Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

W tym artykule

Podsumowanie

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) były intensywnie badane jako nowe podejście terapeutyczne, głównie w celu powstrzymania zaostrzonego stanu zapalnego ze względu na ich potencjał do modulowania odpowiedzi immunologicznej. MSCs są komórkami uprzywilejowanymi immunologicznie, zdolnymi do przetrwania u immunoniezgodnych biorców przeszczepów allogenicznych w oparciu o niską ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I oraz przy zastosowaniu terapii komórkowej do przeszczepu allogenicznego. Komórki te można wyizolować z kilku tkanek, z których najczęściej stosuje się szpik kostny i tkankę tłuszczową. Zapewniamy prosty protokół izolacji, hodowli i charakterystyki MSCs z tkanki tłuszczowej najądrza myszy. Tkanka tłuszczowa najądrza jest wycinana chirurgicznie, fizycznie rozdrobniona i trawiona 0,15% roztworem kolagenazy typu II. Następnie pierwotne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) są hodowane i namnażane in vitro, a charakterystyka fenotypowa jest przeprowadzana za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy również kroki różnicowania ADSC na komórki osteogenne, adipogenne i chondrogenne, a następnie funkcjonalną charakterystykę każdej linii komórkowej. Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do eksperymentów in vivo i ex vivo, a alternatywnie, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wykorzystane do wygenerowania unieśmiertelnionych komórek podobnych do MSCs.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to dorosłe komórki wielopotencjałowe różnicujące się w komórki takie jak osteoblast, chondroblast i adipocyte1,2. Komórki te znajdują się w kilku narządach i z tego powodu można je pobrać z dorosłych tkanek, takich jak szpik kostny, mięśnie, tłuszcz, mieszek włosowy, korzeń zęba, łożysko, skóra właściwa, okołochrzęstne, pępowina, płuca, wątroba i śledziona3,4.

Opisano wpływ MSCs na fizjologię i układ odpornościowy5,6. Komórki te są obiecujące w leczeniu wielu chorób, zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynaryjnej. MSCs mogą kontrolować stan zapalny i promować angiogenezę oraz homeostazę tkanek poprzez różne mechanizmy, takie jak kontakt komórka-komórka, czynniki rozpuszczalne i małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe7,8,9,10. Co więcej, MSCs są komórkami uprzywilejowanymi immunologicznie, zdolnymi do przetrwania u immunoniezgodnych biorców przeszczepów allogenicznych, ponieważ komórki te wykazują niską ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i są stosowane w terapii komórkowej do przeszczepu allogenicznego11,12. Niska immunogenność w połączeniu z potencjałem regeneracyjnym sprawia, że MSCs są idealnymi kandydatami do terapii komórkowej, takiej jak między innymi choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)13, toczeń rumieniowaty układowy (SLE)14 i stwardnienie rozsiane1516,17.

Pomimo faktu, że MSCs znajdują się w kilku dorosłych tkankach, tkanka tłuszczowa oferuje przewagę nad innymi źródłami, takimi jak dostępność do pobrania, przy minimalnej interwencji chirurgicznej; duża liczba dostępnych komórek o wysokim współczynniku ekspansji; i łatwa ekspansja in vitro przy użyciu łatwego do wykonania protokołu bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu i tanich materiałów18,19, 20. Po ekstrakcji, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) muszą być scharakteryzowane zgodnie z ustaleniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT)21. W związku z tym MSCs muszą wykazywać morfologię podobną do fibroblastów, przyleganie do hodowli plastycznej, ekspresję wysokiego procentu (≥95%) markerów mezenchymalnych, takich jak endoglin (CD105), ekto-5'-nukleotydaza (CD73) i Thy-1 (CD90) oraz niski odsetek (≤2%) markerów krwiotwórczych, takich jak wspólny antygen leukocytów (CD45), transbłonowa fosfoglikkoproteina (CD34), glikoproteina błonowa zakotwiczona w glikolipidach (CD14), integryna alfa M (CD11b), białko alfa związane z receptorem antygenu komórek B (CD79α) lub antygen powierzchniowy B-limfocytów B4 (CD19) i ludzki antygen leukocytarny klasy II (HLA-II). Ponadto wymagana jest charakterystyka funkcjonalna, a komórki powinny być w stanie różnicować się w komórki osteoblastów, chondroblastów lub adipoblastów21.

Tutaj pokazujemy, jak uzyskać MSCs z tkanki tłuszczowej najądrza za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego do badań in vitro i charakterystyki morfologicznej wstępnie skonfigurowanej przez ISCT.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były prowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etyki zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki i użytkowania zwierząt State University of Santa Cruz pod numerem protokołu 021/22. Samce myszy szwajcarskich (6-8 tygodni) pozyskano z Laboratorium Hodowli, Utrzymania i Eksperymentowania nad Zwierzętami - State University of Santa Cruz (LaBIO-UESC) w placówce badawczej nad zwierzętami; zwierzęta utrzymywano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, z nielimitowanym dostępem do wody i pożywienia, w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.

