Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to dorosłe komórki wielopotencjałowe różnicujące się w komórki takie jak osteoblast, chondroblast i adipocyte^1,2. Komórki te znajdują się w kilku narządach i z tego powodu można je pobrać z dorosłych tkanek, takich jak szpik kostny, mięśnie, tłuszcz, mieszek włosowy, korzeń zęba, łożysko, skóra właściwa, okołochrzęstne, pępowina, płuca, wątroba i śledziona^3,4.

Opisano wpływ MSCs na fizjologię i układ odpornościowy^5,6. Komórki te są obiecujące w leczeniu wielu chorób, zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynaryjnej. MSCs mogą kontrolować stan zapalny i promować angiogenezę oraz homeostazę tkanek poprzez różne mechanizmy, takie jak kontakt komórka-komórka, czynniki rozpuszczalne i małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe7^,8,9,10. Co więcej, MSCs są komórkami uprzywilejowanymi immunologicznie, zdolnymi do przetrwania u immunoniezgodnych biorców przeszczepów allogenicznych, ponieważ komórki te wykazują niską ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i są stosowane w terapii komórkowej do przeszczepu allogenicznego^11,12. Niska immunogenność w połączeniu z potencjałem regeneracyjnym sprawia, że MSCs są idealnymi kandydatami do terapii komórkowej, takiej jak między innymi choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)¹³, toczeń rumieniowaty układowy (SLE)¹⁴ i stwardnienie rozsiane^1516,17.

Pomimo faktu, że MSCs znajdują się w kilku dorosłych tkankach, tkanka tłuszczowa oferuje przewagę nad innymi źródłami, takimi jak dostępność do pobrania, przy minimalnej interwencji chirurgicznej; duża liczba dostępnych komórek o wysokim współczynniku ekspansji; i łatwa ekspansja in vitro przy użyciu łatwego do wykonania protokołu bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu i tanich materiałów^{18,19, 20}. Po ekstrakcji, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) muszą być scharakteryzowane zgodnie z ustaleniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT)²¹. W związku z tym MSCs muszą wykazywać morfologię podobną do fibroblastów, przyleganie do hodowli plastycznej, ekspresję wysokiego procentu (≥95%) markerów mezenchymalnych, takich jak endoglin (CD105), ekto-5'-nukleotydaza (CD73) i Thy-1 (CD90) oraz niski odsetek (≤2%) markerów krwiotwórczych, takich jak wspólny antygen leukocytów (CD45), transbłonowa fosfoglikkoproteina (CD34), glikoproteina błonowa zakotwiczona w glikolipidach (CD14), integryna alfa M (CD11b), białko alfa związane z receptorem antygenu komórek B (CD79α) lub antygen powierzchniowy B-limfocytów B4 (CD19) i ludzki antygen leukocytarny klasy II (HLA-II). Ponadto wymagana jest charakterystyka funkcjonalna, a komórki powinny być w stanie różnicować się w komórki osteoblastów, chondroblastów lub adipoblastów²¹.

Tutaj pokazujemy, jak uzyskać MSCs z tkanki tłuszczowej najądrza za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego do badań in vitro i charakterystyki morfologicznej wstępnie skonfigurowanej przez ISCT.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etyki zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety opieki i użytkowania z Uniwersytetu Stanowego Santa Cruz na mocy protokołu o numerze 021/22. Szwajcarskie samce myszy (6-8 tygodni) pozyskano z Laboratorium Hodowli, Utrzymania i Eksperymentów Zwierząt - Ośrodka Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Stanowego Santa Cruz (LaBIO-UESC), utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów, otrzymujące wodę i pokarm ad libitum w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności.

UWAGA: Inne linie myszy mogą być używane; zalecamy użycie dorosłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ mają one bardziej rozwiniętą tkankę tłuszczową i komórki o wysokiej aktywności proliferacyjnej.

