego końca kości udowej (rysunek uzupełniający 1E).
    8. Oczyść izolowaną kość udową bibułą, aby usunąć pozostały mięsień i tkankę łączną.
    9. Przechowywać w chłodzie na lodzie w 12-dołkowej płytce wypełnionej 2 ml DMEM (1x) + GlutaMAX-I.
    10. Po zebraniu wszystkich kości udowych upewnij się, że tkanki mięśniowe i włókniste zostały całkowicie usunięte z kości. Nie należy rozcinać kości, aby (a) utrzymać szpik w środku w sterylności i (b) uniknąć utraty komórek w studzience. Wykonaj następujące kroki, aby przepłukać komórki z dwóch kości udowych jednej myszy, zaadaptowane z Haag i Murthy28.
    11. Przygotuj jedną probówkę o pojemności 1,5 ml i jedną probówkę o pojemności 0,5 ml. Dodać 150 μl buforu FACS do probówki o pojemności 1,5 ml, a następnie przebić otwór na dnie probówki 0,5 ml za pomocą igły 18 G i włożyć probówkę 0,5 ml do probówki 1,5 ml.
    12. Otwórz dystalną część każdej kości udowej za pomocą mysich nożyczek chirurgicznych (rysunek uzupełniający 1F): Zablokuj dystalną nasadę między ostrzami i delikatnie dociśnij, obracając nożyczki, aby płynnie odłączyć dystalną nasadę bez ostrego rozcinania kości. Jeśli się powiedzie, 4 wypukłości powinny być widoczne na odsłoniętym końcu physis (rysunek uzupełniający 1G).
    13. Załóż dwie kości udowe otwartym końcem skierowanym w dół do przygotowanej probówki o pojemności 0,5 ml umieszczonej w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej bufor FACS (rysunek uzupełniający 1H).
    14. Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż sitko 2 ml buforu FACS.
    15. Aby przepłukać szpik kostny, odwiruj probówki (otwarte nakrętki) przy 12 000 x g, aż wirówka osiągnie wartość 12 000 x g, a następnie natychmiast zatrzymaj wirówkę.
    16. Sprawdzić, czy komórki szpiku kostnego są osadzone w probówce o pojemności 1,5 ml i czy kości udowe są białe (przed przepłukaniem komórek są czerwone) (rysunek uzupełniający 1I). Wyrzuć probówki o pojemności 0,5 ml z 2 kośćmi udowymi.
    17. Odrzucić 150 μl supernatantu za pomocą pipety.
    18. Zawiesić osad za pomocą mikropipety w 1 ml buforu lizującego chlorku amonu i potasu (ACK) na 1-2 minuty w temperaturze pokojowej w celu lizy czerwonych krwinek. Unikaj dłuższych czasów inkubacji, ponieważ mogą one skutkować obniżeniem żywotności komórek jądrzastych.
    19. Przenieść do probówki o pojemności 50 ml przez wstępnie zwilżone sitko o pojemności 70 μm.
    20. Dodać 10 ml buforu FACS w celu rozcieńczenia buforu lizującego ACK i tym samym zatrzymać lizę.
    21. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 10 ml buforze FACS, najpierw ponownie wlewając 1 ml, a następnie uzupełniając 9 ml.
    22. Przygotować komórki do liczenia zgodnie z opisem w ppkt 1.3.8.
    23. Policz ogniwa za pomocą automatycznego licznika komórek, postępując zgodnie z zaleceniami dostawcy. Oczekuje się, że uda się zebrać około 40 milionów komórek z 2 kości udowych.
  3. Barwienie szpiku kostnego HSPC
    1. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety w buforze FACS do końcowego stężenia 1 x 10 7 komórek/ml.
    2. Za pomocą mikropipety P1000 przenieś zawiesinę do probówki FACS, filtrując przez nasadkę sitową o wielkości 35 μm.
    3. Przygotuj próbki z probówki z pojedynczym barwieniem dla każdego przeciwciała wymienionego w tabeli 1, aby ustawić kompensację fluorochromów w sortowniku komórek:
      1. Przygotować jedną probówkę FACS na przeciwciało i napełnić probówki 200 μl PBS.
      2. Dodać 15 μl kulek kompensacji fluorochromu do każdej probówki FACS z przeciwciałem sprzężonym z fluorochromem. W probówkach FACS dla niebarwionych i żywych / martwych pojedynczych barwionych komórek dodaj 500 000 komórek zamiast kulek.
      3. Dodać 1 μl każdego przeciwciała sprzężonego z fluorochromem (patrz Tabela 1) do odpowiedniej probówki FACS. Dodaj 0,5 μl żywej/martwej plamy do probówki FACS z żywą/martwą pojedynczą plamą.
      4. Przechowywać na lodzie przez 15 minut, chronić przed światłem.
    4. Przygotować mieszanki 1 i 2 zgodnie z tabelą 2.
      UWAGA: Objętości przeciwciał wskazane w Tabeli 2 są ważne dla przeciwciał wymienionych w Tabeli materiałów. Muszą być zoptymalizowane pod kątem każdego nowego odniesienia przeciwciała lub innej partii tego samego odniesienia przeciwciała.
    5. Dodać 300 μl mieszanki 1 do probówki z próbką, zawiesić i przechowywać przez 15 minut na lodzie chronionym przed światłem.
    6. Dodać 300 μl mieszanki 2 do probówki z próbką, zawiesić i przechowywać przez 20 minut na lodzie chronionym przed światłem.
    7. Dodać 3 ml buforu FACS do pojedynczo barwionych probówek i probówek z próbkami barwionymi mieszanką. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
    8. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu FACS.
    9. Przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml wstępnie napełnioną 500 μl pożywki zbiorczej.
      UWAGA: Mix 1 jest przygotowywany w DPBS, ponieważ zawiera żywą/martwą plamę, na którą w znacznym stopniu wpływa HI-FBS. Gdy komórki zostaną wybarwione przez żywe / martwe, dodaje się Mix 2, który zawiera przeciwciała sprzężone z fluorochromem ponownie zawieszone w buforze FACS zawierającym HI-FBS. Jedynym wyjątkiem jest przeciwciało anty-CD16/32, które jest zawarte w mieszance przeciwciał 1, aby służyć jako bloker receptora Fc, który zapobiega niespecyficznemu wiązaniu innych przeciwciał dodanych w następnym kroku.
  4. Sortowanie komórek za pomocą FACS
    UWAGA: Chociaż sortowanie komórek można przeprowadzić na wielu różnych sortownikach komórek, tutaj opisano procedurę korzystania z urządzeń BD FACSAria Fusion lub BD FACSAria III. Zdecydowanie zaleca się, aby kalibracja i konfiguracja sortera komórek była wykonywana pod nadzorem lub przez doświadczonego użytkownika urządzenia.
    1. Kalibracja przyrządu FACS: Patrz Protokół 1 krok 4.1.
    2. Konfiguracja przyrządu FACS do sortowania komórek:
      1. Rozpocznij pozyskiwanie niebarwionych komórek. Służą one do definiowania rozproszeń czołowych i bocznych oraz napięcia detektora dla każdego fluoroforu. Ustaw parametry tak, aby sygnał fluorescencyjny każdego fluoroforu mieścił się w pierwszej dekadzie skali logarytmicznej na wykresie punktowym.
      2. Zdobądź kontrolki pojedynczego koloru, aby ręcznie ustawić kompensacje (mediana populacji dodatnich i ujemnych powinna być wyrównana) lub użyj oprogramowania do obliczeń automatycznych (pomiary nachylenia). Upewnij się, że kontrole kompensacji są zgodne z eksperymentalnymi fluorochromami i ustawieniami detektora. Rejestrowanie 10 000 zdarzeń dla komórek i 5 000 zdarzeń dla koralików.
      3. Użyj probówki z próbką (tj. komórek barwionych wielokrotnie), aby zdefiniować interesujące populacje komórek, korzystając ze strategii bramkowania pokazanej na Rysunek 3A. Wykonaj kroki 4 - 6 (poniżej).
      4. Aby zidentyfikować trzy interesujące HSPC szpiku kostnego (HSC, CMP i GMP), rozpocznij bramkowanie, używając rozmiaru (FSC-A) i ziarnistości (SSC-A) do bramki na leukocytach, a następnie FSC-H / FSC-A do rozróżnienia dubletów.
