Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

DOI:

10.3791/65722

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) były intensywnie badane jako nowe podejście terapeutyczne, głównie w celu powstrzymania zaostrzonego stanu zapalnego ze względu na ich potencjał do modulowania odpowiedzi immunologicznej. MSCs są komórkami uprzywilejowanymi immunologicznie, zdolnymi do przetrwania u immunoniezgodnych biorców przeszczepów allogenicznych w oparciu o niską ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I oraz przy zastosowaniu terapii komórkowej do przeszczepu allogenicznego. Komórki te można wyizolować z kilku tkanek, z których najczęściej stosuje się szpik kostny i tkankę tłuszczową. Zapewniamy prosty protokół izolacji, hodowli i charakterystyki MSCs z tkanki tłuszczowej najądrza myszy. Tkanka tłuszczowa najądrza jest wycinana chirurgicznie, fizycznie rozdrobniona i trawiona 0,15% roztworem kolagenazy typu II. Następnie pierwotne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) są hodowane i namnażane in vitro, a charakterystyka fenotypowa jest przeprowadzana za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy również kroki różnicowania ADSC na komórki osteogenne, adipogenne i chondrogenne, a następnie funkcjonalną charakterystykę każdej linii komórkowej. Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do eksperymentów in vivo i ex vivo, a alternatywnie, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wykorzystane do wygenerowania unieśmiertelnionych komórek podobnych do MSCs.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to dorosłe komórki wielopotencjałowe różnicujące się w komórki takie jak osteoblast, chondroblast i adipocyte1,2. Komórki te znajdują się w kilku narządach i z tego powodu można je pobrać z dorosłych tkanek, takich jak szpik kostny, mięśnie, tłuszcz, mieszek włosowy, korzeń zęba, łożysko, skóra właściwa, okołochrzęstne, pępowina, płuca, wątroba i śledziona3,4.

Opisano wpływ MSCs na fizjologię i układ odpornościowy5,6. Komórki te są obiecujące w leczeniu wielu chorób, zarówno w medycynie ludzkiej, jak i weterynaryjnej. MSCs mogą kontrolować stan zapalny i promować angiogenezę oraz homeostazę tkanek poprzez różne mechanizmy, takie jak kontakt komórka-komórka, czynniki rozpuszczalne i małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe7,8,9,10. Co więcej, MSCs są komórkami uprzywilejowanymi immunologicznie, zdolnymi do przetrwania u immunoniezgodnych biorców przeszczepów allogenicznych, ponieważ komórki te wykazują niską ekspresję cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i są stosowane w terapii komórkowej do przeszczepu allogenicznego11,12. Niska immunogenność w połączeniu z potencjałem regeneracyjnym sprawia, że MSCs są idealnymi kandydatami do terapii komórkowej, takiej jak między innymi choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)13, toczeń rumieniowaty układowy (SLE)14 i stwardnienie rozsiane1516,17.

Pomimo faktu, że MSCs znajdują się w kilku dorosłych tkankach, tkanka tłuszczowa oferuje przewagę nad innymi źródłami, takimi jak dostępność do pobrania, przy minimalnej interwencji chirurgicznej; duża liczba dostępnych komórek o wysokim współczynniku ekspansji; i łatwa ekspansja in vitro przy użyciu łatwego do wykonania protokołu bez konieczności stosowania specjalnego sprzętu i tanich materiałów18,19, 20. Po ekstrakcji, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ADSC) muszą być scharakteryzowane zgodnie z ustaleniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT)21. W związku z tym MSCs muszą wykazywać morfologię podobną do fibroblastów, przyleganie do hodowli plastycznej, ekspresję wysokiego procentu (≥95%) markerów mezenchymalnych, takich jak endoglin (CD105), ekto-5'-nukleotydaza (CD73) i Thy-1 (CD90) oraz niski odsetek (≤2%) markerów krwiotwórczych, takich jak wspólny antygen leukocytów (CD45), transbłonowa fosfoglikkoproteina (CD34), glikoproteina błonowa zakotwiczona w glikolipidach (CD14), integryna alfa M (CD11b), białko alfa związane z receptorem antygenu komórek B (CD79α) lub antygen powierzchniowy B-limfocytów B4 (CD19) i ludzki antygen leukocytarny klasy II (HLA-II). Ponadto wymagana jest charakterystyka funkcjonalna, a komórki powinny być w stanie różnicować się w komórki osteoblastów, chondroblastów lub adipoblastów21.

