Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65727

⸱

1 września 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.

Streszczenie

Embrionalny kurczak (Gallus domesticus) jest dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki, ze względu na jego wysoki stopień podobieństwa do soczewki ludzkiej. RCAS(A) jest kompetentnym do replikacji retrowirusem kurczaka, który infekuje dzielące się komórki, co służy jako potężne narzędzie do badania ekspresji i funkcji in situ białek typu dzikiego i zmutowanych podczas rozwoju soczewki poprzez mikrowstrzyknięcie do pustego światła pęcherzyka soczewki we wczesnych stadiach rozwoju, ograniczając jego działanie do otaczających proliferujących komórek soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, zastosowanie retrowirusa ptaków zdolnego do replikacji RCAS(A) zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. W szczególności ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki. W tym artykule pokrótce omówimy etapy potrzebne do przygotowania rekombinowanego retrowirusa RCAS(A), przedstawimy szczegółowy, kompleksowy przegląd procedury mikroiniekcji oraz przedstawimy przykładowe wyniki techniki.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest opisanie metodologii mikroiniekcji embrionalnej soczewki kurczaka RCAS(A) (kompetentnego replikacyjnie mięsaka ptaka/białaczki A). Wykazano, że skuteczne dostarczanie retrowirusowe w embrionalnej soczewce kurczaka jest obiecującym narzędziem do badania in vivo mechanizmu molekularnego i struktury i funkcji białek soczewki w prawidłowej fizjologii soczewki, stanach patologicznych i rozwoju. Co więcej, ten eksperymentalny model może zostać wykorzystany do identyfikacji celów terapeutycznych i badań przesiewowych leków w przypadku schorzeń takich jak zaćma wrodzona u ludzi. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma na celu określenie niezbędnych kroków do opracowania konfigurowalnej platformy do badania białek soczewek.

Embrionalne pisklęta (Gallus domesticus), ze względu na podobieństwo w budowie i funkcji soczewki do soczewki ludzkiej, są dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki1,2,3,4. Zastosowanie kompetentnego do replikacji retrowirusa ptaków RCAS(A) zostało uznane za wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Warto zauważyć, że ma unikalną zdolność do ograniczania docelowego transferu genów do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki, wykorzystując unikalne ramy czasowe rozwoju embrionalnego, w których obecność pustego światła soczewki pozwala na mikroiniekcję in situ RCAS(A) do miejsca ograniczonego w celu ekspresji białek egzogennych w proliferacyjnych komórkach włókien soczewki5, 6,7,8.

Procedura mikroiniekcji zarodków piskląt, opisana szczegółowo tutaj, jest pierwotnie częściowo oparta na pracy Fekete et. al.6 i dalej rozwijana przez Jiang et. al.8 i została wykorzystana jako sposób na wprowadzenie zarówno wirusowych, jak i niewirusowych plazmidów do soczewki embrionalnych piskląt1,9,10,11,12,13. Ogólnie rzecz biorąc, poprzednie prace pokazują potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act) oraz wykonawczymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, zgodnie z zasadami zawartymi w przewodniku Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na University of Texas Health Science Center w San Antonio. Przegląd protokołu znajduje się na Rysunku 1; szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i instrumentów użytych w tym protokole zawiera Tabela materiałów.

Schemat mikroiniekcji soczewki kurczaka; klonowanie DNA, transfekcja, proces wektora wirusowego, układ eksperymentalny.
Rycina 1: Schemat eksperymentalny. 1. Pierwszym krokiem protokołu jest określenie konkretnego białka docelowego, identyfikacja powiązanych sekwencji genów oraz generowanie fragmentów DNA. 2. Klonowanie sekwencji genu do wektora retrowirusowego poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, 3. a następnie do wektora wirusowego. 4. Przygotowanie cząstek wirusowych o wysokim mianie przy użyciu komórek pakujących w celu ich zbioru i zagęszczenia. 5. Ostatnim krokiem, będącym głównym przedmiotem niniejszego protokołu, jest mikroiniekcja cząstek wirusowych RCAS(A) do światła soczewki kurczaka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie rekombinowanych retrowirusów o wysokim mianie