      5. Na podstawie SSC-A / markera martwej komórki, bramka żywych komórek. Użyj Lineage/c-Kit, aby wybrać komórki, które są ujemne pod względem linii i wyrażają pośrednie lub wysokie poziomy c-Kit. Poprzez c-Kit/Sca-1, bramka na linii-c-Kit+ Sca-1+ (LKS+) HSC, jednej z trzech interesujących populacji.
      6. Wśród komórek progenitorowych szpiku (lineage-c-Kit + Sca-1-) należy użyć FcγR/CD34, aby wykluczyć CD34-FcγR- megakariocyty i progenitory erytroidalne (MEP), włączając CD34 + FcγR- CMP, a także CD34 + FcγR + GMP w populacjach komórek, które mają być sortowane.
      7. Upewnij się, że strumień i ugięcie są stabilne.
      8. W kamerze strumienia bocznego włącz sortowanie testowe, voltage ON i potwierdź dokładne sortowanie kropli w probówce 1.5 ml zamontowanej po lewej stronie.
      9. W oknie Sorting Layout (Układ sortowania) wybierz interesujące populacje (tj. "LKS+" i "przodkowie szpiku CD34+" pokazani w tym przykładzie). W obszarze Urządzenie wybierz opcję 2 Tube. W obszarze Precyzja wybierz pozycję Czystość. W obszarze Zdarzenia docelowe wybierz opcję Ciągłe, aby posortować od 160 000 do 200 000 przodków szpiku LKS+ i CD34+.
      10. Dodać 500 μl buforu FACS do zawiesiny komórek i przenieść 1 ml próbki, filtrując do nowej probówki FACS z filtrem siatkowym o długości 35 μm, aby upewnić się, że wszystkie komórki znajdują się w jednej zawiesinie tuż przed pobraniem. Eliminuje to grudki komórek, które mogłyby zatkać instrument.
      11. Gdy wszystko będzie gotowe, kliknij przycisk Sortuj i OK, aby rozpocząć sortowanie. Dostosuj natężenie przepływu, aby utrzymać prędkość poniżej 10 000 zdarzeń na sekundę.
        UWAGA: Oczekiwany stosunek komórek progenitorowych szpiku LKS+ do CD34+ wynosi 1:3 dla dorosłej (8-12 tygodniowej) samicy myszy C57BL/6J w stanie stacjonarnym. Docelowe posortowane numery komórek są zwykle osiągane w ciągu 30 minut od sortowania.
  5. Kontrola jakości i zliczanie posortowanych komórek
    UWAGA: Ten etap należy wykonać tylko podczas eksperymentu pilotażowego w celu optymalizacji etapów przygotowania próbki, w celu zbadania czystości posortowanych komórek, które mają być użyte do izolacji jąder. Gdy protokół jest w pełni zoptymalizowany, nie zaleca się wykonywania tego etapu kontroli jakości w dalszych eksperymentach, aby uniknąć niepotrzebnego marnotrawstwa materiału wyjściowego, który może być dostępny w małych ilościach do izolacji jąder.
    1. Kontrola czystości za pomocą cytometrii przepływowej
      1. Przenieść 10 μl posortowanych komórek do nowej probówki FACS zawierającej 90 μl buforu FACS.
      2. Zbieraj i rejestruj dane po sortowaniu, aby zweryfikować czystość i żywotność sortowania. Upewnij się, że co najmniej 95% komórek znajduje się w bramce zainteresowania, zgodnie z definicją w 3 - 6 i zilustrowaną w Rysunek 3B.
  6. Izolacja jąder z posortowanych HSPC szpiku kostnego
    1. Użyj protokołu "Low Cell Input Nuclei Isolation" z załącznika do 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C)27, z następującymi modyfikacjami wprowadzonymi w celu optymalizacji odzyskiwania jąder:
      1. Czas lizy: Przeprowadź eksperyment pilotażowy dla tego protokołu, aby określić najlepszy czas lizy dla izolacji jąder. Upewnij się, że osiągnąłeś całkowitą lizę komórek przy zachowaniu nienaruszonych jąder.
        UWAGA: Krok f wyżej wymienionego protokołu 10X Genomics27 instruuje, aby "inkubować [w buforze do lizy] przez 3-5 minut na lodzie". Podczas eksperymentu pilotażowego należy przeprowadzić test trwający co najmniej 3 minuty, 4 minuty i 5 minut, a następnie ocenić ilość odzyskanych jąder przez zliczanie i jakość za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania mikroskopowego, aby wybrać optymalny czas trwania lizy (patrz opis tych kontroli jakości poniżej). Aby oszczędzić odczynniki, w eksperymencie pilotażowym należy zastąpić rozcieńczony bufor jąder PBS 0,04% BSA. W przypadku HSPC szpiku kostnego jako optymalny czas trwania lizy określono 3 minuty.
      2. Wirowanie komórek: W przypadku wszystkich wirowań zawiesiny komórek, wirować przy 300 x g przez 7 minut (zamiast 5 minut w CG000365 - Rev C)27 w temperaturze 4 °C.
      3. Wirowanie jąder: Wykonaj wszystkie odwirowania zawiesiny jąder przy 500 x g przez 5 minut zgodnie z CG000365 - Rev C27.
      4. Pobieranie jąder: Na etapie b, po ponownym zamieszaniu w 50 μl PBS 0,04% BSA i przeniesieniu do probówki o pojemności 0,2 ml, dodać 50 μl PBS 0,04% BSA do oryginalnej probówki i wymieszać pipetą, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki. Przenieś do probówki o pojemności 0,2 ml, aby uzyskać łączną objętość 100 μl.
      5. Odtąd całkowita objętość będzie wynosić 100 μl zamiast 50 μl przewidzianych w protokole. Dostosuj odpowiednio dalsze etapy (np. dla kroku d usuń 90 μl zamiast 45 μl; dla kroku e dodaj 90 μl buforu do lizy zamiast 45 μl).
      6. Dla etapu m ponownie zawiesić osad jądrowy w 12 μl rozcieńczonego buforu jąder zamiast w 7 μl.
      7. Policz izolowane jądra. Do pustej probówki o pojemności 0,5 ml dodaj 10 μl 0,4% błękitu trypanowego i 8 μl PBS 0,04% BSA.
      8. Dodać 2 μl jąder do probówki i policzyć jądra zgodnie z opisem w 1.3.8. Korzystaj z automatycznego licznika komórek zgodnie z zaleceniami dostawcy.
  7. Kontrola czystości metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko podczas eksperymentu pilotażowego w celu optymalizacji etapów przygotowania próbki w celu zbadania czystości jąder, które mają być załadowane na chip 10X Chromium. Gdy protokół jest w pełni zoptymalizowany, nie zaleca się wykonywania tego etapu kontroli jakości w kolejnych eksperymentach, aby uniknąć niepotrzebnego marnotrawstwa pobranych jąder, które mogą być dostępne w małych ilościach.
    1. Po zakończeniu izolacji jąder przenieść 6 μl resuspension jąder do nowej probówki FACS wstępnie wypełnionej 150 μl buforu FACS. Dodaj 3 μl 7-AAD i inkubuj przez 5 minut na lodzie.
    2. Zbieraj i rejestruj dane po sortowaniu, aby zweryfikować czystość i żywotność sortowania. Upewnij się, że co najmniej 95% jąder znajduje się w bramce zainteresowania, zgodnie z definicją w kroku 4.2 Protokołu 1 (patrz Rysunek 4).
  8. Kontrola jakości oczyszczonych jąder za pomocą mikroskopii:
    UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko podczas eksperymentu pilotażowego w celu optymalizacji etapów przygotowania próbki w celu zbadania jakości jąder, które mają być załadowane na chip 10X Chromium. Gdy protokół jest w pełni zoptymalizowany, nie zaleca się wykonywania tego etapu kontroli jakości w kolejnych eksperymentach, aby uniknąć niepotrzebnego marnotrawstwa pobranych jąder, które mogą być dostępne w małych ilościach.
    1. Postępuj zgodnie z opisem w kroku 1.5.3.
  9. Wykonaj test wieloomowy
    1. Przejdź natychmiast do Podręcznika użytkownika Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression (CG000338 - Rev F)25.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa opisane powyżej protokoły szczegółowo opisują izolację jąder od dwóch różnych typów tkanek. Różnice i podobieństwa między tymi dwoma protokołami są schematycznie przedstawione w Rysunek 1.