Tutaj pokazujemy, jak uzyskać MSCs z tkanki tłuszczowej najądrza za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego do badań in vitro i charakterystyki morfologicznej wstępnie skonfigurowanej przez ISCT.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi etyki zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety opieki i użytkowania z Uniwersytetu Stanowego Santa Cruz na mocy protokołu o numerze 021/22. Szwajcarskie samce myszy (6-8 tygodni) pozyskano z Laboratorium Hodowli, Utrzymania i Eksperymentów Zwierząt - Ośrodka Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Stanowego Santa Cruz (LaBIO-UESC), utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów, otrzymujące wodę i pokarm ad libitum w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności.

UWAGA: Inne linie myszy mogą być używane; zalecamy użycie dorosłych myszy (6-8 tygodni), ponieważ mają one bardziej rozwiniętą tkankę tłuszczową i komórki o wysokiej aktywności proliferacyjnej.

1. Przygotowanie

UWAGA: Zanim przejdziesz dalej, przygotuj następujące odczynniki opisane poniżej. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać informacje o odczynnikach i dostawcach materiałów. We wszystkich praktycznych zabiegach należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak maski, czepki, fartuchy laboratoryjne i rękawice.

  1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej najądrza
    1. Zarezerwuj materiały chirurgiczne: trzy zestawy sterylnych pęset i nożyczek, pięć igieł i zlewkę zawierającą 200 ml 70% etanolu.
    2. Przygotuj końcowy środek znieczulający, mieszając ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg).
  2. Kultura ADSC
    1. Pożywka podstawowa: Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 μg/ml gentamycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
    2. Roztwór trawiący: Przygotować 0,15% kolagenazy typu II w PBS sterylizowanej w filtrze 0,25 μm.
      UWAGA: Nie jest konieczne stosowanie czterech antybiotyków opisanych w pożywce podstawowej. Będzie to zależało od warunków hodowli komórkowej w laboratorium, w którym jest to wykonywane.
  3. Charakterystyka fenotypowa ADSC
    1. Przygotować 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
    2. Rozcieńczyć przeciwciała anty-mysie, jak podano w Tabeli 1.
    3. Przygotuj 2% formaldehydu w PBS.
  4. Różnicowanie osteogenne ADSC
    1. Pożywka różnicująca osteogenne: Przygotuj DMEM uzupełniony 5,67 M kwasem askorbinowym, 10 nM deksametazonem, 0,02 M β-glicerofosforanem, 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną.
    2. Do barwienia Von Kossa przygotuj następujące roztwory: 70% etanolu w wodzie, 5% azotanu srebra w wodzie, wody destylowanej, 5% tiosiarczanu sodu w wodzie i 1% eozyny B w wodzie.
  5. Różnicowanie adipogenne:
    1. Pożywka do różnicowania adipogennego: Przygotować DMEM uzupełniony o 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny, 200 μM indometacyny, 1 μM deksametazon, 10 μM insuliny, 10% FBS i 1 % penicyliny/streptomycyny.
    2. Do barwienia czerwienią olejową przygotuj następujące roztwory: 10% formaliny w wodzie dejonizowanej, 60% izopropanolu w wodzie dejonizowanej, lizochromu (barwnika rozpuszczalnego w tłuszczach), barwnika diazowego (roztwór czerwieni olejowej O) w 60% izopropanolu i 1% hematoksyliny w wodzie dejonizowanej.
  6. Różnicowanie chondrogenne:
    1. Pożywka do różnicowania chondrogennego: Przygotować pożywkę chondrogenną uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
    2. Przygotuj 10% formaldehydu w PBS.
    3. Do barwienia proteoglikanami i glikozaminoglikanami przygotuj następujące roztwory: barwienie heteroglikanowe (Alcian Blue 1%) w kwasie octowym, pH 2,5, parafina, hematoksylina, rozcieńczenie szeregu etanolu w wodzie (100%, 96%, 80% i 70%).

powiedział:
Przeciwciało/FluoroforRozcieńczeniuklonStężenie końcowe (μg/ml)Funkcja i komórka, w której jest wyrażona
CD34- PE1:100Pamięć RAM34cyfra arabskaWspółczynnik adhezji komórek. Hematopoetyczne komórki macierzyste.
CD45- Transporter opancerzony1:10030-F11cyfra arabskaAsystencja w aktywacji leukocytów. Ulega ekspresji w leukocytach.
CD71- FITC1:100Klasa C25Kontroluje pobieranie żelaza podczas proliferacji komórek. Komórki proliferacyjne, retikulocyty i komórki prekursorowe.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adhezja i aktywacja, embriogeneza, leukocyty, komórki dendrytyczne, płytki krwi, komórki tuczne, fibroblasty i komórki śródbłonka.
CD90- PerCP1:100OX-7cyfra arabskaSygnalizacja, adhezja. Limfocyt T, NK, monocyt, hemtopoetyczne komórki macierzyste, neuron i fibroblast.

