Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65718

⸱

12 stycznia 2024

 , 
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN). Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Streszczenie

Ligazy i białka E3 przeznaczone do degradacji mogą być indukowane do tworzenia kompleksów przez heterobifunkcjonalne cząsteczki w wieloetapowym procesie. Kinetyka i termodynamika zachodzących oddziaływań przyczynia się do efektywności ubikwitynacji i wynikającej z niej degradacji białka. Techniki biofizyczne, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometria biowarstwowa (BLI) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) dostarczają cennych informacji, które można wykorzystać do optymalizacji tych interakcji. Korzystając z dwóch systemów modelowych, stworzono zestaw narzędzi do testów biofizycznych w celu zrozumienia kooperatywności tworzenia kompleksów trójskładnikowych oraz wpływu "efektu haczyka" na kinetykę wiązania. W jednym przypadku oceniono cząsteczkę chimery ukierunkowaną na proteolizę (PROTAC), która indukowała tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4BD2 i VHL. Heterobifunkcyjna cząsteczka MZ1 ma powinowactwo nM zarówno do białka Brd4BD2 (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM), jak i do kompleksu VHL (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). Dla tego systemu opracowano solidne testy SPR, BLI i ITC, które odtworzyły opublikowane wyniki wykazujące kooperatywność tworzenia kompleksów trójskładnikowych. W drugim przypadku badano cząsteczkę, która indukowała trójskładnikowe kompleksy między białkiem 46,0 kDa, PPM1D i cereblonem [CRBN (319-442)]. Heterobifunkcyjna cząsteczka, BRD-5110, ma SPRK D = 1 nM dla PPM1D, ale znacznie słabsze wiązanie ze skróconym kompleksem CRBN (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). W tym przypadku wiązanie dla CRBN w SPR nie było nasycone, co skutkowało "efektem haczyka". Oceniono przepustowość i wymagania dotyczące odczynników dla SPR, BLI i ITC, a także przedstawiono ogólne zalecenia dotyczące ich stosowania w projektach PROTAC.

Wprowadzenie

Poliubikwitynacja białek w komórce jest ściśle regulowanym procesem, który obejmuje enzymy z rodziny ligaz ubikwityny1,2. Enzymy końcowe w szlaku to ligazy ubikwityny E3, które kowalencyjnie przyłączają cząsteczki ubikwityny do swoich partnerów wiążących białka3. Poliubikwitynacja tych partnerów wiążących białka jest ukierunkowana na degradację proteolityczną przez proteasom4. System ten jest częścią procesu homeostazy białek, który został terapeutycznie wykorzystany do indukowania degradacji białek zaangażowanych w chorobę5. Małe cząsteczki, które indukują interakcję między ligazami ubikwityny E3, takie jak ligaza E3 von Hippel-Lindau (VHL) lub cereblon (CRBN), są zwykle zbudowane z głowicy wiążącej ligazę E3 połączonej elastycznym łącznikiem z głowicą bojową, która wiąże się z białkiem przeznaczonym do degradacji. Te heterobifunkcyjne cząsteczki są powszechnie określane jako chimery ukierunkowane na proteolizę lub PROTACS6.

Rozwój PROTACS polega na ocenie zdolności molekuł do indukowania degradacji białek w komórkach. Opracowano wiele komórkowych systemów testowych, które monitorują indukowaną interakcję między białkiem docelowym a składnikami ligazy E3, takimi jak VHL lub CRBN, po potraktowaniu komórek cząsteczką PROTAC. Jeden z takich testów komórkowych, system nanoluc-Halotag7, obejmuje ligazę E3 połączoną z akceptorem Halotag i docelowe białko oznaczone donorem nanoluc. Tworzenie kompleksu trójskładnikowego zbliża donor nanoluc i akceptor Halotag do siebie, umożliwiając transfer energii z donora do akceptora, co skutkuje emisją światła. Warianty tego systemu mogą być wykorzystane do oceny przepuszczalności komórkowej cząsteczek PROTACS8 lub zmian względnego poziomu ubikwitynacji białka docelowego9. Podczas gdy te systemy komórkowe są niezbędne do napędzania optymalizacji PROTACS, tworzenie kompleksów między ligazami E3 a białkami przeznaczonymi do degradacji jest procesem wieloetapowym10,11. Kinetyka i termodynamika zachodzących interakcji binarnych i trójskładnikowych przyczynia się do ubikwitynacji wydajności i wynikającej z niej degradacji białka12,13,14.