Oczyszczanie jąder z mózgu myszy
W opisanym tu protokole proponujemy łagodną metodę przygotowania jąder z próbek mózgu. Rozpoczyna się od mechanicznej dysocjacji tkanki mózgowej w buforze do lizy, po której następują etapy płukania i filtrowania sitkiem, które usuwają pozostałą tkankę z zawiesiny. Późniejsze usuwanie zanieczyszczeń, niezlizowanych komórek i małych cząstek jest osiągane przez FACS, aby zagwarantować, że tylko oczyszczone jądra są ładowane do dalszego protokołu Multiome. Rysunek 2 pokazuje profil jąder przed i po sortowaniu. Po przefiltrowaniu, a przed sortowaniem jąder, próbka zawiera dużą ilość zanieczyszczeń, przy czym ponad 99% "singletów" jest dodatnich na obecność barwienia jądrowego (7-AAD), co wskazuje na optymalną lizę komórek (Rysunek 2A). Jądra są sortowane na podstawie bramki dodatniej 7-AAD. Frakcję posortowanego materiału pobiera się w celu sprawdzenia czystości przygotowanych jąder. Rysunek 2B pokazuje profil jąder mózgowych po sortowaniu. Sortowanie jąder pozwoliło na zwiększenie czystości jąder z początkowych 36% (Rysunek 2A) do prawie 100% (Rysunek 2B).