  1. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu otrzymania fragmentów DNA docelowego białka
    UWAGA: Celem tej sekcji jest amplifikacja sekwencji DNA odpowiadającej docelowemu białku soczewki. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
    1. Zaprojektować startery do PCR, odpowiadające badanemu białku, aby otrzymać fragmenty DNA, których końce karboksylowe znajdują się w jednej ramce odczytu z sekwencją epitopu FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3') lub bez niej, kodonem stop oraz miejscem cięcia enzymu restrykcyjnego (np. EcoRI) obecnym w regionie polilinkera CLa12NCO, zgodnie ze specyfikacjami opisanymi w wcześniej opublikowanych protokołach, z sekwencjami dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych1,7,8,10,11.
    2. Przeprowadzić reakcję PCR10. Połączyć 100 pmol starterów sens i antysens z 0,5 µg cDNA koneksyny (np. Cx50, Cx43 lub kombinacji chimerycznych Cx50*43L) w wybranym buforze do reakcji PCR. Przeprowadzić 30 cykli, z których każdy składa się z 94 °C przez 1 min, 58 °C przez 1 min i 72 °C przez 1 min, a następnie końcową elongację przez 10 min w 72 °C.
    3. Wyizolować i oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania z żelu.
    4. Przetrawić oczyszczone produkty PCR przy użyciu wybranych enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Klonowanie insertów DNA do plazmidu adaptorowego
    UWAGA: Wstawienie fragmentów DNA do wektora adaptorowego eliminuje konieczność stosowania komórek/wirusów pomocniczych w celu zwiększenia stabilności wektora RCAS(A)14. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
    1. Subklonować fragmenty DNA do plazmidu adaptorowego Cla12NCO, wykorzystując reakcję ligacji lepko-końcowej. Wymieszać fragmenty PCR z enzymami restrykcyjnymi i Cla12NCO w stosunku 2-5:1. Przeprowadzić ligację i transformację DNA przy użyciu komórek kompetentnych.
    2. Wyizolować DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.
    3. Sekwencjonować DNA w celu potwierdzenia poprawności.
  3. Klonowanie do wirusowego wektora RCAS(A)
    UWAGA: Fragmenty DNA są wstawiane do nośnika (retrowirus RCAS(A)) w celu stabilnej transdukcji genu do komórek w rozwijającym się zarodku kurczaka14,15. Więcej szczegółów znajduje się w7,8,15.
    1. Przetrawić wektor Cla12NCO zawierający badany fragment DNA enzymem ClaI (1 jednostka na 1 µg DNA) i wyizolować fragmenty z żelu.
    2. Subklonować fragmenty DNA do zlinearyzowanego enzymem ClaI plazmidu RCAS(A). Użyć enzymu restrykcyjnego SalI, aby odróżnić miejsce cięcia ClaI w plazmidzie RCAS(A).
    3. Potwierdzić poprawną orientację wstawionych fragmentów w konstruktach poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi ClaI i SalI.
    4. Wyizolować DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.
    5. Oznaczyć stężenie DNA.
  4. Transfekcja fibroblastów embrionalnych kurczaka (CEF) i pozyskiwanie RCAS(A)
    UWAGA: Komórki pakujące wirusa, CEFs, są wykorzystywane do otrzymywania/pozyskiwania pożywek hodowlanych zawierających cząsteczki wirusowe15,16. Więcej szczegółów znajduje się w7,8,15.
    1. Transfekować komórki CEF rekombinowanymi konstruktami DNA retrowirusowego, używając czynnika transfekcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Przeprowadzić analizę western blot przetransfekowanych komórek, aby zbadać ekspresję badanego białka.
    3. Gdy przetransfekowane komórki osiągną konfluencję, rozpocząć zbieranie znadpływu pożywki, poddać go odpowiedniemu przetwarzaniu/filtrowaniu (aby usunąć resztki komórkowe za pomocą filtra 0,22 µm) i przechowywać w -80 °C do czasu zagęszczenia.
  5. Zagęszczanie i miareczkowanie zapasów wirusowych
    ​UWAGA: Osad oraz duże objętości pożywek pochodzących z komórek zawierających cząsteczki wirusowe muszą zostać przefiltrowane. Dodatkowo należy przeprowadzić test miana wirusa, aby określić siłę wirusa względem komórek gospodarza. Więcej szczegółów znajduje się w6,7,8,15.
    1. Rozmrozić pożywki hodowlane zawierające wiriony.
    2. Wirować pożywki hodowlane przy 72 000 × g przez 2 h w 4 °C.
    3. Zlać znadpływ i resuspender osad wirusowy w pozostałej (~50 µL) pożywce, a następnie przechowywać w -80 °C do czasu użycia, w aliquotach zapasów wirusowych o objętości ~10 µL.
    4. W celu miareczkowania, używając komórek QT-6 lub CEF, transfekować komórki seryjnymi rozcieńczeniami zapasów wirusowych.
    5. Po osiągnięciu konfluencji utrwalić komórki za pomocą 4% formaldehydu.
    6. Przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne na wirusowe białka gag lub histochemiczne na fosfatazę alkaliczną, aby uzyskać miano, definiowane jako jednostki tworzące kolonie (CFU) na mililitr (CFU/mL).