Tabela 1: Przeciwciała użyte do fenotypowej charakterystyki ADSC za pomocą cytometru przepływowego. Wykaz przeciwciał wraz z ich odpowiednimi fluorochromami, rozcieńczeniami, klonem i końcowym stężeniem, a także ich funkcją w komórce, która ulega ekspresji.

2. Metody

UWAGA: Tkanka tłuszczowa jest rozmieszczona w całym ciele w miejscach podskórnych lub wewnątrzbrzusznych. U myszy najczęstszymi tkankami tłuszczowymi wykorzystywanymi do eksperymentów są podskórne najądrza, krezkowe i zaotrzewnowe22. Tutaj pokazano etapy uzyskiwania tkanki tłuszczowej najądrza (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Eksperymentalny projekt uzyskania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej od szwajcarskich myszy. (A) Za pomocą igieł umieść zwierzę na płycie korkowej lub styropianowej; (B) Podnieś skórę za pomocą pęsety, wykonaj nacięcie w środku okolicy brzucha i oderwij skórę od otrzewnej; C) zidentyfikować białą tkankę tłuszczową powyżej najądrza; (D) przenieść tkankę na pożywkę DMEM uzupełnioną 10% FBS i 1% antybiotykami, dokładnie przemyć tkankę tłuszczową najądrza PBS i przenieść tkankę do roztworu trawiącego; E) rozdrobnić tkankę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, energicznie wstrząsając co 10 minut; (G) po zliczeniu komórek ułóż płytki 6-dołkowe na płytkach i obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem. (F) Morfologia komórek zmieni się z okrągłej na podobną do fibroblastu. Podziałka = 22,22 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ekstrakcja tkanki tłuszczowej najądrza
    UWAGA: Należy pamiętać, że wszystkie procedury muszą być przeprowadzane w sterylnych warunkach w komorze z przepływem laminarnym, aby zapewnić czystą i wolną od zanieczyszczeń hodowlę komórek.
    1. Poddać zwierzęta eutanazji za pomocą roztworu ketaminy i ksylazyny (100 i 10 mg/kg, jak opisano w kroku 1.1.2) drogą dootrzewnową.
      UWAGA: Można zastosować inne metody eutanazji23. Upewnij się, że zwierzę nie żyje, potwierdzając brak bicia serca.
    2. Umieść zwierzę brzuszną stroną skierowaną do góry na płycie korkowej lub styropianowej pokrytej folią aluminiową i przymocuj je za pomocą sterylnych igieł (Rysunek 1A).
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, spryskaj okolice brzucha 70% alkoholem. Alternatywnie zgol włosy skalpelem.
    3. Podnieś skórę za pomocą pęsety na środku brzucha i wykonaj cięcie sterylnymi nożyczkami.
      UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, niezbędne są dwa zestawy sterylnych pęset i nożyczek. Pierwszy służy do otwarcia zwierzęcia, przecinając skórę i warstwę otrzewnej; Drugi służy do zbierania tkanki tłuszczowej najądrza. Zarezerwuj również 150 ml 70% alkoholu w zlewce, aby wyczyścić nożyczki i pęsetę między krokami.
    4. Wprowadź nożyczki pod skórę zwierzęcia i otwórz je, aby odłączyć je od otrzewnej (Ryc. 1B). Podnieś warstwę otrzewnej za pomocą pęsety i przetnij sterylnymi nożyczkami.
    5. Użyj innego zestawu sterylnych pęset i nożyczek i zidentyfikuj najądrze nad jądrami i białą tkankę tłuszczową nad najądrzami. Pociągnij całą tkankę tłuszczową najądrza za pomocą sterylnej pęsety o wielkości około 2 cm i przyciąć bardzo blisko najądrza (Ryc. 1C).
    6. Umieść tłuszcz w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej podłoże podstawowe i umieść go na lodzie (Rysunek 1D). W masce przejdź do kolejnych kroków, jak opisano poniżej.
  2. Izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
    UWAGA: Próbki należy przetwarzać w okapie z przepływem laminarnym klasy biologicznej II, a personel powinien nosić fartuch laboratoryjny, rękawice i maskę chirurgiczną.
    1. Tkankę tłuszczową najądrza dokładnie przemyć PBS.
      UWAGA: Ten krok jest niezbędny do usunięcia krwi i innych cząstek z próbki. Krew może hamować enzym kolagenazę typu II i zagrozić eksperymentowi.
    2. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść tkankę tłuszczową najądrza do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15-20 ml roztworu trawiącego, przygotowanej w sposób 1.2.2. Rozdrobnić tkankę za pomocą sterylnych nożyczek i inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (Rysunek 1E, F).
      UWAGA: Na tym etapie można użyć łaźni wodnej lub inkubatora o temperaturze 37 °C. Co 10 minut zawiesinę należy energicznie wstrząsnąć w celu ułatwienia trawienia. Nie należy wydłużać czasu 1h inkubacji.
    3. Dezaktywować kolagenazę przez rozcieńczenie próbki w stosunku 1:1 w podłożu podstawowym i odwirować zawiesinę o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania frakcji naczyniowej zrębu. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml podłoża podstawowego.
    4. Sprawdzić żywotność i policzyć komórki metodą wykluczania barwnika błękitu trypanowego w komorze Neubauera przy użyciu rozcieńczenia 1:10 lub 1:100,