UWAGA: Można zastosować inne linie myszy; zalecamy użycie myszy dorosłych (6-8 tygodni), ponieważ posiadają one bardziej rozwiniętą tkankę tłuszczową oraz komórki o wysokiej aktywności proliferacyjnej.

1. Przygotowanie

UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy należy przygotować następujące odczynniki opisane poniżej. Patrz na Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o dostawcach odczynników i materiałów. Podczas wszystkich procedur praktycznych należy stosować środki ochrony osobistej, takie jak maseczki, czepki, fartuchy laboratoryjne i rękawiczki.

  1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej najądrza
    1. Przygotuj materiały chirurgiczne: trzy zestawy sterylnych pęset i nożyczek, pięć igieł oraz zlewkę zawierającą 200 mL 70% etanolu.
    2. Przygotuj środek do anestezji terminalnej, mieszając ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg).
  2. Kultura ADSCs
    1. Pożywka podstawowa: Przygotuj pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 µg/mL gentamycyny, 0,25 µg/mL amfoterycyny B, 100 U/mL penicyliny oraz 100 mg/mL streptomycyny.
    2. Roztwór do trawienia: Przygotuj 0,15% kolagenazy typu II w PBS, wysterylizowany za pomocą filtra 0,25 µm.
      UWAGA: Stosowanie czterech antybiotyków opisanych w pożywce podstawowej nie jest konieczne. Zależy to od warunków hodowli komórkowej w laboratorium, w którym przeprowadzana jest procedura.
  3. Charakterystyka fenotypowa ADSCs
    1. Przygotuj 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    2. Rozcieńcz przeciwciała anty-mysie zgodnie z treścią Tabeli 1.
    3. Przygotuj 2% formaldehydu w PBS.
  4. Osteogenna różnicowanie ADSCs
    1. Pożywka do różnicowania osteogennego: Przygotuj DMEM uzupełniony o 5,67 M kwasu askorbinowego, 10 nM deksametazonu, 0,02 M β-glicerolofosforanu, 10% FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
    2. Do barwienia metodą Von Kossa przygotuj następujące roztwory: 70% etanol w wodzie, 5% azotanu srebra w wodzie, wodę destylowaną, 5% ti {iosiarczanu sodu w wodzie oraz 1% eozyny B w wodzie.
  5. Różnicowanie adipogenne:
    1. Pożywka do różnicowania adipogennego: Przygotuj DMEM uzupełniony o 0,5 mM 3-izobutyl-1-metylksantynę, 200 µM indometacynę, 1 µM deksametazonu, 10 µM insuliny, 10% FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
    2. Do barwienia Oil-Red przygotuj następujące roztwory: 10% formalinę w wodzie dejonizowanej, 60% izopropanol w wodzie dejonizowanej, barwnik lizochromowy (barwnik rozpuszczalny w tłuszczach) – barwnik diazo (roztwór Oil-Red O) w 60% izopropanolu oraz 1% hematoksyliny w wodzie dejonizowanej.
  6. Różnicowanie chondrogenne:
    1. Pożywka do różnicowania chondrogennego: Przygotuj pożywkę chondrogenną uzupełnioną o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
    2. Przygotuj 10% formaldehydu w PBS.
    3. Do barwienia proteoglikanów i glikozaminoglikanów przygotuj następujące roztwory: barwnik do heteroglikanów (Alcian Blue 1%) w kwasie octowym, pH 2,5, parafinę, hematoksylinę oraz serię rozcieńczeń etanolu w wodzie (100%, 96%, 80% i 70%).

Przeciwciało/FluoroforRozcieńczanieKlonowanieStężenie końcowe (µg/mL)Funkcja i komórka, w której jest ekspresyjna
CD34- PE1:100RAM342Czynnik adhezyjny komórek. Hematopoetyczne komórki macierzyste.
CD45- APC1:10030-F112Wspomaganie aktywacji leukocytów. Ekspresja w leukocytach.
CD71-FITC1:100C25Kontroluje pobieranie żelaza podczas proliferacji komórek. Komórki proliferujące, retikulocyty i komórki prekursorowe.
CD29-FITC1:100Ha2/55Adhezja i aktywacja, embriogeneza, leukocyty, komórki dendrytyczne, płytki krwi, komórki tuczne, fibroblasty i komórki śródbłonka.
CD90- PerCP1:100OX-72Sygnalizacja, adhezja. Limfocyt T, komórka NK, monocyt, hematopoetyczne komórki macierzyste, neuron i fibroblast.

Tabela 1: Przeciwciała użyte do charakterystyki fenotypowej ADSC za pomocą cytometrii przepływowej. Lista przeciwciał wraz z odpowiadającymi im fluorochromami, rozcieńczeniami, klonami i stężeniami końcowymi, a także ich funkcją w ekspresywnym białku komórkowym.

2. Metody

UWAGA: Tkanka tłuszczowa jest rozmieszczona w całym organizmie w lokalizacjach podskórnych lub wewnątrzbrzusznych. U myszy do eksperymentów najczęściej wykorzystuje się tkankę tłuszczową podskórną, nadjądrzową, krezkową i zaotrzewnową22. Poniżej przedstawiono etapy pozyskiwania tkanki tłuszczowej nadjądrzowej (Rysunek 1).

Proces ekstrakcji tkanki tłuszczowej i izolacji komórek macierzystych; zdjęcia laboratoryjne, mikroskop, badanie biologiczne.
Rysunek 1: Schemat doświadczalny pozyskiwania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy szwajcarskich. (A) Za pomocą igieł unieruchom zwierzę na korkowej lub styropianowej podkładce; (B) unieś skórę pęsetą, wykonaj nacięcie w centrum obszaru brzusznego i oddziel skórę od otrzewnej; (C) zidentyfikuj białą tkankę tłuszczową nad najwidką; (D) przenieś tkankę do pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% antybiotyków, dokładnie wypłucz tkankę tłuszczową najwidka w PBS, a następnie przenieś tkankę do roztworu trawiącego; (E) rozdrobnij tkankę i (F) inkubuj w 37 °C przez 1 h, energicznie wstrząsając co 10 min; (G) po policzeniu komórek wysiej je na płytki 6-dołkowe i zaobserwuj morfologię komórek pod mikroskopem odwróconym. (F) Morfologia komórek zmieni się z okrągłej na fibroblastopodobną. Pasek skali = 22.22 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej nadjądrzowej
    UWAGA: Należy pamiętać, że wszystkie procedury muszą być przeprowadzane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić czystą i wolną od zanieczyszczeń hodowlę komórkową.
    1. Eutanazję zwierząt należy przeprowadzić za pomocą roztworu ketaminy i ksylazyny (100 i 10 mg/kg, zgodnie z opisem w kroku 1.1.2) drogą dosytnieniową.
      UWAGA: Można zastosować inne metody eutanazji23. Śmierć zwierzęcia należy potwierdzić, stwierdzając brak bicia serca.
    2. Zwierzę należy umieścić stroną brzuszną do góry na podkładce korkowej lub styropianowej pokrytej folią aluminiową i unieruchomić za pomocą sterylnych igieł (Rycina 1A).
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń, należy spryskać region brzuszny 70% alkoholem. Alternatywnie można zgolić sierść za pomocą skalpela.
    3. Za pomocą pęsety należy unieść skórę w centralnej części regionu brzusznego i wykonać nacięcie sterylnymi nożyczkami.
      UWAGA: Konieczne jest użycie dwóch zestawów sterylnych pęset i nożyczek, aby uniknąć zanieczyszczeń. Pierwszy zestaw służy do otwarcia zwierzęcia poprzez przecięcie skóry i warstwy otrzewnej; drugi służy do pobrania tkanki tłuszczowej nadjądrzowej. Należy również przygotować 150 mL 70% alkoholu w zlewce do czyszczenia nożyczek i pęset między etapami.
    4. Nożyczki należy wprowadzić pod skórę zwierzęcia i rozsunąć ją, aby oddzielić od otrzewnej (Rycina 1B). Należy unieść warstwę otrzewnej pęsetą i przeciąć sterylnymi nożyczkami.
    5. Używając drugiego zestawu sterylnych pęset i nożyczek, należy zidentyfikować najdokrewek nad jądrami oraz białą tkankę tłuszczową nad najdokrewek. Całą tkankę tłuszczową nadjądrzową o wielkości około 2 cm należy wyciągnąć sterylną pęsetą i odciąć bardzo blisko najdokrewek (Rycina 1C).
    6. Tłuszcz należy umieścić w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 mL zawierającej medium podstawowe i pozostawić w lodzie (Rycina 1D). W komorze laminarnej należy przejść do kolejnych kroków opisanych poniżej.
  2. Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs)
    UWAGA: Próbki należy przetwarzać w biologicznej komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II; personel powinien nosić fartuch laboratoryjny, rękawiczki i maskę chirurgiczną.
    1. Tkankę tłuszczową nadjądrzową należy dokładnie przemyć PBS.
      UWAGA: Krok ten jest niezbędny do usunięcia krwi i innych cząsteczek z próbki. Krew może hamować działanie kolagenazy typu II i negatywnie wpłynąć na eksperyment.
    2. Za pomocą sterylnej pęsety należy przenieść tkankę tłuszczową nadjądrzową do probówki 50 mL zawierającej 15-20 mL roztworu trawiennego, przygotowanego zgodnie z krokiem 1.2.2. Tkankę należy rozdrobić sterylnymi nożyczkami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h (Rycina 1E, F).
      UWAGA: W tym kroku można zastosować kąpiel wodną lub inkubator w temperaturze 37 °C. Co 10 min zawiesinę należy energicznie wstrząsać, aby ułatwić trawienie. Nie należy przekraczać czasu inkubacji wynoszącego 1 h.
    3. Kolagenazę należy dezaktywować poprzez rozcieńczenie próbki 1:1 w medium podstawowym, a następnie odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać frakcję naczyniową zrostu. Należy odlać nadsącz i resuspendować osad w 1 mL medium podstawowego.
    4. Żywotność i liczbę komórek należy ocenić metodą wykluczania barwnika trypan blue w komorze Neubauera, stosując rozcieńczenie 1:10 lub 1:100.
      UWAGA: Przewidywana wydajność wynosi około 0,5-1 miliona komórek/g przetworzonej tkanki tłuszczowej, a żywotność 80%.
    5. Wyizolowane komórki (0,3-0,5 miliona) należy wysiać w 3 mL medium podstawowego w jednym dołku płytki 6-dołkowej. Komórki należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5 % CO2.
    6. Następnego dnia: Należy usunąć medium z dołka i przemyć komórki PBS. Następnie należy dodać 3 mL medium podstawowego. Proces ten należy powtarzać co 2 dni, aż komórki osiągną 90% konfluencji.
      UWAGA: Należy stale obserwować morfologię komórek pod mikroskopem odwróconym; powinna ona zmieniać się z okrągłej na fibroblastopodobną (Rycina 1H).
  3. Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs)
    UWAGA: Po osiągnięciu przez komórki konfluencji ok. 90%, należy przystąpić do subkultury zgodnie z poniższym opisem.
    1. Należy usunąć medium z dołka i przemyć komórki PBS. Do każdego dołka należy dodać 0,5 mL trypsyny/EDTA (0,05 % trypsyny; 200 mg/L EDTA) i inkubować płytkę przez 3-5 min w temperaturze 37 °C w celu odklejenia komórek.
      UWAGA: Czas inkubacji w trypsynie/EDTA nie może przekroczyć 5 min. Całkowite odklejenie komórek należy zweryfikować pod mikroskopem odwróconym. Proces ten można przyspieszyć, delikatnie pipetując zawiesinę w górę i w dół lub opukując bok płytki.
    2. Enzym należy dezaktywować poprzez rozcieńczenie próbki 1:1 w DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyków.
    3. Zawiesinę komórkową należy rozdzielić do 2 dołków i dodać 3 mL medium podstawowego (DMEM uzupełniony o 10 % FBS i 1 % antybiotyków). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
    4. Następnego dnia należy wymienić medium, a następnie powtarzać tę czynność co 2 dni aż do osiągnięcia 90% konfluencji.
    5. Proces należy powtarzać do trzeciego pasażu, a następnie przystąpić do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej.
      UWAGA: Należy stale obserwować morfologię komórek pod mikroskopem odwróconym; powinna ona zmieniać się z okrągłej na fibroblastopodobną.
  4. Charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs)
    1. Charakterystyka fenotypowa metodą cytometrii przepływowej
      1. Komórki należy odkleić za pomocą trypsyny/EDTA, zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2.
      2. Komórki należy zebrać do probówki stożkowej (50 mL) i odwirować przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Należy odlać nadsącz i resuspendować osad w 1 mL PBS.
      3. Liczbę komórek należy policzyć zgodnie z opisem w kroku 2.2.4 i wysiać 0,5-1 x 106 komórek w 100 µL PBS do płytki 96-dołkowej.
        UWAGA: Liczba dołków będzie zależeć od koloru koniugatu fluorochromu oraz filtrów/laserów cytometru.
      4. Należy dodać przeciwciała (Tabela 1) rozcieńczone w 1% BSA w PBS.
        UWAGA: Nie jest konieczne stosowanie blokady Fc w celu uniknięcia niespecyficznego wiązania, ponieważ do rozcieńczania przeciwciał używamy BSA. Należy zachować próbkę komórek bez przeciwciał, która posłuży jako kontrola barwienia. Przeciwciała można łączyć w jednym dołku w zależności od dostępnych fluorochromów i cytometru w laboratorium. Wszystkie przeciwciała opisane w Tabela 1 można dodać do jednego dołka, z wyjątkiem CD71 FITC i CD29 FITC, które muszą znajdować się w osobnych dołkach ze względu na ten sam fluorochrom.
      5. Płytkę należy inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
      6. Po przemyciu komórek należy uzupełnić objętość do 200 µL za pomocą PBS, odwirować płytkę przy 252 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C i odlać nadsącz. Krok ten należy powtórzyć raz jeszcze.
      7. Komórki należy utrwalić, dodając 200 µL na dołek 2% formaldehydu w PBS. Komórki należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy w cytometrze przepływowym.
        UWAGA: Dla uzyskania najlepszych wyników należy przeprowadzić analizę w cytometrze przepływowym jak najszybciej. Intensywność fluorescencji markerów dla większości fluorochromów znacząco spada po 48 h. Dlatego odczyt płytki nie powinien przekroczyć 48 h. Zaleca się akwizycję 30 000 zdarzeń.
      8. Do wyboru populacji ASC należy zastosować strategię bramkowania przedstawioną na Rycina 2B.
    2. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie osteogeniczne
      1. Komórki należy odkleić za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2), a następnie policzyć (zgodnie z opisem w kroku 2.2.4).
      2. W trzech powtórzeniach należy wysiać 2 x 105 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych w medium podstawowym (DMEM uzupełniony o 10 % FBS i 1 % antybiotyków); inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
        UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, jedna dla każdego czasu różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia należy wymienić medium na medium osteogeniczne (krok 1.4.1).
