Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN). Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Streszczenie

Ligazy i białka E3 przeznaczone do degradacji mogą być indukowane do tworzenia kompleksów przez heterobifunkcjonalne cząsteczki w wieloetapowym procesie. Kinetyka i termodynamika zachodzących oddziaływań przyczynia się do efektywności ubikwitynacji i wynikającej z niej degradacji białka. Techniki biofizyczne, takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometria biowarstwowa (BLI) i izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) dostarczają cennych informacji, które można wykorzystać do optymalizacji tych interakcji. Korzystając z dwóch systemów modelowych, stworzono zestaw narzędzi do testów biofizycznych w celu zrozumienia kooperatywności tworzenia kompleksów trójskładnikowych oraz wpływu "efektu haczyka" na kinetykę wiązania. W jednym przypadku oceniono cząsteczkę chimery ukierunkowaną na proteolizę (PROTAC), która indukowała tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4^BD2 i VHL. Heterobifunkcyjna cząsteczka MZ1 ma powinowactwo nM zarówno do białka Brd4^BD2 (SPR K_D = 1 nM, ITC K_D = 4 nM), jak i do kompleksu VHL (SPR K_D = 29 nM, ITC K_D = 66 nM). Dla tego systemu opracowano solidne testy SPR, BLI i ITC, które odtworzyły opublikowane wyniki wykazujące kooperatywność tworzenia kompleksów trójskładnikowych. W drugim przypadku badano cząsteczkę, która indukowała trójskładnikowe kompleksy między białkiem 46,0 kDa, PPM1D i cereblonem [CRBN (319-442)]. Heterobifunkcyjna cząsteczka, BRD-5110, ma SPR_{K D} = 1 nM dla PPM1D, ale znacznie słabsze wiązanie ze skróconym kompleksem CRBN (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). W tym przypadku wiązanie dla CRBN w SPR nie było nasycone, co skutkowało "efektem haczyka". Oceniono przepustowość i wymagania dotyczące odczynników dla SPR, BLI i ITC, a także przedstawiono ogólne zalecenia dotyczące ich stosowania w projektach PROTAC.

Wprowadzenie

Poliubikwitynacja białek w komórce jest ściśle regulowanym procesem, który obejmuje enzymy z rodziny ligaz ubikwityny^1,2. Enzymy końcowe w szlaku to ligazy ubikwityny E3, które kowalencyjnie przyłączają cząsteczki ubikwityny do swoich partnerów wiążących białka³. Poliubikwitynacja tych partnerów wiążących białka jest ukierunkowana na degradację proteolityczną przez proteasom⁴. System ten jest częścią procesu homeostazy białek, który został terapeutycznie wykorzystany do indukowania degradacji białek zaangażowanych w chorobę⁵. Małe cząsteczki, które indukują interakcję między ligazami ubikwityny E3, takie jak ligaza E3 von Hippel-Lindau (VHL) lub cereblon (CRBN), są zwykle zbudowane z głowicy wiążącej ligazę E3 połączonej elastycznym łącznikiem z głowicą bojową, która wiąże się z białkiem przeznaczonym do degradacji. Te heterobifunkcyjne cząsteczki są powszechnie określane jako chimery ukierunkowane na proteolizę lub PROTACS⁶.

Rozwój PROTACS polega na ocenie zdolności molekuł do indukowania degradacji białek w komórkach. Opracowano wiele komórkowych systemów testowych, które monitorują indukowaną interakcję między białkiem docelowym a składnikami ligazy E3, takimi jak VHL lub CRBN, po potraktowaniu komórek cząsteczką PROTAC. Jeden z takich testów komórkowych, system nanoluc-Halotag⁷, obejmuje ligazę E3 połączoną z akceptorem Halotag i docelowe białko oznaczone donorem nanoluc. Tworzenie kompleksu trójskładnikowego zbliża donor nanoluc i akceptor Halotag do siebie, umożliwiając transfer energii z donora do akceptora, co skutkuje emisją światła. Warianty tego systemu mogą być wykorzystane do oceny przepuszczalności komórkowej cząsteczek PROTACS⁸ lub zmian względnego poziomu ubikwitynacji białka docelowego⁹. Podczas gdy te systemy komórkowe są niezbędne do napędzania optymalizacji PROTACS, tworzenie kompleksów między ligazami E3 a białkami przeznaczonymi do degradacji jest procesem wieloetapowym^10,11. Kinetyka i termodynamika zachodzących interakcji binarnych i trójskładnikowych przyczynia się do ubikwitynacji wydajności i wynikającej z niej degradacji białka^12,13,14.