1. Przygotowanie

UWAGA: Zanim przejdziesz dalej, przygotuj następujące odczynniki opisane poniżej. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać informacje o odczynnikach i dostawcach materiałów. We wszystkich praktycznych zabiegach należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak maski, czepki, fartuchy laboratoryjne i rękawice.

1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej najądrza
   1. Zarezerwuj materiały chirurgiczne: trzy zestawy sterylnych pęset i nożyczek, pięć igieł i zlewkę zawierającą 200 ml 70% etanolu.
   2. Przygotuj końcowy środek znieczulający, mieszając ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg).
2. Kultura ADSC
   1. Pożywka podstawowa: Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 μg/ml gentamycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
   2. Roztwór trawiący: Przygotować 0,15% kolagenazy typu II w PBS sterylizowanej w filtrze 0,25 μm.
      UWAGA: Nie jest konieczne stosowanie czterech antybiotyków opisanych w pożywce podstawowej. Będzie to zależało od warunków hodowli komórkowej w laboratorium, w którym jest to wykonywane.
3. Charakterystyka fenotypowa ADSC
   1. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
   2. Rozcieńczyć przeciwciała anty-mysie, jak podano w Tabeli 1.
   3. Przygotuj 2% formaldehydu w PBS.
4. Różnicowanie osteogenne ADSC
   1. Pożywka różnicująca osteogenne: Przygotuj DMEM uzupełniony 5,67 M kwasem askorbinowym, 10 nM deksametazonem, 0,02 M β-glicerofosforanem, 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną.
   2. Do barwienia Von Kossa przygotuj następujące roztwory: 70% etanolu w wodzie, 5% azotanu srebra w wodzie, wody destylowanej, 5% tiosiarczanu sodu w wodzie i 1% eozyny B w wodzie.
5. Różnicowanie adipogenne:
   1. Pożywka do różnicowania adipogennego: Przygotować DMEM uzupełniony o 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny, 200 μM indometacyny, 1 μM deksametazon, 10 μM insuliny, 10% FBS i 1 % penicyliny/streptomycyny.
   2. Do barwienia czerwienią olejową przygotuj następujące roztwory: 10% formaliny w wodzie dejonizowanej, 60% izopropanolu w wodzie dejonizowanej, lizochromu (barwnika rozpuszczalnego w tłuszczach), barwnika diazowego (roztwór czerwieni olejowej O) w 60% izopropanolu i 1% hematoksyliny w wodzie dejonizowanej.
6. Różnicowanie chondrogenne:
   1. Pożywka do różnicowania chondrogennego: Przygotować pożywkę chondrogenną uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
   2. Przygotuj 10% formaldehydu w PBS.
   3. Do barwienia proteoglikanami i glikozaminoglikanami przygotuj następujące roztwory: barwienie heteroglikanowe (Alcian Blue 1%) w kwasie octowym, pH 2,5, parafina, hematoksylina, rozcieńczenie szeregu etanolu w wodzie (100%, 96%, 80% i 70%).

Tabela 1: Przeciwciała użyte do fenotypowej charakterystyki ADSC za pomocą cytometru przepływowego. Wykaz przeciwciał wraz z ich odpowiednimi fluorochromami, rozcieńczeniami, klonem i końcowym stężeniem, a także ich funkcją w komórce, która ulega ekspresji.

2. Metody

UWAGA: Tkanka tłuszczowa jest rozmieszczona w całym ciele w miejscach podskórnych lub wewnątrzbrzusznych. U myszy najczęstszymi tkankami tłuszczowymi wykorzystywanymi do eksperymentów są podskórne najądrza, krezkowe i zaotrzewnowe²². Tutaj pokazano etapy uzyskiwania tkanki tłuszczowej najądrza (Rysunek 1).