      UWAGA: Oczekiwany plon to około 0,5-1 miliona komórek/g przetworzonej tkanki tłuszczowej i żywotność 80%.
    5. Umieść izolowane komórki (0,3-0,5 miliona) w 3 ml podłoża podstawowego w jednym dołku płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 .
    6. Następnego dnia: Usuń pożywkę z dołka i umyj komórki PBS. Dodać 3 ml podłoża podstawowego. Powtarzaj ten proces co 2 dni, aż komórki staną się zlewające w 90%.
      UWAGA: Zawsze obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem, zmieniając się z okrągłego na podobny do fibroblastu (Rysunek 1H).
  3. Ekspansja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
    UWAGA: Gdy komórki osiągną ~90% zlewu, przejdź do subkultury, jak opisano poniżej.
    1. Usuń pożywkę ze studzienki i umyj komórki PBS. Dodać 0,5 ml/basenik trypsyny/EDTA (0,05% trypsyny; 200 mg/l EDTA) i inkubować płytkę przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia komórek.
      UWAGA: Nie przekraczaj 5 minut w trypcynie/EDTA. Całkowite oderwanie komórek należy sprawdzić pod mikroskopem odwróconym. Proces ten można przyspieszyć, ostrożnie pipetując w górę i w dół lub stukając w bok płytki.
    2. Dezaktywować enzym przez rozcieńczenie próbki 1:1 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami.
    3. Podzielić zawiesinę komórkową na 2 dołki i dodać 3 ml podłoża podstawowego (DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% antybiotyków). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    4. Zmieniaj podłoże następnego dnia, a następnie co 2 dni, aż do 90% zbiegu.
    5. Powtórz proces aż do trzeciego pasażu i przejdź do fenotypu i charakterystyki funkcjonalnej.
      UWAGA: Zawsze obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem, zmieniając się z okrągłego na podobny do fibroblastu.
  4. Charakterystyka komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)
    1. Charakterystyka fenotypowa metodą cytometrii przepływowej
      1. Odłącz komórki za pomocą trypsyny/EDTA, jak opisano w krokach 2.3.1 do 2.3.2.
      2. Zebrać komórki do stożkowej probówki (50 ml) i odwirować przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
      3. Policz komórki zgodnie z opisem w kroku 2.2.4 i zasiej 0,5-1 x 106 komórek w 100 μl PBS na 96-dołkowej płytce.
        UWAGA: Liczba dołków będzie zależeć od koloru koniugatu fluorochromowego i filtrów/laserów cytometru.
      4. Dodać przeciwciała (Tabela 1) rozcieńczone w 1% BSA w PBS.
        UWAGA: Nie jest konieczne stosowanie bloku Fc, aby uniknąć niespecyficznego wiązania, ponieważ już używamy BSA do rozcieńczania przeciwciał. Zarezerwuj próbkę komórek bez otrzymywania przeciwciał, które będą używane jako kontrola barwienia. Przeciwciała można łączyć w tej samej studzience zgodnie z barwnikiem fluorochromowym i cytometrem dostępnym w laboratorium. Wszystkie przeciwciała opisane w tabeli 1 można dodać do tego samego studzienki, z wyjątkiem CD71 FITC i CD29 FITC, które muszą znajdować się w różnych studzienkach z powodu tego samego fluorochromu.
      5. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      6. Umyć komórki, następnie uzupełnić objętość do 200 μl za pomocą PBS, odwirować płytkę o sile 252 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok jeszcze raz.
      7. Napraw komórki, dodając 200 μl na studzienkę 2% formaldehydu w PBS. Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy w cytometrze przepływowym.
        UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy jak najszybciej pobrać komórki cytometru przepływowego. Jasność fluorescencji markerów ulega znacznemu zanikowi po 48 godzinach dla większości fluorochromów. Nie przekraczaj więc 48 godzin na odczytanie tabliczki. Zalecane jest pozyskanie 30 000 zdarzeń.
      8. Użyj strategii bramkowania przedstawionej w Rysunek 2B, aby wybrać populację ASC.
    2. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie osteogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Płytka, w trzech powtórzeniach, 2 x 105 komórek na basenie na płytkach 6-dołkowych w podstawowym podaniu przyśrodkowym (DMEM uzupełnionym 10 % FBS i 1 % antybiotykami); inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
        UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, po jednej na każdy czas różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę osteogenną (krok 1.4.1).
        UWAGA: zarezerwuj 3 studzienki hodowane tylko z podłożem podstawowym, które będzie kontrolą różnicowania.
      4. Hoduj komórki przez 14 i 21 dni w pożywkach osteogennych i komórkach kontrolnych, zmieniając pożywkę co 3 dni. Przejdź do barwienia metodą Von Kossa (krok 1.4.2), aby ocenić zmineralizowane guzki pod koniec każdego okresu hodowli.
