Artykuł metodologiczny

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/65733

⸱

27 października 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlaki sygnałowe koordynują podstawowe procesy biologiczne, w tym rozwój, regenerację, homeostazę i choroby. Metody eksperymentalnego manipulowania sygnalizacją są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób sygnalizacja jest interpretowana w tych szerokich kontekstach. Molekularne narzędzia optogenetyczne mogą zapewnić odwracalne, przestrajalne manipulacje aktywnością szlaku sygnałowego z wysokim stopniem kontroli czasoprzestrzennej i były stosowane in vitro, ex vivo i in vivo. Narzędzia te łączą domeny białek reagujących na światło, takie jak homodimeryzująca domena wykrywania napięcia tlenu (LOV) światła niebieskiego, z efektorami sygnalizacyjnymi, aby zapewnić zależną od światła eksperymentalną kontrolę nad sygnalizacją. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania białka morfogenetycznego kości (BMP) opartego na LOV i węzłowych aktywatorów sygnalizacji bOpto-BMP i bOpto-Nodal w optycznie dostępnym wczesnym zarodku danio pręgowanego. Opisano w nim dwa eksperymenty kontrolne: szybki test fenotypowy w celu określenia odpowiednich warunków eksperymentalnych oraz test immunofluorescencyjny w celu bezpośredniej oceny sygnalizacji. Łącznie te eksperymenty kontrolne mogą pomóc w ustaleniu metody wykorzystania narzędzi optogenetycznych we wczesnych zarodkach danio pręgowanego. Strategie te stanowią potężną platformę do badania ról sygnalizacji w rozwoju, zdrowiu i fizjologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szlaki sygnałowe pozwalają komórkom reagować na środowisko i koordynować działania w skali tkanek i organizmów. Sygnały kluczowe dla rozwoju embrionalnego obejmują członków nadrodziny TGF-beta białko morfogenetyczne kości (BMP) i Nodal1,2,3. Podczas embriogenezy szlaki regulowane przez te i inne sygnały kształtują plan organizmu, kontrolując ekspresję genów i dodatkowe procesy, aby zapewnić prawidłowy rozwój i interfejs różnych tkanek i narządów. Patologie, w tym wady wrodzone i nowotwory, mogą wystąpić, gdy sygnalizacja lub reakcje na sygnalizację są zaburzone4,5,6,7. Pomimo rygorystycznych badań nad sygnalizacją, wiele pozostaje do odkrycia na temat tego, jak poziomy i dynamika są dekodowane w różnych kontekstach8,9,10,11, zwłaszcza podczas rozwoju12,13,14,15,16,17,18,19.

Aby zrozumieć, jak dekodowane jest sygnalizacja, idealnym eksperymentem byłoby manipulowanie poziomami sygnalizacji, czasem i/lub dynamiką - z wysokim stopniem kontroli przestrzennej i czasowej - i ocena wyników. Na przykład, zaproponowano precyzyjne gradienty sygnalizacji przestrzennej do tworzenia wzorców rozwijających się tkanek20,21. Zmiana rozkładów przestrzennych gradientu sygnalizacji pomogłaby przetestować tę hipotezę22. Ponadto znaczenie dynamiki sygnalizacji w generowaniu różnorodnych odpowiedzi komórkowych staje się coraz jaśniejsze: ten sam szlak sygnałowy może instruować komórki, aby różnicowały się lub proliferowały w zależności od częstotliwości sygnalizacji, na przykład9,23. Paradygmaty eksperymentalne, w których można łatwo manipulować dynamiką sygnalizacji, będą cenne dla zbadania związku między dynamiką a decyzjami dotyczącymi losu komórki8,12,13,14,15.

Historycznie rzecz biorąc, wiele metod było używanych do manipulowania sygnalizacją w kontekstach rozwojowych, prowadząc do fundamentalnych odkryć1,2,3. Sygnalizacja może być zablokowana za pomocą mutantów utraty funkcji szlaku, ektopowej ekspresji inhibitora lub leków antagonistycznych. Metody aktywacji sygnalizacji obejmują leki agonistyczne, rekombinowane ligandy, ektopową ekspresję ligandów lub konstytutywnie aktywnych receptorów oraz mutanty powodujące utratę funkcji inhibitora szlaku. Metody te obejmują kontinuum kontroli eksperymentalnej. Na przykład, mutanty i ekspresja ektopowa mogą znajdować się po stronie młota kowalskiego kontinuum: przy tych podejściach dramatyczne, ogólnoustrojowe zmiany w aktywności szlaku mogą powodować przedwczesną śmierć i uniemożliwiać badania na późniejszych etapach lub z czasem mogą skutkować efektami plejotropowymi, które są trudne do rozplątania. Ponadto często trudno jest samodzielnie manipulować jedną cechą sygnalizacyjną na raz, taką jak poziom lub czas trwania. Na drugim końcu kontinuum niektóre metody oferują bardziej precyzyjną kontrolę eksperymentalną, takie jak urządzenia mikroprzepływowe, które wystawiają próbki na działanie leków lub rekombinowanych białek z kontrolą czasową, a czasem przestrzenną18,24,25, lub metody genetyczne, w tym promotory indukowane szokiem cieplnym i specyficzne tkankowo, które mogą oferować podobne korzyści16,26,27. Jednak metody te mogą być trudne do wykonania, mogą nie być odwracalne, mogą mieć stosunkowo niską kinetykę lub słabą rozdzielczość i mogą być niedostępne w niektórych systemach modelowych.

Molekularne podejścia optogenetyczne są potężnym dodatkiem do tego zestawu narzędzi. Podejścia te wykorzystują białka, które reagują na różne długości fal świetlnych, do manipulowania procesami biologicznymi, w tym sygnalizacją8,12,13,14,15, i były rozwijane przez dziesięciolecia do użytku w różnych systemach, od hodowli komórkowych po całe zwierzęta12,13,28. W porównaniu z historycznymi podejściami, optogenetyka molekularna może często oferować wyższy stopień czasoprzestrzennej kontroli nad procesami biologicznymi: Kontrolerem w systemach optogenetycznych jest światło, a kontrola długości fali, intensywności, czasu trwania i częstotliwości ekspozycji światła jest stosunkowo prosta. Dzięki zaawansowanym systemom, takim jak mikroskopy konfokalne i dwufotonowe, możliwa jest kontrola przestrzenna w zakresie subkomórkowym29,30,31. Narzędzia do optycznego manipulowania sygnalizacją zostały opracowane i zastosowane w kilku systemach, w tym opisanych w Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33, oraz Huang et al.34. Na przykład, wykorzystując kontrolę przestrzenną zapewnianą przez optogenetykę, strategia ta została niedawno wykorzystana do modyfikacji gradientu sygnałowego w zarodkach Drosophila, wykazując, że embriogeneza much jest zaskakująco odporna na zmiany w tym gradiencie22. Odwracalność i kinetyka szybkiego włączania/wyłączania optogenetycznych aktywatorów sygnalizacji sprawiły, że są one również atrakcyjnymi narzędziami do badania dekodowania dynamiki sygnalizacji8,12,13,14,15,34,35,36.

Wczesny zarodek danio pręgowanego to system in vivo dobrze nadający się do badań optogenetycznych, ponieważ jest zewnętrznie zapłodniony, przezroczysty, przyjazny dla mikroskopu i genetycznie podatny. Ekspozycja na światło jest łatwiejsza do dostarczenia do zarodków, które rozwijają się poza matką, światło może przenikać i uzyskiwać dostęp do ich nieprzezroczystych tkanek, żywe zarodki danio pręgowanego dobrze tolerują obrazowanie (oprócz tego, że są przezroczyste), a istniejące metody genetyczne zapewniają proste możliwości eksperymentów z knockdownem i nadekspresją, oprócz rozwoju użytecznych transgeników37.