Poniżej opisane są protokoły, które można dostosować do biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTACS za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), interferometrii biowarstwowej (BLI) i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Protokoły SPR i ITC dla cząsteczki MZ1 PROTAC, która indukuje tworzenie kompleksu trójskładnikowego między Brd4^BD2 i VHL, pochodzące z doniesień literaturowych^13,15 i opisane tutaj, były w stanie podsumować zgłoszone wyniki z pewną modyfikacją zgłoszonych procedur, które zostaną omówione. Opis testu BLI stosowanego do oceny tworzenia kompleksu trójskładnikowego między MZI, Brd4^BD2 i VHL znajduje się w niniejszym raporcie. Pomiary powinowactwa z BLI były zgodne z tymi obserwowanymi w SPR i ITC. Opisano również wcześniej opublikowany protokół, w którym opracowano test SPR do oceny indukowanego przez PROTAC tworzenia kompleksu trójskładnikowego między PPM1D, fosfatazą białkową Ser / Thr, której ekspresja jest indukowana w sposób zależny od p53 ¹⁶, a CRBN. W tym przypadku cząsteczka PROTAC ma powinowactwo nanomolowe do PPM1D, ale tylko powinowactwo mikromolowe do CRBN. W tym przypadku wiązanie cząsteczki PROTAC z CRBN nie jest nasycone, co skutkuje powszechnie obserwowanym "efektem haczyka". Efekt haka jest właściwością trzech układów ciała, w których istnieją dwa gatunki, które mogą tworzyć kompleks heterotrimeryczny, gdy oba są związane z cząsteczką pomostową ( Rysunek 1) < sup class = "xref">17. Efekt haczyka obserwuje się, gdy stężenie gatunku łączącego się jest nadmierne w stosunku do dwóch pozostałych gatunków. Wynikowy stan to taki, w którym interakcje binarne konkurują z oddziaływaniami trójskładnikowymi. Systemy, w których obserwuje się efekt haka, wymagają szczególnych rozważań dotyczących projektowania eksperymentalnego omówionych w niniejszym raporcie. Podano ogólne koncepcje i wymagania dotyczące odczynników do oceny wykorzystania testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez PROTAC.

Protokół

Wszystkie białka uległy nadekspresji w >E.coli z dobrą wydajnością i czystością (>80%) zgodnie z protokołami literaturowymi¹⁸. Biotynylację przeprowadzono przy użyciu reakcji katalizowanej przez BirA¹⁸. Wszystkie małe cząsteczki przygotowano w roztworach podstawowych 1 mM w 100% DMSO. Procedury opisane w niniejszym dokumencie nie wymagają specjalistycznego laboratoryjnego sprzętu bezpieczeństwa ani środków ostrożności. Należy używać standardowych laboratoryjnych środków ochrony osobistej (PPE) (tj. fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawic).

Białka użyte w tym badaniu są wymienione poniżej:
VHL: biotynylowany kompleks VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) ze znacznikiem Avi na C-końcu ElonginB.
Brd4^BD2: Nieoznakowany Brd4^BD2(333-460)
CRBN: biotynylowany CRBN(319-442) ze znacznikiem Avi na końcu N
PPM1D: nieoznakowany lub podwójnie oznaczony His8-tagowany PPM1D(1-420) na końcu N

Małe cząsteczki użyte w tym badaniu są wymienione poniżej:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC, który wiąże się z VHL i Brd4^BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN K_D ~ 3 μM, nie wiąże się z PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K_D ~3 μM, PPM1D K_D = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): nie wiąże się z CRBN, PPM1D_{K D} = 1-2 nM

1. Metoda 1: ITC (izotermiczna kalorymetria miareczkowa)

UWAGA: Miareczkowanie odbywa się za pomocą mikrokalorymetru z automatycznym wstrzykiwaniem.