      5. Odessać pożywkę z każdej studzienki i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Utrwal komórki 2 ml 70% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Dokładnie umyj komórki pod bieżącą wodą.
      6. Dodać 2 ml 5% roztworu azotanu srebra i inkubować płytkę w świetle ultrafioletowym przez 1 godzinę. Umyć komórki wodą destylowaną. Dodać 2 ml 5% tiosiarczanu sodu i inkubować przez 5 minut. Umyć wodą destylowaną.
      7. Przeciwbarwienie 2 ml eozyny przez 40 s. Myć wodą destylowaną, aż roztwór barwiący zostanie usunięty i uwidocznić barwienie za pomocą mikroskopu optycznego.
    3. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie adipogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Płytka 2 x 105 komórek na basenie 6-dołkowym w podstawowym podkładzie (DMEM uzupełniony 10 % FBS i 1 % antybiotykami); inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
        UWAGA: Potrzebne będą dwie płytki 6-dołkowe, po jednej na każdy czas różnicowania (14 i 21 dni).
      3. Następnego dnia zmień podłoże na podłoże adipogenne (krok 2.5.1).
        UWAGA: Zarezerwuj 3 studzienki hodowane tylko z podłożem podstawowym jako kontrolą.
      4. Hodować komórki przez 14 i 21 dni w pożywce adipogennej, zmieniając pożywkę co 3 dni. Pod koniec każdego okresu hodowli należy przejść do barwienia czerwienią olejową O (kroki 2.4.3.5-2.4.3.7), wskaźnika wewnątrzkomórkowej akumulacji lipidów.
      5. Odessać pożywkę z każdej studzienki. Umyj komórki dwukrotnie PBS. Utrwal komórki w 2 ml 10% formaliny przez 1 godzinę. Umyj raz PBS, a następnie raz wodą.
      6. Zabarwić 2 ml roztworu Oil-Red O w 60% izopropanolu przez 5 min. Raz przemyć wodą destylowaną.
      7. Przeciwbarwić 2 ml 1% hematoksyliny rozcieńczonej w stosunku 1:2 w wodzie destylowanej przez 1 min. Przemyć wodą destylowaną, aż roztwór barwiący zostanie usunięty, a następnie uwidocznić zabarwione próbki za pomocą mikroskopu optycznego.
    4. Charakterystyka funkcjonalna: Różnicowanie chondrogenne
      1. Odłączyć komórki za pomocą trypsyny/EDTA (zgodnie z opisem w krokach 2.3.1 do 2.3.2), zebrać i odwirować komórki (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1.2 i 2.4.1.2) i policzyć je (zgodnie z opisem w krokach 2.2.4).
      2. Umieścić 5 x 105 ADSC w czterech polipropylenowych stożkowych probówkach i wirować przy 450 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Odrzucić supernatant.
      3. Hodować osady w stożkowej probówce w pożywce chondrogennej (etap 1.6.1) lub tylko w pożywce podstawowej (kontrola różnicowania) przez 14 i 21 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 3 dni i unikaj usuwania granulek.
        UWAGA: Każdy osad komórkowy odnosi się do każdego czasu hodowli, a także do odpowiednich kontroli uprawianych tylko na pożywce podstawowej.
      4. Pod koniec każdego punktu czasowego hodowli zbierz granulki za pomocą pęsety z cienką końcówką i umieść je na 24-dołkowej płytce. Przystąpić do cięcia histologicznego i barwienia proteoglikanów i glikozaminoglikanów (kroki 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        UWAGA: Każdy pellet jest przetwarzany w osobnej studzience.
      5. Utrwal granulki w 2 ml 10% buforowanego formaldehydu przez 30 minut. Wyrzuć roztwór formaldehydu i dodaj 2 ml 70% etanolu. Usuń granulki ze stożkowej rurki za pomocą końcówki i zanurz je w parafinie.
      6. Za pomocą obrotowego mikrotomu parafinowego wykonać skrawki histologiczne o wielkości 5 μm. Inkubować skrawki przez 15 minut w temperaturze 60 °C i zanurzyć je dwukrotnie w ksylenie (na 5 i 15 minut).
      7. Ponownie uwodnić próbki, zanurzając skrawki histologiczne w kąpielach alkoholowych o malejących stężeniach (100%, 96%, 80% i 70%) na 2 minuty każda, a następnie płukać wodą dejonizowaną przez 5 minut.
      8. Próbki należy barwić błękitem Alcian 1% w kwasie octowym o pH 2,5 przez 30 minut.
      9. Przeciwbarwić hematoksyliną przez 1 minutę i przemyć wodą destylowaną. Zamontuj za pomocą DPX (mocowanie do histologii) lub innego roztworu montażowego i uwidocznij próbki za pomocą mikroskopu optycznego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki pobrane z tkanki tłuszczowej zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem wykazały morfologię spełniającą minimalne kryteria dla MSCs zaproponowane przez ISCT. Przegląd protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Fenotypowo, ADSC wykazywały przyleganie do morfologii plastycznej i podobnej do fibroblastów w pierwszych dniach hodowli komórkowej (Figura 2A). Ponadto rosły jednorodnie i tworzyły kolonie. Ponadto ADSC wykazały niską ekspresję CD34 (2,12%) i CD45 (1,81%), obu markerów krwiotwórczych, oraz wysoką ekspresję CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) i CD90 (55,1%), wszystkich markerów komórek mezenchymalnych (Figura 2B).