Ostatnio opracowano narzędzia optogenetyczne do aktywacji BMP38 i Nodal39 sygnalizacji u embrionów danio pręgowanego z ekspozycją na niebieskie światło (Rysunek 1). Odnosimy się do tych narzędzi jako bOpto-BMP i bOpto-Nodal (b dla aktywowanego niebieskim światłem i Opto dla optycznego). bOpto-BMP/Nodal opierają się na podobnych mechanizmach aktywacji szlaku. Wiązanie ligandów BMP lub węzłowych z odpowiednimi receptorowymi kinazami serynowo-treoninowymi napędza interakcje domen kinazy receptorowej, które prowadzą do fosforylacji efektorów sygnałowych (Smad1/5/9 dla BMP i Smad2/3 dla węzłowych). Fosforylowane efektory sygnalizacyjne następnie przemieszczają się do jądra i regulują ekspresję docelowego genu3 (Rysunek 1A,D). Te interakcje kinaz receptorowych mogą reagować na światło poprzez sprzęganie kinaz receptorowych z białkami dimeryzującymi reagującymi na światło: Pod wpływem światła te chimeryczne białka powinny ulegać dimeryzacji, powodując interakcję domen kinazy receptorowej i aktywację sygnalizacji (Rysunek 1B, C, E, F). Co ważne, w przeciwieństwie do receptorów endogennych, bOpto-BMP/Nodal nie zawierają zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligandy, zapewniając aktywność niezależną od liganda (Rysunek 1C, F). Ta strategia aktywacji optogenetycznej została po raz pierwszy osiągnięta za pomocą receptorowych kinaz tyrozynowych40,41,42, a następnie zastosowana do receptorowych kinaz serynowo-treoninowych.

bOpto-BMP/Nodal używają reagującego na niebieskie światło (~450 nm) homodimeryzującego sensoru światło-tlenu-napięcia (LOV) z alg Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. Konstrukty te składają się z motywu mirystoylacji ukierunkowanego na błonę, po którym następują domeny BMP lub kinazy receptora węzłowego, połączone z domeną LOV (Figura 1B, E). Ekspozycja na światło niebieskie powinna powodować homodimeryzację LOV, co skutkuje interakcjami domen kinazy receptorowej, które prowadzą do odpowiedniej fosforylacji Smad i aktywacji szlaku (Rysunek 1C, F). W przypadku bOpto-BMP stwierdzono, że połączenie konstruktów z domenami kinazy receptora typu I z Acvr1l (znanego również jako Alk8) i BMPR1aa (znanego również jako Alk3) oraz domeny kinazy receptorowej typu II z BMPR2a optymalnie aktywuje sygnalizację38 (Addgene #207614, #207615 i #207616). Dla bOpto-Nodal stosuje się kombinację konstruktów z domeną kinazy receptorowej typu I z Acvr1ba i domeną kinazy receptorowej typu II z Acvr2ba39.

bOpto-BMP/Nodal zostały wprowadzone do wczesnych zarodków danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie mRNA na etapie jednokomórkowym i wykorzystane do zbadania roli czasu trwania sygnalizacji w interpretacji węzłowej39, aby określić, dlaczego danio pręgowany traci zdolność do reagowania na Nodal45, oraz zbadać, jak docelowe geny BMP reagują na różne poziomy sygnalizacji BMP38. Jest prawdopodobne, że narzędzia te będą nadal przydatne w różnych przyszłych dochodzeniach. Jednak siła aktywatorów sygnalizacji optogenetycznej jest również ich słabością: próbki wrażliwe na światło muszą być traktowane ostrożnie, aby uniknąć niezamierzonej ektopowej aktywności sygnalizacyjnej. Ekspozycja na światło słoneczne w pomieszczeniu lub światło słoneczne może aktywować bOpto-BMP/Nodal.

Ten protokół dostarcza praktycznych sugestii dotyczących stosowania kodowanych przez mRNA BMP opartych na LOV i aktywatorów węzłowych we wczesnych zarodkach danio pręgowanego. Zaczyna się od wyszczególnienia jednej ze strategii budowy lightboxa do kontrolowania jednolitej ekspozycji na światło i temperatury (Rysunek 2, Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4, Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6, Plik uzupełniający 7, Plik uzupełniający 8). Następnie opisano dwa kluczowe eksperymenty kontrolne, które określają, czy aktywator sygnalizacji optogenetycznej zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami - tj. aktywuje aktywność szlaku tylko wtedy, gdy jest wystawiony na działanie światła (Rysunek 3). Pierwszy test kontrolny polega na badaniu fenotypów w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu w zarodkach wystawionych na światło i nienaświetlonych (Figura 3A). Zarodki poddane wstrzyknięciu mRNA naświetlone światłem, ale nie zarodki nienaświetlone, powinny fenoskopować BMP lub nadekspresję węzłową (Figura 4A,B; W szczególności fenotypy BMP są wyraźnie rozróżnialne w tym momencie46). Ten test zapewnia szybki odczyt aktywności. W drugim teście kontrolnym, w celu określenia, czy fenotypy są spowodowane specyficznie przez nadmierną sygnalizację BMP lub sygnalizację węzłową i bezpośrednią obserwację zmiany poziomów sygnalizacji, barwienie immunofluorescencyjne stosuje się do wykrywania fosforylowanych efektorów sygnalizacyjnych (odpowiednio pSmad1/5/9 lub pSmad2/3) po 20-minutowej ekspozycji na światło w późnym stadium blastuli / wczesnej gastrulacji, gdy aktywność sygnalizacyjna została dobrze opisana12, 16,17,47,48,49,50 (Rysunek 3B i Rysunek 4C). (Zauważ, że chociaż aktywacja zlokalizowana przestrzennie została zademonstrowana zarówno dla bOpto-BMP38, jak i bOpto-Nodal39, ten protokół opisuje tylko jednolitą ekspozycję na światło i strategie aktywacji sygnalizacji.) Zaleca się przeprowadzenie tych eksperymentów kontrolnych przed zastosowaniem bOpto-BMP/Nodal do konkretnych pytań badawczych w celu określenia idealnych lokalnych warunków eksperymentalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły badań nad danio pręgowanym zostały przejrzane i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NICHD w Narodowym Instytucie Zdrowia (ASP 21-008). Wszystkie badania nad danio pręgowanym przeprowadzono zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich użytkowania.