figure-results-1
Rysunek 2: Strategia bramkowania dla sortowania jąder i test czystości po sortowaniu. Jądra wybarwiono 7-AAD i pobrano za pomocą sortera komórek. (A) Jądra są najpierw bramkowane na podstawie ich wielkości i ziarnistości (odpowiednio FSC-A i SSC-A). Pojedyncze cząstki są następnie wybierane na podstawie ich właściwości FSC-A/FSC-H i barwienia 7-AAD. (B) Po sortowaniu komórek frakcja jąder z probówki zbiorczej jest badana pod kątem czystości przy użyciu tej samej strategii bramkowania, co w A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oczyszczanie komórek progenitorowych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSPC) szpiku kostnego myszy<br /> Po wyizolowaniu ze szpiku kostnego, do 2 x 105 HSPC są sortowane według FACS, zgodnie ze strategią bramkowania pokazaną na Rysunek 3A. Ocenia się skuteczność sortowania i czystość próbki (Rysunek 3B).

figure-results-2
Rysunek 3: Strategia bramkowania do sortowania HSPC szpiku kostnego. (A) Reprezentatywna strategia bramkowania FACS do sortowania żywotnych hematopoetycznych komórek macierzystych LKS+ i komórek progenitorowych szpiku CD34+ do izolacji jąder. (B) Reprezentatywne powierzchnie FACS wykorzystywane do weryfikacji czystości populacji posortowanych komórek. Pokazano proporcje różnych podzbiorów komórek w odniesieniu do populacji rodzicielskiej. *Dwie posortowane populacje. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół "Low Cell Input Nuclei Isolation" pozwala na izolację jąder z próbek o maksymalnej liczbie 105 komórek. Obejmuje niewielką liczbę etapów wirowania, minimalizując w ten sposób utratę komórek/jąder. Dostosowaliśmy objętość do lizy i płukania proporcjonalnie do wejścia komórki i wydłużyliśmy czas wirowania w celu maksymalnego odzysku jąder. Przeprowadziliśmy eksperyment pilotażowy w celu oceny ilości odzyskanych jąder przez liczenie oraz ich jakości za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania mikroskopowego. Rysunek 4 pokazuje próbkę HSPC po lizie komórek. Protokół ten wygenerował jądra wysokiej jakości, jak zaobserwowano w Rysunek 5A, bez żadnych zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na dalszy protokół multiome.

