Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja rekombinowanego retrowirusa RCAS(A) do soczewki embrionalnej kurczaka

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65727

⸱

1 września 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł o protokole opisuje metodologię mikroiniekcji retrowirusa RCAS(A) do embrionalnej soczewki kurczaka jako narzędzia do badania funkcji in situ i ekspresji białek podczas rozwoju soczewki.

Streszczenie

Embrionalny kurczak (Gallus domesticus) jest dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki, ze względu na jego wysoki stopień podobieństwa do soczewki ludzkiej. RCAS(A) jest kompetentnym do replikacji retrowirusem kurczaka, który infekuje dzielące się komórki, co służy jako potężne narzędzie do badania ekspresji i funkcji in situ białek typu dzikiego i zmutowanych podczas rozwoju soczewki poprzez mikrowstrzyknięcie do pustego światła pęcherzyka soczewki we wczesnych stadiach rozwoju, ograniczając jego działanie do otaczających proliferujących komórek soczewki. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak modele transgeniczne i hodowle ex vivo, zastosowanie retrowirusa ptaków zdolnego do replikacji RCAS(A) zapewnia wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. W szczególności ukierunkowany transfer genów może być ograniczony do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki. W tym artykule pokrótce omówimy etapy potrzebne do przygotowania rekombinowanego retrowirusa RCAS(A), przedstawimy szczegółowy, kompleksowy przegląd procedury mikroiniekcji oraz przedstawimy przykładowe wyniki techniki.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest opisanie metodologii mikroiniekcji embrionalnej soczewki kurczaka RCAS(A) (kompetentnego replikacyjnie mięsaka ptaka/białaczki A). Wykazano, że skuteczne dostarczanie retrowirusowe w embrionalnej soczewce kurczaka jest obiecującym narzędziem do badania in vivo mechanizmu molekularnego i struktury i funkcji białek soczewki w prawidłowej fizjologii soczewki, stanach patologicznych i rozwoju. Co więcej, ten eksperymentalny model może zostać wykorzystany do identyfikacji celów terapeutycznych i badań przesiewowych leków w przypadku schorzeń takich jak zaćma wrodzona u ludzi. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ma na celu określenie niezbędnych kroków do opracowania konfigurowalnej platformy do badania białek soczewek.

Embrionalne pisklęta (Gallus domesticus), ze względu na podobieństwo w budowie i funkcji soczewki do soczewki ludzkiej, są dobrze znanym modelem zwierzęcym do badań nad rozwojem i fizjologią soczewki1,2,3,4. Zastosowanie kompetentnego do replikacji retrowirusa ptaków RCAS(A) zostało uznane za wysoce skuteczny, szybki i konfigurowalny system ekspresji białek egzogennych w zarodkach piskląt. Warto zauważyć, że ma unikalną zdolność do ograniczania docelowego transferu genów do proliferacyjnych komórek włókien soczewki bez potrzeby stosowania promotorów specyficznych dla tkanki, wykorzystując unikalne ramy czasowe rozwoju embrionalnego, w których obecność pustego światła soczewki pozwala na mikroiniekcję in situ RCAS(A) do miejsca ograniczonego w celu ekspresji białek egzogennych w proliferacyjnych komórkach włókien soczewki5, 6,7,8.