1. Budowa lightboxa

  1. Aby kontrolować ekspozycję na światło i temperaturę, skonstruuj kaseton świetlny, który wykorzystuje oświetlacz mikropłytki z diodą elektroluminescencyjną (LED) jako źródło światła (Rysunek 2A, Tabela materiałów, Plik uzupełniający 1 , Plik uzupełniający 2). Ten konfigurowalny iluminator zapewnia dynamiczną, programowalną kontrolę nad wieloma długościami fal.
    UWAGA: Istnieje wiele możliwych strategii budowania lightboxa, a alternatywne podejście może być bardziej odpowiednie (zobacz np. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash53 i więcej na https://www.optobase.org/materials/).
  2. Uwzględnij następujące funkcje w kasecie świetlnej: kontrola temperatury (28 °C jest idealna dla zarodków danio pręgowanego), wykluczenie niepożądanego światła (np. światła w pomieszczeniu i światła słonecznego), równomierne dostarczanie niebieskiego światła, które pokrywa obszar docelowy (np. płytka 6-dołkowa) oraz kontrola natężenia światła i dynamiki ekspozycji.
    UWAGA: bOpto-BMP/Nodal są aktywowane przez niebieskie światło, ale niektóre narzędzia optogenetyczne reagują na inne długości fal. Użyj odpowiedniej długości fali dla narzędzia optogenetycznego.
  3. Wywierć otwór w górnej części inkubatora (Rysunek 2B), który jest nieco szerszy niż soczewka wyjściowa LED.
    1. Upewnij się, że w górnej części inkubatora nie ma żadnych elementów elektrycznych, które zostaną zniszczone podczas wiercenia (tabela materiałów). Można to ustalić, kontaktując się z producentem inkubatora i pytając bezpośrednio.
    2. Jeśli na górnym panelu inkubatora znajduje się otwór, użyj wiertła stopniowego, aby zwiększyć rozmiar otworu do 1.25 cala. W przeciwnym razie użyj otwornicy 1.25 cala z trzpieniem.
    3. Jeśli istnieją wewnętrzne panele, które blokują źródło światła, wywierć otwór o odpowiednim rozmiarze, aby upewnić się, że stożek świetlny nie jest zablokowany (Rysunek 2A). Panele są zwykle wykonane z cienkiej blachy, więc używaj niskich prędkości i wierteł do metalu, aby zapobiec uszkodzeniom (zalecane wiertło kobaltowe).
  4. Skonstruuj uchwyt LED, aby przymocować oświetlacz mikropłytki LED do górnej części inkubatora (Rysunek 2C, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4, Plik uzupełniający 5, Plik uzupełniający 6, Plik uzupełniający 7, Plik uzupełniający 8).
    1. Zamontuj cztery wsporniki sześcienne M3 do pionowego wspornika za pomocą M3.
    2. Przymocuj dwa boczne wsporniki po lewej i prawej stronie wsporników sześciennych wspornika pionowego. Zamontuj kolejny wspornik kostki do pozostałego otworu w bocznych wspornikach.
    3. Zamontuj pionowy wspornik do zespołu oświetlacza mikropłytki LED (tabela materiałów) za pomocą M6. Umieść uszczelkę soczewki LED na soczewce systemu LED.
    4. Zamontuj zmontowane elementy do montażu panelowego inkubatora, a następnie do wsporników M3 na wspornikach pionowych i bocznych. Umieść uszczelkę inkubatora nad wywierconym otworem w górnej części inkubatora.
    5. Umieść uchwyt panelowy inkubatora na uszczelce inkubatora, upewniając się, że uszczelka i otwory panelu są koncentryczne z otworem inkubatora. Zamontuj panel do górnej części inkubatora za pomocą nr 8. Upewnij się, że ta uszczelka jest światłoszczelna.
  5. Umieść 6-dołkową płytkę na górnej półce inkubatora. Określ, czy wiązka światła równomiernie pokrywa płytkę (Rysunek 2A). Użyj kartki papieru, aby zwizualizować pokrycie światłem.
  6. Jeśli cała płyta nie jest pokryta wiązką, zwiększ odległość między diodą LED a płytą, przesuwając półkę w dół. Dla opisanego tutaj systemu wystarczy ~14 cali między diodą LED a półką.
  7. Użyj światłomierza, aby określić poziom natężenia promieniowania i jednorodność przestrzenną (Tabela materiałów).
  8. Aby uniknąć przypadkowego nasłonecznienia i ekspozycji na światło w pomieszczeniu, użyj izolacji pogodowej, aby upewnić się, że drzwi inkubatora są szczelne (Rysunek 2A).
  9. Zarodki danio pręgowanego rozwijają się prężnie w temperaturze 28 °C54. Użyj termometru z karty pamięci, aby upewnić się, że kaseton świetlny utrzymuje temperaturę 28 °C.

2. Generowanie mRNA do iniekcji

UWAGA: pCS2+ jest szkieletem wektorowym dla konstrukcji bOpto-BMP38 i bOpto-Nodal constructs39. Ten wektor jest odporny na ampicylinę. bOpto-BMP składa się z trzech konstruktów (Rysunek 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Przypuszczalna domena kinazy receptora BMPR1aa typu I (znanego również jako Alk3) połączonego z LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Przypuszczalna domena kinazy receptora Acvr1l typu I (znanego również jako Alk8) połączonego z LOV; i BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): Przypuszczalna domena kinazy receptora BMPR2a typu II i następująca po niej domena C-końcowa połączona z LOV. bOpto-Nodal składa się z dwóch konstruktów (Rysunek 1E): Acvr1ba-LOV: Przypuszczalna domena kinazy receptora Acvr1ba typu I (znanego również jako Acvr1b) połączonego z LOV; Acvr2ba-LOV: Przypuszczalna domena kinazy receptora Acvr2ba typu II (znanego również jako Acvr2b) połączonego z LOV.

  1. Aby zlinearyzować plazmidy, trawić od 2 do 5 μg plazmidowego DNA za pomocą enzymu restrykcyjnego NotI w temperaturze 37 °C przez 1-3 godziny (tabela materiałów).
    UWAGA: Możliwe jest również wygenerowanie zlinearyzowanego DNA przy użyciu plazmidu jako matrycy PCR.
  2. Oczyść DNA za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania opartego na kolumnie (tabela materiałów).
  3. Użyj zestawu do transkrypcji SP6 in vitro, takiego jak zestaw mMessage mMachine, aby dokonać transkrypcji RNA ze zlinearyzowanego szablonu (Tabela materiałów). Ustaw dwie reakcje zgodnie z zaleceniami producenta, aby zapewnić wyższą wydajność.
  4. Oczyść RNA za pomocą standardowego zestawu do czyszczenia RNA opartego na kolumnie (tabela materiałów). Możliwe jest również oczyszczanie przez wytrącanie.