Poniżej opisane są protokoły, które można dostosować do biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTACS za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), interferometrii biowarstwowej (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Protokoły SPR i ITC dla cząsteczki MZ1 PROTAC, która indukuje tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4BD2 i VHL, pochodzące z doniesień literaturowych13,15 i opisane tutaj, były w stanie podsumować zgłoszone wyniki z pewną modyfikacją zgłoszonych procedur, które zostaną omówione. Opis testu BLI stosowanego do oceny tworzenia kompleksu trójskładnikowego między MZI, Brd4BD2 i VHL znajduje się w niniejszym raporcie. Pomiary powinowactwa z BLI były zgodne z tymi obserwowanymi w SPR i ITC. Opisano również wcześniej opublikowany protokół, w którym opracowano test SPR do oceny indukowanego przez PROTAC tworzenia kompleksu trójskładnikowego między PPM1D, fosfatazą białkową Ser / Thr, której ekspresja jest indukowana w sposób zależny od p53 16, a CRBN. W tym przypadku cząsteczka PROTAC ma powinowactwo nanomolowe do PPM1D, ale tylko powinowactwo mikromolowe do CRBN. W tym przypadku wiązanie cząsteczki PROTAC z CRBN nie jest nasycone, co skutkuje powszechnie obserwowanym "efektem haczyka". Efekt haka jest właściwością trzech układów ciała, w których istnieją dwa gatunki, które mogą tworzyć kompleks heterotrimeryczny, gdy oba są związane z cząsteczką pomostową ( Rysunek 1) < sup class = "xref">17. Efekt haczyka obserwuje się, gdy stężenie gatunku łączącego się jest nadmierne w stosunku do dwóch pozostałych gatunków. Wynikowy stan to taki, w którym interakcje binarne konkurują z oddziaływaniami trójskładnikowymi. Systemy, w których obserwuje się efekt haka, wymagają szczególnych rozważań dotyczących projektowania eksperymentalnego omówionych w niniejszym raporcie. Podano ogólne koncepcje i wymagania dotyczące odczynników do oceny wykorzystania testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTAC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie białka uległy nadekspresji w >E.coli z dobrą wydajnością i czystością (>80%) zgodnie z protokołami literaturowymi18. Biotynylację przeprowadzono przy użyciu reakcji katalizowanej przez BirA18. Wszystkie małe cząsteczki przygotowano w roztworach podstawowych 1 mM w 100% DMSO. Procedury opisane w niniejszym dokumencie nie wymagają specjalistycznego laboratoryjnego sprzętu bezpieczeństwa ani środków ostrożności. Należy używać standardowych laboratoryjnych środków ochrony osobistej (PPE) (tj. fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawic).

Białka użyte w tym badaniu są wymienione poniżej:
VHL: biotynylowany kompleks VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) ze znacznikiem Avi na C-końcu ElonginB.
Brd4BD2: Nieoznakowany Brd4BD2(333-460)
CRBN: biotynylowany CRBN(319-442) ze znacznikiem Avi na końcu N
PPM1D: nieoznakowany lub podwójnie oznaczony His8-tagowany PPM1D(1-420) na końcu N

Małe cząsteczki użyte w tym badaniu są wymienione poniżej:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC, który wiąże się z VHL i Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN KD ~ 3 μM, nie wiąże się z PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN KD ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): nie wiąże się z CRBN, PPM1DK D = 1-2 nM

1. Metoda 1: ITC (izotermiczna kalorymetria miareczkowa)

UWAGA: Miareczkowanie odbywa się za pomocą mikrokalorymetru z automatycznym wstrzykiwaniem.