        UWAGA: Należy zachować 3 dołki hodowane tylko w medium podstawowym, które będą służyć jako kontrola różnicowania.
      4. Komórki w medium osteogenicznym oraz komórki kontrolne należy hodować przez 14 i 21 dni, wymieniając medium co 3 dni. Na koniec każdego okresu hodowli należy przeprowadzić barwienie metodą Von Kossa (krok 1.4.2) w celu oceny obecności zmineralizowanych guzków.
      5. Należy odessać medium z każdego dołka i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Komórki należy utrwalić w 2 mL 70% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Następnie komórki należy ostrożnie przemyć pod bieżącą wodą.
      6. Należy dodać 2 mL 5% roztworu azotanu srebra i inkubować płytkę w świetle ultrafioletowym przez 1 h. Komórki należy przemyć wodą destylowaną. Następnie należy dodać 2 mL 5% tiączanu sodu i inkubować przez 5 min. Przemyć wodą destylowaną.
      7. Należy przeprowadzić przeciwbarwienie za pomocą 2 mL eozyny przez 40 s. Przemyć wodą destylowaną aż do usunięcia roztworu barwiącego, a następnie ocenić barwienie pod mikroskopem optycznym.
    3. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie adipogeniczne
      1. Komórki należy odkleić za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2), a następnie policzyć (zgodnie z opisem w kroku 2.2.4).
      2. Należy wysiać 2 x 105 komórek na dołek w płytkach 6-dołkowych w medium podstawowym (DMEM uzupełniony o 10 % FBS i 1 % antybiotyków); inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.
        UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, jedna dla każdego czasu różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia należy wymienić medium na medium adipogeniczne (krok 2.5.1).
        UWAGA: Należy zachować 3 dołki hodowane tylko w medium podstawowym jako kontrolę.
      4. Komórki należy hodować przez 14 i 21 dni w medium adipogenicznym, wymieniając medium co 3 dni. Na koniec każdego okresu hodowli należy przeprowadzić barwienie Oil-Red O (kroki 2.4.3.5-2.4.3.7), będące wskaźnikiem wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów.
      5. Należy odessać medium z każdego dołka. Komórki należy dwukrotnie przemyć PBS. Komórki należy utrwalić w 2 mL 10% formaliny przez 1 h. Przemyć raz PBS, a następnie raz wodą.
      6. Należy barwić za pomocą 2 mL roztworu Oil-Red O w 60% izopropanolu przez 5 min. Przemyć raz wodą destylowaną.
      7. Należy przeprowadzić przeciwbarwienie za pomocą 2 mL 1% hematoksyliny rozcieńczonej 1:2 w wodzie destylowanej przez 1 min. Przemyć wodą destylowaną aż do usunięcia roztworu barwiącego, a następnie ocenić zabarwione próbki pod mikroskopem optycznym.
    4. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie chondrogeniczne
      1. Komórki należy odkleić za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2), a następnie policzyć (zgodnie z opisem w kroku 2.2.4).
      2. Należy umieścić 5 x 105 komórek ADSCs w czterech polipropylenowych probówkach stożkowych i odwirować przy 450 x g przez 5 min w celu utworzenia osadu (pelletu). Należy odlać nadsącz.
      3. Osady należy hodować w probówkach stożkowych w medium chondrogenicznym (krok 1.6.1) lub tylko w medium podstawowym (kontrola różnicowania) przez 14 i 21 dni w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Medium należy wymieniać co 3 dni, unikając usuwania osadów.
        UWAGA: Każdy osad komórkowy odnosi się do każdego czasu hodowli, a także do ich odpowiednich kontrol hodowanych tylko w medium podstawowym.
      4. Na koniec każdego punktu czasowego hodowli należy zebrać osady za pomocą pęsety z cienkim końcem i umieścić je w płytce 24-dołkowej. Następnie należy przejść do wykonania przekrojów histologicznych i barwienia proteoglikanów oraz glikozaminoglikanów (kroki 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        UWAGA: Każdy osad jest przetwarzany w osobnym dołku.
      5. Osady należy utrwalić w 2 mL 10% buforowanego formaldehydu przez 30 min. Należy usunąć roztwór formaldehydu i dodać 2 mL 70% etanolu. Osad należy wyjąć z probówki stożkowej za pomocą końcówki i zalać go parafiną.
      6. Za pomocą obrotowego mikrotomu do parafiny należy wykonać przekroje histologiczne o grubości 5 µm. Przekroje należy inkubować przez 15 min w temperaturze 60 °C, a następnie dwukrotnie zanurzyć w ksylenie (na 5 i 15 min).
      7. Próbki należy rehydratować, zanurzając przekroje histologiczne w kąpielach alkoholowych o malejących stężeniach (100%, 96%, 80% i 70%) po 2 min każda, a następnie płukać wodą dejonizowaną przez 5 min.
      8. Następnie należy zabarwić próbki 1% błękitem Alciana w kwasie octowym o pH 2,5 przez 30 min.
      9. Należy przeprowadzić przeciwbarwienie hematoksyliną przez 1 min i przemyć wodą destylowaną. Próbki należy zamontować w DPX (medium montażowe do histologii) lub innym medium montażowym i ocenić pod mikroskopem optycznym.