3. Wstrzykiwanie mRNA

  1. Co najmniej 1 dzień przed wstrzyknięciem należy przygotować naczynia iniekcyjne i 6-dołkowe płytki pokryte agarozą.
    1. Przygotuj 200 ml 1% agarozy w pożywce dla zarodków danio pręgowanego i mikrofaluj, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Dopuszczalna powinna być każda standardowa pożywka dla zarodków danio pręgowanego; Należy jednak wykluczyć błękit metylenowy z pożywki zarodkowej, ponieważ może on wpływać na dalsze obrazowanie w innych zastosowaniach.
    2. Ostrożnie wlej stopioną agarozę do plastikowych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Napełnij naczynia do połowy.
    3. Opłucz formę naczynia do iniekcji pożywką dla zarodków i delikatnie umieść na stopionej agarozie, upewniając się, że między pleśnią a agarozą nie utknęły pęcherzyki. Użyj taśmy, aby zrobić zakładkę z tyłu formy, aby ułatwić umieszczanie i pobieranie.
    4. Pleśń powinna unosić się w stopionej agarozie. Jeśli pleśń tonie, ostrożnie wyjmij ją ze stopionej agarozy i powtórz krok 3.1.3.
    5. Po zastygnięciu agarozy użyj tabletki, aby delikatnie usunąć pleśń. Można to przyspieszyć, umieszczając naczynie w temperaturze 4 °C.
    6. Wykonaj 6-dołkowe płytki pokryte agarozą, jeśli pracujesz z zarodkami pozbawionymi chorówki do eksperymentów immunofluorescencyjnych.
    7. Użyj jednorazowej plastikowej pipety o pojemności 10 ml, aby przenieść wystarczającą ilość stopionej agarozy, aby pokryć dno każdej studzienki 6-dołkowej płytki.
    8. Przechowywać naczynia iniekcyjne i płytki 6-dołkowe w temperaturze 4 °C. Można je stosować natychmiast lub przechowywać do momentu wysuszenia lub zanieczyszczenia agarozy (zwykle 2-3 tygodnie).
    9. Przygotuj końcówki pipet z płomieniowanego szkła, jeśli pracujesz z zarodkami pozbawionymi naskórkówki, do eksperymentów immunofluorescencyjnych.
    10. Włóż końcówkę szklanej pipety do płomienia palnika Bunsena i obracaj w sposób ciągły, aż krawędzie będą gładkie. Zarodki z odkorzą muszą wygodnie zmieścić się na końcu pipety. Nie pozwól, aby otwór skurczył się poniżej średnicy zarodka.
    11. Kup lub wyciągnij igły do mikroiniekcji (tabela materiałów). Wskazane jest, aby w dniu wstrzyknięcia mieć pod ręką dodatkowe igły na wypadek, gdyby konieczna była wymiana.
  2. Dzień przed wstrzyknięciami należy ustawić hodowców danio pręgowanego zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP) instytutu. Trzymaj samce i samice oddzielnie.
    1. Włącz regulator temperatury kasetonu, aby utrzymać 28 °C. Aby upewnić się, że temperatura kasetonu pozostaje na poziomie 28 °C, monitoruj temperaturę za pomocą termometru z karty pamięci (tabela materiałów).
    2. Przygotuj mieszaninę (mieszaniny) do wstrzykiwań mRNA. Wstrzyknij równomolowe ilości każdego konstruktu. Konieczne jest empiryczne określenie, jaką ilość należy wstrzyknąć.
    3. Rozmiary transkrypcji bOpto-BMP są następujące:
      Acvr1l-LOV = 2007 nukleotydy (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. Aby wstrzyknąć ilości równomolowe, wstrzyknij 1,01 razy więcej konstruktu Acvr1l niż BMPR1aa; wstrzyknij 1,72 razy więcej konstruktu BMPR2a niż BMPR1aa.
    5. Rozmiary transkrypcji bOpto-węzłowej są następujące:
      Acvr1ba-LOV i Acvr2ba-LOV pochodzą z 1962 roku.
    6. Aby wstrzyknąć ilości równomolowe, wstrzyknij taką samą ilość każdego konstruktu.
    7. Przygotuj równomolowe mieszaniny iniekcyjne, łącząc wszystkie mRNA ukierunkowane na jedną ścieżkę w jedną mieszankę iniekcyjną. W razie potrzeby dołącz znacznik do wstrzykiwań czerwieni fenolowej. Dla danych pokazanych w Rysunek 4, użyto 15 pg każdego konstruktu bOpto-Nodal (Acvr1ba-LOV i Acvr2ba-LOV), a dla bOpto-BMP użyto 7,8 pg Acvr1l-LOV i BMPR1aa-LOV oraz 13,4 pg BMPR2a-LOV.
    8. Mieszaniny iniekcyjne przechowywać w temperaturze -20 °C. Po ustaleniu optymalnego stężenia mieszaniny iniekcyjnej należy przygotować 5-10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
  3. Dzień iniekcji
    1. Jeśli wykonujesz test fenotypowy (Rysunek 3A), wstrzyknij przez kosmówkę bezpośrednio do środka komórki na etapie jednokomórkowym zgodnie z SOP twojego laboratorium. Kosmówka chroni zarodki przed stresorami środowiskowymi i utrzymuje zarodki poddane lizie w zamknięciu. Jest to pomocne podczas punktacji w celu dokładnej kwantyfikacji zlizowanych zarodków (Rysunek 4A,B).
    2. Jeśli wykonujesz test immunofluorescencyjny (Rysunek 3B), zarodki ostatecznie będą musiały zostać zdechorionowane do obrazowania (Rysunek 4C). W związku z tym należy wstrzyknąć bezpośrednio do środka komórki zarodków z odciętą kosmówką w stadium jednokomórkowym (patrz Rogers et al.55 dla protokołu dechorionacji). Alternatywnie, zarodki mogą być ręcznie dechorionowane po utrwaleniu, ale jest to bardziej kłopotliwe niż dechorionacja za pomocą pronazy.
    3. Do postępowania z zarodkami z odciętą kosmówką należy używać pipet ze szkła płomiennego (krok 3.1.10). Należy uważać, aby nie wystawiać zarodków z odkorionowaną zarodkami na działanie powietrza lub plastiku, co spowoduje lizę zarodków. Z zarodkami z odciętą chorągiewką należy obchodzić się delikatnie.
    4. Przygotuj dodatkowe naczynie z zarodkami bez wstrzyknięć jako wskaźnik zastępczy do oceny postępu etapu (patrz krok 4.3.5). Upewnij się, że zarodki zastępcze pochodzą z tego samego zestawu zarodków doświadczalnych, tak aby wszystkie zarodki zostały zapłodnione w tym samym czasie od tych samych rodziców. Jest to przydatne w teście immunofluorescencyjnym, w którym stopień zaawansowania jest istotny, ale nie jest konieczne w przypadku testu fenotypowania.
    5. Zarówno dla testów fenotypowania, jak i immunofluorescencji należy zastosować następujące warunki: 1) bez wstrzyknięć, bez ekspozycji, 2) bez wstrzyknięć, wystawiony na działanie światła, 3) wstrzyknięty, nienaświetlony, 4) wstrzyknięty, wystawiony na działanie światła. Wybierz co najmniej 30 zarodków w każdym stanie. Aby uzyskać optymalne zdrowie zarodków, nie należy inkubować więcej niż 30 zarodków na studzienkę na płytce 6-dołkowej.
    6. Po wstrzyknięciu przenieść zarodki na znakowane szalki Petriego lub 6-dołkowe płytki pokryte agarozą (w przypadku zarodków z dekoryzacją) i inkubować w temperaturze 28 °C. Zarodki nie są jeszcze wrażliwe na światło. Traktuj wstrzyknięte zarodki tak, jakby były wrażliwe na światło po 1,5 godziny po zapłodnieniu (hpf).

4. Eksperyment z ekspozycją na światło

UWAGA: Ekspozycja na światło ~450 nm o natężeniu promieniowania 45 W/m2 zdecydowanie aktywuje bOpto-BMP/Nodal bez oczywistej fototoksyczności (informacje o światłomierzu, patrz Tabela Materiałów). Poziom sygnalizacji aktywowanej optogenetycznie można dostroić, zmieniając wartości natężenia promieniowania38. Jednak fototoksyczność będzie musiała być oceniana przy wyższych natężeniach promieniowania.