1. Przygotowanie buforu: Przygotować 3 l buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
2. Dializa: Dializować VHL i Brd4^BD2 (~ 500 μL przy 150 μM każdy) w stosunku do 1 l buforu przygotowanego w kroku 1.1, 3 razy w temperaturze 4 °C, odpowiednio przez 4 godziny, 2 godziny i około 16 godzin. Należy zachować bufor po ostatniej dializie do wykorzystania w kolejnych krokach.
3. Przygotować próbki na 96-dołkowej płytce z plastikową osłoną.
   1. Do każdego miareczkowania należy przygotować 400 μl roztworu dla celi, 125 μl dla strzykawki i 400 μl buforu do czyszczenia. Dodaj próbki do trzech kolejnych studzienek na płytce. Ponieważ wywar złożony jest przygotowywany w 1 mM w 100% DMSO, dodaj ten sam procent DMSO do roztworów białkowych, aby zapewnić pasujący bufor w komórce i strzykawce. Dodaj 2% DMSO do końcowych roztworów.
      1. Próbka do miareczkowania VHL do MZ1: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 4 μl MZ1 przy 1 mM (10 μM stężenie końcowe) i 4 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM, 2,5 μl 100% DMSO (stężenie końcowe 84 μM).
      2. Próbki do miareczkowania VHL do buforu (dane zostaną wykorzystane do odjęcia tła danych wygenerowanych z próbki 1.3.1.1): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl buforu, 8 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i dodać 2,5 μl 100% DMSO.
      3. Próbki do miareczkowania VHL do MZ1 i Brd4^BD2: Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μl 17,1 μM Brd4^BD2 (16,8 μM stężenie końcowe), 3,36 μL MZ1 przy 1 mM (stężenie końcowe 8,4 μM) i 4,64 μl 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.
      4. Próbki do miareczkowania VHL do Brd4^BD2 (tło 1.3.1.3): Przygotować roztwór komórkowy zawierający 392 μL 17,1 μM Brd4^BD2 (16,8 μM stężenie końcowe) i 8 μL 100% DMSO. Przygotować roztwór strzykawki zawierający 122,5 μl VHL o stężeniu 85,7 μM (stężenie końcowe 84 μM) i 2,5 μl 100% DMSO.
4. Uruchomić wszystkie cztery miareczkowania na mikrokalorymetrze. Każdy z nich składa się z 19 wstrzyknięć 2 μl roztworu strzykawkowego z szybkością 2 μl/s w odstępach 120 s. Wykonaj wstępne wstrzyknięcie białka (0,4 μl) i odrzuć je podczas analizy danych. Wszystkie doświadczenia należy wykonywać w temperaturze 25 °C, mieszając przy 600 obr./min.
5. Analiza danych: Dopasuj dane do modelu z pojedynczym miejscem wiązania, aby uzyskać stechiometrię (n), stałą dysocjacji (K_D) i entalpię wiązania (ΔH) za pomocą oprogramowania analitycznego dostarczonego przez producenta (Rysunek 2).

2. Metoda 2: BLI (interferometria biowarstw)

1. Przeprowadzić eksperymenty BLI przy użyciu czujników pokrytych streptawidyną (SA) w temperaturze pokojowej (RT) z częstotliwością akwizycji 5 Hz. Podczas zautomatyzowanego eksperymentu BLI upewnij się, że czujniki są nieruchome w jednej kolumnie i poruszają się między różnymi kolumnami 96-dołkowej, płaskiej, czarnej płytki o maksymalnej objętości dołka 392 μL. Napełnij każdą studzienkę płytki użytej w eksperymencie 200 μl roztworu.
   UWAGA: BLI jest przydatny tylko do wykrywania interakcji białko-białko (tj. tworzenia kompleksów trójskładnikowych). Nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć interakcje między białkami a małymi cząsteczkami.
   1. Przygotowanie buforu: Przygotować 100 ml buforu zawierającego 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
   2. Optymalizacja dla etapu unieruchomienia: Załaduj czujnik testowy do 1-3 nm, zgodnie z zaleceniami producenta. Obciążenie ~1,0 nm jest używane do opisanych tutaj procedur. Aby to osiągnąć, zanurz czujnik w roztworze zawierającym VHL w stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.
   3. Przeprowadzić pomiary kinetyczne BLI, stosując siedem czujników SA w następującej kolejności:
      1. W pierwszej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.
      2. W fazie unieruchomienia zanurzyć w roztworze VHL o stężeniu 1,5 μg/ml na 80 s.
      3. W drugiej fazie podstawowej zanurz się w buforze na 60 sekund.
      4. W fazie asocjacji zanurzyć w roztworze o stałym stężeniu Brd4^BD2 przy 2 μM, stałym stężeniu DMSO przy 2% i zmiennych stężeniach MZ1 przy 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM i 0 nM (czujnik odniesienia) przez 300 s.
      5. W fazie dysocjacji zanurz się w buforze na 600 s.
   4. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta. k_on, k_off i K_D są raportowane dla dopasowania danych (Rysunek 3).

3. Metoda 3: SPR (powierzchniowy rezonans plazmonowy)

UWAGA: Wszystkie eksperymenty SPR są przeprowadzane przy użyciu chipów czujników pokrytych streptawidyną (SA) w RT. Chociaż chip NTA jest używany do wykrywania między białkiem a małymi cząsteczkami, należy go używać z ostrożnością w przypadku stosowania do kompleksu trójskładnikowego, ponieważ obserwuje się znacznie wyższe tło niż chip SA, prawdopodobnie ze względu na oddziaływania elektrostatyczne między naładowaną powierzchnią chipa a białkiem w analicie.