Wyniki

Komórki wyizolowane z tkanki tłuszczowej zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem wykazywały morfologię zgodną z minimalnymi kryteriami dla MSC zaproponowanymi przez ISCT. Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Pod względem fenotypowym ADSCs wykazywały przyleganie do tworzywa sztucznego oraz morfologię fibroblastopodobną w pierwszych dniach hodowli komórkowej (Rysunek 2A). Ponadto rosły one homogenicznie i tworzyły kolonie. Co więcej, ADSCs wykazywały niską ekspresję markerów krwiotwórczych CD34 (2,12%) i CD45 (1,81%) oraz wysoką ekspresję markerów komórek mezenchymalnych CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) i CD90 (55,1%) (Rysunek 2B).

Wzrost komórek w dniach 2, 4, 10; histogramy cytometrii przepłyewej wykazujące markery różnicowania (CD34, CD45).
Rycina 2: Charakterystyka fenotypowa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. (A) Zmiana morfologii ADSC z okrągłej na fibroblastopodobną w dniach 2, 4 i 8 hodowli; pasek skali = 22.22 µm. (B) Histogramy dla markerów ekspresjonowanych (CD71, CD29 i CD90) lub nieekspresjonowanych (CD34 i CD45) przez ASC. Rycina ta została powielona za zgodą Mirandy i wsp.24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pod względem funkcjonalnym ADSCs wykazały wielopotencjalność do różnicowania się w osteoblasty, adipoblasty i chondroblasty podczas hodowli w mediach warunkujących dla każdej linii komórkowej przez 14 lub 21 dni (Rysunek 3). Barwienie metodą Von Kossa ujawniło zmineralizowane guzki w macierzy zewnątrzkomórkowej, co jest charakterystyczne dla procesu osteogenezy (Rysunek 3). Barwienie Oil-red O wykazało obecność wakuol lipidowych w cytoplazmie ADSCs, a barwienie błękitem alkianowym (Alcian Blue) potwierdziło obecność glikozaminoglikanów w macierzy zewnątrzkomórkowej (Rysunek 3). Wspólnie cechy fenotypowe i funkcjonalne potwierdziły, że populacja komórek wyizolowanych z tkanki tłuszczowej najwidnieszka to MSCs.

Etapy różnicowania komórek macierzystych; szlaki osteogeniczne, adipogeniczne i chondrogeniczne; obrazy mikroskopowe.
Rysunek 3: Charakterystyka funkcjonalna komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. Potencjał wieloliniowy osteogeniczny, adipogeniczny i chondrogeniczny ADSC po 14 i 21 dniach hodowli. Pasek skali = 50 µm (panel górny), 100 µm (panele środkowy i dolny). Rysunek powtórzono za zgodą Mirandy i wsp.24. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

MSCs mogą być ekstrahowane z różnych tkanek. Pomimo tego, że szpik kostny stanowi powszechne źródło MSCs zarówno u myszy, jak i u ludzi25,26, zdecydowaliśmy się pracować z tkanką tłuszczową w tym badaniu ze względu na jej bogactwo MSC, dystrybucję w organizmie i łatwość dostępu do niej. Alternatywnie, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wykorzystane do wytworzenia unieśmiertelnionych komórek podobnych do MSCs27.