Rysunek 1: Eksperymentalny projekt uzyskania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej od szwajcarskich myszy. (A) Za pomocą igieł umieść zwierzę na płycie korkowej lub styropianowej; (B) Podnieś skórę za pomocą pęsety, wykonaj nacięcie w środku okolicy brzucha i oderwij skórę od otrzewnej; C) zidentyfikować białą tkankę tłuszczową powyżej najądrza; (D) przenieść tkankę na pożywkę DMEM uzupełnioną 10% FBS i 1% antybiotykami, dokładnie przemyć tkankę tłuszczową najądrza PBS i przenieść tkankę do roztworu trawiącego; E) rozdrobnić tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, energicznie wstrząsając co 10 minut; (G) po zliczeniu komórek ułóż płytki 6-dołkowe na płytkach i obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem. (F) Morfologia komórek zmieni się z okrągłej na podobną do fibroblastu. Podziałka = 22,22 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej najądrza
   UWAGA: Należy pamiętać, że wszystkie procedury muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym, aby zapewnić czystą i wolną od zanieczyszczeń hodowlę komórek.
   1. Poddać zwierzęta eutanazji za pomocą roztworu ketaminy i ksylazyny (100 i 10 mg/kg, jak opisano w kroku 1.1.2) drogą dootrzewnową.
      UWAGA: Można zastosować inne metody eutanazji²³. Upewnij się, że zwierzę nie żyje, potwierdzając brak bicia serca.
   2. Umieść zwierzę brzuszną stroną skierowaną do góry na płycie korkowej lub styropianowej pokrytej folią aluminiową i przymocuj je za pomocą sterylnych igieł (Rysunek 1A).
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, spryskaj okolice brzucha 70% alkoholem. Alternatywnie zgol włosy skalpelem.
   3. Podnieś skórę za pomocą pęsety na środku brzucha i wykonaj cięcie sterylnymi nożyczkami.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, niezbędne są dwa zestawy sterylnych pęset i nożyczek. Pierwszy służy do otwarcia zwierzęcia, przecinając skórę i warstwę otrzewnej; Drugi służy do zbierania tkanki tłuszczowej najądrza. Zarezerwuj również 150 ml 70% alkoholu w zlewce, aby wyczyścić nożyczki i pęsetę między krokami.
   4. Wprowadź nożyczki pod skórę zwierzęcia i otwórz je, aby odłączyć je od otrzewnej (Ryc. 1B). Podnieś warstwę otrzewnej za pomocą pęsety i przetnij sterylnymi nożyczkami.
   5. Użyj innego zestawu sterylnych pęset i nożyczek i zidentyfikuj najądrze nad jądrami i białą tkankę tłuszczową nad najądrzami. Pociągnij całą tkankę tłuszczową najądrza za pomocą sterylnej pęsety o wielkości około 2 cm i przyciąć bardzo blisko najądrza (Ryc. 1C).
   6. Umieść tłuszcz w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej podłoże podstawowe i umieść go na lodzie (Rysunek 1D). W masce przejdź do kolejnych kroków, jak opisano poniżej.
2. Izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
   UWAGA: Próbki należy przetwarzać w okapie z przepływem laminarnym klasy biologicznej II, a personel powinien nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę chirurgiczną.
   1. Tkankę tłuszczową najądrza dokładnie przemyć PBS.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do usunięcia krwi i innych cząstek z próbki. Krew może hamować enzym kolagenazę typu II i zagrozić eksperymentowi.
   2. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść tkankę tłuszczową najądrza do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15-20 ml roztworu trawiącego, przygotowanej w sposób 1.2.2. Rozdrobnić tkankę za pomocą sterylnych nożyczek i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (Rysunek 1E, F).
      UWAGA: Na tym etapie można użyć łaźni wodnej lub inkubatora o temperaturze 37 °C. Co 10 minut zawiesinę należy energicznie wstrząsnąć w celu ułatwienia trawienia. Nie należy wydłużać czasu 1h inkubacji.
   3. Dezaktywować kolagenazę przez rozcieńczenie próbki w stosunku 1:1 w podłożu podstawowym i odwirować zawiesinę o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania frakcji naczyniowej zrębu. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml podłoża podstawowego.
   4. Sprawdzić żywotność i policzyć komórki metodą wykluczania barwnika błękitu trypanowego w komorze Neubauera przy użyciu rozcieńczenia 1:10 lub 1:100,
      UWAGA: Oczekiwany plon to około 0,5-1 miliona komórek/g przetworzonej tkanki tłuszczowej i żywotność 80%.