1. SPR do współpracy VHL-MZ1
   1. Przygotowanie buforu.
      1. Przygotuj 1 l bufor zawierający 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuść go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
      2. Usuń 20 ml buforu do wykorzystania w przyszłości (bufor wolny od DMSO) i napełnij ponownie 20 ml DMSO (2% DMSO w końcowym buforze działającym). Utrzymuj DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.1 i 3.2)
   2. Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~2000 RU (wstrzyknąć roztwór białka 5 μg/ml przy 5 μL/min).
   3. Przygotować MZ1 w 3-krotnym, 8-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 10 μM na 384-dołkowej, stożkowej dnie, półprzezroczystej, polipropylenowej płytce o maksymalnej objętości 130 μL. Przykryj płytkę samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego kompatybilnymi z mikropłytkami polipropylenowymi.
      1. Przygotuj górne stężenie z buforem wolnym od DMSO, aby zapewnić 2% DMSO w końcowym stężeniu. Do 147 μl buforu wolnego od DMSO dodaj 1,5 μl bulionu MZ1 w 1 mM i 1,5 μl 100% DMSO.
      2. Przygotować 3-krotne seryjne rozcieńczenie z uruchomionym buforem zawierającym 2% DMSO. Do 100 μl bieżącego buforu dodać 50 μl roztworu o najwyższym stężeniu przygotowanym w kroku 3.1.3.1 i dobrze wymieszać, aby przygotować 2. najwyższe stężenie.
      3. Następnie przenieść 50 μl roztworu przygotowanego w kroku 3.1.3.2 do następnych 100 μl działającego buforu, dobrze wymieszać, aby przygotować trzecie najwyższe stężenie i tak dalej.
   4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 120 s; czas dysocjacji: 300 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.
   5. Przeprowadzić analizę danych za pomocą oprogramowania ewaluacyjnego dostarczonego przez producenta urządzenia. Analiza w stanie ustalonym wykazała, że K_D = 26 (± 3) nM i Rmax ~91% (± 5%) osiągnięto wiązanie (Rysunek 4A)
2. SPR dla VHL: MZ1: kompleks trójskładnikowy Brd4^BD2
   1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.1.1.
   2. Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchomij VHL do ~100 RU. Wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml VHL przy natężeniu przepływu 5 μl/min i czasie kontaktu od 1 do 5 minut, aż do osiągnięcia gęstości powierzchni ~100 RU.
   3. Przygotować próbki do dwóch 5-krotnych, 5-punktowych jednocyklowych wstrzyknięć w 96-dołkową, przezroczystą, polistyrenową płytkę o okrągłym dnie o maksymalnej objętości 323 μl i przykryć ją samoprzylepnymi, przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego, które są kompatybilne z mikropłytkami polistyrenowymi, jak opisano w krokach 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Kontrola ujemna: analit zawiera tylko Brd4^BD2.
         1. Przygotować najwyższe stężenie przy 25 μM w bieżącym buforze o objętości 200 μL (#A5)
         2. Dodaj po 160 μl Brd4^BD2 w 2 μM w buforze bieżącym do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#A1-A4)
         3. Przenieś 40 μl A5 do A4. Dobrze wymieszaj.
         4. Przenieś 40 μl formatu A4 do formatu A3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do A1.
      2. Tworzenie kompleksu trójskładnikowego: analit zawiera MZ1 i Brd4^BD2.
         1. Przygotować najwyższe stężenie, dodając 4 μl MZ1 przy 20 μM w 100% roztworze DMSO do 196 μl zawierających 25,5 μM Brd4^BD2 w buforze wolnym od DMSO (#B5). Końcowe stężenia to 25 μM Brd4^BD2, 100 nM MZ1 i 2% DMSO.
         2. Dodaj po 160 μl Brd4^BD2 w 2 μM do bieżącego buforu do następnych 4 studzienek po lewej stronie (#B1-B4)
         3. Przenieść 40 μl witaminy B5 do witaminy B4. Dobrze wymieszaj.
         4. Przenieść 40 μl witaminy B4 do witaminy B3. Dobrze wymieszaj. Rób to aż do B1.
   4. Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Czas kontaktu: 100 s; czas dysocjacji: 720 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdą próbką, aby zapewnić stabilne tło.