Procedura mikroiniekcji zarodków piskląt, opisana szczegółowo tutaj, jest pierwotnie częściowo oparta na pracy Fekete et. al.6 i dalej rozwijana przez Jiang et. al.8 i została wykorzystana jako sposób na wprowadzenie zarówno wirusowych, jak i niewirusowych plazmidów do soczewki embrionalnych piskląt1,9,10,11,12,13. Ogólnie rzecz biorąc, poprzednie prace pokazują potencjał wykorzystania tej metodologii do badania rozwoju, różnicowania, komunikacji komórkowej i progresji choroby, a także do odkrywania i testowania celów terapeutycznych w stanach patologicznych soczewki, takich jak zaćma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Przepisami Wykonawczymi dotyczącymi Dobrostanu Zwierząt zgodnie z zasadami Przewodnika Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio. Aby zapoznać się z przeglądem protokołu, zobacz Rysunek 1; Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w niniejszym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Zarys eksperymentu. 1. Pierwszym krokiem protokołu jest określenie określonego białka docelowego (białek), identyfikacja powiązanej sekwencji genów i generowanie fragmentów DNA. 2. Klonowanie sekwencji genu (sekwencji) genu do wektora retrowirusowego poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, 3. a następnie wektora wirusowego. 4. Przygotowanie cząstek wirusa o wysokim mianie przy użyciu komórek pakujących do zbioru i koncentracji. 5. Ostatnim krokiem i celem tego protokołu jest mikrowstrzyknięcie cząstek wirusa RCAS (A) do światła soczewki kurczaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie rekombinowanych retrowirusów o wysokim mianie

  1. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu wytworzenia docelowych fragmentów DNA białka
    UWAGA: Ta sekcja ma na celu amplifikację sekwencji DNA odpowiadającej białku soczewki docelowej. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz7,8.
    1. Zaprojektuj startery do PCR, odpowiadające białku będącemu przedmiotem zainteresowania, aby wytworzyć fragmenty DNA z ich końcami karboksylowymi w ramce z sekwencją epitopu FLAG lub bez niej (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), kodonem stop i miejscem enzymu restrykcyjnego (tj. EcoRI) obecnym w regionie polilinkera CLa12NCO)) Zgodnie ze specyfikacjami zapisanymi we wcześniej opublikowanych protokołach, z sekwencjami dla odpowiednich enzymów restrykcyjnych1,7,8,10,11.
    2. Wykonaj reakcję PCR10. Połącz 100 pmol sensu i antysensu zaprojektowanych starterów z 0,5 μg koneksyny cDNA (takiej jak Cx50, Cx43 lub chimeryczne kombinacje Cx50*43L) do wybranego buforu reakcyjnego PCR. Wykonać 30 cykli, z których każdy składa się z 94 °C przez 1 minutę, 58 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 minutę, a następnie końcowe przedłużenie przez 10 minut w temperaturze 72 °C.
    3. Wyizoluj i oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    4. Oczyszczone produkty PCR należy roztrawić przy użyciu wybranych enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Klonowanie wstawek DNA do plazmidu adaptorowego
    UWAGA: Wprowadzenie fragmentów DNA do wektora adaptorowego eliminuje potrzebę stosowania komórek pomocniczych/wirusów w celu zwiększenia stabilności wektora RCAS(A)14. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz7,8.
    1. Subklonuj fragmenty DNA do plazmidu adapterowego, Cla12NCO, wykorzystując reakcję ligacji lepkiego końca. Wymieszaj fragmenty PCR z enzymami restrykcyjnymi i Cla12NCO w stosunku 2-5:1. Wykonaj ligację i transformację DNA przy użyciu kompetentnych komórek.