  1. Przygotowanie buforu: Przygotować 3 l buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Dializa: Dializować VHL i Brd4BD2 (~ 500 μL przy 150 μM każdy) w stosunku do 1 l buforu przygotowanego w kroku 1.1, 3 razy w temperaturze 4 °C, odpowiednio przez 4 godziny, 2 godziny i około 16 godzin. Należy zachować bufor po ostatniej dializie do wykorzystania w kolejnych krokach.
  3. Przygotować próbki na 96-dołkowej płytce z plastikową osłoną.
    1. Do każdego miareczkowania należy przygotować 400 μl roztworu dla celi, 125 μl dla strzykawki i 400 μl buforu do czyszczenia. Dodaj próbki do trzech kolejnych studzienek na płytce. Ponieważ wywar złożony jest przygotowywany w 1 mM w 100% DMSO, dodaj ten sam procent DMSO do roztworów białkowych, aby zapewnić pasujący bufor w komórce i strzykawce. Dodaj 2% DMSO do końcowych roztworów.
      1. Próbka do miareczkowania VHL do MZ1: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 4 μl MZ1 przy 1 mM (10 μM stężenie końcowe) i 4 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM, 2,5 μl 100% DMSO (stężenie końcowe 84 μM).
      2. Próbki do miareczkowania VHL do buforu (dane zostaną wykorzystane do odjęcia tła danych wygenerowanych z próbki 1.3.1.1): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 8 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i dodać 2,5 μl 100% DMSO.
      3. Próbki do miareczkowania VHL do MZ1 i Brd4BD2: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM stężenie końcowe), 3,36 μL MZ1 przy 1 mM (stężenie końcowe 8,4 μM) i 4,64 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.
      4. Próbki do miareczkowania VHL do Brd4BD2 (tło 1.3.1.3): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μL 17,1 μM Brd4BD2 (16,8 μM stężenie końcowe) i 8 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.
  4. Uruchomić wszystkie cztery miareczkowania na mikrokalorymetrze. Każdy z nich składa się z 19 wstrzyknięć 2 μl roztworu strzykawkowego z szybkością 2 μl/s w odstępach 120 s. Wykonaj wstępne wstrzyknięcie białka (0,4 μl) i odrzuć je podczas analizy danych. Wszystkie doświadczenia należy wykonywać w temperaturze 25 °C, mieszając przy 600 obr./min.
  5. Analiza danych: Dopasuj dane do modelu z pojedynczym miejscem wiązania, aby uzyskać stechiometrię (n), stałą dysocjacji (KD) i entalpię wiązania (ΔH) za pomocą oprogramowania analitycznego dostarczonego przez producenta (Rysunek 2).

2. Metoda 2: BLI (interferometria biowarstw)

  1. Przeprowadzić eksperymenty BLI przy użyciu czujników pokrytych streptawidyną (SA) w temperaturze pokojowej (RT) z częstotliwością akwizycji 5 Hz. Podczas zautomatyzowanego eksperymentu BLI upewnij się, że czujniki są nieruchome w jednej kolumnie i poruszają się między różnymi kolumnami 96-dołkowej, płaskiej, czarnej płytki o maksymalnej objętości dołka 392 μL. Napełnij każdą studzienkę płytki użytej w eksperymencie 200 μl roztworu.
    UWAGA: BLI jest przydatny tylko do wykrywania interakcji białko-białko (tj. tworzenia kompleksów trójskładnikowych). Nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć interakcje między białkami a małymi cząsteczkami.
    1. Przygotowanie buforu: Przygotować 100 ml buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Optymalizacja dla etapu unieruchomienia: Załaduj czujnik testowy do 1-3 nm, zgodnie z zaleceniami producenta. Obciążenie ~1,0 nm jest używane do opisanych tutaj procedur. Aby to osiągnąć, zanurz czujnik w roztworze zawierającym VHL w stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.
    3. Przeprowadzić pomiary kinetyczne BLI, stosując siedem czujników SA w następującej kolejności:
      1. W pierwszej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.
      2. W fazie unieruchomienia zanurzyć w roztworze VHL o stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.
      3. W drugiej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.
      4. W fazie asocjacji zanurzyć w roztworze o stałym stężeniu Brd4BD2 przy 2 μM, stałym stężeniu DMSO przy 2% i zmiennych stężeniach MZ1 przy 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM i 0 nM (czujnik odniesienia) przez 300 s.
      5. W fazie dysocjacji zanurz się w buforze na 600 s.
    4. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta. kon, koff i KD są raportowane dla dopasowania danych (Rysunek 3).

