Artykuł metodologiczny

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

DOI:

10.3791/65729

⸱

20 października 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste, które są szeroko stosowane w medycynie regeneracyjnej. Ponieważ MSCs pochodzące z tkanek somatycznych są ograniczone przez ograniczoną dawstwo, różnice w jakości i bezpieczeństwo biologiczne, w ciągu ostatnich 10 lat nastąpił znaczny wzrost wysiłków na rzecz generowania MSCs z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Wcześniejsze i niedawne wysiłki zmierzające do różnicowania hiPSC w MSCs koncentrowały się na dwóch metodologiach hodowli: (1) tworzeniu ciał zarodkowych (EBs) oraz (2) zastosowaniu hodowli jednowarstwowej. Niniejszy protokół opisuje te dwie reprezentatywne metody wyprowadzania MSC z hiPSC. Każda metoda przedstawia swoje zalety i wady, w tym czas, koszt, zdolność do proliferacji komórek, ekspresję markerów MSC i ich zdolność do różnicowania in vitro. Protokół ten pokazuje, że obie metody mogą wyprowadzać dojrzałe i funkcjonalne MSC z hiPSC. Metoda monowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym, natomiast metoda EB charakteryzuje się mniejszym czasochłonnością.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) to dorosłe pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące z mezodermy1. MSCs są obecne w prawie wszystkich tkankach łącznych2. Odkąd MSCs zostały po raz pierwszy odkryte w latach siedemdziesiątych XX wieku i pomyślnie wyizolowane ze szpiku kostnego w 1987 roku przez Friedensteina i wsp.3,4,5, do izolowania MSCs wykorzystano różne ludzkie tkanki somatyczne (w tym płodowe i dorosłe), takie jak kości, chrząstki, ścięgna, mięśnie, tkanka tłuszczowa i zrąb podtrzymujący układ krwiotwórczy1,2,6,7. MSCs wykazują wysokie zdolności proliferacyjne i plastyczność, aby różnicować się w wiele linii komórek somatycznych i mogą migrować do uszkodzonych i zapalnych tkanek2,8,9. Te właściwości sprawiają, że MSCs są potencjalnym kandydatem na medycynę regeneracyjną10. Jednak MSC pochodzące z tkanek somatycznych (st-MSC) są ograniczone przez ograniczoną dawstwo, ograniczoną zdolność proliferacyjną komórek, różnice w jakości i obawy o bezpieczeństwo biologiczne w przypadku możliwego przenoszenia patogenów, jeśli takie występują, od dawców11,12.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) pochodzą z przeprogramowania dorosłych komórek za pomocą czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc), które pełnią podobne funkcje jak embrionalne komórki macierzyste13,14. Mogą się one samoodnawiać i mają potencjał różnicowania się w dowolny typ komórek somatycznych, w tym MSC. W porównaniu z st-MSC, iPSC-MSCs mają tę zaletę, że mają nieograniczoną podaż, niższy koszt, wyższą czystość, wygodę w kontroli jakości, łatwość produkcji na dużą skalę i modyfikację genów15,16,17.

Ze względu na te zalety iPSC-MSC, zgłoszono różne metody wyprowadzania MSC z iPSC. Te metody różnicowania koncentrowały się wokół dwóch metodologii hodowli: (1) tworzenia ciał zarodkowych (EBs) oraz (2) stosowania kultur jednowarstwowych11,18,19,20. W niniejszej pracy scharakteryzowano reprezentatywne podejście dla każdej z dwóch metodologii. Ponadto uzyskano dostęp do porównań między dwoma reprezentatywnymi podejściami opartymi na czasie, kosztach, zdolności proliferacyjnej, ekspresji biomarkerów MSC i zdolności różnicowania in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konserwacja hiPSC