   5. Analiza danych: Zastosuj trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, gdy MZ1 nie jest obecny, odpowiedź SPR między VHL a Brd4^BD2 jest znikoma. Gdy MZ1 jest obecny, dopasowanie kinetyczne wskazuje, że oddziaływanie między VHL i kompleksem MZ1-Brd4^BD2 ma k_włączone = 7,9 (± 1,5) *10⁷ / M / s, k_wyłączone = 0,014 ^s-1 i K_D = 1 nM. (Rysunek 4B)
3. SPR dla oddziaływań CRBN i małych cząsteczek
   1. Przygotowanie buforu.
      1. Przygotować 1 l bufor zawierający 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 i przepuścić go przez jednostkę filtrującą 0,2 μm.
      2. Usuń 20 ml buforu i uzupełnij 20 ml 100% DMSO (2% DMSO w końcowym buforze). Ważne jest, aby utrzymać DMSO na poziomie 2% we wszystkich próbkach opisanych poniżej (kroki 3.3, 3.4 i 3.5).
   2. Aktywuj układ SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchom, CRBN do ~800 RU.
   3. Przygotować związki w 3-krotnym, 6-punktowym seryjnym rozcieńczeniu na 384-dołkowej płytce o najwyższym stężeniu 30 μM, jak opisano w ppkt 3.1.3.
   4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność, czas kontaktu: 60 s, czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. W przypadku tego systemu wystarczą trzy wstrzyknięcia bufora, aby uzyskać stabilne tło. W przypadku innych systemów testowych może być konieczne wykonanie dodatkowych iniekcji buforowych.
   5. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta.
      UWAGA: Analiza w stanie ustalonym wskazuje, że K_D BRD-2512 i BRD-5110 wynoszą około 3 μM. Jednak wiązanie osiągnęło tylko ~ 70%_{R max} wiązania przy najwyższym stężeniu. Zarówno słabe powinowactwo, jak i kształt sensorgramu wskazują, że prawdopodobieństwo wystąpienia nierozpuszczalności związku w wysokich stężeniach. W związku z tym rzeczywisty K_D może być wyższy niż 3 μM. BRD-4761, który nie wiąże się z CRBN, został włączony jako kontrola ujemna.
4. SPR dla PPM1D i oddziaływań małocząsteczkowych
   1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1. Użyj chipa czujnika kwasu nitrylooctowego (NTA).
   2. Zastosuj pojedynczy cykl, ponieważ głowica bojowa PPM1D ma powolne k_włączania i _wyłączania. Zregeneruj chip NTA przy użyciu domyślnej konfiguracji producenta i unieruchamiaj PPM1D do ~ 1000 RU po każdym wstrzyknięciu związku (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 5 μg/ml przy 5 μl/min).
   3. Przygotować związki w 3-krotnym, 5-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 400 nM, jak opisano w ppkt 3.1.3.
   4. Uruchom SPR w konfiguracji jednocyklowej: Tryb: wysoka wydajność; czas kontaktu: 90 s; czas dysocjacji: 600 s; natężenie przepływu: 50 μL/min. Zastosuj trzy wstrzyknięcia buforu przed każdym związkiem, aby zapewnić stabilne tło.
   5. analiza danych. Zastosować trzecie wstrzyknięcie buforu jako tło do odejmowania. Jako kontrola ujemna, BRD-2512 nie wykazuje wiązania z PPM1D. W przypadku BRD-4761 i BRD-5110 dopasowanie kinetyczne wskazywało, że KD dla obu wynosi 1-2 nM.
5. SPR dla CRBN:PROTAC: Kompleks trójskładnikowy PPM1D
   1. Przygotuj bufor zgodnie z opisem w kroku 3.3.1.
   2. Aktywuj chip SA zgodnie z protokołem producenta i unieruchamij CRBN do ~35 RU (wstrzyknąć roztwór białka o stężeniu 0,5 μg/ml przy 5 μl/min).
   3. Przygotować trzy związki w 3-krotnym, 6-punktowym rozcieńczeniu seryjnym o najwyższym stężeniu 30 μM, utrzymując [PPM1D] na poziomie 1 μM we wszystkich próbkach, w tym w próbach ślepych, stosując metodę opisaną w kroku 3.2.3.
   4. Uruchom SPR w konfiguracji wielocyklowej: Tryb: Wysoka wydajność; czas kontaktu: 60 s; czas dysocjacji: 90 s; natężenie przepływu: 50 μL/min.
   5. Wykonaj analizę danych za pomocą oprogramowania producenta.
      UWAGA: Podczas gdy BRD-2512 i BRD-4761 wykazują brak/znikomą odpowiedź, BRD-5110 wyraźnie pokazuje "efekt haka" w stanie ustalonym z szybką kinetyką włączania/wyłączania (Rysunek 5A-C). Eksperymentalna odpowiedź wiązania z BRD-5110 (Rysunek 5C) znajduje się pomiędzy przewidywaną odpowiedzią z symulacji, gdy zakłada się, że K_D (CRBN, cpd) wynosi 3 lub 10 μM (Rysunek 5E), co sugeruje, że trójskładnikowe K_D i binarne K_D są bardzo podobne. Nie ma widocznej kooperatywności PPM1D: BRD-5110: tworzenia kompleksu CRBN.