3. Metoda 3: SPR (powierzchniowy rezonans plazmonowy)

UWAGA: Wszystkie eksperymenty SPR są przeprowadzane przy użyciu chipów czujników pokrytych streptawidyną (SA) w RT. Chociaż chip NTA jest używany do wykrywania między białkiem a małymi cząsteczkami, należy go używać z ostrożnością w przypadku stosowania do kompleksu trójskładnikowego, ponieważ obserwuje się znacznie wyższe tło niż chip SA, prawdopodobnie ze względu na oddziaływania elektrostatyczne między naładowaną powierzchnią chipa a białkiem w analicie.

  1. SPR do współpracy VHL-MZ1
    1. Przygotowanie buforu.
      1. Przygotuj 1 l bufor zawierający 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuść go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
      2. Usuń 20 ml buforu do wykorzystania w przyszłości (bufor wolny od DMSO) i napełnij ponownie 20 ml DMSO (2% DMSO w końcowym buforze działającym). Utrzymuj DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.1 i 3.2)
    2. Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~2000 RU (wstrzyknąć roztwór białka 5 μg/ml przy 5 μL/min).
    3. Przygotować MZ1 w 3-krotnym, 8-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 10 μM na 384-dołkowej, stożkowej dnie, półprzezroczystej, polipropylenowej płytce o maksymalnej objętości 130 μL. Przykryj płytkę samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego kompatybilnymi z mikropłytkami polipropylenowymi.
      1. Przygotuj górne stężenie z buforem wolnym od DMSO, aby zapewnić 2% DMSO w końcowym stężeniu. Do 147 μl buforu wolnego od DMSO dodaj 1,5 μl bulionu MZ1 w 1 mM i 1,5 μl 100% DMSO.
      2. Przygotować 3-krotne seryjne rozcieńczenie z uruchomionym buforem zawierającym 2% DMSO. Do 100 μl bieżącego buforu dodać 50 μl roztworu o najwyższym stężeniu przygotowanym w kroku 3.1.3.1 i dobrze wymieszać, aby przygotować 2. najwyższe stężenie.
      3. Następnie przenieść 50 μl roztworu przygotowanego w kroku 3.1.3.2 do następnych 100 μl działającego buforu, dobrze wymieszać, aby przygotować trzecie najwyższe stężenie i tak dalej.
    4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 120 s; czas dysocjacji: 300 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.
    5. Przeprowadzić analizę danych za pomocą oprogramowania ewaluacyjnego dostarczonego przez producenta urządzenia. Analiza w stanie ustalonym wykazała, że KD = 26 (± 3) nM i Rmax ~91% (± 5%) osiągnięto wiązanie (Rysunek 4A)
  2. SPR dla VHL: MZ1: kompleks trójskładnikowy Brd4BD2
    1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.1.1.
    2. Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~100 RU. Wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml VHL przy natężeniu przepływu 5 μl/min i czasie kontaktu od 1 do 5 minut, aż do osiągnięcia gęstości powierzchni ~100 RU.
    3. Przygotować próbki do dwóch 5-krotnych, 5-punktowych jednocyklowych wstrzyknięć w 96-dołkową, przezroczystą, polistyrenową płytkę o okrągłym dnie o maksymalnej objętości 323 μl i przykryć ją samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego, które są kompatybilne z mikropłytkami polistyrenowymi, jak opisano w krokach 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Kontrola ujemna: analit zawiera tylko Brd4BD2.
        1. Przygotować najwyższe stężenie przy 25 μM w bieżącym buforze o objętości 200 μL (#A5)
        2. Dodaj po 160 μl Brd4BD2 w 2 μM w buforze bieżącym do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#A1-A4)
        3. Przenieś 40 μl A5 do A4. Dobrze wymieszaj.
        4. Przenieś 40 μl formatu A4 do formatu A3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do A1.
      2. Tworzenie kompleksu trójskładnikowego: analit zawiera MZ1 i Brd4BD2.