  1. Rozmrażanie hiPSC
    1. Wyjmij komórki z ciekłego azotu i szybko rozmroź komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść rozmrażające się komórki do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej z 3 ml pożywki konserwacyjnej iPSC (tabela materiałów). Delikatnie wymieszaj podłoże.
    2. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki konserwacyjnej iPSC z 10 μM Y-27632 (pipetować komórki w górę i w dół 2-3 razy).
    3. Przenieś zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) i 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC z 10 μM Y-27632 dodanymi wcześniej (około 4 x 104 komórek/cm2).
    4. Hoduj komórki przez 5-6 dni (80%-90% konfluencji) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 z codzienną wymianą pożywek konserwacyjnych iPSC.
  2. Przejście hiPSC
    1. Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej. Umyj hiPSC raz za pomocą DPBS.
    2. Dodać 700-800 μl 0,48 mM roztworu EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie usunąć roztwór wytrawiający. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    3. Gdy komórki są trawione na arkusze (nie trawić komórek na pojedyncze komórki), dodaj 1 ml pożywki konserwującej iPSC z 10 μM Y-27632, aby zakończyć trawienie. Ostrożnie pipetuj komórki w górę i w dół 2-3 razy.
    4. Przenieś zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o zredukowanym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) i 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC z wcześniej dodanymi 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Współczynnik pasażowania waha się od 1:6 do 1:20 (około 4 x 104 komórki/cm2), a średnia wielkość agregacji wynosi około 50-200 μm.
    5. Hodować komórki do 80%-90% konfluencji (5-6 dni) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 z codzienną wymianą pożywek konserwacyjnych iPSC.

2. Odróżnianie MSC od hiPSC poprzez tworzenie EB

UWAGA: Metoda wywodzi się z poprzedniej literatury21,22,23,24. Przegląd metody jest zilustrowany w Rysunek 1. Charakterystykę metody podsumowano w tabeli 1.

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotować pożywkę różnicującą MSC, suplementując α-MEM 1% (v/v) GlutaMAX, 10% (v/v) FBS, 10 ng/ml FGF2 i 5 ng/ml TGFβ.
    2. Przygotować pożywkę podtrzymującą MSC, uzupełniając α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS i 1 ng/ml FGF2.
  2. Przygotowanie komórek hiPSC
    1. Linie hodowli hiPSC (przejście co najmniej 2-3 razy po rozmrożeniu) w pożywce podtrzymującej iPSC na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do zbiegu 80%-90%.
  3. Dzień 0: Formacja EB
    1. Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej. Umyj hiPSC raz za pomocą DPBS.
    2. Dodać 700-800 μl 0,48 mM roztworu EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć roztwór wytrawiający. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    3. Gdy komórki są trawione na arkusze (nie trawić komórek na pojedyncze komórki), dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej iPSC (zawierającej 10 μM inhibitora Rock i 1:100 GFR - żel macierzy zewnątrzkomórkowej), aby zakończyć trawienie.
    4. Przenieś komórki na 6-dołkową niską płytkę mocującą. Zasiać komórki w proporcji 2 dołki płytki do hodowli tkankowej na 1 dołek płytki o niskim przyłączeniu. Inkubować komórki w wytrząsarce (60 obr./min) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny, aby uzyskać kuliste EB.
  4. Dzień 1 – Dzień 7: Różnicowanie EB
    1. Przenieść EBs do probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura (bez niszczenia EBs) i pozostawić EBs do naturalnego osadzania się przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć supernatant.
    2. Przenieś EB na 6-dołkową płytkę o niskim stopniu mocowania z 2 ml pożywki różnicującej MSC. Hodować EB na wytrząsarce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 7 dni, zmieniając pożywkę jeden raz.
  5. Dzień 8 – Dzień 17: Szczepienie EB
    1. Przenieś EB do probówki wirówkowej za pomocą pipety Pasteura (bez niszczenia EBs) i pozwól EBs naturalnie osiadać przez 5-10 minut. Następnie usunąć supernatant.
    2. Przenieś EB na 6-dołkową płytkę pokrytą żelem z macierzą zewnątrzkomórkową GFR z 2 ml pożywki podtrzymującej MSC. Hodowla do 90% zbiegu (~10 dni) z regularną zmianą pożywki po adhezji komórek.
  6. Dzień 18 – Dzień 27: Dojrzewanie i ekspansja MSCs
    1. Kulturę pochodzącą z EB należy traktować roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut (czas trawienia różni się ze względu na obecność różnych typów komórek).
    2. Gdy część komórek zostanie strawiona na pojedyncze komórki, dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej MSC, aby zakończyć trawienie i przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Pozostałe niestrawione komórki należy raz przepłukać DPBS i ponownie strawić. Powtórz kilka razy, aż wszystkie komórki zostaną strawione na pojedyncze komórki. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
    3. Wysiewaj komórki na płytce hodowlanej pokrytej żelatyną (około 2 x 105 komórek/cm2). Hodowla do 90% zbieżności w pożywce podtrzymującej MSC z regularną wymianą pożywki. Oznacz tę generację komórek jako przejście 0 (P0) w tym momencie.
    4. Aby MSC był czysty i dojrzały, kontynuuj dwukrotne przechodzenie komórek w stosunku 1:3 w ciągu około 6 dni. Większość komórek ma morfologię podobną do fibroblastów (wrzecionowata).

3. Odróżnienie MSC od hiPSC dzięki hodowli jednowarstwowej

UWAGA: Metoda wywodzi się z poprzedniej literatury25,26,27,28. Przegląd tej metody jest zilustrowany w Rysunek 1. Charakterystykę metody podsumowano w tabeli 1.

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotować pożywkę konserwacyjną MSC, uzupełniając α-MEM 1% (v/v) GlutMAX, 10% (v/v) FBS i 1 ng/ml FGF2.
  2. Przygotowanie komórek hiPSC
    1. Linie hodowli hiPSC (pasaż co najmniej 2-3 razy po rozmrożeniu) w pożywce podtrzymującej iPSC na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej pokrytej żelem macierzy zewnątrzkomórkowej o obniżonym czynniku wzrostu (GFR) (1:100) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do 50%-60% konfluencji.
  3. Dzień 0 – Dzień 13: Różnicowanie przez bezpośrednie kultury jednowarstwowe
    1. Usunąć pożywkę konserwacyjną iPSC z płytki 6-dołkowej.
    2. Bezpośrednio dodać 2 ml pożywki konserwacyjnej MSC i hodować ją przez 14 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę codziennie.
  4. Dzień 14 – dzień 35: Dojrzewanie MSCs przez wielokrotne pasażowanie
    1. Kultury jednowarstwowe należy traktować roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut (czas trawienia różni się ze względu na obecność różnych typów komórek).
    2. Gdy komórki są trawione na pojedyncze komórki, dodaj 2 ml pożywki podtrzymującej MSC, aby zakończyć trawienie i przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Pozostałe niestrawione komórki należy raz przepłukać DPBS i ponownie strawić. Powtórz kilka razy, aż wszystkie komórki zostaną strawione na pojedyncze komórki. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
    3. Wysiewaj komórki na pokrytym żelatyną naczyniu hodowlanym (około 2 x 10,5 komórek/cm2). Hodowla do 90% zbieżności w pożywce podtrzymującej MSC z regularną wymianą pożywki. Oznacz tę generację komórek jako przejście 0 (P0) w tym momencie.
    4. Aby MSC był czysty i dojrzały, kontynuuj pasaż komórek 6 razy w stosunku 1:3 przez około 18 dni. Większość komórek ma morfologię podobną do fibroblastów (wrzecionowata).

4. Analiza antygenów powierzchniowych MSC napędzających hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Podobnie jak antygeny powierzchniowe MSC pochodzące ze szpiku kostnego, MSC napędzające hiPSC wyrażają CD105, CD73 i CD90, ale nie wyrażają CD45, CD3429. Ponadto hiPSC mogą być wykorzystywane jako komórki kontroli ujemnej. Analiza antygenów powierzchniowych MSC i hiPSC napędzających hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej jest pokazana na Rysunek 2.