    2. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.
    3. Zsekwencjonuj DNA, aby zapewnić dokładność.
  3. Klonowanie do wektora wirusa RCAS(A)
    UWAGA: Fragmenty DNA są wprowadzane do nośnika (retrowirusa RCAS(A)) w celu stabilnej transdukcji genu do komórek w rozwijającym się zarodku pisklęcia14,15. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz7,8,15.
    1. Trawić fragment Cla12NCO-DNA wektora zawierającego zainteresowanie za pomocą ClaI (1 jednostka na 1 μg DNA) i izolować fragmenty żelem.
    2. Subklonuj fragmenty DNA do zlinearyzowanego plazmidu RCAS(A) ClaI. Użyj enzymu restrykcyjnego SalI, aby odróżnić miejsce ClaI na plazmidzie RCAS(A).
    3. Potwierdzić prawidłową orientację wprowadzonych fragmentów na konstruktach poprzez trawienie enzymami ograniczającymi ClaI i SalI.
    4. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA.
    5. Określ stężenie DNA.
  4. Transfekcja komórek fibroblastów zarodkowych piskląt (CEF) i zbiór RCAS(A)
    UWAGA: Komórki pakujące wirusy, CEF, są używane do uzyskiwania/zbierania pożywek do hodowli komórkowych zawierających cząsteczki wirusa15,16. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz7,8,15.
    1. Transfekcyjne komórki CEF z rekombinowanym retrowirusowym DNA konstruuje się przy użyciu środka do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wykonaj western blot transfekowanych komórek, aby zbadać ich ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    3. Gdy transfekowane komórki osiągną konfluację, zacznij zbierać pożywkę supernatantową, odpowiednio ją przetwarzać/filtrować (w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń komórkowych za pomocą filtra 0,22 μm) i przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowa do koncentracji.
  5. Koncentracja i mianowanie zapasów wirusów
    UWAGA: Osad i duże objętości pożywki pochodzące z komórek zawierających cząstki wirusa muszą zostać przefiltrowane. Dodatkowo należy wykonać test miana wirusa w celu ustalenia siły wirusa w stosunku do komórek gospodarza. Aby uzyskać więcej szczegółów, zobacz6,7,8,15.
    1. Rozmrozić pożywkę hodowlaną zawierającą wiriony.
    2. Wirować pożywkę w temperaturze 72 000 × g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad wirusa z pozostałym (~50 μL) podłożem i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia, w ~10 μl zapasów wirusa.
    4. W celu mianowania, przy użyciu komórek QT-6 lub CEF, należy transfekować komórki seryjnym rozcieńczeniem zapasów wirusa.
    5. Po konfluencji napraw komórki za pomocą 4% formaldehydu.
    6. Barwienie immunologiczne wirusowych białek gag lub proces fosfatazy alkalicznej histochemicznie w celu uzyskania miana, zdefiniowanego jako (jednostki tworzące kolonie) CFU na mililitr (CFU/ml).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Instrumenty i konfiguracja do mikroiniekcji soczewek typu chick. (A) Ręczny pionowy ściągacz do mikropipet mikroelektrodowych P-30. (1) Wstawka przedstawiająca wyciąganą szklaną mikropipetę. b) (2) Inkubator jaj. Inkubować jaja kurze przez ~65-68 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby osiągnąć etap 18 (z zamkniętym, pustym światłem centralnym) w celu wstrzyknięcia retrowirusa. (C) Konfiguracja mikroiniekcji. (3) sprzęt oświetleniowy, (4) Pico-Injector, (5) mikroskop preparacyjny, (6) mikromanipulator Drummond, (7) komputer/kamera do wizualizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Mikroiniekcja soczewek Chick