figure-results-3
Rysunek 4: Test czystości sortowania izolowanych jąder HSPC szpiku kostnego. Jądra zostały wybarwione 7-AAD i pozyskane przez sorter komórek. Jądra zostały najpierw bramkowane na podstawie ich wielkości i ziarnistości (odpowiednio FSC-A i SSC-A) w celu oceny czystości próbki. Proporcja jąder jest wskazywana w odniesieniu do populacji rodzicielskiej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

osób osób
Numer rurkiNazwa ruryPoplamiony bytIlość poplamionego elementuPrzeciwciało/barwnik (μL)Bufor zbiorczy (μL)
1NiepoplamioneKomórek5 00 000N/a200
cyfra arabskaLIVE/DEAD Możliwa do naprawienia plama Aqua Dead Cell Komórek5 00 0000,5
3APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (FcγR)Koraliki elektroniczne OneComp15 μL1
4Pacific Blue anty-mysi koktajl LineageKoraliki elektroniczne OneComp15 μL1
5PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)Koraliki elektroniczne OneComp15 μL1
6Układ chroniący przed myszami APC CD117 (zestaw c)Koraliki elektroniczne OneComp15 μL1
7Anty-mysz FITC CD34Koraliki elektroniczne OneComp15 μL1

Tabela 1: Kontrola pojedynczego barwnika dla ustawień kompensacji na cytometrze przepływowym. Wskazane są wymagane kontrole pojedynczego barwienia, liczba komórek lub kulek do barwienia oraz ilości przeciwciał.

szt. szt.
Mistrz MixOdczynnikKońcowe rozcieńczeniePrzeciwciało/barwnik (μL)Typ buforaBufor (μL)
Mix 1APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (FcγR)1/500Rozdział 1.2DPBS300
LIVE/DEAD Możliwa do naprawienia plama Aqua Dead Cell 1/2502.4
Mix 2Pacific Blue anty-mysi koktajl Lineage1/20Rozdział 30Bufor FACS300
PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)1/2003
Układ chroniący przed myszami APC CD117 (zestaw c)1/2003
Anty-mysz FITC CD341/5012
Całkowita objętość barwienia 600

Tabela 2: Skład mieszanki barwiącej dla HSPC szpiku kostnego. Pokazano objętości odczynników wymaganych do barwienia jednej próbki zawierającej 40 milionów komórek. W celu barwienia większej liczby próbek należy pomnożyć wskazaną objętość przez wymaganą liczbę próbek i dodać połowę dodatkowej objętości próbki, aby zapewnić wystarczającą objętość mieszanki wzorcowej.

Rysunek uzupełniający 1: Protokół izolacji komórek szpiku kostnego. (A) Otwórz otrzewną. Białe przerywane linie wskazują linię, wzdłuż której należy przeciąć. (B) Po oderwaniu skóry od tylnej nogi, ułóż nożyczki wzdłuż kręgosłupa w stawie biodrowym, aby wyciąć nogę bez przecinania kości udowej. (C) Wygląd nogi oddzielonej od ciała przed usunięciem mięśni. (D) Wygląd nogi po usunięciu mięśni. (E) Procedura oddzielania kości udowej w stawie kolanowym, a następnie w stawie biodrowym, z zachowaniem ostrożności, aby nie rozciąć kości udowej. Białe zakrzywione strzałki pokazują wymagany ruch. Białe kropkowane strzałki wskazują obszar, który należy delikatnie oddzielić za pomocą nożyczek, aby uszczypnąć. (F) Procedura otwarcia dystalnej części kości udowej (tj. części wcześniej przyczepionej do kości piszczelowej w stawie kolanowym) poprzez bezpieczne chrząstkę i dystalną nasadę nożyczkami i odwrócenie jej do tyłu, aby odsłonić szpik kostny. (G) Cztery występy, oznaczone czarnymi strzałkami, powinny być widoczne na odsłoniętym końcu physis. (H) Pojawienie się kości udowej z otwartym końcem skierowanym w dół do przygotowanej probówki o pojemności 0,5 ml umieszczonej w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 150 μl buforu FACS. (I) Wygląd granulowanych komórek szpiku kostnego i białej kości udowej po szybkim odwirowaniu w dawce 12 000 x g. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie wysokiej jakości zawiesiny komórek lub jąder ma kluczowe znaczenie dla powodzenia analiz monokomórkowych lub jednokomórkowych RNA-Seq i monokomórkowych 29,30,31. W tym miejscu opisaliśmy protokoły przygotowania próbek i izolacji jąder do testów multiomowych z dwóch rodzajów tkanek: mózgu i szpiku kostnego.