  1. Potraktować MSCs napędzające hiPSC roztworem dysocjacyjnym w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty. Potraktować hiPSC odczynnikiem dysocjacyjnym EDTA 0,48 mM i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć odczynnik dysocjacyjny. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
  2. Gdy komórki są trawione na pojedyncze komórki, dodaj pożywkę (pożywkę podtrzymującą MSC do MSC i pożywkę podtrzymującą iPSC do iPSC), aby zakończyć trawienie.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.
  4. Umyj komórki raz zimnym DPBS, odwiruj przy 350 x g przez 5 minut, a następnie usuń supernatant.
  5. Policz i ponownie zawieś komórki w zimnym 10% roztworze FBS-DPBS (v/v) o stężeniu 10 x 106 komórek/ml i rozprowadź 100 μl/probówkę zawiesiny komórek (1 x 106 komórek/probówkę) do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 5 μl ludzkiego roztworu blokującego receptor Fc do 100 μl zawiesiny komórkowej. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aby wykonać niespecyficzne blokowanie.
  7. Wirować przy 350 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj komórki dwukrotnie zimnym 2% roztworem FBS-DPBS (v/v).
  8. Ponownie zawiesić komórki w zimnym 100 μl 2% roztworu FBS-DPBS (v/v).
  9. Dodać 5 μl (1 test) anty-CD34-FITC i 5 μl (1 test) anty-CD45-APC do 100 μl komórki
    Zawieszenie. Dodać 5 μl (1 test) anty-CD73-APC, 5 μl (1 test) anty-CD90-FITC i 5 μl (1 test) anty-CD105-PE do kolejnej probówki do zawieszania komórek o pojemności 100 μl. Dodać 5 μl ludzkiej kontrolnej izotypu IgG1 FITC, ludzkiej kontroli izotypu IgG1 PE i ludzkiej kontroli izotypu IgG1 APC do trzeciej probówki do zawieszania komórek o pojemności 100 μl. Inkubować przez 15-20 minut na lodzie w ciemności. W międzyczasie przygotuj pojedyncze koraliki barwiące.
  10. Umyj komórki dwukrotnie zimnym 2% roztworem FBS-DPBS (v/v).
  11. Dodaj 300 μl zimnego 2% roztworu FBS-DPBS (v/v) w celu ponownego zawieszenia komórek i przefiltruj przez filtr siatkowy o siatce 200.
  12. Analizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Przeanalizować zawiesinę komórkową wybarwioną przeciwciałami kontrolnymi izotypu i ustawić bramkę. Następnie przeanalizuj zawiesinę komórkową wybarwioną docelowymi przeciwciałami.

5. Osteogenne różnicowanie MSC napędzających hiPSC

UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania osteogennego (Rysunek 3A, B). Protokół różnicowania osteogennego podano poniżej.

  1. Przygotować osteogenną pożywkę indukcyjną, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 100 nM deksametazonu, 10 mM beta-glicerofosforanu i 100 μM kwasu askorbinowego.
  2. Wysiewaj 1 x 105 MSCs na pokrytą żelatyną 48-dołkową płytkę i hoduj, aż będzie zlewać się w 60%-70%.
  3. Usunąć pożywkę i dodać 0,3 ml osteogennej pożywki indukcyjnej. Hodować komórki w pożywce indukcyjnej osteogennej przez 14 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę co 3 dni.
  4. Usuń podłoże i raz umyj DPBS.
  5. Dodać 0,3 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  6. Usuń PFA. Przepłucz komórki 0,3 ml DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórz 3 razy.
  7. Usunąć DPBS, dodać 0,2 ml roztworu do barwienia czerwienią alizaryny i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usuń roztwór barwiący, przepłucz komórki 0,3 ml DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i powtórz 3 razy.
  9. Obserwuj barwienie osadzania się wapnia pod mikroskopem świetlnym.

6. Adipogenne różnicowanie MSC napędzających hiPSC

UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania adipogennego (Rysunek 3C, D). Protokół różnicowania adipogennego podano poniżej.