        1. Przygotować najwyższe stężenie, dodając 4 μl MZ1 przy 20 μM w 100% roztworze DMSO do 196 μl zawierających 25,5 μM Brd4BD2 w buforze wolnym od DMSO (#B5). Końcowe stężenia to 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 i 2% DMSO.
        2. Dodaj po 160 μl Brd4BD2 w 2 μM do bieżącego buforu do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#B1-B4)
        3. Przenieść 40 μl witaminy B5 do witaminy B4. Dobrze wymieszaj.
        4. Przenieść 40 μl witaminy B4 do witaminy B3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do B1.
    4. Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Czas kontaktu: 100 s; czas dysocjacji: 720 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdą próbką, aby zapewnić stabilne tło.
    5. Analiza danych: Zastosuj trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, gdy MZ1 nie jest obecny, odpowiedź SPR między VHL a Brd4BD2 jest znikoma. Gdy MZ1 jest obecny, dopasowanie kinetyczne wskazuje, że oddziaływanie między VHL i kompleksem MZ1-Brd4BD2 ma kwłączone = 7,9 (± 1,5) *107 / M / s, kwyłączone = 0,014 s-1 i KD = 1 nM. (Rysunek 4B)
  3. SPR dla oddziaływań CRBN i małych cząsteczek
    1. Przygotowanie buforu.
      1. Przygotować 1 l bufor zawierający 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuścić go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
      2. Usuń 20 ml buforu i uzupełnij 20 ml 100% DMSO (2% DMSO w końcowym buforze). Ważne jest, aby utrzymać DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.3, 3.4 i 3.5).
    2. Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchom, CRBN do ~800 RU.
    3. Przygotować związki w 3-krotnym, 6-punktowym seryjnym rozcieńczeniu na 384-dołkowej płytce o najwyższym stężeniu 30 μM, jak opisano w ppkt 3.1.3.
    4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność, czas kontaktu: 60 s, czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. W przypadku tego systemu wystarczą trzy wstrzyknięcia bufora, aby uzyskać stabilne tło. W przypadku innych systemów testowych może być konieczne wykonanie dodatkowych iniekcji buforowych.
    5. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta.
      UWAGA: Analiza w stanie ustalonym wskazuje, że KD BRD-2512 i BRD-5110 wynoszą około 3 μM. Jednak wiązanie osiągnęło tylko ~ 70%R max wiązania przy najwyższym stężeniu. Zarówno słabe powinowactwo, jak i kształt sensorgramu wskazują, że prawdopodobieństwo wystąpienia nierozpuszczalności związku w wysokich stężeniach. W związku z tym rzeczywisty KD może być wyższy niż 3 μM. BRD-4761, który nie wiąże się z CRBN, został włączony jako kontrola ujemna.
  4. SPR dla PPM1D i oddziaływań małocząsteczkowych
    1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1. Użyj chipa czujnika kwasu nitrylooctowego (NTA).
    2. Zastosuj pojedynczy cykl, ponieważ głowica bojowa PPM1D ma powolne kwłączania i wyłączania. Zregeneruj chip NTA przy użyciu domyślnej konfiguracji producenta i unieruchamiaj PPM1D do ~ 1000 RU po każdym wstrzyknięciu związku (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 5 μg/ml przy 5 μl/min).
    3. Przygotować związki w 3-krotnym, 5-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 400 nM, jak opisano w ppkt 3.1.3.
    4. Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Tryb: wysoka wydajność; czas kontaktu: 90 s; czas dysocjacji: 600 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdym związkiem, aby zapewnić stabilne tło.
    5. analiza danych. Zastosować trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, BRD-2512 nie wykazuje wiązania z PPM1D. W przypadku BRD-4761 i BRD-5110 dopasowanie kinetyczne wskazywało, że KD dla obu wynosi 1-2 nM.
  5. SPR dla CRBN:PROTAC: Kompleks trójskładnikowy PPM1D
    1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1.
    2. Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchamij CRBN do ~35 RU (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml przy 5 μl/min).