  1. Krok wrażliwy na czas. Na etapie od 4 do 16 komórek, około 1,5 hpf, usuń niezapłodnione i niezdrowe zarodki. W razie potrzeby dokonać redystrybucji, aby zapewnić taką samą liczbę zarodków w każdym basenie (nie więcej niż 30).
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok na etapie od 4 do 16 komórek, ponieważ zarodki staną się wrażliwe na światło, gdy wstrzyknięte mRNA zostanie przekształcone w białko. Nie zaobserwowaliśmy dowodów na to, że zarodki są znacząco wrażliwe na światło przed 1,5 hpf. Aby zminimalizować przypadkową fotoaktywację podczas oceny zarodków po 1,5 hpf, użyj czerwonych świateł lub przykryj źródła światła - w tym stoliki mikroskopu - czerwoną żelową bibułą filtracyjną, która blokuje dimeryzujące niebieskie długości fal LOV (tabela materiałów).
    1. Oceniaj zarodki konsekwentnie, aby zapewnić bezstronny rozkład między warunkami i eksperymentami.
  2. Do testu fenotypowania należy zastosować następujący 1-dniowy protokół ekspozycji na światło, zaczynając od 1,5 hpf (Rysunek 3A).
    1. Owiń nieodsłoniętą płytkę kontrolną folią aluminiową. Tabliczka ta powinna zawierać zarówno zarodki bez wstrzyknięć, jak i z wstrzyknięciami. Upewnij się, że talerz jest całkowicie zakryty i uważaj, aby nie wprowadzić rozdarć do folii. Umieść tę tabliczkę na dolnej półce kasetonu oświetleniowego o temperaturze 28 °C (Rysunek 2A).
    2. Umieść odsłoniętą płytkę na górnej półce kasetonu oświetleniowego o temperaturze 28 °C ( Rysunek 2A). Upewnij się, że pokrywka znajduje się na naczyniu, aby uniknąć parowania pożywki zarodkowej. Włącz niebieskie światło (natężenie promieniowania 45 W/m2 solidnie aktywuje sygnalizację).
    3. Zamknij drzwi kasetonu, aby uniknąć przypadkowego wystawienia na działanie światła w pomieszczeniu. W razie potrzeby przed zamknięciem drzwi umieść termometr na karcie pamięci w kaseju oświetleniowym. Nie otwieraj drzwiczek do momentu oceny fenotypu w 1 dniu po zapłodnieniu (dpf; patrz krok 5.1).
  3. W przypadku testu immunofluorescencyjnego wystaw zarodki na działanie niebieskiego światła przez 20 minut, zaczynając od około 40% epiboly56 (~6 hpf) i utrwal natychmiast po ekspozycji na światło, razem z nienaświetlonymi kontrolami (Rysunek 3B). 20-minutowa ekspozycja na niebieskie światło przy 40% epibolii powtarzalnie aktywuje sygnalizację.
    1. Około 1,5 hpf oddzielnie zawiń zarówno odsłonięte, jak i nienaświetlone naczynia w folię aluminiową. Upewnij się, że naczynia są całkowicie przykryte i uważaj, aby nie wprowadzić rozdarć do folii. Pozostaw rozpakowaną miskę proxy. Umieść owinięte naczynia i nieopakowaną miskę proxy w kasecie świetlnej o temperaturze 28 °C ( Rysunek 2A). Nie włączaj jeszcze diody LED.
    2. Jeśli testujesz więcej niż jedną ilość mRNA, w przypadku stanu nieeksponowanego, posortuj zarodki, którym wstrzyknięto różne ilości, na indywidualne 6-dołkowe płytki pokryte agarozą, co pomoże zminimalizować przypadkową ekspozycję na światło podczas późniejszego utrwalania.
    3. Zamknij drzwi kasetonu, aby uniknąć przypadkowego wystawienia na działanie światła w pomieszczeniu.
    4. Rozcieńczyć formaldehyd do 4% w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i podwielokrotność 1 ml do wstępnie znakowanych probówek mikrowirówek okrągłodennych o pojemności 2 ml, po jednej probówce na warunek. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Około 5 hpf wyjmij miskę proxy zawierającą niewstrzyknięte zarodki i oceń stadium rozwojowe za pomocą lunety preparacyjnej. Stadium zarodków zastępczych powinno odzwierciedlać stadium zarodków wrażliwych na światło w opakowanych naczyniach.
    6. Wyjmij również zawinięte naczynia, aby wszystkie naczynia miały tę samą temperaturę. Powtarzaj, aż zarodki zastępcze osiągną 40% epibolii (~6 hpf). Postęp embriogenezy jest wrażliwy na temperaturę54; Dlatego im dłużej szalki znajdują się poza inkubatorem, tym dłużej zajmie zarodkom osiągnięcie 40% epibolii.
    7. Gdy zarodki proxy osiągną 40% epibolii, rozpakuj odsłonięte naczynie i umieść je na górnej półce kasetonu świetlnego (Rysunek 2A). Pozostaw nieodsłonięte naczynia owinięte i umieść na dolnej półce. Natychmiast włącz niebieskie światło, zamknij drzwi i ustaw timer na 20 minut (natężenie promieniowania 45 W/m2 solidnie aktywuje sygnalizację).
    8. Aby przygotować się do mocowania, wyeliminuj jak najwięcej światła w pomieszczeniu (zamknij rolety okienne, wyłącz górne światła, wyłącz ekrany itp.). Upewnij się, że probówki zawierające formaldehyd są odpowiednio oznakowane. Bezpośrednio przed utrwaleniem należy usunąć probówki zawierające formaldehyd z 4 °C i umieścić obok kasetonu oświetleniowego.
    9. Krok wrażliwy na czas i światło. Przygotuj się na szybkie poruszanie się po upływie 20 minut ekspozycji na światło. Po 20 minutach otwórz drzwiczki kasety oświetleniowej i wyjmij nienaświetlone naczynie.
    10. Użyj szklanej końcówki do pipety, aby szybko, ale delikatnie przenieść wrażliwe na światło zarodki do przygotowanej odpowiedniej probówki z 4% formaldehydem.
    11. Zminimalizuj czas transferu (<45 s) wrażliwych na światło zarodków, aby uniknąć niezamierzonej ekspozycji na światło. Upewnij się, że w pipecie nie ma pęcherzyków powietrza. Ekspozycja na powietrze niszczy zarodki z odkorzonką.
    12. Aby wyrzucić zarodki do formaldehydu, zanurz szklaną końcówkę pipety w formaldehydzie i pozwól zarodkom zanurzyć się w płynie. Zminimalizuj ilość pożywki zarodkowej, która jest przenoszona do formaldehydu, trzymając zarodki na końcu końcówki.
    13. Po przeniesieniu zarodków włóż pipetę z powrotem do tego samego dołka i pipetuj w górę iw dół, aby usunąć wszelkie zablokowane zarodki. Zapobiega to przypadkowemu trafieniu zarodków z wielu schorzeń do jednej probówki.
    14. Natychmiast powtórzyć kroki 4.3.11-4.3.13 dla nieodsłoniętych, niewstrzykniętych zarodków, a następnie dla odsłoniętych zarodków (wstrzykniętych i niewstrzykniętych).
    15. Utrwalone zarodki przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.

5. Ocena eksperymentu

  1. Ocena i obrazowanie fenotypu
    1. Przy 1 dpf, najlepiej między 24-32 hpf, usuń zarodki z kasetonu świetlnego, aby ocenić fenotypy za pomocą lunety preparacyjnej i utworzyć rubrykę punktacji. Jest to eksperymentalny punkt końcowy; Przypadkowa fotoaktywacja nie jest już problemem.
    2. Dla ułatwienia nacinaj zarodki, będąc jeszcze w kosmówce. Użyj pipety lub sondy, aby przesunąć zarodki, aby zobaczyć je pod różnymi kątami.
      1. Zarodki, u których występuje nadmierna sygnalizacja BMP, zostaną poddane wentralizacji z różnym stopniem nasilenia, jak opisano szczegółowo w Kishimoto et al. 199746 (Figura 4A, lewy panel). Zarodki doświadczające nadmiaru sygnalizacji węzłowej będą miały szereg wad rozwojowych związanych z nadmiarem mezendodermy (Rysunek 4A, prawy panel)1,3,47,57,58,59,60. Często ulegają lizie o 1 dpf.
    3. Oceń każdy zarodek we wszystkich warunkach (Rysunek 4B). Uzyskaj obraz poglądowy wszystkich zarodków w każdym dołku. W razie potrzeby należy dokonać dechorionatu i zobrazować poszczególne reprezentatywne zarodki w metylocelulozie (Ryc. 4A).
  2. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie
    1. Po inkubacji zarodków w 4% formaldehydzie w temperaturze 4 °C przez noc, usuń formaldehyd i przemyj 3-5x solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem z Tween20 (PBST). Usuń PBST i dodaj 100% metanolu.
    2. Zamknij probówki i delikatnie je odwróć, aby wymieszać resztki PBST i metanol. Umyć 2x metanolem i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny do lat.
    3. Protokół immunofluorescencji pSmad1/5/9 (BMP) patrz Rogers et al.38. Aby zapoznać się z protokołem immunofluorescencji pSmad2/3 (węzłowym), zobacz van Boxtel et al.17 i Rogers et al.47.
    4. Obrazowanie zarodków barwionych immunologicznie przy użyciu mikroskopu zdolnego do cięcia optycznego (np. mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu z blachą świetlną). Unikaj nasycenia i utrzymuj identyczne warunki obrazowania między wszystkimi próbkami barwionymi tym samym przeciwciałem.
    5. Obraz w ciągu 5 dni od zakończenia barwienia immunofluorescencyjnego, ponieważ fluorescencja może z czasem zanikać.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem dwóch opisanych tutaj eksperymentów kontrolnych jest ustalenie, czy bOpto-BMP/Nodal aktywują swoje odpowiednie ścieżki w odpowiedzi na ekspozycję na niebieskie światło, nie wpływając na sygnalizację przy braku światła, zgodnie z oczekiwaniami. Użyj tych elementów sterujących, aby ustalić odpowiedni eksperymentalny przepływ pracy w laboratorium przed zastosowaniem bOpto-BMP/Nodal do interesujących Cię pytań badawczych.

Test fenotypowania może być zakończony w ciągu zaledwie 2 dni i dostarcza użytecznego wskaźnika aktywności sygnalizacyjnej i fototoksyczności (Rysunek 3A). Zarodki, którym wstrzyknięto, wystawione na działanie światła niebieskiego powinny fenoskopować nadmiar sygnalizacji BMP (ventralization46; Rysunek 4A, lewy panel) lub sygnalizacja węzłowa (wady rozwojowe związane z dodatkową mezendoderą1,3,47,57,58,59,60 (Rysunek 4A, prawy panel)). W przypadku wstrzyknięcia, zarodki wystawione na działanie światła są afenotypowe, przetestuj jakość mRNA i rozważ wstrzyknięcie większej ilości oraz dwukrotnie sprawdź strategię ekspozycji na światło, aby zapewnić stałą ekspozycję na jasne światło (światło ~450 nm o natężeniu promieniowania 45 W/m2 powinno silnie aktywować sygnalizację). W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięte, nieeksponowane zarodki powinny wyglądać identycznie jak rodzeństwo bez wstrzyknięcia. W przypadku wstrzyknięcia, nienarażone zarodki wykazują fenotypy, zmniejsz ilość wstrzykniętego mRNA i ponownie oceń zestaw doświadczalny, aby upewnić się, że nienarażone zarodki są chronione przed ekspozycją na światło. Dane pokazane w Rysunek 4B pokazuje wyniki typowych eksperymentów fenotypowania z odpowiednimi ilościami mRNA i warunkami ekspozycji: silna aktywność sygnalizacyjna jest widoczna w wstrzykniętych, wystawionych na światło zarodkach, przy czym tylko niewielka część wstrzykniętych, nieeksponowanych zarodków wykazuje fenotypy.