figure-results-1
Rysunek 2: Charakterystyka fenotypowa komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. (A) Morfologia ADSC zmienia się z okrągłej na podobną do fibroblastów w 2, 4 i 8 dniu hodowli; Podziałka liniowa = 22,22 μm. (B) Histogramy dla markerów wyrażonych (CD71, CD29 i CD90) lub nie (CD34 i CD45) przez ASC. Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Mirandy et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Funkcjonalnie, ADSC wykazały zdolność do różnicowania się na osteoblasty, adipoblasty i chondroblasty, gdy były hodowane w kondycjonowanych pożywkach dla każdej linii przez 14 lub 21 dni (Rysunek 3). Barwienie metodą Von Kossy ujawniło zmineralizowane guzki w macierzy zewnątrzkomórkowej, charakterystyczne dla procesu osteogenezy (Ryc. 3). Barwienie czerwienią olejową O wykazało wakuole lipidowe w cytoplazmie ADSC, a barwienie błękitem Alcian potwierdziło obecność glikozaminoglikanu w macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 3). Łącznie cechy fenotypowe i funkcjonalne potwierdziły, że populacja komórek wyekstrahowanych z tkanki tłuszczowej najądrza jest MSCs.

figure-results-2
Rysunek 3: Charakterystyka funkcjonalna komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej. Osteogenny, adipogenny i chondrogeniczny potencjał wieloliniowy ADSC po 14 i 21 dniach na hodowli. Podziałka = 50 μm (panel górny), 100 μm (panel środkowy i dolny). Ten rysunek został zreprodukowany za zgodą Mirandy et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSCs mogą być ekstrahowane z różnych tkanek. Pomimo tego, że szpik kostny stanowi powszechne źródło MSCs zarówno u myszy, jak i u ludzi25,26, zdecydowaliśmy się pracować z tkanką tłuszczową w tym badaniu ze względu na jej bogactwo MSC, dystrybucję w organizmie i łatwość dostępu do niej. Alternatywnie, komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być wykorzystane do wytworzenia unieśmiertelnionych komórek podobnych do MSCs27.