  1. Przygotować adipogenną pożywkę indukcyjną, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 1 μM deksametazon, 1 μM IBMX, 10 μg/ml insuliny i 100 μM indometacyny. Przygotować adipogenną pożywkę podtrzymującą, suplementując α-MEM 10% FBS i 10 μg/ml insuliny.
  2. Wysiewać 1 x 105 MSCs na pokrytą żelatyną 48-dołkową płytkę i hodować, aż gęstość komórek osiągnie 90%.
  3. Usuń pożywkę i dodaj 0,3 ml adipogennej pożywki indukcyjnej. Kontynuować hodowlę komórek w pożywce do indukcji adipogennej przez 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Usuń pożywkę i dodaj 0,3 ml adipogennej pożywki podtrzymującej. Kontynuować hodowlę komórek w adipogennej pożywce podtrzymującej przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Powtórz kroki 6.3 i 6.4 2-3 razy, aż do różnicowania i dojrzewania adipocytów.
  6. Usuń podłoże i raz umyj DPBS.
  7. Dodać 0,3 ml 4% PFA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć PFA i spłukać 2 razy DPBS.
  8. Nałóż barwnik Oli Red O zgodnie z instrukcją producenta i obserwuj kropelki lipidów pod mikroskopem świetlnym.

7. Chondrogenne zróżnicowanie MSC napędzających hiPSC

UWAGA: MSC napędzające hiPSC posiadają potencjał różnicowania chondrogennego (Rysunek 3E, F). Protokół różnicowania chondrogennego podano poniżej.

  1. Przygotować pożywkę indukcyjną chondroblastu, uzupełniając α-MEM 10% FBS, 100 nM deksametazonu, 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 10 μM kwasu askorbinowego, 1 mM pirogronianu sodu, 50 μg/ml proliny, 0,02 nM transformującego czynnika wzrostu β3 (TGFβ3) i 0,5 μg/ml białka morfogenetycznego kości 6 (BMP-6).
  2. Zebrać 2,5 x 105 MSC napędzających hiPSC i odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml α-MEM, a następnie odwirować przy 150 x g przez 5 minut.
  3. Usunąć supernatant i zawiesić komórki w 0,5 ml chondrogenicznej pożywki indukcyjnej. Odwirować komórki przy sile 150 x g przez 5 minut.
  4. Bezpośrednio odkręcić pokrywkę i hodowlę przez 21 dni z chondrogenną wymianą pożywki indukcyjnej co 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Delikatnie potrząśnij probówką wirówkową, aby zawiesić granulki chondrogenne (bez niszczenia granulek chondrogennych) każdego dnia podczas różnicowania chondrogennego.
  5. Usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć 0,5 ml PBS.
  6. Dodać 0,3 ml 4% PFA i utrwalać przez 24 godziny.
  7. Parafina zatapia chondrogenne granulki, a następnie je kroi (3 μm). Zabarwić skrawki na niebiesko toluidyną (1%) przez 30 minut.
  8. Obserwuj zewnątrzkomórkową macierz chondrocytów pod mikroskopem świetlnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem (Rysunek 1A), hiPSC zostały zróżnicowane na MSC za pomocą metod tworzenia EB i hodowli jednowarstwowej. Podczas różnicowania komórki wykazywały różne reprezentatywne morfologie (Rysunek 1B, C).