Test fenotypowy daje również możliwość oceny fototoksyczności. Jeśli fototoksyczność jest znikoma, zarodki bez wstrzyknięć, wystawione na działanie światła powinny wyglądać jak dzikie, podobne do zarodków bez wstrzyknięć, nienaświetlonych. Jeśli zarodki bez wstrzyknięć, wystawione na działanie światła mają wady, ale nie zarodki bez wstrzyknięć, nienaświetlone, należy rozważyć zmniejszenie natężenia promieniowania. Natężenie promieniowania 45 W/m2 solidnie aktywuje sygnalizację bez oczywistej fototoksyczności. Dane pokazane w Rysunek 4B nie pokazują żadnych niepokojących różnic między zarodkami bez wstrzyknięć, wystawionymi na działanie światła i niewstrzykniętymi, nienaświetlonymi, co wskazuje na znikomą fototoksyczność.

Chociaż testy immunofluorescencyjne wymagają więcej czasu i wysiłku (~1 tydzień) w porównaniu do testów fenotypowania (2 dni), barwienie immunofluorescencyjne zapewnia bezpośredni odczyt aktywności szlaku sygnałowego i może ujawnić subtelne zmiany sygnalizacyjne, które mogą nie być odzwierciedlone przez morfologię ogólną. Immunofluorescencja jest szczególnie ważna do oceny odpowiedzi na bOpto-Nodal, ponieważ nadmiar sygnalizacji węzłowej często powoduje lizę zarodków przez 1 dpf - co może mieć wiele przyczyn - w przeciwieństwie do specyficznych fenotypów wentylacji charakterystycznych dla nadmiaru sygnalizacji BMP46 (Figura 4A). Zarodki poddane iniekcji, wystawione na działanie światła niebieskiego powinny wykazywać równomierny wzrost fosforylacji Smad1/5/9 lub Smad2/3 w porównaniu z zarodkami bez iniekcji, wystawionymi na działanie światła. Jeśli poziomy nie są zwiększone lub są tylko nieznacznie podwyższone, przetestuj jakość mRNA i rozważ wstrzyknięcie większej ilości oraz dwukrotnie sprawdź strategię ekspozycji na światło. 20-minutowa ekspozycja na światło niebieskie o natężeniu promieniowania 45 W/m2 około 40% epibolii powinna silnie aktywować sygnalizację. Jeśli barwienie pSmad jest niejednorodne, spróbuj wstrzyknąć mRNA do środka komórki (a nie do żółtka), co może skutkować bardziej równomierną dystrybucją mRNA.

Wstrzyknięte, nienarażone zarodki powinny mieć poziom pSmad porównywalny do zarodków bez wstrzyknięć. Anegdotycznie zaobserwowaliśmy bardziej nieszczelną fosforylację Smad z bOpto-Nodal niż bOpto-BMP. Jeśli poziom pSmad jest zwiększony w wstrzykniętych, nieeksponowanych zarodkach, należy zmniejszyć ilość wstrzykniętego mRNA. Ponadto należy ponownie ocenić konfigurację eksperymentalną, aby upewnić się, że 1) niewystawione zarodki nie są przypadkowo wystawione na działanie światła oraz 2) ekspozycja na światło podczas fiksacji jest minimalna. Na etapie utrwalania bardzo ważne jest, aby między wyjęciem z kasetonu a zanurzeniem w formaldehydzie nie upłynęło więcej niż 45 sekund. Ponadto na tym etapie należy zminimalizować narażenie na światło słoneczne i światło słoneczne w pomieszczeniu poprzez zamknięcie rolet okiennych, wyłączenie białych źródeł światła, użycie światła czerwonego lub zakrycie źródeł światła białego bibułą filtracyjną z żelu blokującego światło niebieskie (tabela materiałów).

Dane w Rysunek 4C pokazuje wyniki typowych eksperymentów barwienia immunofluorescencyjnego z odpowiednimi ilościami mRNA i warunkami ekspozycji na światło: poziomy pSmad są podobne w zarodkach bez wstrzyknięć i bez ekspozycji, podczas gdy wstrzyknięte, wystawione na działanie światła zarodki wykazują wyższy poziom fosforylacji Smad.