Niektóre punkty ekstrakcji zasługują na szczególną uwagę ze względu na powodzenie udostępnionych tutaj protokołów. Po pierwsze, zwracamy uwagę na staranność przy pobieraniu tkanki, która musi być wykonywana w warunkach aseptycznych. Dlatego przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że myszy są odpowiednio zdezynfekowane 70% alkoholem. Kolejną ważną kwestią jest to, aby nie używać tego samego zestawu pęset i nożyczek do zbierania tkanki tłuszczowej najądrza, unikając w ten sposób jakiegokolwiek źródła zanieczyszczenia.

Drugim problemem jest przetwarzanie tkanek. Fragmenty w stożkowej probówce muszą być właściwie i energicznie wstrząśnięte podczas 10 minut inkubacji w temperaturze 37 °C. Bardzo ważna jest zmiana podłoża następnego dnia, a następnie co 2-3 dni. Zaleca się codzienną obserwację kultury, sprawdzanie koloru podłoża, kształtu komórek i wszelkich ingerencji w środowisko kultury.

Trzecia obawa dotyczy najlepszego czasu/przejścia dla charakterystyki MSC. Tutaj zalecamy zrobienie tego przy trzecim przejściu komórek, ale nie jest to obowiązkowe. To zależy od celu badania. W trzecim fragmencie mamy około 80% komórek scharakteryzowanych jako MSCs, co wystarcza na przykład do osiągnięcia celów tego badania. Charakterystykę fenotypową przeprowadza się poprzez analizę ekspresji markerów krwiotwórczych (na przykład CD34 i CD45) i markerów mezenchymalnych (na przykład CD29, CD73, CD90 i CD105). Co więcej, Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT)21 podkreśla, że ADSC powinny mieć morfologię podobną do fibroblastów i przylegać do plastiku platformy hodowlanej. Morfologię można obserwować pod mikroskopem podczas uprawy kultury. Charakterystykę funkcjonalną przeprowadza się poprzez analizę potencjału ADSC do różnicowania się w komórki osteoblastów, adipoblastów i chondroblastów. W charakterystyce fenotypowej procent markerów mezenchymalnych i krwiotwórczych może się różnić w zależności od gatunku zwierzęcia i źródła komórek, nie w pełni spełniając liczby zalecane przez ISCT. Na przykład ISCT zaleca dla ludzkich MSCs ≥95% CD105, CD73, CD90 i ≤2% CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79a lub CD19, ludzki antygen leukocytarny - izotyp DR (HLA-DR)21. Ponadto ważne jest, aby przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną i potwierdzić wielomoc komórek różnicujących się w osteoblasty, chondrocyty i linie adipocytów. Co najmniej dwie z tych linii są zalecane do udowodnienia multipotencji.

Oprócz tych podkreślonych punktów, niektóre sugerowane tutaj testy można zastąpić, na przykład czerwień alizarynową S zamiast barwienia Von Kossa, Shiff kwasu okresowego zamiast błękitu alcian i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) zamiast cytometrii przepływowej.

Spośród trzech typów tkanki tłuszczowej opisanych u ludzi (biała, brązowa i beżowa), biała tkanka tłuszczowa ma największe źródło MSCs28. Tkankę tę można uzyskać z obszarów podskórnych, brzusznych i pachwinowych, takich jak tłuszcz nad najądrzem, o którym mowa tutaj. Fizyczna fragmentacja i trawienie enzymatyczne przez kolagenazę zastosowane w udostępnionym tutaj protokole wyprowadzają frakcję naczyniową zrębu (SVF) złożoną z wielu typów komórek, z wyjątkiem adipocytów, które są wyczerpywane podczas przetwarzania.