Jak pokazano w Rysunek 1B, kolonie hiPSC wykazują typową zwartą morfologię przed różnicowaniem z wyraźną obwódką złożoną z ciasno upakowanych komórek. Jednorodne kuliste EB powst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole zbadano dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na MSC 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Obie metody pozwoliły na wyprowadzenie MSC z hiPSC. MSCs pochodzące z h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni wszystkim członkom Laboratorium Mao i Hu, byłym i obecnym, za interesujące dyskusje i wielki wkład w projekt. Jesteśmy wdzięczni Narodowemu Centrum Badań Klinicznych nad Zdrowiem Dziecka za ogromne wsparcie. Badania te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidana Hu), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (nr 1). LQ22C070004 do Lidana Hu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do barwienia na czerwono AlizarynBeyotime  BiotechnologiaC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Kwas askorbinowySolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Wytrząsarka poziomu dwutlenku węglaKryształCO-06UC6
Koraliki kompensacyjneBioLegend424601
CryoStor CS10Technologia STEMCELL07959
DeksametazonBeyotime  BiotechnologiaST1254
DMEM/F12  mediumServicebioG4610
Płodowa surowica bydlęcaHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
ŻelatynaSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
kontrola izotypu ludzkiej IgG1 APCBioLegend403505
kontrola ludzkiego izotypu IgG1 FITCBioLegend403507
kontrola ludzkiego izotypu IgG1 PEBioLegend403503
Human TGF-β 1Stemcell78067
Ludzki TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  BiotechnologiaST1398
IndometacynaSolarbioSI9020
InsulinaBeyotime  BiotechnologiaP3376
Pożywka pielęgnacyjna iPSCTechnologia STEMCELL85850
ITS Suplement prasowyBeyotime  BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, obniżony czynnik wzrostuBD Corning354230
Zestaw do barwienia Oli Red OBeyotime  BiotechnologiaC0158S
ProlineSolarbioP0011
Pirogronian soduThermoFisher11360-070
TGFβ 3ZestawCJ44
SolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Ultra-Low Attachment 6-dołkowa płytkaCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHyclonSH30265
β-glicerofosforanSolarbioG8100
do barwienia błękitem toluidyny Novoprotein

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One name, multiple identities. Cell Stem Cell. 28 (10), 1690-1707 (2021).
  3. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Gerasimov, U. V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell and Tissue Kinetics. 20 (3), 263-272 (1987).
  4. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Experimental Hematology. 2 (2), 83-92 (1974).
  5. Friedenstein, A. J., Gorskaja, J. F., Kulagina, N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology. 4 (5), 267-274 (1976).
  6. El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
  7. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  8. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  9. Regmi, S., et al. Enhanced viability and function of mesenchymal stromal cell spheroids is mediated via autophagy induction. Autophagy. 17 (10), 2991-3010 (2021).
  10. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 272(2022).
  11. Jiang, B., et al. Concise review: Mesenchymal stem cells derived from human pluripotent cells, an unlimited and quality-controllable source for therapeutic applications. Stem Cells. 37 (5), 572-581 (2019).
  12. Soontararak, S., et al. Mesenchymal stem cells (MSC) derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) equivalent to adipose-derived MSC in promoting intestinal healing and microbiome normalization in mouse inflammatory bowel disease model. Stem Cells Translational Medicine. 7 (6), 456-467 (2018).
  13. Di Baldassarre, A., Cimetta, E., Bollini, S., Gaggi, G., Ghinassi, B. Human-induced pluripotent stem cell technology and cardiomyocyte generation: Progress and clinical applications. Cells. 7 (6), 48(2018).
  14. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  15. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), eaba6884(2020).
  16. Zhao, C., Ikeya, M. Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2018, 9601623(2018).
  17. Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells. Metabolism. 90, 1-15 (2019).
  18. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (22), e3080(2018).
  19. Hua, Z., et al. Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778(2022).
  20. Dupuis, V., Oltra, E. Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).
  21. Zhang, W., et al. Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging. Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).
  22. Liu, G. H., et al. Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs. Nature Communications. 5, 4330(2014).
  23. Kubben, N., et al. Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging. Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).
  24. Duan, S., et al. PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype. Nature Communications. 6, 10068(2015).
  25. Zhang, J., et al. Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis. Journal of Translational Medicine. 13, 49(2015).
  26. Hu, G. W., et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 10(2015).
  27. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 144(2015).
  28. Wang, L. T., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells. Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).
  29. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  30. Kim, S., Kim, T. M. Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles. World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie cia embrionalnychhodowla monowarstwowar nicowanie MSCcytometria przep ywowar nicowanie osteogennemorfologia wrzecionowatamarkery MSCmedycyna regeneracyjna

Powiązane artykuły