figure-results-1
Rysunek 1: Strategia aktywacji sygnalizacji bOpto-BMP i -węzłowej. (A) Endogenny szlak sygnałowy BMP jest aktywowany przez wiązanie ligandu BMP, co prowadzi do powstania kompleksu receptorów typu I/II, fosforylacji Smad1/5/9 i ekspresji docelowych genów BMP. Receptory typu I BMPR1aa i Acvr1l są również znane odpowiednio jako Alk3 i Alk8. BMPR2a jest receptorem typu II. (B) konstrukcje bOpto-BMP38. Przypuszczalne domeny kinazy z BMPR1aa i Acvr1l są połączone z LOV; fuzja BMPR2a-LOV zawiera domniemaną domenę kinazy i domenę C-końcową receptora (CTD). Wszystkie fuzje są ukierunkowane na błonę z motywem mirystoylacji (Myr). Domeny są oddzielone łącznikami glicyna-seryna (GS). Konstrukty są oznaczone w CTD tagiem epitopu HA. Stwierdzono, że ta kombinacja trzech konstruktów optymalnie aktywuje sygnalizację BMP. (C) aktywacja sygnalizacji BMP za pośrednictwem bOpto-BMP. Pod wpływem światła niebieskiego domeny LOV ulegają dimeryzacji, co uważa się za wyzwalanie tworzenia kompleksów i aktywacji sygnalizacji. (D) Endogenny szlak sygnalizacji węzłowej jest aktywowany przez wiązanie liganda węzłowego, co prowadzi do powstania kompleksu receptorowego typu I / II, fosforylacji Smad2 / 3 i ekspresji docelowych genów węzłowych. Receptor typu I Acvr1ba i receptor typu II Acvr2ba są również znane odpowiednio jako Acvr1b i Acvr2b. (E) konstrukcje bOpto-węzłowe39. Przypuszczalne domeny kinazy z Acvr1ba i Acvr2ba są połączone z LOV. Wszystkie fuzje są ukierunkowane na błonę z motywem mirystoylacji (Myr). Domeny są oddzielone linkerami GS. Konstrukty są oznaczone w CTD tagiem epitopu HA. (F) aktywacja sygnalizacji węzłowej za pośrednictwem bOpto-węzłów. Pod wpływem światła niebieskiego domeny LOV ulegają dimeryzacji, co uważa się za wyzwalanie tworzenia kompleksów i aktywacji sygnalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Kaseton świetlny z kontrolowaną temperaturą do eksperymentów optogenetycznych. (A) Oświetlacz mikropłytki LED jest zamontowany na górze inkubatora za pomocą specjalnie zaprojektowanego uchwytu LED. Zarodki danio pręgowanego na 6-dołkowej płytce na pierwszej półce są wystawiane na działanie światła przez otwór wywiercony w górnej części inkubatora. Dolna półka zawiera drugi zestaw nieeksponowanych zarodków kontrolnych na 6-dołkowej płytce owiniętej folią aluminiową. Drzwi inkubatora są wyłożone listwą uszczelniającą, aby zapobiec przypadkowemu wystawieniu na działanie światła słonecznego lub światła słonecznego. (B) Szczegółowa procedura tworzenia otworu w inkubatorze za pomocą wiertła stopniowego. Zastosowany tu model inkubatora posiada panel wewnętrzny, który wymagał wywiercenia drugiego, większego otworu (Tabela Materiałów). (C) Szczegół niestandardowego uchwytu LED zaprojektowanego dla systemu oświetlenia o trzech długościach fali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: przebieg eksperymentu bOpto-BMP/Nodal. Test fenotypowy i barwienie immunofluorescencyjne pSmad w celu zbadania aktywności bOpto-BMP/Nodal. Zarodkom wstrzykuje się mRNA w stadium jednokomórkowym i przenosi do kasetonu nie później niż 1,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). (A) Test fenotypu. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki i rodzeństwo bez wstrzyknięcia, są hodowane w ciemności lub wystawione na działanie jednolitego niebieskiego światła od 1,5 hpf do 1 dnia po zapłodnieniu (dpf). Aktywność sygnalizacji optogenetycznej można ocenić, oceniając zarodki pod kątem fenotypów zgodnych z nadmierną aktywnością szlaku. (B) barwienie immunofluorescencyjne pSmad. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki i rodzeństwo bez wstrzyknięcia, są hodowane w ciemności do 40% epibolii (~6 hpf). Połowa zarodków, którym wstrzyknięto isknięcie, i połowa zarodków, którym nie wstrzyknięto, jest następnie wystawiana na działanie jednolitego niebieskiego światła przez 20 minut. Po ekspozycji wszystkie zarodki są utrwalane i poddawane barwieniu immunofluorescencyjnemu w kierunku pSmad. Podwyższone poziomy pSmad1/5/9 lub pSmad2/3 odzwierciedlają odpowiednio optogenetyczną aktywację BMP lub sygnalizacji węzłowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena reakcji sygnalizacyjnych aktywowanych światłem w zarodkach danio pręgowanego. Zarodki danio pręgowanego wstrzyknięto w stadium jednokomórkowym za pomocą mRNA kodującego bOpto-BMP/Nodal. (A) Zarodki były albo hodowane w ciemności, albo wystawione na działanie jednolitego niebieskiego światła, począwszy od 1,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). Fenotypy oceniano 1 dzień po zapłodnieniu (dpf). Pokazano reprezentatywne fenotypy. Nadmierna sygnalizacja BMP prowadzi do ventralizacji (lewy panel), podczas gdy nadmiarowa sygnalizacja węzłowa powoduje wady rozwojowe związane z dodatkową mezendrumową (prawy panel). Podziałka = 500 μm. (B) Kwantyfikacja fenotypu. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki i rodzeństwo, którym nie wstrzyknięto szczepionki, hodowano w ciemności, zaczynając od 1,5 hpf (żarówka). Połowa zarodków, którym wstrzyknięto i połowa zarodków nie została wstrzyknięta, wystawiono na działanie jednolitego niebieskiego światła (niebieskiej żarówki). (C) Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki i rodzeństwo bez wstrzyknięcia, były hodowane w ciemności, zaczynając od 1,5 hpf (żarówka). Przy 40% epibolii (~6 hpf) połowa wstrzykniętych i połowa niewstrzykniętych zarodków była wystawiona na działanie jednolitego niebieskiego światła (niebieska żarówka). Po 20 minutach wszystkie zarodki utrwalono i poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu pod kątem fosforylowanego Smad1/5/9 lub Smad2/3. Wyższe intensywności pSmad wskazują odpowiednio na zwiększoną sygnalizację BMP/węzłową. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Pełny montaż kasetonu świetlnego. Plik PDF 3D pokazujący widok 3D pełnego zestawu kasetonu świetlnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Widok rozstrzelony lightbox. Plik PDF 3D pokazujący widok 3D zespołu rozstrzelonej lightboxa. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Duża lekka uszczelka. Plik rysunku CAD (. w formacie DWG) do wykonania dużej uszczelki świetlnej do oprawki LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Mała lekka uszczelka. Plik rysunku CAD (. DWG) do wykonania małej uszczelki świetlnej do oprawki LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Akrylowa podstawa platformy. Plik rysunku CAD (. w formacie DWG) do wykonania akrylowej podstawy platformy z uchwytem LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Platforma akrylowa pionowa. Plik rysunku CAD (. w formacie DWG) do wykonania pionowej platformy akrylowej uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Akrylowa podpora po lewej. Plik rysunku CAD (. w formacie DWG) do wykonania akrylowego lewego wspornika uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 8: Prawo do podpory akrylowej. Plik rysunku CAD (. w formacie DWG) do wykonania akrylowego prawego wspornika uchwytu LED za pomocą wycinarki laserowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzyknięcie mRNA jest obecną strategią dostarczania bOpto-BMP/Nodal do zarodków danio pręgowanego. Ta metoda ma kilka wad. Po pierwsze, odpowiednia ilość mRNA różni się w zależności od laboratorium. Użyta ilość powinna być wystarczająca do silnej aktywacji sygnalizacji przy ekspozycji na światło, ale bez niezamierzonej aktywacji ciemności. Dobrym pomysłem jest przetestowanie kilku ilości w celu znalezienia optymalnych poziomów mRNA, a po ustaleniu utwórz podwielokrotności mieszanki głównej, aby w powtarzalny sposób wprowadzić tę samą ilość mRNA. Po drugie, nierównomierne rozmieszczenie wstrzykniętego mRNA może prowadzić do nierównomiernej aktywacji sygnalizacji. Uważa się, że wstrzyknięcie do środka komórki (nie do żółtka) sprzyja równomiernej dystrybucji mRNA. Wreszcie, ponieważ wstrzyknięte mRNA ulega degradacji z czasem, podejście to może nie być odpowiednie do eksperymentów na starszych zarodkach. W przyszłości problemy te mogą zostać rozwiązane przez transgeniczne linie danio pręgowanego powszechnie wykazujące ekspresję bOpto-BMP/Nodal za pomocą promotora indukowanego przez matkę lub leki. Chociaż praca z potencjalnie wrażliwymi na światło dorosłymi danio pręgowanymi może być wyzwaniem w tym kontekście, udało się opracować transgeniczne danio pręgowane61,62 i Drosophila 22,34,35,63 wyposażone w narzędzia optogenetyczne.

Uniknięcie niezamierzonej fotoaktywacji jest ogólnym wyzwaniem związanym z narzędziami optogenetycznymi. Dla uproszczenia należy traktować wstrzyknięte zarodki starsze niż 1,5 hpf jako wrażliwe na światło. Niezamierzonej ekspozycji na światło można często uniknąć, po prostu owijając talerze lub naczynia folią aluminiową. Jednak w przypadku eksperymentów wymagających obserwacji wzrokowej żywych zarodków starszych niż 1,5 hpf możliwe jest użycie źródeł światła czerwonego lub pokrycie źródeł światła białego niedrogą bibułą filtracyjną w żelu, która blokuje długości fal dimeryzujących LOV (tabela materiałów).

Opisana tutaj kaseton świetlny jest przeznaczony do konkretnych zastosowań wymagających precyzyjnej kontroli nad poziomami natężenia promieniowania, dynamiką i długościami fal światła (ilustracja 2). Inne zalety tego kasetonu to równomierna ekspozycja na światło, znikome przypadkowe nagrzewanie próbki, dużo miejsca na wiele płytek 6-dołkowych oraz długowieczne, dobrze scharakteryzowane spektralnie źródła światła. Jednak w zależności od zastosowania badawczego preferowane mogą być różne strategie ekspozycji na światło. Wiele laboratoriów opracowało prostsze i bardziej opłacalne systemy jednolitej ekspozycji na światło o mniejszych rozmiarach, w tym wykładanie inkubatorów paskami LED, zawieszanie paneli LED nad próbkami lub umieszczanie diod LED w pokrywkach naczyń hodowlanych 32,38,39,40,64,65,66. Co ważne, kaseton zastosowany w tym protokole nie pozwala użytkownikom na samodzielną regulację poszczególnych studni (w przeciwieństwie do Bugaj i wsp.52) ani nie zapewnia przestrzennej kontroli nad ekspozycją na światło. Przestrzennie zlokalizowana aktywacja optogenetyczna została zademonstrowana za pomocą bOpto-BMP38 i bOpto-Nodal39 przy użyciu laserów w systemach SPIM lub konfokalnych, odpowiednio, a także została zrealizowana za pomocą wielu innych strategii optogenetycznych w różnych systemach modelowych (omówionych w Rogers i Müller12). Niektóre podejścia osiągnęły nawet subkomórkową rozdzielczość przestrzenną 29,30,31. Chociaż implementacja przestrzennie zlokalizowanych systemów ekspozycji na światło wykracza poza zakres tego protokołu, eksperymenty z aktywacją przestrzenną za pomocą bOpto-BMP/Nodal są teoretycznie możliwe przy użyciu specjalistycznego sprzętu, takiego jak cyfrowe urządzenia mikrolustrzane lub podejścia maskujące. Czytelnicy są zachęcani do zapoznania się z obszerną literaturą na temat kasetonów świetlnych DIY do eksperymentów optogenetycznych przed podjęciem decyzji o strategii ekspozycji na światło (patrz np. Gerhardt i wsp.51, Bugaj i wsp.52, Kumar i Khammash53 i więcej na https://www.optobase.org/materials/).