Schemat sprzętu do równowagi statycznej: A) konfiguracja testera mechanicznego; B) szafa magazynowa; C) mikroskop i stacja badawcza do analizy materiałowej.
Rysunek 2: Instrumenty i konfiguracja do mikroiniekcji do soczewki kurczaka. (A) Manualny pionowy wyprawiacz mikroelektrod i mikropipet P-30. (1) wstawka przedstawiająca proces wyprawiania szklanej mikropipety. (B) (2) Inkubator do jaj. Inkubacja jaja kurzego przez ~65-68 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C do osiągnięcia stadium 18 (z zamkniętym, pustym światłem centralnym) w celu iniekcji retrowirusa. (C) Układ do mikroiniekcji. (3) sprzęt oświetleniowy, (4) Pico-Injector, (5) mikroskop sekcyjny, (6) mikromanipulator Drummond, (7) komputer/kamera do wizualizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Mikroiniekcja do soczewki kurczaka

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Przygotowanie szklanych mikropipet do mikroiniekcji17
      UWAGA: Do wykonania szklanych mikropipet z ostrym końcem i średnicą zewnętrzną (OD) ~11 µm do mikroiniekcji wykorzystuje się kapilary szklane. Układ przedstawiono na Rysunku 2A.
      1. Przymocuj kapilarę z borokrzemianowego szkła do zacisków z gumową podkładką w ręcznym pionowym wyciągaczu do mikropipet.
      2. Ustaw temperaturę grzania (HEAT 1) na 950 °C i przeprowadź wstępne wyciąganie w celu uzyskania cieńszej i bardziej plastycznej kapilary szklanej.
      3. Ustaw temperaturę grzania (HEAT 2) na 790 °C i przeprowadź wtórne wyciąganie w celu wytworzenia końcowych mikropipet.
      4. Za pomocą szlifierki do mikropipet zaostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej (OD) ~11 µm.
      5. Na potrzeby przyszłych eksperymentów przechowuj szklane mikropipety w uchwycie z gąbki wewnątrz szklanego słoika.
    2. Inkubacja zapłodnionych jaj do 18. stadium rozwoju
      UWAGA: Podczas rozwoju soczewki, w ok. 65-68 h rozwoju embrionalnego, soczewka oddziela się od ektodermy i tworzy zamknięty pęcherzyk z centralnym światłem; iniekcja do tego pustego światła soczewki umożliwia ograniczenie ekspresji do proliferujących komórek soczewki7,8,18.
      1. Inkubuj zapłodnione jaja kurze przez ~65-68 h w nawilżanym inkubatorze kołyszącym w temperaturze 37 °C (Rysunek 2B).
  2. Otwieranie jaja kurzego
    UWAGA: Krok ten opisuje identyfikację i odsłonięcie embrionu do mikroiniekcji. Więcej szczegółów znajduje się w7,8.
    1. Dokładnie przetrzyj obszar roboczy 70% etanolem.
    2. Wyjmij jaja z inkubatora, obficie spryskaj je 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
    3. Umieść jajo na uchwycie, szerszym końcem skierowanym do góry.
    4. Używając pęsety z ostrymi ząbkami, wykonaj otwór o średnicy ~2 cm na szerszym końcu jaja, ostrożnie stukając w skorupkę i usuwając jej fragmenty (Rysunek 3A).
    5. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zlokalizuj embrion.
    6. Po zlokalizowaniu embrionu i soczewki pisklęcia, użyj mikroskopu stereoskopowego, precyzyjnej pęsety i nożyczek, aby wyciąć błonę owodni bezpośrednio pokrywającą górną część embrionu (Rysunek 3B).
      UWAGA: Nie wycinaj zbyt szeroko (tylko tyle, aby odsłonić embrion na obszarze ~0,5 cm x 0,5 cm), w przeciwnym razie embriony mogą zatonąć w masie żółtka; unikaj również, jeśli to możliwe, dotykania naczyń krwionośnych.
    7. Przykryj otwór w jajze szalką Petriego o średnicy 60 mm w przygotowaniu do kolejnych kroków.
  3. Mikroiniekcja stężonego roztworu wirusowego
    UWAGA: Cząstki wirusowe zawierające fragmenty DNA docelowego białka do transdukcji są wprowadzane do komórek wewnątrz światła soczewki. Układ przedstawiono na Rysunku 2C. Więcej szczegółów znajduje się w6,7,8.
    1. Odmroź zapasy wirusowe na lodzie.
    2. W celu wizualizacji roztworu wirusowego podczas iniekcji, dodaj 1 µL 10x Fast green do jednej fiolki z roztworem wirusowym zawierającej 10 µL.
    3. Aby upewnić się, że nie ma dużych grudek nierozpuszczonego materiału, które mogłyby zapchać szklaną mikropipetę, wirowarkuj roztwory przez 10 s przy 10 000 × g w temperaturze 4 °C, aby osadzić „duże grudki”, a następnie przenieś nadsącz do nowych probówek, cały czas utrzymując roztwory na lodzie.