  1. Przygotowanie materiałów eksploatacyjnych
    1. Przygotowanie szklanych mikropipet do mikroiniekcji17
      UWAGA: Kapilary szklane służą do wytwarzania szklanych mikropipet z końcówką i średnicą zewnętrzną (OD) ~11 μm do mikroiniekcji. Konfiguracja jest pokazana w Rysunek 2A.
      1. Przymocuj kapilarę ze szkła borokrzemianowego do gumowych wyściełanych klipsów w ręcznym pionowym ściągaczu do mikropipet.
      2. Ustaw temperaturę grzania (HEAT 1) na 950 °C i wykonaj wstępne ciągnięcie, aby uzyskać cieńszą i bardziej miękką szklaną kapilarę.
      3. Ustaw temperaturę grzania (HEAT 2) na 790 °C i wykonaj wtórne odciąganie, aby uzyskać końcowe mikropipety.
      4. Za pomocą młynka do mikropipet naostrz otwór końcówki do średnicy zewnętrznej ~11 μm.
      5. Do przyszłych eksperymentów należy przechowywać szklane mikropipety w gąbczastej podkładce zaciskowej w szklanym słoiku.
    2. Inkubacja zapłodnionych jaj do fazy rozwojowej 18
      UWAGA: Podczas rozwoju soczewki, w ~65-68 h rozwoju embrionalnego, soczewka oddziela się od ektodermy i tworzy szczelny pęcherzyk z centralnym światłem; Wstrzyknięcie do tego pustego światła soczewki zapewnia ograniczoną ekspresję do proliferacyjnych komórek soczewki7,8,18.
      1. Inkubuj zapłodnione jaja kurze przez ~65-68 godzin w nawilżanym inkubatorze bujanym o temperaturze 37 °C (Rysunek 2B).
  2. Otwarcie jaja kurzego
    UWAGA: Ten krok opisuje identyfikację i ekspozycję zarodka do mikroiniekcji. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz7,8.
    1. Dokładnie wytrzyj obszar roboczy 70% etanolem.
    2. Wyjmij jaja z inkubatora, spryskaj je mocno 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
    3. Umieść jajko większym końcem jajka skierowanym do góry na uchwycie na jajka.
    4. Używając pary kleszczyków o ostrych zębach, wykonaj otwór o średnicy ~2 cm na większym końcu jajka, ostrożnie stukając w skorupkę jajka i usuwając fragmenty skorupki jajka (Rysunek 3A).
    5. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zlokalizuj zarodek.
    6. Po zlokalizowaniu soczewki zarodka i pisklęcia użyj mikroskopu preparacyjnego oraz cienkich kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby odciąć błonę owodniową natychmiast pokrywającą wierzchołek zarodka (Ryc. 3B).
      UWAGA: Nie tnij zbyt szeroko (tylko na tyle, aby odsłonić zarodek ~0,5 cm x 0,5 cm), w przeciwnym razie zarodki mogą zatonąć w masie żółtkowej; Jeśli to możliwe, unikaj dotykania naczyń krwionośnych.
    7. Przykryj otwór jajka szalką Petriego o średnicy 60 mm, przygotowując się do kolejnych kroków.
  3. Mikroiniekcja skoncentrowanego zapasu wirusa
    UWAGA: Cząsteczki wirusa zawierające fragmenty DNA białka docelowego do transdukcji są wprowadzane do komórek wewnątrz światła soczewki. Konfiguracja jest pokazana w Rysunek 2C. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz6,7,8.
    1. Rozmrozić zapasy wirusów na lodzie.
    2. W celu uwidocznienia zapasu wirusa podczas wstrzykiwania, należy rozcieńczyć 1 μl 10x Fast green w jednej fiolce z zapasem wirusa zawierającym 10 μl.
    3. Aby upewnić się, że nie ma dużych kawałków nierozpuszczonego materiału, które mogłyby zatkać szklaną mikropipetę, należy odwirować roztwory przez 10 s w temperaturze 10 000 × g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać "duże kawałki" i przenieść supernatanty do nowych probówek, a wszystko to przy jednoczesnym utrzymywaniu roztworów na lodzie.
    4. Na naczyniu hodowlanym o wymiarach 35 mm x 10 mm umieścić rozciągnięty parafilm laboratoryjny i dodać 1 μl sterylnego soli fizjologicznej (PBS) na wierzch folii (niesterylizowanej, z przykrytą stroną uważaną za "czystą").
    5. Podłączyć przygotowaną szklaną mikropipetę do automatycznego wtryskiwacza pico.
    6. Naciśnij tryb napełniania, aby napełnić sterylną sól fizjologiczną (PBS) szklaną mikropipetą, a następnie użyj trybu wstrzykiwania, aby przetestować przydzielony 1 μl płynu.