Molekularne strategie optogenetyczne często oferują wyższy stopień czasoprzestrzennej kontroli nad procesami biologicznymi w porównaniu z historycznymi podejściami, takimi jak mutanty, ektopowa ekspresja genów, rekombinowane białka i leki. Czytelnicy, którzy są zainteresowani korzyściami płynącymi z podejść optogenetycznych, mogą zapoznać się z innymi opublikowanymi narzędziami dostępnymi dla danio pręgowanego i innych organizmów. Należą do nich narzędzia do manipulowania dodatkowymi szlakami sygnałowymi 32,65,67,68, regulowania ekspresji genów 61,64,66,69,70,71, zmiany lokalizacji białek31,72 i aktywacji apoptozy62. Te i wiele innych narzędzi jest wygodnie skatalogowanych w OptoBase, wyselekcjonowanym zasobie internetowym dla podejść do optogenetyki molekularnej28. Dla tych, którzy zainspirowali się do stworzenia nowych narzędzi optogenetycznych, zasób zawiera również przydatne opisy białek reagujących na światło, które zostały wykorzystane w szerokim zakresie strategii, w tym białek reagujących na światło, które reagują na fale zielone, czerwone i bliskiej podczerwieni. Cieszymy się, że społeczność naukowa może w pełni wykorzystać potencjał optogenetycznych podejść molekularnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego protokołu zostało zapewnione przez NICHD Intramural Program dla KWR (ZIA HD009002-01). Dziękujemy Jeffowi Farrellowi i jego laboratorium za pouczające opinie, Willowi Andersonowi za doskonałe wsparcie techniczne, Leanne Iannucci za testy warunków skrajnych protokołu i pomiar natężenia promieniowania, a także zakładowi NIH Shared Zebrafish za ciężką pracę nad utrzymaniem danio pręgowanego w zdrowiu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Budowa kasetonu świetlnego i Protokół ekspozycji na światło
#8 x 1" Wkręt samowiercący sześciokątnyMcMaster-Carr99663A2221.4.5
Cyfrowy miernik mocy optycznej i energii InkubatorThorLabsPM100D1,7
4
(142 litry)Boekel Scientific1394001.3.1
Inkubator do montażu panelowego (1/4" gruby akryl)Niestandardowy część / Piedmont PlasticsIncubator_panel1.4.4
Wiertło stopniowe do rowków spiralnych HSSCO-ZSDB0001TA1.3.2
Uszczelka soczewki LED, uszczelka inkubatora; 1/32" gruby silikonMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
Oświetlacz mikropłytek LEDPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10mm Cube StandoffNewark Eletronics005.60.5331.4.1
M3 x 10mm 316SS Śruba z płaskimMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10mm 316SS Śruba z płaskimMcMaster-Carr91801A3051.4.3
Termometr na kartę pamięciFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
Głowica czujnika miernika mocy suwaka mikroskopu (150 mW)ThorLabsS170C1.7< br/> 4
Bibuła filtracyjna z czerwonym żelem #E106Rosco / B& H Zdjęcie & Elektronika110084014805-E1064.2.1
Wsporniki boczne (1/4" gruby akryl)Część niestandardowa / Piedmont PlasticsSide_bracket1.4.2
Wspornik pionowy (1/4" gruby akryl)Część niestandardowa / Piedmont PlasticsVertical_bracket1.4.1
Izolacja pogodowa: Lekka pianka EPDM, 1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
Generating mRNA
EZNA MicroElute Cycle PureKit OmegaD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
Inkubator do mikropróbek (Hybex)SciGene1057-30-02
Inkubator do mikropróbek 1,5 ml blok probówek (Hybex)SciGene1057-34-02
Spektrofotometr Nanodrop OneThermo ScientificND-ONE-W2.4
Enzym restrykcyjny NotI-HFNew England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene207615
2 pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit (250 rxns)Qiagen741062.3
Iniekcyjne mRNA
Agaroza (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml szklane zlewkiFisherbrandFB1002503.3.2 3.3.2
opakowanie 50 szt.)Sokół08 772 1B3.1.6
B-8A przegub kulowyNarishigeB-8A3.3
Jednostka ciśnienia zwrotnego (element zestawu do mikroiniekcji)Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)BPU3.3
Przełącznik nożny (element zestawu do mikroiniekcji)Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)FWS3.3
GJ-1 Stojak magnetycznyNarishigeGJ-13.3
Kapilary szklane (4 cale, średnica zewnętrzna 1 mm, żarnik)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
Szklane dna szalek Petriego (do dechorionacji)Pyrex08-748A3.3.2
Pipety szklane (5 3/4" z szeroką końcówką)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
Formy do naczyń wtryskowychAdaptive Science Toolstu13.1.3
Płyta żelazna IPNarishigeIP3.3
M-152 mikromanipulatorNarishigeM-1523.3
Zestaw uchwytów do mikropipet (element zestawu do mikroiniekcji)Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)MIMPH-MPIP-Kit3,3
mikrometraMeiji Techno AmericaMA2853.3
(element platformy do mikroiniekcji)Stosowane oprzyrządowanie naukowe (ASI)MPPI-33.3
Ściągacz igiełWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
Szalki Petriego (100 mm x 15 mm, opakowanie 500 szt.)Falcon08-757-100D3.1.2
Pibuła (10 ml, zielona)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
Butelki do wyciskania (500 ml)Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3
( Wtryskiwacz ciśnieniowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
  2. Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
  3. Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274(2018).
  4. Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
  5. Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107(2022).
  6. Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
  7. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  8. Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
  9. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  10. Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103(2022).
  11. Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
  12. Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
  13. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
  14. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 341-372 (2022).
  15. Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977(2019).
  16. Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
  17. van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
  18. Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
  19. Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
  20. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  21. Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990(2009).
  22. Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
  23. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
  24. Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
  25. Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205(2020).
  26. Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
  27. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
  28. Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
  29. Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
  30. Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
  31. Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
  32. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093(2019).
  33. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  34. Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258(2017).
  35. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
  36. Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
  37. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
  38. Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641(2020).
  39. Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
  40. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
  41. Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197(2022).
  42. Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
  43. Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
  44. Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M. Photoreactions of aureochrome-1. Biophysical Journal. 100 (11), 2801-2809 (2011).
  45. Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832(2018).
  46. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
  47. Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785(2017).
  48. Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042(2015).
  49. Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101(2009).
  50. Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
  51. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
  52. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  53. Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917(2022).
  54. Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  55. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266(2015).
  56. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  57. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  58. Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
  59. Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
  60. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  61. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  62. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640(2020).
  63. Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
  64. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  65. Patel, A. L., et al. Optimizing photoswitchable MEK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25756-25763 (2019).
  66. LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818(2021).
  67. Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
  68. Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
  69. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  70. Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
  71. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  72. Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja optogenetycznaszlaki sygnalizacyjneaktywacja wiat em niebieskimsygnalizacja BMPsygnalizacja Nodaltest immunofluorescencyjnyanaliza fenotypowafosforylacja bia ek Smadbia ka wiat oczu e

Powiązane artykuły