Wyniki

Charakterystyka kompleksu binarnego VHL: MZ1 i VHL: MZ1: Trójskładnikowy kompleks^Bd2 Brd4 można znaleźć w Rysunek 2 (ITC), Rysunek 3 (BLI), oraz Rysunek 4 (SPR) przy użyciu bardzo podobnego bufora. K_D wyekstrahowany z testów ortogonalnych jest spójny. Kooperatywność można obliczyć za pomocą K_D (binarny) / K_D (trójskładnikowy), który jest wysoce dodatni (15 z ITC lub 26 z SPR).

Charakterystyka systemu CRBN:PROTAC: PPM1D została przeprowadzona przez SPR (Rysunek 5A-D). CRBN został unieruchomiony do ~35 RU, aby ułatwić obserwację powstawania kompleksów trójskładnikowych. Samo wiązanie PROTAC spowodowało powstanie sygnału o wartości <2 RU, który jest poniżej szumu. PPM1D w analicie daje wysoki sygnał tła na powierzchni chipa SA, a najwyższe stężenie, jakie można zastosować, wynosi około 1 μM. Wartość ta jest niższa niż K_D między CRBN a jego głowicą bojową ≥3 μM), dlatego spodziewany jest "efekt haka". SPR jest wystarczająco czuły, aby go wykryć, co dobrze zgadza się z symulacją (Rysunek 5E). Symulacja została przeprowadzona przy użyciu równowag niekooperatywnych w literaturze¹⁹ w połączeniu z klasycznym obliczeniem SPR [_{Response max} = (_{Response Ligand} ×_{Mass Immobilization})/_{Mass Ligand}]. Ponieważ_{K D} między CRBN a związkiem nie jest dokładnie określany ze względu na nierozpuszczalność związku przy wysokim stężeniu, symulację przeprowadzono przy użyciu czterech zakładanych KD: 1 μM, 3 μM, 10 μM lub 30 μM. Wyniki eksperymentalne mieściły się pomiędzy symulowanymi krzywymi 3 μM i 10 μM, co jest prawie identyczne z K_D w układzie binarnym, co sugeruje, że nie ma kooperatywności.

Rysunek 1: Ilustracja trzech wiążących scenariuszy i definicja różnych K_D. (A) Klasyczne systemy dwuskładnikowe. (B) System trójskładnikowy, w którym jeden koniec PROTAC może być nasycony, dzięki czemu może być oceniany jako system dwuskładnikowy. (C) Układ trójskładnikowy, w którym obserwuje się "efekt haka". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wyniki ITC. Miareczkowanie VHL do kompleksu MZ1 (po lewej) lub MZ1:Brd4^BD2 (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wyniki BLI. MZ1 pośredniczy w tworzeniu trójskładnikowego kompleksu VHL: MZ1: Brd4^BD2. (A) Dane surowe. (B) Odejmowanie sygnałów tła gdzie [MZ1] = 0. (C) Dopasowanie kinetyczne B w celu ekstrakcji k_on, k_off i K_D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyniki SPR. (A) MZ1 wiążący się z VHL. (B) Binarny kompleks MZ1:Brd4^BD2 wiążący się z VHL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyniki SPR pokazujące "efekt haka" reprezentatywnego PPM1D-PROTAC. CRBN został unieruchomiony na powierzchni chipa SA, podczas gdy [PPM1D] był utrzymywany na poziomie 1 μM w analicie dla wszystkich przypadków. (A) BRD-2512, związek, który wiąże się tylko z CRBN, nie daje prawie żadnej odpowiedzi. (B) BRD-4761, związek, który wiąże się tylko z PPM1D, również nie daje odpowiedzi. (C,D) BRD-5110, PROTAC z głowicą bojową CRBN w BRD-2512 i głowicą PPM1D w BRD-4761, indukował tworzenie się kompleksu trójskładnikowego. (E) Symulacja wyników SPR przy założeniu, że_{K D} między CRBN a związkiem wynosi 1 μM (), 3 μM (niebieski), 10 μM (czerwony) lub 30 μM (zielony). Krzywa BRD-2512 mieści się w przedziale od 3 μM do 10 μM, co jest bardzo zbliżone do zmierzonego układu binarnego K_D, co sugeruje brak kooperatywności (kooperatywność = 1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Biofizyczna charakterystyka binarnych i trójskładnikowych oddziaływań między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka może dostarczyć unikalnych i uzupełniających informacji w odniesieniu do powszechnie stosowanych systemów komórkowych. Zrozumienie powinowactwa między każdą głowicą bojową cząsteczki PROTAC a jej partnerami wiążącymi białka może pomóc w ukierunkowaniu wysiłków chemii medycznej w kierunku optymalizacji tych interakcji. Wcześniej opublikowane struktury krystaliczne trójskładnikowych kompleksów PROTAC ujawniły, że atomy w regionie łącznikowym mogą tworzyć interakcje z jednym lub oboma partnerami wiążącymi białka ^16,20. Eksperymentalne określenie kooperatywności tworzenia kompleksu trójskładnikowego może pomóc w optymalizacji łącznika.