    3. Przygotować trzy związki w 3-krotnym, 6-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 30 μM, utrzymując [PPM1D] na poziomie 1 μM we wszystkich próbkach, w tym w próbach ślepych, stosując metodę opisaną w kroku 3.2.3.
    4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 60 s; czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.
    5. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta.
      UWAGA: Podczas gdy BRD-2512 i BRD-4761 wykazują brak/znikomą odpowiedź, BRD-5110 wyraźnie pokazuje "efekt haka" w stanie ustalonym z szybką kinetyką włączania/wyłączania (Rysunek 5A-C). Eksperymentalna odpowiedź wiązania z BRD-5110 (Rysunek 5C) znajduje się pomiędzy przewidywaną odpowiedzią z symulacji, gdy zakłada się, że KD (CRBN, cpd) wynosi 3 lub 10 μM (Rysunek 5E), co sugeruje, że trójskładnikowe KD i binarne KD są bardzo podobne. Nie ma widocznej kooperatywności PPM1D: BRD-5110: tworzenia kompleksu CRBN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystykę kompleksu binarnego VHL: MZ1 oraz kompleksu trójskładnikowego VHL: MZ1: Brd4BD2 przedstawiono na Rysunku 2 (ITC), Rysunku 3 (BLI) oraz Rysunku 4 (SPR) przy zastosowaniu bardzo podobnego buforu. Wartości KD uzyskane z ortogonalnych analiz są spójne. Kooperatywność można obliczyć jako KD (binarny) / KD (trójskładnikowy), co daje wynik wyraźnie dodatni (15 z ITC lub 26 z SPR)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biofizyczna charakterystyka binarnych i trójskładnikowych oddziaływań między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka może dostarczyć unikalnych i uzupełniających informacji w odniesieniu do powszechnie stosowanych systemów komórkowych. Zrozumienie powinowactwa między każdą głowicą bojową cząsteczki PROTAC a jej partnerami wiążącymi białka może pomóc w ukierunkowaniu wysiłków chemii medycznej w kierunku optymalizacji tych interakcji. Wcześniej opublikowane struktury krystaliczne trójskładnikowych kompleksów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta nagrodą za Innowacyjność i Rozwój Technologii od Centrum Rozwoju Terapii w Broad Institute of MIT i Harvardzie. Autorzy pragną podziękować członkom zespołu kierowniczego wyższego szczebla oraz komisji rewizyjnej za wsparcie tych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-płytkowepłytki Greiner655076płaskodenne, czarne płytki używane W eksperymentach BLI
Płytka 96-dołkowaNunc73520-120Płytka do przygotowania próbki ITC
Płytka 96-dołkowaGreiner650101Płytka używana do przygotowania próbek do eksperymentów SPR
Automatyczny mikrokalorymetr iTC200Malvern PanalyticalPrzyrząd używany do przeprowadzania eksperymentów ITC. Produkt wycofany z rynku.
Biacore S200Cytiva29136649Instrument używany do wykonywania eksperymentów SPR
MZ1ProbeChemPC-60099PROTAC wiążący się z VHL i chipem czujnika Brd4BD2
NTACytivaBR100532chip SPR używany do wykonywania eksperymentów SPR z udziałem PPM1D
Octet Red-384SartoriusInstrument używany do wykonywania eksperymentów BLI. Produkt wycofany z rynku.
Osłona płytkiMalvernPQA0001Osłona płytki Nunc 96-dołkowa (73520-120)
Osłona płytkiCytiva28975816Osłona płytki do płytki Greiner (650101)
Układ czujnika serii S SACytivaBR100531Chip SPR używany do przeprowadzania eksperymentów SPR z udziałem MZ1:VHL:BRD4
Streptawidyna (SA) Biosensory zanurzania i odczytuSartorius18-509Czujniki powlekane stosowane w BLI Eksperymenty

Bibliografia

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23(2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362(2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Powierzchniowy rezonans plazmonowyinterferometria warstw biologicznychizotermiczna kalorymetria miareczkowadegradacja białekkompleks ligazy E3analiza kooperatywnościefekt haczyka
Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.