   5. Umieść izolowane komórki (0,3-0,5 miliona) w 3 ml podłoża podstawowego w jednym dołku płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5 % CO₂ .
   6. Następnego dnia: Usuń pożywkę z dołka i umyj komórki PBS. Dodać 3 ml podłoża podstawowego. Powtarzaj ten proces co 2 dni, aż komórki staną się zlewające w 90%.
      UWAGA: Zawsze obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem, zmieniając się z okrągłego na podobny do fibroblastu (Rysunek 1H).
3. Ekspansja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
   UWAGA: Gdy komórki osiągną ~90% zlewu, przejdź do subkultury, jak opisano poniżej.
   1. Usuń pożywkę ze studzienki i umyj komórki PBS. Dodać 0,5 ml/basenik trypsyny/EDTA (0,05% trypsyny; 200 mg/l EDTA) i inkubować płytkę przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia komórek.
      UWAGA: Nie przekraczaj 5 minut w trypcynie/EDTA. Całkowite oderwanie komórek należy sprawdzić pod mikroskopem odwróconym. Proces ten można przyspieszyć, ostrożnie pipetując w górę i w dół lub stukając w bok płytki.
   2. Dezaktywować enzym przez rozcieńczenie próbki 1:1 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami.
   3. Podzielić zawiesinę komórkową na 2 dołki i dodać 3 ml podłoża podstawowego (DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% antybiotyków). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   4. Zmieniaj podłoże następnego dnia, a następnie co 2 dni, aż do 90% zbiegu.
   5. Powtórz proces aż do trzeciego pasażu i przejdź do fenotypu i charakterystyki funkcjonalnej.
      UWAGA: Zawsze obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem, zmieniając się z okrągłego na podobny do fibroblastu.
4. Charakterystyka komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
   1. Charakterystyka fenotypowa metodą cytometrii przepływowej
      1. Odłącz komórki za pomocą trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 2.3.1 do 2.3.2.
      2. Zebrać komórki do stożkowej probówki (50 ml) i odwirować przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
      3. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.2.4 i zasiej 0,5-1 x 10⁶ komórek w 100 μl PBS na 96-dołkowej płytce.
         UWAGA: Liczba dołków będzie zależeć od koloru koniugatu fluorochromowego i filtrów/laserów cytometru.
      4. Dodać przeciwciała (Tabela 1) rozcieńczone w 1% BSA w PBS.
         UWAGA: Nie jest konieczne stosowanie bloku Fc, aby uniknąć niespecyficznego wiązania, ponieważ już używamy BSA do rozcieńczania przeciwciał. Zarezerwuj próbkę komórek bez otrzymywania przeciwciał, które będą używane jako kontrola barwienia. Przeciwciała można łączyć w tej samej studzience zgodnie z barwnikiem fluorochromowym i cytometrem dostępnym w laboratorium. Wszystkie przeciwciała opisane w tabeli 1 można dodać do tego samego studzienki, z wyjątkiem CD71 FITC i CD29 FITC, które muszą znajdować się w różnych studzienkach z powodu tego samego fluorochromu.
      5. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      6. Umyć komórki, następnie uzupełnić objętość do 200 μl za pomocą PBS, odwirować płytkę o sile 252 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz.
      7. Napraw komórki, dodając 200 μl na studzienkę 2% formaldehydu w PBS. Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy w cytometrze przepływowym.
         UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy jak najszybciej pobrać komórki cytometru przepływowego. Jasność fluorescencji markerów ulega znacznemu zanikowi po 48 godzinach dla większości fluorochromów. Nie przekraczaj więc 48 godzin na odczytanie tabliczki. Zalecane jest pozyskanie 30 000 zdarzeń.
      8. Użyj strategii bramkowania przedstawionej w Rysunek 2B, aby wybrać populację ASC.
   2. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie osteogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Płytka, w trzech powtórzeniach, 2 x 10⁵ komórek na basenie na płytkach 6-dołkowych w podstawowym podaniu przyśrodkowym (DMEM uzupełnionym 10 % FBS i 1 % antybiotykami); inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂,
         UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, po jednej na każdy czas różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę osteogenną (krok 1.4.1).
         UWAGA: zarezerwuj 3 studzienki hodowane tylko z podłożem podstawowym, które będzie kontrolą różnicowania.