W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie trzech różnych technik biofizycznych, które mogą dostarczyć informacji na temat powinowactwa wiązania między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka. Metoda 1 szczegółowo opisuje konfigurację eksperymentalną kalorymetrii miareczkowej izotermicznej (ITC) dla cząsteczki PROTAC, MZ1, kompleksu ligazy VHL E3 i bromodomeny Brd4^BD2 . Wyniki ITC wykazały K_D 59 nM dla interakcji binarnej między MZ1 i VHL oraz 4 nM dla interakcji trójskładnikowej między VHL a wstępnie zmieszanymi MZ1 i Brd4^BD2. Powinowactwa były zgodne z obserwowanymi w SPR (unieruchomione wiązanie VHL z MZ1_{K D} = 26 nM, unieruchomione wiązanie VHL z wstępnie zmieszanymi MZ1 i Brd4^BD2 _{K D} = 1 nM) i BLI (K_D = 2,8 nM). Podczas gdy wyniki ITC K_D dla wiązania VHL z MZ1 są zgodne z podanymi wartościami¹⁶, uzyskana stechiometria jest inna. Jednym z potencjalnych wyjaśnień tego wyniku jest słaba rozpuszczalność MZ1 w buforze opartym na HEPES zastosowanym w opisanym tutaj protokole, podczas gdy wyniki z literatury zostały wygenerowane przy użyciu buforu opartego na Bis-tris. Autorzy woleli używać tych samych komponentów bufora w SPR, ITC i BLI.

Metoda 2 opisuje układ doświadczalny do analizy BLI oddziaływania unieruchomionego VHL, stałego stężenia Brd4^BD2 i różnych stężeń MZ1. Ze względu na ograniczenia czułości techniki, można było wygenerować wartości K_{D, k on} i_{k off} dla tworzenia kompleksu trójskładnikowego, ale nie dla interakcji binarnej między MZ1 a białkami.

Metoda 3 opisuje wiele testów SPR. SPR jest bardziej czuły niż BLI i może być stosowany do obserwacji zarówno interakcji białko-mała cząsteczka (binarna), jak i białko-białko (trójskładnikowa). W tym drugim przypadku sygnały tła powinny być uważnie monitorowane, ponieważ białko w analicie może dawać wysokie i niestabilne sygnały. SPR jest bardzo wrażliwy na odczynniki o wysokim współczynniku załamania światła, w tym DMSO, glicerol i detergenty. Jeżeli białko jest przechowywane w buforze zawierającym glicerol lub detergent, bufor bieżący musi zawierać odpowiednie stężenia tych składników. Alternatywnie, zastosowanie chromatografii wykluczającej rozmiar całkowicie usuwa je przed jakimkolwiek eksperymentem SPR. Należy dołożyć starań, aby dokładnie dopasować stężenia DMSO między próbkami buforu i analitu. Korekty rozpuszczalnika DMSO są wykonywane zgodnie z instrukcjami producenta.