Niektóre punkty ekstrakcji zasługują na szczególną uwagę ze względu na powodzenie udostępnionych tutaj protokołów. Po pierwsze, zwracamy uwagę na staranność przy pobieraniu tkanki, która musi być wykonywana w warunkach aseptycznych. Dlatego przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że myszy są odpowiednio zdezynfekowane 70% alkoholem. Kolejną ważną kwestią jest to, aby nie używać tego samego zestawu pęset i nożyczek do zbierania tkanki tłuszczowej najądrza, unikając w ten sposób jakiegokolwiek źródła zanieczyszczenia.

Drugim problemem jest przetwarzanie tkanek. Fragmenty w stożkowej probówce muszą być właściwie i energicznie wstrząśnięte podczas 10 minut inkubacji w temperaturze 37 °C. Bardzo ważna jest zmiana podłoża następnego dnia, a następnie co 2-3 dni. Zaleca się codzienną obserwację kultury, sprawdzanie koloru podłoża, kształtu komórek i wszelkich ingerencji w środowisko kultury.

Trzecia obawa dotyczy najlepszego czasu/przejścia dla charakterystyki MSC. Tutaj zalecamy zrobienie tego przy trzecim przejściu komórek, ale nie jest to obowiązkowe. To zależy od celu badania. W trzecim fragmencie mamy około 80% komórek scharakteryzowanych jako MSCs, co wystarcza na przykład do osiągnięcia celów tego badania. Charakterystykę fenotypową przeprowadza się poprzez analizę ekspresji markerów krwiotwórczych (na przykład CD34 i CD45) i markerów mezenchymalnych (na przykład CD29, CD73, CD90 i CD105). Co więcej, Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT)21 podkreśla, że ADSC powinny mieć morfologię podobną do fibroblastów i przylegać do plastiku platformy hodowlanej. Morfologię można obserwować pod mikroskopem podczas uprawy kultury. Charakterystykę funkcjonalną przeprowadza się poprzez analizę potencjału ADSC do różnicowania się w komórki osteoblastów, adipoblastów i chondroblastów. W charakterystyce fenotypowej procent markerów mezenchymalnych i krwiotwórczych może się różnić w zależności od gatunku zwierzęcia i źródła komórek, nie w pełni spełniając liczby zalecane przez ISCT. Na przykład ISCT zaleca dla ludzkich MSCs ≥95% CD105, CD73, CD90 i ≤2% CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79a lub CD19, ludzki antygen leukocytarny - izotyp DR (HLA-DR)21. Ponadto ważne jest, aby przeprowadzić charakterystykę funkcjonalną i potwierdzić wielomoc komórek różnicujących się w osteoblasty, chondrocyty i linie adipocytów. Co najmniej dwie z tych linii są zalecane do udowodnienia multipotencji.

Oprócz tych podkreślonych punktów, niektóre sugerowane tutaj testy można zastąpić, na przykład czerwień alizarynową S zamiast barwienia Von Kossa, Shiff kwasu okresowego zamiast błękitu alcian i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) zamiast cytometrii przepływowej.

Spośród trzech typów tkanki tłuszczowej opisanych u ludzi (biała, brązowa i beżowa), biała tkanka tłuszczowa ma największe źródło MSCs28. Tkankę tę można uzyskać z obszarów podskórnych, brzusznych i pachwinowych, takich jak tłuszcz nad najądrzem, o którym mowa tutaj. Fizyczna fragmentacja i trawienie enzymatyczne przez kolagenazę zastosowane w udostępnionym tutaj protokole wyprowadzają frakcję naczyniową zrębu (SVF) złożoną z wielu typów komórek, z wyjątkiem adipocytów, które są wyczerpywane podczas przetwarzania.