Protokół mózgu opisany w tym artykule pozwala na odzyskanie wysokiej jakości jąder ze świeżo zamrożonej tkanki mózgowej. Obejmuje ona następujące etapy: rozerwanie zamrożonej tkanki, izolację jąder, oczyszczanie jąder oraz kontrolę jakości przygotowanego materiału. Tkanka mózgowa składa się z wielu różnych typów komórek, a procedura dysocjacji tkanek i izolacji jąder powinna zachować proporcje populacji komórek obecnych w tkance wyjściowej. W tym przypadku zoptymalizowano skład buforu do lizy i czas inkubacji, aby umożliwić pełną i delikatną lizę wszystkich populacji komórek tworzących tkankę.

Protokół HSPC szpiku kostnego jest nieco inny, ponieważ wymaga jednego dodatkowego kroku na początku eksperymentu w celu wyizolowania interesującej populacji komórek z heterogenicznej zawiesiny komórkowej. Po pobraniu świeżej tkanki czerwone krwinki są poddawane lizie, a próbka jest wzbogacana o podzbiór komórek będących przedmiotem zainteresowania. Docelowe komórki są poddawane lizie, jądra są izolowane, a jakość przygotowanego materiału jest kontrolowana.

10X Genomics dostarcza kilka zatwierdzonych protokołów do izolacji jąder w wielu różnych tkankach 32,33. Firma wprowadza również na rynek zestaw do izolacji jąder z prostym procesem izolowania jąder od zwalidowanych tkanek34. Protokoły te wymagają jednak dodatkowej optymalizacji, aby dostosować specyfikę niektórych próbek. Przykładem są próbki, które wymagają pracy z małą liczbą danych wejściowych komórek. W przypadku tych próbek najtrudniejszymi etapami są wirowanie, które musi być wystarczająco rygorystyczne, aby oczyścić próbkę i wystarczająco delikatne, aby uniknąć utraty komórek/jąder. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi dostosowaliśmy 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27, aby znaleźć delikatną równowagę między tymi dwoma wymaganiami. Jak pokazano na przykładzie przygotowania jąder z posortowanych HSPC, poprawiliśmy odzysk jąder bez wpływu na jakość próbki.

Dodatkowym wyzwaniem jest etap lizy oczyszczonych komórek w celu izolacji jąder. Trudniejsze warunki lizy i dłuższy czas inkubacji mogą uszkodzić jądra, a tym samym wpłynąć na jakość danych sekwencjonowania. Rycina 5 przedstawia reprezentatywne obrazowanie jąder z próbek szpiku kostnego w różnych czasach inkubacji z buforem do lizy i ilustruje, jak różny może być stan jąder w zależności od lizy komórek. W przykładzie HSPC zidentyfikowaliśmy 3-minutową lizę jako stan, który skutkuje najwyższym odsetkiem zdrowo wyglądających, nienaruszonych jąder i najniższym odsetkiem uszkodzonych jąder. Czas inkubacji lizy powinien być zoptymalizowany dla każdego nowego rodzaju próbki.

figure-discussion-1
Rysunek 5: Kontrola jakości jąder za pomocą mikroskopii. Pokazano reprezentatywne obrazy w jasnym polu izolowanych jąder ze szpiku kostnego myszy z (A) nienaruszonymi i (B) uszkodzonymi jądrami. Podziałka 5 μm. Zdjęcia wykonano mikroskopem odwróconym przy użyciu 40-krotnego obiektywu ELWD NA 0,60 i 1,5-krotnego zoomu cyfrowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oba protokoły szczegółowo opisane w tej pracy opierają się na oczyszczaniu docelowych komórek lub jąder za pomocą wysokoprzepustowych instrumentów FACS. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla protokołów przygotowania pojedynczych komórek/jąder, w których rzadkie podzbiory komórek mają być izolowane z heterogenicznych zawiesin. W tych, podobnie jak w pokazanym tutaj przykładzie dla sortowania HSPC, może być wymagany panel wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, aby umożliwić "bramkowanie" na populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Sortowanie jest niezwykle szybkie i dokładne, co prowadzi do ponad 95% czystości posortowanych podzbiorów komórek. Takie podejście wystawia zawiesinę komórkową na ciśnienie do 70 psi i dlatego może być ograniczające sortowanie delikatnych komórek (np. komórek dendrytycznych, neutrofili), ponieważ może spowodować pęknięcie ich błony komórkowej. W takich przypadkach należy wybrać alternatywne rozwiązania do oczyszczania komórek, w tym sortowanie magnetyczne, zastosowanie urządzeń nowej generacji (np. CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36 lub systemy oparte na kropelkach (np. ODIN, Sensific)37. Niemniej jednak niska szybkość sortowania w tych technologiach, z sortowaniem komórek, które trwa godzinami, a nie minutami, jest silnym czynnikiem ograniczającym zastosowanie tych podejść w przygotowaniu żywotnych komórek do Multiome i innych zastosowań jednokomórkowych opartych na analizie dużej liczby komórek.