Metoda opisana w kroku 3.1 opisuje test SPR dla binarnej interakcji VHL-MZ1. Metoda 3.2 opisuje test SPR dla kompleksu trójskładnikowego VHL: MZ1: Brd4^BD2 , w którym VHL jest unieruchomiony, a analitem jest sam Brd4^BD2 lub kompleks MZ1: Brd4^BD2 . W tym systemie interakcja między Brd4^BD2 a VHL jest znikoma. Formacja kompleksu trójskładnikowego jest wysoce kooperatywna (ɑ = 26). Współczynnik odchylenia dla tworzenia kompleksu trójskładnikowego wynosi 0,014 ^s-1, co wymaga zastosowania kinetyki jednego cyklu. Wyniki ITC wskazują również na wysoce kooperatywną formację kompleksu trójskładnikowego (ɑ=15). Metody SPR w krokach 3.3, 3.4 i 3.5 opisują testy do oceny tworzenia kompleksu między CRBN i PPM1D indukowanego obecnością cząsteczki PROTAC, BRD-5110. Cząsteczka PROTAC ma słabe powinowactwo do CRBN (K_D ~ 3 μM) i silne powinowactwo do PPM1D (K_D = 1-2 nM). W rezultacie, słabe wiązanie z CRBN nie jest nasycone i powoduje obserwowany "efekt haczyka". Chociaż możliwe jest zwiększenie rozpuszczalności ligandów poprzez zwiększenie stężenia DMSO użytego w eksperymencie, ważne jest, aby w takich przypadkach dokładnie monitorować stabilność białka, na którą wysokie stężenia DMSO mogą mieć negatywny wpływ. Dodatkowo DMSO ma wysokie ciepło rozpuszczania, które może przesłaniać ciepło wiązania ligandów z białkiem. Należy dołożyć starań, aby dopasować stężenia DMSO roztworu w strzykawce i roztworu w kuwecie. Autorzy zalecają dializę obu roztworów z tym samym preparatem buforowym.

Ogólne zalecenia i wytyczne są oparte na przeprowadzonych i zgłoszonych eksperymentach tutaj. Gdy powinowactwo oddziaływań binarnych między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka jest silne (K_D <1 μM), SPR dostarcza wiarygodnych i powtarzalnych powinowactw wraz z cennymi informacjami na temat kooperatywności tworzenia kompleksów trójskładnikowych. W przypadku, gdy powinowactwo oddziaływania binarnego między jednym z partnerów wiążących białko a cząsteczką PROTAC jest słabe (_{K D} >1 μM), konieczne będzie zmodyfikowanie układu testowego. W takich przypadkach zastosowanie symulacji molekularnych, w których stałe wiązania są stałe, a stężenia liganda i analitu są zróżnicowane, może być cenne w kierowaniu projektowaniem testów i interpretacji wyników eksperymentalnych. Testy ITC dostarczają ważnych informacji na temat stechiometrii wiązania, ale wymagają znacznie więcej odczynników białkowych i złożonych w porównaniu z SPR i BLI. Ponadto rozpuszczalność cząsteczki PROTAC może być ograniczona w eksperymentach ITC. BLI ma wyższą przepustowość niż ITC i wymaga mniej odczynników białkowych i złożonych. Jednak ze względu na ograniczenia czułości, BLI może być stosowany tylko do oceny tworzenia kompleksu trójskładnikowego, a nie interakcji binarnych między cząsteczkami PROTAC a ich partnerami wiążącymi białka. Zaleca się, aby SPR był stosowany do rutynowych testów zarówno binarnych, jak i trójskładnikowych testów wiązania PROTAC oraz testów BLI i ITC stosowanych do ortogonalnej walidacji wyników z SPR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96-płytkowe	płytki Greiner	655076	płaskodenne, czarne płytki używane W eksperymentach BLI
Płytka 96-dołkowa	Nunc	73520-120	Płytka do przygotowania próbki ITC
Płytka 96-dołkowa	Greiner	650101	Płytka używana do przygotowania próbek do eksperymentów SPR
Automatyczny mikrokalorymetr iTC200	Malvern Panalytical		Przyrząd używany do przeprowadzania eksperymentów ITC. Produkt wycofany z rynku.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument używany do wykonywania eksperymentów SPR
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC wiążący się z VHL i chipem czujnika Brd4BD2
NTA	Cytiva	BR100532	chip SPR używany do wykonywania eksperymentów SPR z udziałem PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument używany do wykonywania eksperymentów BLI. Produkt wycofany z rynku.
Osłona płytki	Malvern	PQA0001	Osłona płytki Nunc 96-dołkowa (73520-120)
Osłona płytki	Cytiva	28975816	Osłona płytki do płytki Greiner (650101)
Układ czujnika serii S SA	Cytiva	BR100531	Chip SPR używany do przeprowadzania eksperymentów SPR z udziałem MZ1:VHL:BRD4
Streptawidyna (SA) Biosensory zanurzania i odczytu	Sartorius	18-509	Czujniki powlekane stosowane w BLI Eksperymenty