Podsumowując, do głównych zalet stosowania tkanki tłuszczowej jako źródła MSCs należy zaliczyć ich obfitość i łatwość metod izolacji komórek, związane z potencjałem terapeutycznym MSCs jako właściwości przeciwzapalnych i regeneracyjnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania wspierane przez grant z Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) i Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG i URS dzięki stypendium przyznanemu odpowiednio przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
140 stopni Celsjusza; C Sterylizacja wysokotemperaturowa Inkubator CO2RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinyC180
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Kwas octowy lodowcowySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, StanyZjednoczone PHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneA9186BioReagent, odpowiedni do wykrywania glikoprotein. 1% w kwasie octowym, pH 2,5
Alkohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% w wodzie
Amfoterycyna BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Przeciwciała anty-mysie anty-CD29 FITC (Klon Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Funkcje w komórce: Adhezja i aktywacja, embriogeneza, leukocyty, DC, płytki krwi, komórki tuczne, fibroblasty i komórki śródbłonka
Przeciwciała anty-mysie anty-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Funkcje w komórce: Czynnik adhezji komórek. Hematopoetyczne komórki macierzyste
Przeciwciała anty-mysie anty-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Funkcje w komórce: Pomaga w aktywacji leukocytów Przeciwciała
anty-mysie anty-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Funkcje w komórce: Kontroluje wychwyt żelaza podczas proliferacji komórek. Komórki proliferacyjne, retikulocyty i prekursory Przeciwciała
anty-mysie anty-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Funkcje w komórce: sygnalizacja, adhezja. Limfocyt T, NK, monocyt, HSC, neuron, fibroblasty
Kwas askorbinowySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczonePHR1008
Pipety automatyczneThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone4700850NFinnpipette F1 Zestawy do pipetowania laboratoryjnego (GLP)
ZlewkaNie dotyczy1 jednostka
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Płytki do hodowli komórkowych (6-dołkowe)Merck, Darmstadt, NiemcyZ70775907 jednostek sterylnych. Płytki do hodowli tkankowych TPP
Płytki do hodowli komórkowych (96-dołkowe. Okrągłe lub V na dole)Merck, Darmstadt, NiemcyCLS35307701 jednostka sterylna. Studnie, 96, powierzchnia poddana kulturze tkankowej (TC), przezroczyste studzienki z okrągłym dnem, sterylne
podłoże chondrogenneŁodyga Pro Różnicowanie chondrogenezy– Technologie ŻyciaA1007101TGF-β 2, TGF-β 3, deksametazon, insulina, transferyna, ITS, sód-l - askorbinian, pirogronian sodu, 2-fosforan askorbinianu
Kolagenaza typu IILife Technologies, Kalifornia, USA17101015
płyta korkowa lub styropianowa pokryta aluminiumNie dotyczy1 sztuka
bawełnyNie dotyczy50 g
deksametazonuSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneD4902
Nożyczki preparacyjneNie dotyczy03 sztuki sterylny
DPX Uchwyt do histologiiSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523Z 1000 mg/L glukozy i L-glutaminy, bez wodorowęglanu sodu, proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneF4135
FormaldehydSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany Zjednoczone47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneHT501128
GentamycynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Igła podskórna (0,3 mm x 13 mm)Nie dotyczy5 sztuk
IndometacynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneI0200000
InsulinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% w H2O
Roztwór chlorowodorku ketaminy-D4Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061,0 mg/ml w metanolu (jako wolna zasada), certyfikowany materiał odniesienia, Cerilliant®
Komora NeubaueraSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620Komora licząca MARKA BLAUBRAND Neubauer wzór. Z klipsami,
końcówkami do pipet Nichiryo z podwójną linijką (0,1– 10 μ L)Merck, Darmstadt, NiemcyZ645540Zakres głośności 0,1– 10 μ L, wydłużone, opakowanie zbiorcze. Sterylne
końcówki do pipet Nichiryo (1– 10 mL)Merck, Darmstadt, NiemcyZ717401Zakres głośności 1– 10 mL, uniwersalny, opakowanie zbiorcze. Sterylne
końcówki do pipet Nichiryo (200 μ L)Merck, Darmstadt, NiemcyZ645516Maksymalna objętość 200 μ L, z podziałką, ministack. Sterylny
roztwór oleju i czerwieni OSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910,5% w parafinie izopropanolu
Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146– 48, w postaci bloku
Penicylina/StreptomycynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Roztwór stabilizowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny / ml, 0,1 μ m przefiltrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Proszek, pH 7,4, do przygotowania 1 L roztworów. Zrównoważone i sterylne
probówki stożkowe z polipropylenu (15 ml)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterylne
probówki stożkowe z polipropylenu (50 ml)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 sztuki sterylnego
skalpela (opcjonalnie)Nie dotyczy1 szt
Azotan srebraSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Tiosiarczan soduSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Pęseta chirurgiczna (15 cm)Nie dotyczy3 sztuki sterylnych
szwajcarskich samców myszy (6– 8 tygodni)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
strzykawka (1 ml)Nie dotyczy1 jednostka
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540,4%, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
Trypsyna/EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glicerofosforan sól disodowa hydratSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, odpowiedni do hodowli komórkowych, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99% (miareczkowanie)
.

Bibliografia

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja komórek macierzystychcytometria przepływowaróżnicowanie osteogenneróżnicowanie adipogenneróżnicowanie chondrogennetrawienie kolagenazątkanka nadjądrza myszy
Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.