Do oczyszczania jąder wyizolowanych z tkanki metodą z wyboru jest FACS ze względu na jej przepustowość i czystość izolowanego materiału. Jądra nie są wrażliwe na nacisk, a przefiltrowane izolaty tkanek można łatwo oczyścić za pomocą sortera komórek. Jeśli laboratorium nie jest wyposażone w przyrząd FACS, istnieją inne alternatywy, nieco mniej wydajne, ale wystarczająco dobre. Przykłady obejmują ultrawirowanie lub użycie małego sprzętu, takiego jak MARS (Applied Cell), który oddziela cząstki na podstawie ich różnicy wielkości za pomocą fal akustycznych; Myjka laminarna CURIOX wykorzystująca właściwości hydrofobowe zawiesin komórek/jąder; lub LEVITAS bio, który opiera się na fizycznych właściwościach komórek (lewitacja) w celu oddzielenia ich od gruzu.

W tym miejscu opisujemy protokoły pozwalające uzyskać dużą liczbę jąder i najlepszą czystość dla dalszego protokołu Multiome. Sortowanie metodą FACS i powtarzające się etapy wirowania powodują znaczne straty materiału wyjściowego. Z tego powodu w opisanym przez nas protokole preparacji jąder z mózgu wymagana jest wystarczająco obfita ilość materiału wyjściowego, aby po sortowaniu FACS udało się zebrać co najmniej 500 000 jąder. Jeżeli nie można spełnić tego kryterium, należy zastosować alternatywne protokoły. Podczas pracy z rzadkimi populacjami komórek lub małymi skrawkami tkanek dostępna ilość materiału wyjściowego może być czynnikiem ograniczającym. Aby rozwiązać ten problem, możliwe jest usprawnienie odzyskiwania jąder poprzez (a) zmniejszenie objętości lizy, (b) zmniejszenie objętości płukania, (c) użycie pojedynczego płukania z wydłużonym czasem wirowania w celu poprawy odzysku, jak wskazano w protokołach 10X Genomics dla izolacji jąder o niskim nakładzie komórki. W przypadku analizy multiomicznej materiału o niskiej zawartości warto rozważyć zastosowania oparte na płytkach, takie jak scNMT, SNARE-seq i Paired-seq38 , które wymagają znacznie mniejszej liczby próbek wejściowych.

Podsumowując, opisaliśmy dwa solidne protokoły przygotowania jąder z mózgu i HSPC szpiku kostnego do dalszej analizy Multiome. Protokoły te mają zastosowanie w każdym projekcie naukowym, który wymaga wysokiej jakości zawiesin pojedynczych jąder z tych dwóch typów tkanek, niezależnie od postawionego pytania naukowego. Nasza grupa stosuje protokół izolacji jąder mózgowych w badaniach nad rozwojem mózgu po inaktywacji różnych docelowych genów oraz w badaniach odpowiedzi immunologicznej w kontekście chorób neurologicznych. Używamy protokołu izolacji jąder szpiku kostnego do rozszyfrowania udziału różnych subpopulacji krwiotwórczych w tworzeniu układu odpornościowego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ana Jeemin Choi była wspierana przez stypendium z Międzynarodowego Programu Doktoranckiego Pasteura - Uniwersytetu Paryskiego (PPU).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 G x 1 & frac12; (1,2 mm x 38 mm) Igły AganiTerumoAN*1838S1
Probówki 15 mlFalcon352097
5 ml probówka FACS z okrągłym dnem z nasadką sitka do komórek 35 &mikro; mFalcon352235
probówki 50 mlFalcon352070
7-AADBD pharmagen559925
ACK Bufor lizującyGibcoA10492-01
APC anty-mysz CD117 (c-Kit)BioLegend105812Klon: 2B8
APC/Cyjanina 7 anty-mysz CD16/32 (Fcγ R)BioLegend101328Klon: 93
BD FACSAria IIIBD Biosciencesnie dotyczy
Oprogramowanie BD FACSDiva v8.0.1BD Biosciencesnie dotyczy
Albumina surowicy bydlęcej  roztwór podstawowy 10%Miltenyi Biotec130-091-376
Bufor do barwienia komórekBiolegend420201
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6Nikon nie dotyczy
Kamera CMOS Prime 95B 25 mmPhotometrixnie dotyczy
Countess II FL Automatyczny licznik komórekInvitrogenAMQAF1000
Szkiełko komory zliczania komórek HrabinaInvitrogenC10283
Szkło nakrywkowe 24 mm x 24 mm 0,13-0,17 mmMarkaBR470819
Digitonine 5%InvitrogenBN2006
Skalpele jednorazowe Swann-Morton 0508
DMEM (1x) + GlutaMAX-IGibco31966-021
DPBS (10x)Gibco14200-067
DTTSigma aldrich646563
Mikroskop odwrócony epifluorescencji Nikon Ti2 -ENikon nie dotyczy
Probówki Eppendorf Safe-Lock 0,5 mlEppendorf30123603
Etanol 70%VWR83801.290
FITC anty-mysie CD34Invitrogen11-0341-85Klon: Kleszcze RAM34
do sekcjiFST11152-10
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco11533387
Homogenizator Dounce 2 mlSzkło Bellco1984-10002Tłuczek " A” Duży prześwit: .0030-.0050 i prime; i Tłuczek " B” Mały prześwit: .0005-.0025″
LIVE/DEAD zestaw do usuwania martwych komórekInvitrogenL34957
Roztwór chlorku magnezu 1 MSigma aldrichM1028
Mikrowirówka Eppendorf5424R
Medium montażowe Fluoromount-G invitrogen00-4958-02
Substytut Nonidet P40Sigma aldrich74385
Woda wolna od nukleazThermoFischerAM9932
Bufor jąder 20x 10X Genomics2000153/2000207
Zestaw do izolacji jąder EZ prepSigma AldrichNUC-101
Koraliki kompensacyjne OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-41
Pacific Blue koktajl przeciw myszom
(w tym anty-mysie CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)		BioLegend133310Klony (w tej samej kolejności co wymienione przeciwciała): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119
Paski probówki do PCR 0,2 mlEppendorf951010022
PE przeciw myszom Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend122507Klon: E13-161.7
szalka Petriego 100 mm x 20 mm OPTILUXFalcon353003
Ply-L-lizyna 0,01% przefiltrowana sterylnie, odpowiednia do hodowli komórkowychSigmaP4707
Drukowane szkiełka mikroskopowe 8-dołkowe 6 mm numerowaneEprediaER-301B-CE24
Probówki białkowe LoBind 1,5 mlEppendorf30108116
Rekombinowany inhibitor rnazy 5000 UTakara2313A
Nożyczki do preparacjiFST14090-09
Roztwór chlorku sodu 5 MSigma aldrich59222C
Filtry strzykawkowe, PES, 0,2 i mikro; mFisher Scientific15206869
Przezroczysty lakier do paznokci dowolnyniemający zastosowania
roztwór chlorowodorku Trizma pH 7,4Sigma aldrichT2194
Błękit trypanowy 0,4%gibco15250061
Tween 20Biorad 
UltraPure Distilated Water Bez Dnazy/RnazyInvitrogen10977-035
1662404