      4. Hoduj komórki przez 14 i 21 dni w pożywkach osteogennych i komórkach kontrolnych, zmieniając pożywkę co 3 dni. Przejdź do barwienia metodą Von Kossa (krok 1.4.2), aby ocenić zmineralizowane guzki pod koniec każdego okresu hodowli.
      5. Odessać pożywkę z każdej studzienki i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Utrwal komórki 2 ml 70% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Dokładnie umyj komórki pod bieżącą wodą.
      6. Dodać 2 ml 5% roztworu azotanu srebra i inkubować płytkę w świetle ultrafioletowym przez 1 godzinę. Umyć komórki wodą destylowaną. Dodać 2 ml 5% tiosiarczanu sodu i inkubować przez 5 minut. Umyć wodą destylowaną.
      7. Przeciwbarwienie 2 ml eozyny przez 40 s. Myć wodą destylowaną, aż roztwór barwiący zostanie usunięty i uwidocznić barwienie za pomocą mikroskopu optycznego.
   3. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie adipogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Płytka 2 x 10⁵ komórek na basenie 6-dołkowym w podstawowym podkładzie (DMEM uzupełniony 10 % FBS i 1 % antybiotykami); inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂,
         UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, po jednej na każdy czas różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia zmień podłoże na podłoże adipogenne (krok 2.5.1).
         UWAGA: Zarezerwuj 3 studzienki hodowane tylko z podłożem podstawowym jako kontrolą.
      4. Hodować komórki przez 14 i 21 dni w pożywce adipogennej, zmieniając pożywkę co 3 dni. Pod koniec każdego okresu hodowli należy przejść do barwienia czerwienią olejową O (kroki 2.4.3.5-2.4.3.7), wskaźnika wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów.
      5. Odessać pożywkę z każdej studzienki. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Utrwal komórki w 2 ml 10% formaliny przez 1 godzinę. Umyj raz PBS, a następnie raz wodą.
      6. Zabarwić 2 ml roztworu Oil-Red O w 60% izopropanolu przez 5 min. Raz przemyć wodą destylowaną.
      7. Przeciwbarwić 2 ml 1% hematoksyliny rozcieńczonej w stosunku 1:2 w wodzie destylowanej przez 1 min. Przemyć wodą destylowaną, aż roztwór barwiący zostanie usunięty, a następnie uwidocznić zabarwione próbki za pomocą mikroskopu optycznego.
   4. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie chondrogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Umieścić 5 x 10⁵ ADSC w czterech polipropylenowych stożkowych probówkach i wirować przy 450 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Odrzucić supernatant.
      3. Hodować osady w stożkowej probówce w pożywce chondrogennej (etap 1.6.1) lub tylko w pożywce podstawowej (kontrola różnicowania) przez 14 i 21 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ . Zmieniaj podłoże co 3 dni i unikaj usuwania granulek.
         UWAGA: Każdy osad komórkowy odnosi się do każdego czasu hodowli, a także do odpowiednich kontroli uprawianych tylko na pożywce podstawowej.
      4. Pod koniec każdego punktu czasowego hodowli zbierz granulki za pomocą pęsety z cienką końcówką i umieść je na 24-dołkowej płytce. Przystąpić do cięcia histologicznego i barwienia proteoglikanów i glikozaminoglikanów (kroki 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         UWAGA: Każdy pellet jest przetwarzany w osobnej studzience.
      5. Utrwal granulki w 2 ml 10% buforowanego formaldehydu przez 30 minut. Wyrzuć roztwór formaldehydu i dodaj 2 ml 70% etanolu. Usuń granulki ze stożkowej rurki za pomocą końcówki i zanurz je w parafinie.
      6. Za pomocą obrotowego mikrotomu parafinowego wykonać skrawki histologiczne o wielkości 5 μm. Inkubować skrawki przez 15 minut w temperaturze 60 °C i zanurzyć je dwukrotnie w ksylenie (na 5 i 15 minut).
      7. Ponownie uwodnić próbki, zanurzając skrawki histologiczne w kąpielach alkoholowych o malejących stężeniach (100%, 96%, 80% i 70%) na 2 minuty każda, a następnie płukać wodą dejonizowaną przez 5 minut.
      8. Próbki należy barwić błękitem Alcian 1% w kwasie octowym o pH 2,5 przez 30 minut.
      9. Przeciwbarwić hematoksyliną przez 1 minutę i przemyć wodą destylowaną. Zamontuj za pomocą DPX (mocowanie do histologii) lub innego roztworu montażowego i uwidocznij próbki za pomocą mikroskopu optycznego.