    7. Umieścić drugi rozciągnięty parafilm laboratoryjny na powierzchni nowego naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 35 mm x 10 mm i dodać 1 μl szybko zabarwionych na zielono wirusów na wierzch folii.
    8. Opuść końcówkę mikropipety do materiału wirusowego i naciśnij model napełniający, aby napełnić szklaną mikropipetę ~1 μl materiału wirusowego.
      UWAGA: Aby uniknąć wysuszenia, należy umieścić końcówkę napełnionej mikropipety w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (PBS) za każdym razem, gdy następuje przerwa w procedurze.
    9. Opuścić napełnioną szklaną mikropipetę, podłączoną do automatycznego wstrzykiwacza, do docelowego obszaru światła soczewki zarodka za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
    10. Wyreguluj źródło światła, aby zapewnić wyraźną wizualizację konturu pęcherzyka soczewki.
      UWAGA: Lumen prawej soczewki (skierowanej do góry) jest zwykle używany do wstrzykiwania, a lewa (skierowana w dół) jest utrzymywana w stanie nienaruszonym jako kontrola kontralateralna.
    11. Po upewnieniu się, że mikropipeta jest umieszczona we właściwym miejscu wewnątrz światła soczewki, wstrzyknij 5-40 nL materiału wirusowego (Rysunek 3C).
      UWAGA: Praktyka jest bardzo potrzebna w celu optymalnego umiejscowienia wstrzyknięcia.
    12. Odczekaj ~45 s, a następnie delikatnie wyjmij szklaną mikropipetę.
    13. Sprawdź, czy mikroiniekcja zakończyła się sukcesem za pomocą mikroskopu preparacyjnego, badając barwnik Fast Green, który powinien pozostać w pustym świetle soczewki bez wycieku.
    14. Po zabiegu wstrzyknięcia należy uszczelnić otwór skorupki jajka taśmą klejącą.
    15. Umieścić zarodek z powrotem w inkubatorze nawilżanym w temperaturze 37 °C, bez żadnych ruchów obrotowych, aż do osiągnięcia pożądanego wieku zarodkowego w celu wycięcia soczewki.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przygotowanie piskląt do mikroiniekcji i schemat. (A) Otwarcie jaja kurzego. (B) Przecięcie błony owodniowej. (C) Schemat mikroiniekcji strumienia świetlnego soczewki kurczaka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po określeniu konkretnego docelowego białka (białek) i identyfikacji powiązanych sekwencji genów, ogólne podejście eksperymentalne obejmuje klonowanie sekwencji (sekwencji) genu do retrowirusowego wektora RCAS(A) poprzez wstępne klonowanie do wektora adaptorowego, a następnie wektora wirusowego. Po drugie, cząsteczki wirusa o wysokim mianie są przygotowywane przy użyciu komórek pakujących w celu zebrania i zagęszczenia wirionów. Te pierwsze dwa główne kroki zostały w dużej mierze opisane, a reprezentatywne wyniki przedst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten eksperymentalny model daje możliwość ekspresji białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania w nienaruszonej soczewce, co prowadzi do zbadania funkcjonalnego znaczenia tych białek w strukturze i funkcji soczewki. Model mikroiniekcji embrionalnych piskląt jest częściowo oparty na pracy Fekete et. al.6 i był dalej rozwijany przez Jiang et. al.8 i został wykorzystany jako środek do wprowadzania zarówno plazmidów wirusowych, jak i czynników, takich jak agoniści, małe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (dla J.X.J) i F32DK134051 (dla F.M.A.) oraz grant Fundacji Welch: AQ-1507 (dla J.X.J.). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Figury zostały częściowo stworzone przy użyciu Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m FiltrCorning431118Do usuwania zanieczyszczeń komórkowych z pożywki
35 mm x 10 mm Naczynie hodowlaneFisherScientific50-202-030Do stosowania podczas mikroiniekcji
WirówkaFisherbrand13-100-676Roztwór do wirowania
w dół KonstruktyGENEWIZ-Dogenerowania konstruktów
Mikroskop preparacyjnyAmScopeSM-4TZ-144A Wizualizacjasoczewki do mikroiniekcji
starterów DNA PCRZintegrowane technologieDNA-Generacja starterów:

Cx50 z delecją wewnątrzkomórkową (IL) (reszty 1– 97 oraz 149– 400) oraz wektor Cla12NCO uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antysens, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs Cx43 (reszty 98– 150) i Cx46 (pozostałości 98– 166) były  otrzymany z następującymi parami starterów: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antysens, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, odpowiednio

Szablon konstrukcji Cla12NCO-Cx43 uzyskano za pomocą następującej pary starterów: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antysens, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs Cx50 (pozostałości 98– 148) lub Cx46 (pozostałości 98– 166) zostały sklonowane przy użyciu konstrukcji Cla12NCO-Cx50 i Cla12NCO-Cx46 jako szablonów z następującą parą starterów: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antysens, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sens, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, odpowiednio
Drummond Nanoject II Automatyczny wtryskiwacz nanolitrowyDrummond Scientific3-000-204Pipeta do mikroiniekcji
Podwójne światła na gęsiej szyi Oświetlacz mikroskopuAmScopeLED-50WYOświetlenie do wizualizacji
Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)InvitrogenDo hodowli komórkowych
Uchwyt na jaja-Domowe styropianowe pierścienie o średnicy 2 cali i wysokości pół cala
Inkubator jajGQF Manufacturing Company Inc.1502Do inkubacji zapłodnionych jaj
Fast GreenFisher scientificF99-10Do wizualizacji iniekcji zapasów wirusowych
Zapłodnione białe jaja kurze leghornTexas A& M UniversityN/APreferowany model zwierzęcy do mikroiniekcji (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Płodowa surowica bydlęca (FBS)LaboratoriaDo hodowli komórkowej
Anty-mysie IgG sprzężone z fluoresceinąJackson ImmunoResearch115-095-003Do anty-FLAG  1:500
KleszczeFisherScientific22-327379Do przenoszenia rzeczy i izolacja
Kapilary szklaneSutter InstrumentsB100-75-10Szklana mikropipeta do mikroiniekcji (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm, długość 10 cm)
LipofectamineInvitrogenL3000001Do transfekcji
Ręczny pionowy ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP-30Aby uzyskać szklaną mikropipetę o odpowiednim rozmiarze
Probówkido mikrowirówekFisherScientific02-682-004Roztwór do rozpuszczania
MikroskopKeyenceBZ-X710Do barwienia
obrazowego ParafilmuFisherScientific03-448-254Roztwór do umieszczania
Penicylina / StreptomycynaInvitrogenDo hodowli komórkowych
Pico-InjectorAparat HarvardPLI-100Do precyzyjnego dostarczania małych objętości cieczy przez mikropipety poprzez zastosowanie regulowanego ciśnienia przez cyfrowo ustawiony okres czasu
królik anty-piskląt AQP0Self generated-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Klonowanie molekularne i charakterystyka funkcjonalna koneksyny światłowodowej soczewki pisklątej 45.6. Komórka Mol Biol. 1994 marzec; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
królicze przeciwciało anty-FLAGRockland Immunichemicals600-401-383Do barwienia FLAG
IgG anty-króliczej sprzężonej z rodaminą Jackson ImmunoResearch111-295-003Do anty-AQP0  1:500
Podkładka zaciskowa z gąbkąSutter InstrumentsBX10Do przechowywania szklanej mikropipety
hyklonowe

Bibliografia

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501(2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Retrowirus RCASmikroiniekcja do soczewki kurczakaembrionalny model kurczakarozw j soczewkitransfer gen wekspresja bia ek egzogennychkom rki w kien soczewkiznakowanie immunofluorescencyjneoddzia ywanie koneksyniniekcja mikropipet

Powiązane artykuły