Podsumowując, do głównych zalet stosowania tkanki tłuszczowej jako źródła MSCs należy zaliczyć ich obfitość i łatwość metod izolacji komórek, związane z potencjałem terapeutycznym MSCs jako właściwości przeciwzapalnych i regeneracyjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania wspierane przez grant z Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) i Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG i URS dzięki stypendium przyznanemu odpowiednio przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) oraz Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
140 stopni Celsjusza; C Sterylizacja wysokotemperaturowa Inkubator CO2RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinyC180
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Kwas octowy lodowcowySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, StanyZjednoczone PHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneA9186BioReagent, odpowiedni do wykrywania glikoprotein. 1% w kwasie octowym, pH 2,5
Alkohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% w wodzie
Amfoterycyna BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Przeciwciała anty-mysie anty-CD29 FITC (Klon Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Funkcje w komórce: Adhezja i aktywacja, embriogeneza, leukocyty, DC, płytki krwi, komórki tuczne, fibroblasty i komórki śródbłonka
Przeciwciała anty-mysie anty-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Funkcje w komórce: Czynnik adhezji komórek. Hematopoetyczne komórki macierzyste
Przeciwciała anty-mysie anty-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Funkcje w komórce: Pomaga w aktywacji leukocytów Przeciwciała
anty-mysie anty-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Funkcje w komórce: Kontroluje wychwyt żelaza podczas proliferacji komórek. Komórki proliferacyjne, retikulocyty i prekursory Przeciwciała
anty-mysie anty-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Funkcje w komórce: sygnalizacja, adhezja. Limfocyt T, NK, monocyt, HSC, neuron, fibroblasty
Kwas askorbinowySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczonePHR1008
Pipety automatyczneThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone4700850NFinnpipette F1 Zestawy do pipetowania laboratoryjnego (GLP)
ZlewkaNie dotyczy1 jednostka
Albumina surowicy bydlęcejSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Płytki do hodowli komórkowych (6-dołkowe)Merck, Darmstadt, NiemcyZ70775907 jednostek sterylnych. Płytki do hodowli tkankowych TPP
Płytki do hodowli komórkowych (96-dołkowe. Okrągłe lub V na dole)Merck, Darmstadt, NiemcyCLS35307701 jednostka sterylna. Studnie, 96, powierzchnia poddana kulturze tkankowej (TC), przezroczyste studzienki z okrągłym dnem, sterylne
podłoże chondrogenneŁodyga Pro Różnicowanie chondrogenezy– Technologie ŻyciaA1007101TGF-β 2, TGF-β 3, deksametazon, insulina, transferyna, ITS, sód-l - askorbinian, pirogronian sodu, 2-fosforan askorbinianu
Kolagenaza typu IILife Technologies, Kalifornia, USA17101015
płyta korkowa lub styropianowa pokryta aluminiumNie dotyczy1 sztuka
bawełnyNie dotyczy50 g
deksametazonuSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneD4902
Nożyczki preparacyjneNie dotyczy03 sztuki sterylny
DPX Uchwyt do histologiiSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523Z 1000 mg/L glukozy i L-glutaminy, bez wodorowęglanu sodu, proszek, odpowiedni do hodowli komórkowych
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneF4135
FormaldehydSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany Zjednoczone47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneHT501128
GentamycynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Igła podskórna (0,3 mm x 13 mm)Nie dotyczy5 sztuk
IndometacynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Stany ZjednoczoneI0200000
InsulinaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% w H2O
Roztwór chlorowodorku ketaminy-D4Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061,0 mg/ml w metanolu (jako wolna zasada), certyfikowany materiał odniesienia, Cerilliant®
Komora NeubaueraSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620Komora licząca MARKA BLAUBRAND Neubauer wzór. Z klipsami,
końcówkami do pipet Nichiryo z podwójną linijką (0,1– 10 μ L)Merck, Darmstadt, NiemcyZ645540Zakres głośności 0,1– 10 μ L, wydłużone, opakowanie zbiorcze. Sterylne
końcówki do pipet Nichiryo (1– 10 mL)Merck, Darmstadt, NiemcyZ717401Zakres głośności 1– 10 mL, uniwersalny, opakowanie zbiorcze. Sterylne
końcówki do pipet Nichiryo (200 μ L)Merck, Darmstadt, NiemcyZ645516Maksymalna objętość 200 μ L, z podziałką, ministack. Sterylny
roztwór oleju i czerwieni OSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910,5% w parafinie izopropanolu
Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146– 48, w postaci bloku
Penicylina/StreptomycynaSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Roztwór stabilizowany, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny / ml, 0,1 μ m przefiltrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Proszek, pH 7,4, do przygotowania 1 L roztworów. Zrównoważone i sterylne
probówki stożkowe z polipropylenu (15 ml)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterylne
probówki stożkowe z polipropylenu (50 ml)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 sztuki sterylnego
skalpela (opcjonalnie)Nie dotyczy1 szt
Azotan srebraSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Tiosiarczan soduSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Pęseta chirurgiczna (15 cm)Nie dotyczy3 sztuki sterylnych
szwajcarskich samców myszy (6– 8 tygodni)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
strzykawka (1 ml)Nie dotyczy1 jednostka
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540,4%, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
Trypsyna/EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glicerofosforan sól disodowa hydratSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, odpowiedni do hodowli komórkowych, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99% (miareczkowanie)
.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22(2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187(2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206(2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mesenchymal Stem CellsAdipose TissueStem Cell IsolationIn Vitro ExpansionFlow CytometryOsteogenic DifferentiationAdipogenic DifferentiationChondrogenic DifferentiationCollagenase DigestionMouse Epididymal Tissue

Powiązane artykuły