Komórki pobrane z tkanki tłuszczowej zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem wykazały morfologię spełniającą minimalne kryteria dla MSCs zaproponowane przez ISCT. Przegląd protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Fenotypowo, ADSC wykazywały przyleganie do morfologii plastycznej i podobnej do fibroblastów w pierwszych dniach hodowli komórkowej (Figura 2A). Ponadto rosły jednorodnie i tworzyły kolonie. Ponadto ADSC wykazały niską ekspresję CD34 (2,12%) i CD45 (1,81%), obu markerów krwiotwórczych, oraz wysoką ekspresję CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) i CD90 (55,1%), wszystkich markerów komórek mezenchymalnych (Figura 2B).

Rysunek 2: Charakterystyka fenotypowa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. (A) Morfologia ADSC zmienia się z okrągłej na podobną do fibroblastów w 2, 4 i 8 dniu hodowli; Podziałka liniowa = 22,22 μm. (B) Histogramy dla markerów wyrażonych (CD71, CD29 i CD90) lub nie (CD34 i CD45) przez ASC. Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Mirandy et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Funkcjonalnie, ADSC wykazały zdolność do różnicowania się na osteoblasty, adipoblasty i chondroblasty, gdy były hodowane w kondycjonowanych pożywkach dla każdej linii przez 14 lub 21 dni (Rysunek 3). Barwienie metodą Von Kossy ujawniło zmineralizowane guzki w macierzy zewnątrzkomórkowej, charakterystyczne dla procesu osteogenezy (Ryc. 3). Barwienie czerwienią olejową O wykazało wakuole lipidowe w cytoplazmie ADSC, a barwienie błękitem Alcian potwierdziło obecność glikozaminoglikanu w macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 3). Łącznie cechy fenotypowe i funkcjonalne potwierdziły, że populacja komórek wyekstrahowanych z tkanki tłuszczowej najądrza jest MSCs.

Rysunek 3: Charakterystyka funkcjonalna komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. Osteogenny, adipogenny i chondrogeniczny potencjał wieloliniowy ADSC po 14 i 21 dniach na hodowli. Podziałka = 50 μm (panel górny), 100 μm (panel środkowy i dolny). Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Mirandy et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.