    4. Na szalce hodowlanej 35 mm x 10 mm rozciągnij laboratoryjną parafinię i nanieś na nią 1 µL sterylnego roztworu soli fizjologicznej (PBS) (niejałowiona, strona przykryta uznawana jest za „czystą”).
    5. Podłącz przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego piko-injektora.
    6. Naciśnij fill mode, aby zaciągnąć sterylną sól fizjologiczną (PBS) do szklanej mikropipety, a następnie użyj inject mode, aby przetestować odmierzoną 1 µL cieczy.
    7. Rozciągnij drugą warstwę laboratoryjnej parafinii na powierzchni nowej szalki hodowlanej 35 mm x 10 mm i nanieś na nią 1 µL roztworów wirusowych zabarwionych Fast green.
    8. Zanurz końcówkę mikropipety w roztworze wirusowym i naciśnij fill-model, aby zaciągnąć do szklanej mikropipety ~1 µL roztworu wirusowego.
      UWAGA: Aby zapobiec wysychaniu, podczas każdej przerwy w procedurze umieszczaj końcówkę wypełnionej mikropipety w sterylnej soli fizjologicznej (PBS).
    9. Przy pomocy mikroskopu stereoskopowego wprowadź wypełnioną szklaną mikropipetę, podłączoną do automatycznego injektora, do docelowego obszaru światła soczewki embrionu.
    10. Dostosuj źródło światła, aby zapewnić wyraźną wizualizację obrysu pęcherzyka soczewki.
      UWAGA: Do iniekcji zazwyczaj wykorzystuje się światło prawej soczewki (skierowanej w górę), a lewą (skierowaną w dół) pozostawia się nienaruszoną jako kontrolę kontralateralną.
    11. Po upewnieniu się, że mikropipeta znajduje się w prawidłowym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij 5-40 nL roztworu wirusowego (Rysunek 3C).
      UWAGA: Praktyka jest niezbędna dla optymalnego rozmieszczenia iniekcji.
    12. Odczekaj ~45 s, a następnie ostrożnie wyjmij szklaną mikropipetę.
    13. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego sprawdź powodzenie mikroiniekcji do światła soczewki, obserwując barwnik Fast Green, który powinien pozostać w pustym świetle soczewki bez żadnych wycieków.
    14. Po zakończeniu procedury iniekcji zaklej otwór w skorupce jaja taśmą klejącą.
    15. Przenieś embrion z powrotem do nawilżanego inkubatora w temperaturze 37 °C, bez ruchu obrotowego, aż do osiągnięcia pożądanego wieku embrionalnego do dyssekcji soczewki.

Schemat operacji oka z wstawieniem soczewki i konfiguracją badania mikroskopowego.
Rycina 3: Przygotowanie i schemat mikroiniekcji u kurczęcia. (A) Otwieranie jaja kurzego. (B) Przecinanie błony owodniowej. (C) Schemat mikroiniekcji do światła soczewki kurczęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po określeniu specyficznego białka docelowego i identyfikacji powiązanej sekwencji genu (lub genów), ogólne podejście eksperymentalne obejmuje klonowanie sekwencji genu (lub genów) do retrowirusowego wektora RCAS(A) poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, a następnie do wektora wirusowego. Po drugie, przy użyciu komórek pakujących przygotowuje się cząstki wirusowe o wysokim mianie w celu zbioru i zagęszczenia wirionów. Te dwa pierwsze główne etapy zostały w znacznym stopniu opisane, a reprezentatywne wyniki p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten eksperymentalny model daje możliwość ekspresji białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania w nienaruszonej soczewce, co prowadzi do zbadania funkcjonalnego znaczenia tych białek w strukturze i funkcji soczewki. Model mikroiniekcji embrionalnych piskląt jest częściowo oparty na pracy Fekete et. al.6 i był dalej rozwijany przez Jiang et. al.8 i został wykorzystany jako środek do wprowadzania zarówno plazmidów wirusowych, jak i czynników, takich jak agoniści, małe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (dla J.X.J) i F32DK134051 (dla F.M.A.) oraz grant Fundacji Welch: AQ-1507 (dla J.X.J.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Figury zostały częściowo stworzone przy użyciu Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m FiltrCorning431118Do usuwania zanieczyszczeń komórkowych z pożywki
35 mm x 10 mm Naczynie hodowlaneFisherScientific50-202-030Do stosowania podczas mikroiniekcji
WirówkaFisherbrand13-100-676Roztwór do wirowania
w dół KonstruktyGENEWIZ-Dogenerowania konstruktów
Mikroskop preparacyjnyAmScopeSM-4TZ-144A Wizualizacjasoczewki do mikroiniekcji
starterów DNA PCRZintegrowane technologieDNA-Generacja starterów:

Cx50 z delecją wewnątrzkomórkową (IL) (reszty 1– 97 oraz 149– 400) oraz wektor Cla12NCO uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antysens, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs Cx43 (reszty 98– 150) i Cx46 (pozostałości 98– 166) były  otrzymany z następującymi parami starterów: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antysens, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, odpowiednio

Szablon konstrukcji Cla12NCO-Cx43 uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antysens, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs Cx50 (pozostałości 98– 148) lub Cx46 (pozostałości 98– 166) zostały sklonowane przy użyciu konstrukcji Cla12NCO-Cx50 i Cla12NCO-Cx46 jako szablonów z następującą parą starterów: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antysens, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, odpowiednio
Drummond Nanoject II Automatyczny wtryskiwacz nanolitrowyDrummond Scientific3-000-204Pipeta do mikroiniekcji
Podwójne światła na gęsiej szyi Oświetlacz mikroskopuAmScopeLED-50WYOświetlenie do wizualizacji
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)InvitrogenDo hodowli komórkowych
Uchwyt na jaja-Domowe styropianowe pierścienie o średnicy 2 cali i wysokości pół cala
Inkubator jajGQF Manufacturing Company Inc.1502Do inkubacji zapłodnionych jaj
Fast GreenFisher scientificF99-10Do wizualizacji iniekcji zapasów wirusowych
Zapłodnione białe jaja kurze leghornTexas A& M UniversityN/APreferowany model zwierzęcy do mikroiniekcji (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)LaboratoriaDo hodowli komórkowej
Anty-mysie IgG sprzężone z fluoresceinąJackson ImmunoResearch115-095-003Do anty-FLAG  1:500
KleszczeFisherScientific22-327379Do przenoszenia rzeczy i izolacja
Kapilary szklaneSutter InstrumentsB100-75-10Szklana mikropipeta do mikroiniekcji (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm, długość 10 cm)
LipofectamineInvitrogenL3000001Do transfekcji
Ręczny pionowy ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-30Aby uzyskać szklaną mikropipetę o odpowiednim rozmiarze
Probówkido mikrowirówekFisherScientific02-682-004Roztwór do rozpuszczania
MikroskopKeyenceBZ-X710Do barwienia
obrazowego ParafilmuFisherScientific03-448-254Roztwór do umieszczania
Penicylina / StreptomycynaInvitrogenDo hodowli komórkowych
Pico-InjectorAparat HarvardPLI-100Do precyzyjnego dostarczania małych objętości cieczy przez mikropipety poprzez zastosowanie regulowanego ciśnienia przez cyfrowo ustawiony okres czasu
królik anty-piskląt AQP0Self generated-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Klonowanie molekularne i charakterystyka funkcjonalna koneksyny światłowodowej soczewki pisklątej 45.6. Komórka Mol Biol. 1994 marzec; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
królicze przeciwciało anty-FLAGRockland Immunichemicals600-401-383Do barwienia FLAG
IgG anty-króliczej sprzężonej z rodaminą Jackson ImmunoResearch111-295-003Do anty-AQP0  1:500
Podkładka zaciskowa z gąbkąSutter InstrumentsBX10Do przechowywania szklanej mikropipety
hyklonowe

Bibliografia

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501(2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Retrowirus RCASmikroiniekcja do soczewki kurczakaembrionalny model kurczakarozwój soczewkitransfer genówekspresja białek egzogennychkomórki włókien soczewkiznakowanie immunofluorescencyjneoddziaływanie koneksyniniekcja mikropipetą
Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.