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  2. Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental & Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
  3. Cerrizuela, S., et al. High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids. STAR Protocols. 3 (3), 101555(2022).
  4. Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. Single-cell multiomics techniques: From conception to applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317(2022).
  5. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  6. Cao, J., et al. Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. Science (New York, N.Y.). 361 (6409), 1380-1385 (2018).
  7. Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61542(2020).
  8. Kim, M., et al. Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells. Nature Communications. 11 (1), 6375(2020).
  9. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694(2021).
  10. Safabakhsh, S., et al. Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing. Current Protocols. 2 (7), e480(2022).
  11. Lau, S. -F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).
  12. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
  13. Morabito, S., et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).
  14. Chen, S., et al. Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 188(2022).
  15. Paul, F., et al. Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors. Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).
  16. Kaufmann, E., et al. BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis. Cell. 172 (1-2), 176-190.e19 (2018).
  17. Christ, A., et al. Western diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming. Cell. 172 (1-2), 162-175.e14 (2018).
  18. Moorlag, S. J. C. F. M., et al. β-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1. Cell Reports. 31 (7), 107634(2020).
  19. de Laval, B., et al. C/EBPβ-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674.e8 (2020).
  20. Renthal, W., et al. Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing. Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).
  21. Yang, A. C., et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk. Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).
  22. Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains. STAR Protocols. 4 (1), 101944(2022).
  23. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  24. Ranzoni, A. M., et al. Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis. Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487.e7 (2021).
  25. 10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide, Document Number CG000338 Rev F. , At https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-next-gem-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-reagent-kits-user-guide (2022).
  26. Meyerhoff,, et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941(2021).
  27. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). , At https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  28. Haag, S., Murthy, A. Murine monocyte and macrophage culture. Bio-Protocol. 11 (6), e3928(2021).
  29. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lönnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).
  30. Jiang, P. Quality control of single-cell RNA-seq. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 1935, 1-9 (2019).
  31. Regan, C., Preall, J. Practical considerations for single-cell genomics. Current Protocols. 2 (8), e498(2022).
  32. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). , At https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-atac/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-for-single-cell-atac-sequencing (2022).
  33. 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). , At https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
  34. 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). , At https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/chromium-nuclei-isolation-kit-sample-prep-user-guide (2022).
  35. Shomroni, O., et al. A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease. Scientific Reports. 12 (1), 4091(2022).
  36. Ocañas, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  37. Gérard, A., et al. High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics. Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).
  38. Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics. Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przygotowanie pojedynczych j derizolacja j der z m zguprofilowanie pojedynczych kom rekdysocjacja tkankikontrola jako ci j dersortowanie kom rekprzygotowanie bibliotekisekwencjonowanie pojedynczych j der

Powiązane artykuły