Method Article

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste, które są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej. Ponieważ MSCs pochodzące z tkanek somatycznych są ograniczone przez ograniczoną dawstwo, różnice w jakości i bezpieczeństwo biologiczne, w ciągu ostatnich 10 lat nastąpił znaczny wzrost wysiłków na rzecz generowania MSCs z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Wcześniejsze i niedawne wysiłki zmierzające do różnicowania hiPSC w MSCs koncentrowały się na dwóch metodologiach hodowli: (1) tworzeniu ciał zarodkowych (EBs) oraz (2) zastosowaniu hodowli jednowarstwowej. Niniejszy protokół opisuje te dwie reprezentatywne metody wyprowadzania MSC z hiPSC. Każda metoda przedstawia swoje zalety i wady, w tym czas, koszt, zdolność do proliferacji komórek, ekspresję markerów MSC i ich zdolność do różnicowania in vitro. Protokół ten pokazuje, że obie metody mogą wyprowadzać dojrzałe i funkcjonalne MSC z hiPSC. Metoda monowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym, natomiast metoda EB charakteryzuje się mniejszym czasochłonnością.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z mezodermy1. MSCs są obecne w prawie wszystkich tkankach łącznych2. Odkąd MSCs zostały po raz pierwszy odkryte w latach siedemdziesiątych XX wieku i pomyślnie wyizolowane ze szpiku kostnego w 1987 roku przez Friedensteina i wsp.3,4,5, do izolowania MSCs wykorzystano różne ludzkie tkanki somatyczne (w tym płodowe i dorosłe), takie jak kości, chrząstki, ścięgna, mięśnie, tkanka tłuszczowa i zrąb podtrzymujący układ krwiotwórczy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konserwacja hiPSC

  1. Rozmrażanie hiPSC
    1. Wyjmij komórki z ciekłego azotu i szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrażające się komórki do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej z 3 ml pożywki konserwacyjnej iPSC (tabela materiałów). Delikatnie wymieszaj podłoże.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki konserwacyjnej iPSC z 10 μM Y-27632 (pipetować komórki w górę i w dół 2-3 razy).
    3. Przenieś zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą żelem macierzy zewnątr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem (Rysunek 1A), hiPSC zostały zróżnicowane na MSC za pomocą metod tworzenia EB i hodowli jednowarstwowej. Podczas różnicowania komórki wykazywały różne reprezentatywne morfologie (Rysunek 1B, C).

Jak pokazano w Rysunek 1B, kolonie hiPSC wykazują typową zwartą morfologię przed różnicowaniem z wyraźną obwódką złożoną z ciasno upakowanych komórek. Jednorodne kuliste EB powst.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole zbadano dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Obie metody pozwoliły na wyprowadzenie MSC z hiPSC. MSCs pochodzące z h.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni wszystkim członkom Laboratorium Mao i Hu, byłym i obecnym, za interesujące dyskusje i wielki wkład w projekt. Jesteśmy wdzięczni Narodowemu Centrum Badań Klinicznych nad Zdrowiem Dziecka za ogromne wsparcie. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidana Hu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (nr 1). LQ22C070004 do Lidana Hu).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do barwienia na czerwono AlizarynBeyotime  BiotechnologiaC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Kwas askorbinowySolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Wytrząsarka poziomu dwutlenku węglaKryształCO-06UC6
Koraliki kompensacyjneBioLegend424601
CryoStor CS10Technologia STEMCELL07959
DeksametazonBeyotime  BiotechnologiaST1254
DMEM/F12  mediumServicebioG4610
Płodowa surowica bydlęcaHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
ŻelatynaSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
kontrola izotypu ludzkiej IgG1 APCBioLegend403505
kontrola ludzkiego izotypu IgG1 FITCBioLegend403507
kontrola ludzkiego izotypu IgG1 PEBioLegend403503
Human TGF-β 1Stemcell78067
Ludzki TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  BiotechnologiaST1398
IndometacynaSolarbioSI9020
InsulinaBeyotime  BiotechnologiaP3376
Pożywka pielęgnacyjna iPSCTechnologia STEMCELL85850
ITS Suplement prasowyBeyotime  BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, obniżony czynnik wzrostuBD Corning354230
Zestaw do barwienia Oli Red OBeyotime  BiotechnologiaC0158S
ProlineSolarbioP0011
Pirogronian soduThermoFisher11360-070
TGFβ 3ZestawCJ44
SolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Ultra-Low Attachment 6-dołkowa płytkaCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHyclonSH30265
β-glicerofosforanSolarbioG8100
do barwienia błękitem toluidyny Novoprotein

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles