Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

Summary

Opracowaliśmy metodologię oceny, czy nowotwory układu nerwowego u genetycznie modyfikowanych myszy dokładnie odwzorowują patologię ich ludzkich odpowiedników. Tutaj stosujemy te techniki histologiczne, zdefiniowane kryteria patologiczne i metodologie hodowli do nerwiakowłókniaków i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych powstających w mysim modelu P 0-GGFβ3.

Abstract

Pacjenci z autosomalnym dominującym zespołem podatności na nowotwory typu 1 (NF1) często rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate (PN), które następnie przekształcają się w wysoce agresywne złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST). Zrozumienie procesu, w którym PN przekształca się w MPNST, byłoby ułatwione dzięki dostępności genetycznie modyfikowanych modeli myszy (GEM), które dokładnie replikują progresję PN-MPNST obserwowaną u ludzi z NF1. Niestety, modele GEM z ablacją Nf1 nie oddają w pełni tego procesu. To skłoniło nas do opracowania myszy P 0-GGFβ3, modelu GEM, w którym nadekspresja mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) w komórkach Schwanna powoduje rozwój PN, które z dużą częstotliwością przekształcają się w MPNST. Jednak, aby ustalić, czy nowotworzenie i progresja nowotworowa u myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy obserwowane u pacjentów z NF1, musieliśmy najpierw udowodnić, że patologia guzów osłonki nerwów obwodowych P_0-GGFβ3 podsumowuje patologię ich ludzkich odpowiedników.

Tutaj opisujemy specjalistyczne metodologie używane do dokładnego diagnozowania i oceniania nowotworów obwodowego układu nerwowego w modelach GEM, używając P 0-GGFβ3 i P_0-GGFβ3; Na przykład myszy Trp53 ^+/-. Opisujemy metody histologiczne, immunohistochemiczne i histochemiczne stosowane do diagnozowania PN i MPNST, jak odróżnić te nowotwory od innych typów nowotworów, które naśladują ich patologię, oraz jak ocenić te nowotwory. Omawiamy tworzenie kultur wczesnopasażowych z MPNST GEM, jak scharakteryzować te kultury za pomocą immunocytochemii oraz jak zweryfikować ich rakotwórczość poprzez ustanowienie alloprzeszczepów. Łącznie techniki te charakteryzują patologię PN i MPNST, które pojawiają się w modelach GEM i krytycznie porównują patologię tych mysich guzów z ich ludzkimi odpowiednikami.

Introduction

W ciągu ostatnich trzech dekad liczne laboratoria próbowały stworzyć mysie modele ludzkich nowotworów, wprowadzając mutacje związane z ludzkim rakiem do genomu myszy lub poprzez nadekspresję produktu genetycznego, który ulega nadekspresji w ludzkich nowotworach. Powstałe w ten sposób modele myszy modyfikowanych genetycznie (GEM) można wykorzystać do różnych celów, takich jak ustalenie, że nowo wprowadzona modyfikacja genomu inicjuje nowotworzenie nowotworu, identyfikacja innych zachodzących później zmian genetycznych lub epigenetycznych, które przyczyniają się do progresji nowotworu, oraz zdefiniowanie kluczowych szlaków sygnałowych, które napędzają inicjację i progresję guza. W przeciwieństwie do ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów, które opierają się na wykorzystaniu myszy z niedoborem odporności, modele raka GEM mają w pełni funkcjonalny układ odpornościowy, a więc dokładniej modelują odpowiedzi na potencjalne środki terapeutyczne. Jednak przy użyciu modeli raka GEM do takich celów ważne jest, aby badacze potwierdzili, że obserwacje poczynione z nowotworami GEM są istotne dla ich ludzkich odpowiedników. Walidacja ta powinna obejmować dokładną ocenę patologii nowotworów GEM oraz ustalenie, czy cechy patologiczne nowotworów GEM odzwierciedlają patologię odpowiedniego typu nowotworu ludzkiego.

Zespół podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) jest najczęstszą chorobą genetyczną atakującą ludzki układ nerwowy, występującą u około 1 na każde 3 000-3 500 żywych urodzeń^1,2,3. U osób dotkniętych NF1 rozwijają się liczne łagodne guzy osłonki nerwów obwodowych znane jako nerwiakowłókniaki w skórze (nerwiakowłókniaki skórne) oraz w dużych nerwach i splotach nerwowych (nerwiakowłókniaki splotowate). Podczas gdy zarówno nerwiakowłókniaki skórne, jak i splotowate pogarszają jakość życia pacjenta, powodując upośledzenie fizyczne, behawioralne i/lub społeczne, nerwiakowłókniaki splotowate (PN) są szczególnie niebezpieczne^4,5. Dzieje się tak, ponieważ PN często przekształcają się w złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST), które są agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi o wyjątkowo niskim wskaźniku przeżycia^1,2. W dużej mierze ten niski wskaźnik przeżycia wynika z tego, że schematy radio- i chemioterapeutyczne, które są obecnie stosowane w leczeniu MPNST, są nieskuteczne. Jednak opracowanie nowych, skuteczniejszych terapii było wyzwaniem. Dzieje się tak dlatego, że pomimo tego, jak często MPNST występują u pacjentów z NF1, nadal są to rzadkie nowotwory. W rezultacie bardzo trudno jest uzyskać dużą liczbę ludzkich nowotworów do badań; wyzwaniem jest również rekrutacja wystarczającej liczby pacjentów z MPNST do badań klinicznych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono kilka modeli GEM, których celem jest uzyskanie dalszych informacji na temat nieprawidłowości napędzających patogenezę nerwiakowłókniaka i progresję PN-MPNST oraz ułatwienie badań przedklinicznych z potencjalnymi środkami terapeutycznymi.

NF1 pacjenci mają mutacje inaktywujące w jednej kopii genu NF1. Patogeneza nerwiakowłókniaka jest wywoływana, gdy mutacja inaktywująca w pozostałym funkcjonalnym genie NF1 występuje w komórce w linii komórkowej Schwanna. Co zaskakujące, gdy myszy zostały wygenerowane z mutacjami Nf1 inaktywującymi linię zarodkową, nie rozwinęły się u nich nerwiakowłókniaki^6,7. Późniejsze wykazanie, że myszy z komórkami Schwanna Nf1-null i haploinsuficjencją Nf1 we wszystkich innych typach komórek (Krox20-Cre;U myszy Nf1^flox/- rozwinęły się nerwiakowłókniaki splotowate, co sugerowało, że zmniejszona dawka genu Nf1 w dodatkowych typach komórek była wymagana do patogenezy nerwiakowłókniaka⁸. Nawet wtedy nerwiakowłókniaki splotowate w Krox20-Cre; Myszy Nf1^flox/- nie rozwinęły się, aby stać się MPNST, a więc tylko częściowo naśladowały biologię swoich ludzkich odpowiedników. Patogeneza MPNST występowała, gdy mutacje Nf1 były powiązane z mutacjami w dodatkowych genach supresorowych nowotworów, takich jak Trp53⁹ lub Cdkn2a¹⁰, ale MPNST w tych modelach GEM rozwinęły się de novo lub z atypowych nowotworów nerwiakowłókniakowatych o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs)^11,12, a nie z wcześniej istniejących łagodnych nerwiakowłókniaków splotowatych (patrz^13,14 za doskonałe recenzje tych modeli, jak również innych modeli wprowadzających dodatkowe mutacje powodujące utratę funkcji w genach związanych z MPNST, takich jak Suz12 i Pten¹⁵).

Te mysie modele były nieocenione dla ustalenia roli, jaką geny takie jak NF1, TP53 i CDKN2A odgrywają w patogenezie nowotworów obwodowego układu nerwowego związanych z NF1 oraz dla badań przedklinicznych testujących potencjalne środki terapeutyczne. Jednak nadal mamy niepełne zrozumienie procesu, w którym nerwiakowłókniaki splotowate przekształcają się w atypowe nowotwory nerwiakowłókniakowate o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs¹⁶), a następnie MPNST. Ostatnio poczyniono pewne postępy w zrozumieniu tego procesu dzięki niedawnemu raportowi, że myszy z delecjami w Nf1 i Arf rozwijają ANNUBPs, które stają się MPNSTs¹¹. Jednak mysie modele oparte na mutacji Nf1, które w pełni podsumowują proces progresji nerwiakowłókniaka splotowatego-MPNST obserwowany u ludzi, jeszcze nie istnieją. Ponadto nie jest jasne, czy istnieje wiele odrębnych ścieżek, które prowadzą do rozwoju MPNST. Biorąc to pod uwagę, możliwe jest, że opisane powyżej GEM modelują tylko podzbiór kilku różnych szlaków, które prowadzą do progresji nerwiakowłókniaka-MPNST i patogenezy MPNST. Podkreśla to fakt, że MPNST również występują sporadycznie i że niektóre sporadyczne MPNST najwyraźniej nie mają mutacji NF1^17,18.

Chociaż ten ostatni punkt został zakwestionowany przez niedawną sugestię Magollon-Lorenz et al., że przynajmniej niektóre sporadyczne MPNST pozbawione mutacji NF1 to czerniaki lub inny typ mięsaka¹⁹, ostatnio informowaliśmy o sporadycznym MPNST i linii komórkowej pochodzącej z tego guza (komórki 2XSB), która była NF1 wild-type²⁰. Podczas charakterystyki guza macierzystego i linii komórkowej 2XSB systematycznie wykluczaliśmy alternatywne możliwości diagnostyczne, w tym czerniaka i wiele innych typów mięsaków, które są rutynowo brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej sporadycznego złośliwego guza osłonki nerwu obwodowego²⁰. Ponadto zauważamy, że Magollon-Lorenz i in. przyznali, że ich odkrycia w trzech sporadycznych liniach komórkowych MPNST, które badali, nie mogą być uogólnione, aby wskazać, że wszystkie guzy zidentyfikowane jako sporadyczne MPNST nie są MPNST.

Aby skonstruować model GEM, w którym neurofibroma i patogeneza MPNST niekoniecznie były zależne od specyficznych mutacji genu supresorowego nowotworu, wygenerowaliśmy transgeniczne myszy, u których nadekspresja silnego mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) była napędzana przez promotor białka mieliny specyficznego dla komórek Schwanna (P₀) (myszy P_0-GGFβ3)²¹. Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie nerwiakowłókniaki, MPNST i linie komórkowe MPNST wyrażają kilka izoform NRG1 wraz z kinazami tyrozynowymi receptora erbB (erbB2, erbB3 i erbB4), które pośredniczą w sygnalizacji NRG1 i że te receptory erbB są konstytutywnie aktywowane²². Wykazaliśmy również, że farmakologiczne inhibitory kinaz erbB silnie hamują proliferację MPNST²², survival²³ i migration²⁴. Zgodnie z naszymi obserwacjami na ludziach, myszy P 0-GGFβ3 rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate²⁵, które stają się MPNST z dużą częstotliwością^21,25. Wykazaliśmy, że MPNST P 0-GGFβ3, podobnie jak ich ludzkie odpowiedniki, często rozwijają mutacje Trp53 i Cdkn2a, a także wiele innych nieprawidłowości genomowych, które potencjalnie przyczyniają się do nowotworzenia²⁵. MPNST powstające u myszy P 0-GGFβ3 nie mają inaktywujących mutacji Nf1. Jednak za pomocą komplementacji genetycznej wykazaliśmy, że NRG1 promuje nowotworzenie u myszy P 0-GGFβ3 głównie poprzez te same kaskady sygnałowe, które są zmieniane przez Nf1 loss²⁶; wniosek ten opiera się na naszym ustaleniu, że zastąpienie nadekspresji NRG1 utratą Nf1 w obecności haploinsuficjencji Trp53 (P 0-GGFβ3;Myszy Trp53 ^+/-) produkują zwierzęta, u których MPNST rozwijają się de novo, jak widać w cis-Nf1 ^+/-; Trp53^+/- myszy27.

Aby uzyskać te i inne informacje pokazujące, że myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy patogenezy nerwiakowłókniaka i progresji nerwiakowłókniaka-MPNST obserwowanej u ludzi z NF1, opracowaliśmy specjalistyczne metodologie przetwarzania tkanek od tych zwierząt, dokładnego diagnozowania ich guzów, oceny MPNST powstających u tych myszy, ustalenia i scharakteryzowania wczesnych pasaży P_0-GGFβ3 i P_0-GGFβ3;Trp53 ^+/- hodowle MPNST i krytyczne porównanie patologii P 0-GGFβ3 PN i MPNST oraz P_0-GGFβ3; Trp53 ^+/- MPNST do swoich ludzkich odpowiedników. Wiele z tych metodologii można uogólnić na inne modele GEM nowotworu układu nerwowego. Ponadto kilka z tych metodologii ma szersze zastosowanie do modeli GEM, w których nowotwory powstają w innych miejscach narządów. W związku z tym poniżej przedstawiamy szczegółowy opis tych metodyk.

Protocol

Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny i zostały wykonane przez odpowiednio przeszkolony personel zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi MUSC dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Określanie penetracji guza i przeżywalności u myszy P 0-GGFβ3 oraz identyfikacja nowotworów u tych zwierząt w celu dalszej charakterystyki

1. Wygeneruj kohortę myszy, które zostaną ocenione pod kątem nowotworzenia. Wymagana liczba myszy zależy od penetracji fenotypu guza. Aby zrekompensować takie straty, zacznij od kohorty, która jest o 10-15% wyższa niż pożądana końcowa liczba zwierząt.
   UWAGA: Określiliśmy penetrację guza u myszy P 0-GGFβ3 empirycznie w początkowej kohorcie 50 myszy (z których sześć zostało utraconych z przyczyn niezwiązanych z neoplazją (np. walka))²⁵.
2. Oceniaj stan zdrowia zwierząt trzy razy w tygodniu i rejestruj wyniki kondycji ciała, w tym wagę i zmiany zachowania podczas każdego badania. Zakończ myszy z guzem lub w stanie agonalnym (patrz uwaga poniżej) za pomocą eutanazji dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Rekordowy wiek w chwili śmierci w dniach. Jeśli guzy są widoczne na zewnątrz, zapisz wymiary guza (długość, szerokość i wysokość).
   UWAGA: Istotne jest, aby zwierzęta nie mogły przekroczyć zatwierdzonego przez IACUC maksymalnego dopuszczalnego rozmiaru guza i/lub humanitarnego punktu końcowego.
3. Korzystając z wieku w chwili śmierci, ustal krzywą przeżycia Kaplana-Meiera, aby określić średni wiek w chwili śmierci i zakres przeżycia.
   UWAGA: Myszy P 0-GGFβ3 miały średni wiek w chwili śmierci 261,5 dnia, w zakresie 74-533 dni; 91% naszej kohorty miało nerwiakowłókniaki mnogie, a 71% miało MPNSTs²¹.
4. Ustal, czy obecne są rażąco widoczne guzy, a jeśli tak, wypreparuj je w sterylnych warunkach, aby ustalić, czy guz jest związany z nerwem obwodowym, a następnie wyciąć guz. w P 0-GGFβ3 i P_0-GGFβ3; Myszy Trp53 ^+/- guzy osłonki nerwów obwodowych najczęściej występują w nerwach trójdzielnych i kulszowych. Nawet jeśli rażąco widoczne guzy nie są widoczne w połączeniu z tymi nerwami, napraw i osadź te nerwy zgodnie z poniższym opisem, aby można je było zbadać pod kątem obecności mikroguzów. Mikroguzy zwykle występują w zwojach związanych z tymi nerwami.
5. Pokrój rażąco widoczne guzy na trzy części (Rysunek 1A). Użyj elementu 1 do histologii (skrawki parafiny, immunohistochemia i histochemia). Użyj elementu 2, aby założyć kultury wczesnego przejścia. Zamroź fragment 3 (przy użyciu ciekłego azotu) do ewentualnych przyszłych eksperymentów (np. Immunobloty, izolacja RNA i DNA).
6. Utrwalić kawałek 1 do 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez noc w temperaturze 4 ^oC. Resztę ciała zwierzęcia utrwalić przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na noc w temperaturze 4 °C.

2. Osadzanie w parafinie rażąco widocznych guzów i przygotowanie skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną do wstępnej oceny diagnostycznej

1. Osadzanie parafiny w rażąco widocznych guzach
   1. Po utrwaleniu kawałka guza 1 przez noc w 4% paraformaldehydzie, przepłucz tkankę, umieszczając ją w objętości PBS, która jest co najmniej 10 razy większa niż objętość tkanki przez 15 minut; używaj tej samej objętości do wszystkich kolejnych płukań. Powtórz dwa kolejne 15-minutowe płukania PBS, używając świeżej objętości PBS do każdego płukania.
   2. Przenieś kawałek guza 1 do 70% etanolu. Przechowywać tkankę w 70% etanolu przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby przechowuj tkankę przez długi czas w tych warunkach.
      UWAGA: Kroki od 2.1.1 do 2.1.7 są dostępne z myślą o badaczach, którzy nie mają dostępu do komercyjnej maszyny do przetwarzania tkanek. Jeśli badacz ma dostęp do procesora tkanek, tkanka zostanie przetworzona za pomocą klasyfikowanych etanoli i ksylenów zgodnie z zaprogramowanym protokołem instrumentu.
   3. Przenieś kawałek guza od 1 do 80% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzać inkubację przez dodatkowe 30 minut w świeżej objętości 80% etanolu.
   4. Przenieś kawałek guza od 1 do 95% etanolu przez 75 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć inkubację jeszcze dwa razy, za każdym razem przez dodatkowe 75 minut w świeżej objętości 95% etanolu.
   5. Przenieś kawałek guza od 1 do 100% etanolu i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć 60-minutową inkubację jeszcze dwa razy, za każdym razem używając świeżej objętości 100% etanolu.
   6. Przenieś fragment guza 1 do rozpuszczalnika na bazie d-limonenu i inkubuj przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fragment guza 1 do świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu i inkubuj przez dodatkowe 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Przenieść fragment guza 1 do rozpuszczalnika na bazie parafiny/d-limonenu w stosunku 1:1 przez 1 godzinę w temperaturze 60 ^oC. Odrzucić rozpuszczalnik na bazie parafiny 1:1 / d-limonenu i przenieść kawałek guza od 1 do 60 ^oC parafiny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 60 ^oC. Powtórzyć inkubację w świeżej objętości parafiny o temperaturze 60 ^oC ponownie przez 20 minut. Inkubować fragment guza 1 w parafinie przez noc w temperaturze 60 ^oC.
   8. Wlej warstwę bazową parafiny do stalowej formy histologicznej i pozwól jej zastygnąć. Przenieś kawałek guza 1 na powierzchnię parafiny bazowej i natychmiast po umieszczeniu przykryj tkankę parafiną o temperaturze 60 ^oC i umieść kasetę z tkanką na wierzchu stopionej parafiny i w kontakcie z nią. Przenieś formę na zimną stronę stacji zatapiania i pozwól jej zastygnąć przez 10-15 minut.
   9. Wyjmij blok parafiny z dołączoną kasetą na chusteczki z formy. Użyj dołączonej kasety na tkanki, aby zacisnąć blok w mikrotomie podczas cięcia.
      UWAGA: Blok parafiny może być teraz przechowywany w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj barwione hematoksyliną i eozyną skrawki rażąco widocznych guzów.
   1. Wytnij 4-5 μm skrawki tkanki nowotworowej za pomocą mikrotomu i zamontuj je na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych.
   2. Aby przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), należy odparafinować skrawki tkanki poprzez inkubację szkiełek w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć inkubację w świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 10 minut.
   3. Przenieś szkiełka do 100% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść szkiełka do świeżej objętości 100% etanolu i inkubować przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Przenieś szkiełka do 95% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełka do świeżej objętości 95% etanolu i inkubuj przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Przenieś szkiełka do 70% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś do 50% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Przenieś szkiełka do wody destylowanej i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Wybarwić szkiełka, zanurzając je w hematoksylinie na 5 minut w temperaturze pokojowej. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 1-2 min. Wyróżnij się, zanurzając szkiełka 2-5 razy w 0,5% kwasie solnym w 70% etanolu. Płukać pod bieżącą kąpielą z kranu przez 1-2 minuty. Umieść szkiełka w 95% etanolu z 0,5% kwasem octowym na 10 s.
   8. Barwieć szkiełka eozyną-Y przez 30 s w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść szkiełka do 100% etanolu na 5 minut. Próbki należy oczyścić w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 5 minut.
   9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu, gdy szkiełko jest jeszcze mokre rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu. Poczekaj, aż podłoże montażowe zastygnie przez noc.
      UWAGA: Nie używaj medium montażowego na bazie wody.
3. Przygotuj tkanki bez rażąco widocznych guzów w celu identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych i mikro-MPNST. Zanurz tkanki w parafinie, przygotuj skrawki histologiczne i wybarwij te skrawki hematoksyliną i eozyną.
   1. Usuń narządy wewnętrzne i osadź reprezentatywne części każdego narządu w parafinie, aby przygotować skrawki wybarwione H&E, które zostaną zbadane pod kątem mikroskopijnych dowodów guzów (Rysunek 1B). Usuń głowę, kończyny przednie, kończyny tylne i ogon (Rysunek 1C). Aby zbadać rdzeń kręgowy i korzenie nerwowe in situ pod kątem oznak guzów korzeni nerwowych, należy odwapnić kręgosłup i związane z nim żebra oraz tkanki miękkie przez zanurzenie w 0,3 M EDTA/4% paraformaldehye (pH 8,0) przez 48-72 godzin w temperaturze 4 ^oC; następnie przepłukać próbki 1x PBS. Pod koniec odwapniania upewnij się, że odwapnienie zostało zakończone, próbując przebić kręgosłup igłą. Odwapnienie jest skuteczne, jeśli igła łatwo wnika w kość bez chrupania.
   2. Wytnij odwapniony kręgosłup i związane z nim struktury na bloki, które zmieszczą się w kasecie na tkanki. Odwodnić za pomocą klasyfikowanych etanoli, a następnie rozpuszczalnika na bazie d-limonenu, jak opisano w krokach 2.1.2-2.1.7. Zanurzyć w parafinie i przygotować skrawki 4-5 μm zgodnie z opisem w krokach 2.1.7-2.2.1. Wykonaj barwienie H&E zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.9; Poczekaj, aż medium montażowe stwardnieje przez noc.

3. Zidentyfikuj potencjalne nerwiakowłókniaki splotowate i wykonaj specjalne barwienie, aby potwierdzić diagnozę

UWAGA: Zdecydowanie zalecamy włączenie doświadczonego patologa ludzkiego lub weterynaryjnego do oceny H&E i specjalnych plam na odcinkach guza GEM.

1. Zbadaj szkiełka barwione H&E przygotowane zgodnie z powyższym opisem za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu zidentyfikowania potencjalnych guzów osłonki nerwów obwodowych. Ponieważ nerwiakowłókniaki i MPNST powstają w nerwach obwodowych, ważne jest, aby ustalić, czy mikroskopijne guzy są związane z nerwem obwodowym. Zidentyfikuj bloki z potencjalnymi guzami osłonki nerwów obwodowych, aby można było wykonać barwienia immunologiczne i inne specjalne barwienia w celu potwierdzenia lub obalenia diagnozy.
2. Odróżnienie potencjalnych PN od MPNST/innych nowotworów o wysokim stopniu złośliwości na podstawie cech histologicznych obserwowanych podczas badania w jasnym polu skrawków barwionych H&E. Ludzkie PN są łagodnie hiperkomórkowymi nowotworami złożonymi głównie z komórek o wydłużonych, często falistych jądrach. W wielu obszarach komórki są luźno upakowane i mogą być oddzielone przez śluzowaty materiał zewnątrzkomórkowy; PN u myszy P 0-GGFβ3 mają podobny wygląd. Mitozy zazwyczaj nie są obecne; jeśli tak jest, a guz jest umiarkowanie lub wysoce hiperkomórkowy, guz jest MPNST lub innym rodzajem nowotworu o wysokim stopniu złośliwości (patrz poniżej).
3. PN składają się z mieszaniny nowotworowych komórek Schwanna i innych nienowotworowych typów komórek, takich jak komórki tuczne. Aby potwierdzić tożsamość PN, należy wykonać barwienie immunologiczne dla markerów komórek Schwanna S100β i Sox10 oraz markera komórek tucznych CD117 (c-Kit) na odcinkach z bloków zawierających potencjalne PN zidentyfikowane w badaniu H&E (patrz sekcja 3.4 dla alternatywnych opcji barwienia markerów komórek tucznych). Wykonaj barwienie immunologiczne Ki67, aby potwierdzić niskie tempo proliferacji.
   UWAGA: W tabeli 1 wymieniono markery antygenowe stosowane do rutynowej identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnozy MPNST oraz do pełnej oceny innych typów komórek obecnych w nerwiakowłókniakach; te ostatnie antygeny wybarwiamy tylko wtedy, gdy po raz pierwszy opisujemy nowy model GEM. Zapoznaj się z arkuszem danych producenta przeciwciał, aby uzyskać informacje na temat zalecanych warunków. Zwróć uwagę, czy ulotka producenta przeciwciała zaleca pobranie antygenu; Nie wszystkie antygeny wymagają pobrania, aby były wykrywalne.
   1. Z wybranych bloków parafinowych należy przygotować skrawki o wielkości 4-5 μm i zamontować je na dodatnio naładowanych szkiełkach. Odparafinować sekcje zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.6.
   2. Płukać sekcje 1x PBS przez 3-5 min.
   3. Jeśli producent przeciwciał zaleca pobranie antygenu, należy przygotować bufor cytrynianowy. Połącz 9 ml roztworu kwasu cytrynowego (10,5 g kwasu cytrynowego w 500 ml wody destylowanej) i 41 ml roztworu cytrynianu sodu (14,7 g cytrynianu sodu w 500 ml wody destylowanej).
   4. Wykonaj pobieranie antygenu, umieszczając szkiełka w buforze cytrynianowym na 20 minut w podgrzewanym urządzeniu do gotowania ryżu.
   5. Przenieś szkiełka do 3% nadtlenku wodoru/1x PBS na 10 minut, aby wyeliminować aktywność peroksydazy w tkance.
      UWAGA: Roztwór ten należy za każdym razem sporządzać świeżo i nie używać podstawowego roztworu nadtlenku wodoru, jeśli jest starszy niż 3-4 miesiące.
   6. Wypłucz sekcje w 1x PBS.
   7. Blokuj sekcje za pomocą bufora blokującego (2% BSA, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez 1 h. Krótko przepłukać szkiełka w 1x PBS.
   8. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe do skrawków tkanki. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczonym buforze blokującym. Inkubować szkiełka przez 2 godziny w temperaturze 37 ^oC lub przez noc w temperaturze 4 ^oC.
   9. Myj szkiełka w 1x PBS przez 5 min. Powtórz 3x.
   10. Inkubować tkankę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 1-2 godziny.
   11. Przygotuj roztwór diaminobenzydyny (DAB) w oparciu o protokół producenta i zanurz szkiełka w roztworze na 2-10 minut. Umyj szkiełka w wodzie na 5 minut.
   12. Przeciwdziałaj barwieniu skrawków, zanurzając je w hematoksylinie na 10-15 min. Wystawić na działanie bieżącej wody, aż będzie klarowna. Szybko zanurz szkiełka w alkoholu i opłucz szkiełka w wodzie.
   13. Odwodnić szkiełka w stopniowanych etanolach, szybko zanurzając szkiełka, 4-5 razy na roztwór, w 70% etanolu, 95% etanolu, a następnie 100% etanolu. Inkubować szkiełka w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 2 minuty. Inkubować szkiełka w drugiej partii rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 2 minuty.
   14. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu.
   15. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopii jasnego pola.
   16. W przypadku immunofluorescencji należy pominąć kroki 3.3.10-3.3.15. Zamiast tego inkubuj tkankę ze specyficznym dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 1-2 godziny.
   17. Płukać szkiełka w 1x PBS przez 5 min. Powtórzyć 3x.
   18. Zamontuj szkiełka za pomocą 1x PBS/glicerol.
   19. Zbadaj preparaty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
4. Alternatywna metoda barwienia komórek tucznych: barwienie błękitem toluidynowym
   1. Przygotować roztwór podstawowy błękitu toluidynowego, rozpuszczając 1 g błękitu toluidynowego O w 100 ml 70% etanolu.
   2. Przygotować 1% roztwór chlorku sodu (NaCl), rozpuszczając 0,5 g NaCl w 50 ml wody destylowanej. Mieszaj do rozpuszczenia. Dostosuj pH do około 2,0-2,5 za pomocą HCl.
      UWAGA: Ten roztwór NaCl musi być świeży za każdym razem, gdy wykonywane są barwienia.
   3. Przygotować roztwór roboczy błękitu toluidynowego, dodając 5 ml roztworu podstawowego błękitu toluidyny do 45 ml 1% roztworu NaCl. Dobrze wymieszaj i upewnij się, że pH wynosi około 2,3,3,
      UWAGA: pH wyższe niż 2,5 spowoduje barwienie z mniejszą metachromazją. Spraw, aby ten roztwór był świeży za każdym razem, gdy wykonywane jest barwienie.
   4. Odparafinować sekcje 4-5 μm zamontowane na dodatnio naładowanych szkiełkach, jak opisano w krokach 2.2.2-2.2.6. Odparafinowane sekcje myć pod bieżącą wodą przez 2 min.
   5. Skrawki plamić w roztworze roboczym błękitu toluidynowego przez 2-3 min. Myć w wodzie destylowanej przez 2 min.
   6. Odwodnić sekcje, zanurzając 10x w 95% etanolu. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 10x. Zanurz szkiełka w świeżym 100% etanolu jeszcze 10 razy.
   7. Inkubować szkiełka w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 2 minuty. Inkubować szkiełka w drugiej partii rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 2 minuty.
   8. Szkiełka nakrywkowe należy zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu, gdy szkiełko jest jeszcze mokre rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu.
      UWAGA: Nie używaj medium montażowego na bazie wody.
   9. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopii jasnego pola. Zidentyfikuj komórki tuczne na podstawie obecności ciemnofioletowych granulek w ich cytoplazmie. Inne typy komórek są zabarwione na jasnoniebiesko.

4. Specjalne plamy do diagnozowania MPNST i wykluczania alternatywnych diagnoz

1. Wygląd histologiczny ludzkich MPNST jest bardzo zmienny, a kilka różnych typów nowotworów ma wygląd podobny do MPNSTs²⁸. Ponieważ MPNST pochodzą z linii komórek Schwanna, określ, czy guz powstaje z nerwu obwodowego, czy w obrębie istniejącego łagodnego PN, poprzez badanie ogólne lub badanie mikroskopowe w jasnym polu skrawków barwionych H&E. Chociaż czasami MPNST nie są wykrywane w związku z nerwem obwodowym lub PN (zwykle z powodu nieumyślnego oddzielenia się od nerwu podczas rozwarstwienia, zniszczenia istniejącego wcześniej PN przez przerost MPNST lub dlatego, że zmiana jest przerzutowa), szukaj związku guza z nerwem lub PN, ponieważ diagnoza jest mniej prawdopodobna, jeśli guz nie jest związany z nerwem lub PN.
2. Przygotuj skrawki o wielkości 4-5 μm z bloków parafinowych zawierających potencjalne MPNST i zamontuj je na dodatnio naładowanych szkiełkach, jak opisano w kroku 2.2.1. Odparafinować sekcje zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.6.
3. Przeprowadzić immunohistochemię z panelem przeciwciał wskazanym w Tabeli 2, jak opisano w krokach 3.3.1-3.3.15.
4. Zbadaj barwniki immunologiczne za pomocą mikroskopii jasnego pola. Ponieważ MPNST wykazują różnicowanie Schwanna, należy szukać jednolitej lub niejednolitej immunoreaktywności dla S100β, nestyny i Sox10. Jeśli guzy nie są dodatnie dla tych trzech markerów, zapoznaj się z Tabelą 2 w celu ustalenia diagnozy.
   UWAGA: Ludzkie i mysie MPNST mogą wykazywać rozbieżne różnicowanie. Na przykład niektóre ludzkie MPNST wykazują ogniskowe zróżnicowanie rabdomyoblastyczne (warianty te są znane jako złośliwe guzy trytona); chociaż nowotwory te będą barwić się na markery Schwanniana, wyrażają również markery mięśniowe, takie jak desmina, MyoD1 i miogenina. Immunoreaktywność tych ostatnich markerów nie powinna zniechęcać badaczy do diagnozowania guza jako MPNST. Chociaż wiele modeli myszy warunkowo wyrażających gen fuzyjny SS18-SSX zostało uznanych za modelujące patogenezę mięsaka maziowego²⁹, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, modele mięsaka maziowego, które spontanicznie generują równoważny transkrypt fuzyjny, nie są znane. W związku z tym nie szukamy transkryptów fuzyjnych SS18-SSX w guzach GEM i zamiast tego polegamy na profilach immunohistochemicznych.

5. Klasyfikacja MPNST

1. Określ, czy występuje martwica guza, cecha charakterystyczna MPNST stopnia IV WHO. W przypadku MPNST stopnia IV należy zwrócić uwagę na wyraźną hiperkomórkowość, energiczną aktywność mitotyczną (≥4 mitozy na 10 pól o dużej mocy (40x)) i atypię cytologiczną.
   1. Jeśli martwica nie jest obecna, oceń guz, aby określić, czy występuje hiperkomórkowość, energiczna aktywność mitotyczna i atypia cytologiczna. Jeśli wszystkie te cechy są obecne przy braku martwicy, należy ocenić guz jako MPNST stopnia III WHO.
   2. Guzy stopnia II WHO charakteryzują się zwiększoną komórkowością, ale w mniejszym stopniu niż MPNST stopnia III i IV WHO. Jądra komórek nowotworowych w MPNST stopnia II wg WHO wykazują zwiększony rozmiar (ponad 3 razy większy niż jądra komórek nowotworowych w nerwiakowłókniakach) i hiperchromazję. Zwiększona aktywność mitotyczna (><<4 mitozy na 10 pól o dużej mocy) jest związana z nowotworami II stopnia WHO, ale nie jest w nich wymagana. UWAGA: Ponieważ nowotwory o wyższym stopniu złośliwości zwykle rozwijają się od niższych stopni, regiony o niskim i wysokim stopniu złośliwości mogą być obecne w tym samym MPNST. W tej sytuacji stopień zaawansowania guza zależy od obecnego regionu o najwyższym stopniu złośliwości.
      UWAGA: Wśród patologów istnieją kontrowersje co do tego, czy opisany powyżej system klasyfikacji WHO jest predyktorem wyników pacjenta, a niektórzy z tych patologów wolą zamiast tego po prostu klasyfikować MPNST jako niskiego lub wysokiego stopnia. W ramach tego schematu MPNST o wysokim stopniu złośliwości mają wyraźną atypię cytologiczną, energiczną aktywność mitotyczną (>5 mitoz na 10 pól dużej mocy) i wyraźną hiperkomórkowość z martwicą lub bez. MPNST o niskim stopniu złośliwości nie mają martwicy, ale wykazują aktywność mitotyczną, atypię cytologiczną i komórkowość, która jest pośrednia między MPNST o wysokim stopniu złośliwości a atypowym nowotworem nerwiakowłókniakowym o nieznanym potencjale biologicznym (ANNUBP). Preferujemy system opisany powyżej, ponieważ rozróżnienie między ANNUBP a MPNST niskiej klasy może być wyzwaniem dla badaczy, którzy nie mają długiego doświadczenia z tymi jednostkami.

6. Przygotowanie kultur komórek MPNST 0-GGFβ3 wczesnego pasażu

1. Hodowla komórek nowotworowych P 0-GGFβ3 we wczesnym pasażu ze świeżego fragmentu guza 2 (krok 1.5, Figura 1A). Od tego momentu należy utrzymywać sterylne warunki.
   1. Zdysocjuj guz, krojąc go na małe (2-4 mm) kawałki i mieląc DMEM10 (minimalna niezbędna pożywka Dulbecco) zawierającą 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 μmol/L forskoliny i 10 nmol/L neureguliny 1β (NRG1β) w 100 mm szalkach do hodowli tkankowych.
   2. Pozwolić komórkom wyrosnąć z rozdrobnionych fragmentów tkanek w temperaturze 37 ^oC w 5% CO_{2 aż} do zlewania się płytek. Zmieniaj nośniki co 3-4 dni.
   3. Podziel kulturę komórkową. Wyjąć pożywkę z naczynia o średnicy 100 mm i umyć komórki PBS; Usuń i wyrzuć zmieloną tkankę. Usuń PBS i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć odwarstwienie komórek, delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy nie ma oderwania za pomocą mikroskopu świetlnego; W razie potrzeby przedłuż inkubację trypsyny.
   4. Zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml DMEM10. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i granulek o masie 500 × g przez 5 minut. Usuń pożywkę i dodaj 5 ml świeżego DMEM10 do osadu.
   5. Rozprowadzić zawiesinę komórek na dwie lub cztery szalki o średnicy 100 mm zawierające DMEM10. Nie należy dzielić komórek na więcej niż pięć pasaży (kroki 6.1.3 i 6.1.4) i utrzymywać je w DMEM bez forskoliny i NRG1β. Pamiętaj, aby zamrozić komórki w przejściu 2 do wykorzystania w przyszłości.

7. Weryfikacja tożsamości komórek MPNST wczesnego pasażu za pomocą immunocytochemii

1. Umieść sterylne okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe 18 mm #1.5 w dołkach 6-dołkowych sterylnych naczyń do hodowli tkankowych.
   1. Umieścić roztwór poli-L-lizyny/lamininy w studzienkach w objętości wystarczającej do przykrycia szkiełka nakrywkowego. Uszczelnij płytkę folią, aby zminimalizować parowanie. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka nakrywkowe 3x sterylnym PBS.
      UWAGA: Próbowaliśmy umieścić komórki MPNST o wczesnym pasażu na niepowlekanych szkiełkach nakrywkowych i stwierdziliśmy, że komórki nie przylegają dobrze przy braku powłoki poli-L-lizyny / lamininy.
   2. Umieść 10 000 komórek na szkiełku nakrywkowym, delikatnie dodając 2 ml zawiesiny komórkowej w pożywce wzrostowej do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli tkankowych.
   3. Następnego ranka płukać szkiełka nakrywkowe przez 2 x 5 minut za pomocą PBS.
   4. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 18 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Szkiełka nakrywkowe płukać 3 x 5 min za pomocą PBS. W razie potrzeby uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego i przechowywać ją w tym momencie w temperaturze 4 °C.
   6. Przygotuj świeże 50 mM NH₄Cl w PBS. Ugasić aldehydy, inkubując szkiełka nakrywkowe w 50 mM NH₄Cl w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Przepuszczalność komórek poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka nakrywkowe przez 3 x 5 min za pomocą PBS.
   8. Zablokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w buforze blokującym (1x PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,2% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   9. Usuń bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowe przeciwciała rozpoznające markery MPNST obecne w guzie macierzystym (zwykle S100β, Nestin i Sox10) rozcieńczone do wcześniej określonego optymalnego rozcieńczenia w buforze blokującym. Owinąć płytkę folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
   10. Przemyć 3 x 5 minut PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego. Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
   11. Mycie 3 x 5 min za pomocą PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 1-5 μg barwnika Hoechst przez 10 minut. Kontynuować ochronę przed światłem.
   12. Myj szkiełka nakrywkowe PBS przez 5 minut. Zamontuj szkiełka za pomocą 1:1 1x PBS/glicerol. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

8. Przeszczep allogeniczny komórek nowotworowych wczesnego pasażu w celu wykazania rakotwórczości

1. Hoduj komórki MPNST P 0-GGFβ3 o wczesnym pasażu w konfluencji DMEM10 do 80%. Wypłucz komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa o temperaturze pokojowej (HBSS). Traktuj komórki przez 30 s do 1 minuty nieenzymatycznym roztworem dysocjacyjnym komórek, aby usunąć je z podłoża. Dodać 5 ml DMEM10 na 1 ml nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek.
   UWAGA: Dysocjacja komórkowa może trwać znacznie dłużej, do 10-20 minut. Proszę zapoznać się z protokołem producenta.
   UWAGA: Nie hoduj komórek do zbieżności, ponieważ zmniejszy to skuteczność przeszczepu.
   1. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwiruj komórki w ilości 5 × g przez 5 minut i ponownie je zawieś w stężeniu 1-2 ×^{10 6} komórek na 100 μl DMEM10. Komórki należy przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia.
   2. Znieczulenie myszy NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) w komorze indukcyjnej parownika izofluranowego. Ułożyć zwierzę na brzuchu i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem. Przed wstrzyknięciem należy pozostawić miejsce do wyschnięcia na powietrzu. Przed wstrzyknięciem należy odczekać, aż komórki osiągną temperaturę pokojową.
   3. Wstrzyknąć 1-2 x 10⁶ komórek podskórnie w prawą flankę. Umieść mysz samą w klatce bez ściółki i pozwól jej dojść do siebie. Upewnij się, że tylko część klatki znajduje się na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Zapewnia to strefę, do której mysz może się przenieść, jeśli się przegrzeje.
      UWAGA: Szczepimy co najmniej trzy myszy z każdą kulturą wczesnego pasażu, ponieważ niektóre przeszczepy mogą nie przyjąć.
   4. Pozwól przeszczepowi rosnąć przez 15-60 dni; oceniaj stan zdrowia zwierząt 3 razy w tygodniu i rejestruj wyniki kondycji ciała, w tym wagę i zmiany w zachowaniu podczas każdego badania. Zakończ myszy, które osiągnęły maksymalny dopuszczalny rozmiar przeszczepu lub myszy w stanie agonalnym, stosując eutanazję dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Rekordowy wiek w chwili śmierci w dniach. Gdy guzy stają się widoczne na zewnątrz, zapisuj wymiary guza (długość, szerokość i wysokość).
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że różne kultury MPNST z wczesnym pasażem szczepią się z różną wydajnością i różnią się czasem wymaganym do wzrostu przeszczepu. Zwierzętom nie wolno dopuścić do przekroczenia zatwierdzonego przez IACUC maksymalnego dopuszczalnego rozmiaru guza i/lub humanitarnego punktu końcowego.
2. Pobrać guz, utrwalić go w 4% paraformaldehydzie, zanurzyć w parafinie i wykonać barwienie H&E, jak opisano w sekcjach 2.1-2.2.9, aby sprawdzić, czy przeszczep allogeniczny jest guzem, a nie tkanką reaktywną. W razie potrzeby należy wybarwić przeszczep immunologicznie pod kątem markerów, które były obecne w guzie macierzystym.

Results

Rysunek 2 ilustruje przykłady rażąco widocznych nowotworów powstających u myszy P 0-GGFβ3. Guzy, które są łatwe do zidentyfikowania gołym okiem, mogą być postrzegane jako masy rozdęte obszary ciała, jak pokazano na Rysunek 2A (strzałka). Przy ustalaniu, czy nowotwór jest potencjalnie guzem osłonki nerwów obwodowych, konieczne jest ustalenie, że guz jest związany z nerwem obwodowym. W tym przypadku skan MRI (Rysunek 2B) pokazuje, że guz jest związany z nerwem kulszowym (grot strzałki); Związek ten został potwierdzony po eutanazji myszy i wycięciu guza. Należy zauważyć, że duży rozmiar niekoniecznie oznacza, że guz jest złośliwy. W tym przypadku badanie histologiczne guza (Ryc. 2C) wykazało, że był to nerwiakowłókniak. Najczęściej jednak rażąco widoczne guzy nie są identyfikowane przed wykonaniem sekcji zwłok myszy. Rysunek 2D ilustruje duży, mięsisty MPNST, który powstał w splocie ramiennym tego zwierzęcia.

Rysunek 3 ilustruje reprezentatywne przykłady MPNST i nerwiakowłókniaków z myszy P 0-GGFβ3 przygotowanych zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 1 protokołu. Rysunek 3A-J ilustruje dziesięć przykładów niezależnie powstających MPNST z naszej kolonii myszy P_0-GGFβ3. Należy zauważyć, że histologiczny wygląd MPNST może być bardzo zmienny, nawet między MPNST powstającymi niezależnie u tego samego zwierzęcia. Ta zmienność histologiczna ilustruje, dlaczego rutynowo potwierdzamy diagnozę P 0-GGFβ3 MPNST za pomocą barwienia immunohistochemicznego. Chcielibyśmy również zwrócić uwagę, że inne, pozornie niepowiązane typy nowotworów występują sporadycznie z niską częstotliwością w niektórych wsobnych szczepach myszy (np. kilkakrotnie napotkaliśmy chłoniaki u myszy P 0-GGFβ3 przenoszących transgen na tle C57BL / 6J), co dodatkowo podkreśla znaczenie stosowania immunohistochemii do potwierdzania diagnoz guza. Pomimo zmienności ich wyglądu histologicznego, wszystkie dziesięć guzów zilustrowanych w Figura 3A-J były immunoreaktywne dla S100β i gniazda oraz ujemne dla markerów innych typów nowotworów. Rysunek 3K ilustruje reprezentatywny obraz prawidłowo odwapnionego kręgosłupa i związanych z nim tkanek. Należy pamiętać, że rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe, trzon kręgu i mięśnie szkieletowe utrzymują ze sobą prawidłowe relacje anatomiczne. Rysunek 3L to obraz o większej mocy trzonu kręgu i leżącego nad nim rdzenia kręgowego. Ponieważ tkanka ta jest odpowiednio odwapniona, kość łatwo się przecina bez rozdrabniania lub fałdowania, a szpik kostny jest łatwo rozpoznawalny w przestrzeniach szpikowych. Gdyby tkanka nie została odpowiednio odwapniona, zahaczyłaby o ostrze mikrotomu i zostałaby wyrwana z sekcji, powodując znaczne uszkodzenia sąsiednich tkanek (rdzeń kręgowy, korzenie nerwów rdzeniowych i mięśnie szkieletowe. Rysunek 3M przedstawia reprezentatywny obraz nerwiakowłókniaka powstającego w korzeniu nerwu grzbietowego u myszy P 0-GGFβ3. Zauważ, że ten guz jest mniej komórkowy niż MPNST pokazane w Rysunek 3A-J. Kluczową diagnostyką nerwiakowłókniaków jest to, że składają się one ze złożonej mieszaniny nowotworowych komórek Schwanna i nienowotworowych komórek tucznych, makrofagów, fibroblastów i elementów okołoskórych, które naciekają nerw i rozprzestrzeniają aksony.

Rysunek 4 ilustruje przykłady plam, które są najbardziej przydatne do wstępnej identyfikacji nerwiakowłókniaka splotowatego i rozróżnienia nerwiakowłókniaka splotowatego od MPNST. Rysunek 4A ilustruje immunoreaktywność S100β w nerwiakowłókniaku splotowatym P 0-GGFβ3. Należy zauważyć, że immunoreaktywność S100β jest widoczna tylko w subpopulacji komórek, co jest zgodne z faktem, że nerwiakowłókniaki składają się z mieszaniny nowotworowych komórek Schwanna i innych elementów nienowotworowych (fibroblasty, komórki tuczne, makrofagi, komórki okołobiegunowe, słabo zdefiniowana populacja komórek immunoreaktywnych CD34 i układ naczyniowy). Niestety, niejednolite barwienie S100β nie rozróżnia nerwiakowłókniaków splotowatych od MPNST, ponieważ barwienie S100β może być niejednolite w MPNST (barwienie H&E jest przydatne do tego celu; jednakże, ponieważ MPNST są zazwyczaj bardziej komórkowe niż nerwiakowłókniaki splotowate [patrz Rysunek 3]). Nowotworowe komórki Schwanna są również immunoreaktywne dla gniazda włókien pośrednich, jak wykazano w P 0-GGFβ3 MPNST przedstawionym w Rysunek 4B. Nowotworowe komórki Schwanna często wykazują również immunoreaktywność jądrową dla czynnika transkrypcyjnego Sox10, jak pokazano w MPNST w Figura 4C. Cechy przydatne do rozróżnienia nerwiakowłókniaków splotowatych i MPNST to obecność komórek tucznych i wyraźna immunoreaktywność markera proliferacji Ki67. Rysunek 4D ilustruje barwienie Unna wykonane na nerwiakowłókniaku splotowatym P 0-GGFβ3 w celu podkreślenia obecności komórek tucznych, które można łatwo zidentyfikować po wyraźnym metachromatycznym fioletowym zabarwieniu ich cytoplazmatycznych granulek. Komórki tuczne nie są obecne w MPNST. W przeciwieństwie do tego, immunoreaktywność Ki67 praktycznie nie występuje w nerwiakowłókniakach splotowatych, co widać w guzie P 0-GGFβ3 pokazanym na Rysunek 4E. Znakowanie jądrowe Ki67 jest zwykle obecne w bardzo dużej frakcji komórek nowotworowych, jak widać w mikroskopijnym MPNST powstającym w zwoju trójdzielnym myszy P 0-GGFβ3 (Figura 4F).

Rysunek 5 ilustruje przykłady barwień, które wykonujemy, aby w pełni scharakteryzować skład komórkowy nerwiakowłókniaków w nowo opracowanym modelu GEM. Chociaż plamy pokazane na tym rysunku zostały uzyskane w ludzkich nerwiakowłókniakach skóry, są one identyczne pod względem wyglądu z tym, co widzieliśmy w guzach GEM. Immunoreaktywność na CD117 (c-Kit) jest obecna w komórkach tucznych w nerwiakowłókniakach, a zatem ma rozkład bardzo podobny do tego, co obserwuje się w przypadku barwienia Unna (patrz ryc. 3A). Makrofagi są również obecne rozproszone w nerwiakowłókniakach, co widać w przypadku markera pan-makrofagów Iba1 (patrz ryc. 5D); obejmuje to podklasy makrofagów, które są immunoreaktywne dla CD163 i CD86 (patrz odpowiednio rysunek 5B i rysunek 5C). Frakcja pierwiastka Schwannian w nerwiakowłókniakach wykazuje również immunoreaktywność jądrową dla Sox10. Fibroblasty można wyróżnić na podstawie ich immunoreaktywności na TCF4. Na rysunku 5G, CD31 oznacza elementy naczyniowe w nerwiakowłókniaku, podczas gdy CD34, pokazany na rysunku 5H, oznacza enigmatyczną dendrytyczną populację komórek, które zostały zasugerowane jako subpopulacja rezydentnych makrofagów tkankowych³⁰ lub nowa populacja komórek osłonki nerwowej, które nie są ani komórkami Schwanna, ani fibroblastami³¹.

Rysunek 6 jest dołączony, aby umożliwić porównanie ludzkich nerwiakowłókniaków splotowatych i MPNST z guzami obserwowanymi u myszy P 0-GGFβ3 i dostarczyć reprezentatywnych przykładów niektórych typów ludzkich nowotworów, które mogą być mylone z MPNST. Rysunek 6A ilustruje nerwiakowłókniaka splotowatego, która powstała w splocie ramiennym pacjenta z NF1, podczas gdy Rysunek 6B przedstawia MPNST IV stopnia WHO, który powstał w tym samym nerwiakowłókniaku splotowatym. Rysunek 6B pokazuje niektóre z charakterystycznych cech MPNST IV stopnia WHO, w tym wyraźną hiperkomórkowość i atypię komórkową, energiczną aktywność mitotyczną i martwicę guza. Dla porównania, Rysunek 6C pokazuje MPNST stopnia II według WHO, który ma znaczącą atypię komórkową, ale jest mniej hiperkomórkowy niż MPNST stopnia IV i, mimo obecności mitozy, wykazuje mniejszą aktywność mitotyczną. Rysunek 6D ilustruje włókniakomięsaka z charakterystycznym wzorem "w jodełkę" przeplatających się osłonek komórek nowotworowych. Ten wzorzec niekoniecznie odróżnia włókniakomięsaki od MPNST, ponieważ niektóre MPNST będą miały podobny wzór. Co więcej, widok o wyższej mocy przedstawiony w Rysunek 6E pokazuje morfologię komórkową, która jest podobna do tej obserwowanej w MPNST klasy IV WHO przedstawionej w Rysunek 6B. Rysunek 6F ilustruje mięśniakomięsaka gładkokomórkowego. W przeciwieństwie do większości MPNST, mięśniakomięsaki gładkokomórkowe są immunoreaktywne dla markerów mięśniowych, takich jak aktyna mięśni gładkich i desmina. Immunoreaktywność aktyny mięśni gładkich może być zmienna w zależności od guza, przy czym niektóre guzy wykazują intensywną jednorodną immunoreaktywność (Figura 6G), a inne wykazują immunoreaktywność, która pokazuje zmienność komórkową w obrębie guza (Figura 6H). Immunoreaktywność Desmin może być również niejednolita w mięśniakomięsakach gładkokomórkowych (Ryc. 6I). Czerniaki są bardzo zmienne pod względem morfologii, przy czym niektóre nowotwory składają się z komórek wielokątnych (Figura 6J), a inne składają się z wrzecionowatych komórek, które mogą naśladować morfologię komórek MPNST. Czerniaki można odróżnić od MPNST na podstawie immunoreaktywności markerów melanosomów, takich jak MART1 (Figura 6K). Jednak czerniaki, takie jak MPNST, często są dodatnie dla S100β i Sox10 (Rysunek 6L).

Rysunek 7 ilustruje patologiczne cechy MPNST stopnia II, III i IV WHO wyizolowanych od myszy P0-GGFβ3. Rysunek 8 pokazuje reprezentatywne obrazy komórek MPNST P 0-GGFβ3 o niskiej (Rysunek 7A) i wysokiej (Rysunek 7B) mocy. Rakotwórczość tych komórek jest wykazana zarówno przez ich zdolność do tworzenia kolonii, gdy są zawieszone w miękkim agarze (Figura 7C), jak i do tworzenia przeszczepów po alloprzeszczepie podskórnym u myszy z niedoborem odporności (Figura 7D).

Rysunek 1: Przepływ pracy używany do przetwarzania guza i innych tkanek myszy P 0-GGFβ3. (A) Rażąco widoczne guzy są zbierane i dzielone na trzy porcje w celu: 1) utrwalenia w 4% paraformaldehydzie, a następnie immunohistochemii i histochemii, 2) ustanowienia hodowli komórek nowotworowych we wczesnym pasażu i / lub analiz genomowych oraz 3) szybkiego zamrażania przy użyciu ciekłego azotu do izolacji białek, DNA lub RNA. (B) Po wycięciu guza ciało myszy utrwala się w 4% paraformaldehydzie, a narządy wewnętrzne są usuwane. Narządy te są pobierane do badania histologicznego wykonywanego w celu zidentyfikowania mikroskopijnych dowodów nowotworu i innych procesów patologicznych. (C) Po usunięciu narządów wewnętrznych z tuszy usuwa się kończyny (głowę, kończyny, ogon) i skórę. Kręgosłup, przyległe żebra i sąsiednie mięśnie szkieletowe są odwapniane za pomocą 0,3 M EDTA/4% paraformaldehydu (pH 8,0). Odwapnione tkanki są następnie zatapiane w parafinie, a skrawki tkanek przygotowywane do badania immunohistochemicznego i histochemicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy rażąco widocznych nerwiakowłókniaków i MPNST u myszy P 0-GGFβ3. (A) Mysz P 0-GGFβ3 z dużym, wyraźnie widocznym guzem na prawym boku (strzałka). (B) Skan MRI tej myszy pokazuje, że guz jest połączony z nerwem kulszowym (grot strzały) i że wyrósł przez leżącą nad nim powięź, aby rozszerzyć się w obrębie podskórnej (strzałka, masa guza). (C) Badanie mikroskopowe tego guza pokazuje, że pomimo swoich dużych rozmiarów, guz jest nerwiakowłókniakiem. (D) Duży mięsisty MPNST, który powstał w splocie ramiennym myszy P 0-GGFβ3. Podziałka = 100 μm. (C). Skróty: MPNST = złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych; MRI = rezonans magnetyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy MPNST, odwapnionego kręgosłupa i nerwiakowłókniaków przygotowane zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu. (A-J) Wycięte i barwione H&E P 0-GGFβ3 MPNST wykazują zmienność histologiczną. Wszystkie obrazy są niezależnie powstającymi MPNST. Pomimo tej zmienności histologicznej, wszystkie te guzy wykazywały odpowiednie oznakowanie dla markerów MPNST wskazanych w Tabeli 1. Podziałka = 200 μm. (K) Reprezentatywny obraz przekroju poprzecznego odwapnionego kręgosłupa wybarwionego H&E. Na tym obrazie można łatwo zobrazować następujące struktury: rdzeń kręgowy; kość kręgowa; zwoje korzenia grzbietowego na grzbietowym korzeniu nerwu rdzeniowego; i mięśnie szkieletowe przykręgosłupowe. Powiększenie 4x. (L) Obraz rdzenia kręgowego i kręgu o większej mocy pokazany w K pokazuje prawidłowy wygląd kości po odwapnieniu za pomocą tej metodologii. Powiększenie 10x. (M) Reprezentatywny obraz nerwiakowłókniaka korzenia nerwu grzbietowego u myszy P_0-GGFβ3. Powiększenie 40x. Podziałka = 100 μm. Skróty: MPNST = złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych; H&E = hematoksylina i eozyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Barwnik diagnostyczny używany do wstępnej identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych i ich odróżnienia od MPNST. (A) Barwienie immunologiczne dla S100β w nerwiakowłókniaku splotowatym P 0-GGFβ3. Należy zauważyć, że intensywne brązowe zabarwienie tego antygenu występuje tylko w podzbiorze komórek w tym guzie, co jest zgodne z faktem, że nerwiakowłókniaki składają się z nowotworowych komórek Schwanna i wielu innych typów komórek nienowotworowych. (B) Obraz immunofluorescencyjny P 0-GGFβ3 MPNST wybarwiony dla gniazda włókien pośrednich (czerwony) i wybarwiony przeciwstawnie bisbenzimidem (niebieski, barwnik jądrowy). (C) MPNST barwiony na czynnik transkrypcyjny Sox10. Intensywna immunoreaktywność (brązowa) jest widoczna w jądrach podzbioru komórek nowotworowych. (D) Widok o dużej mocy nerwiakowłókniaka splotowatego P 0-GGFβ3 po barwieniu Unna. To zabarwienie powoduje metachromatyczne (fioletowe) zabarwienie granulek w komórkach tucznych. Nerwiakowłókniaki splotowate można odróżnić od MPNST, ponieważ te ostatnie nie mają komórek tucznych. (E,F) Immunohistochemia Ki67 w (E) A P 0-GGFβ3 nerwiakowłókniaku splotowatym i (F) A P_0-GGFβ3 MPNST. Obie sekcje zostały podbarwione przeciwwagowo hematoksyliną (niebieskie barwienie jądrowe), przy czym immunoreaktywność Ki67 jest widoczna jako brązowe barwienie jądrowe w tych barwieniach immunoperoksydazy. Należy zauważyć, że w nerwiakowłókniaku splotowatym nie jest widoczne brązowe zabarwienie jądrowe, podczas gdy większość jąder komórek nowotworowych jest dodatnia w MPNST. Podziałka = 100 μm. Skrót: MPNST = złośliwy guz osłonki nerwu obwodowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy barwników immunologicznych używane do identyfikacji subpopulacji komórek tworzących nerwiakowłókniaki. Te immunofluorescencyjne obrazy z ludzkiego nerwiakowłókniaka skóry zostały wybarwione pod kątem (A) CD117 (c-Kit; marker komórek tucznych), (B) CD163 (makrofagi M2), (C) CD86 (makrofagi M1), (D) Iba1 (marker pan-makrofagów), (E) Sox10 (marker komórek Schwanna), (F) TCF4 (marker fibroblastów), (G) CD31 (marker naczyń krwionośnych) i (H) CD34 (oznacza odrębną, słabo poznaną subpopulację komórek w nerwiakowłókniakach). Powiększenie 60x, podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy nerwiakowłókniaków splotowatych, MPNST i niektórych innych typów nowotworów ludzkich, które są brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej MPNST. (A) Nerwiakowłókniak splotowaty powstający w splocie ramiennym pacjenta z NF1, pokazujący ogólną dolną komórkowość i łagodny wygląd tego nowotworu. Chociaż nie jest to łatwe do uwidocznienia w skrawkach wybarwionych H&E, obecna jest złożona mieszanina typów komórek. Mitozy nie są widoczne. Powiększenie: 40x. (B) MPNST IV stopnia WHO, który powstał z nerwiakowłókniaka splotowatego zilustrowanego w A. Zwróć uwagę na znacznie wyższy stopień komórkowości. Strzałka wskazuje figurę mitotyczną, a gwiazdka oznacza obszar martwicy guza w prawej górnej części tego mikroskopijnego pola. Powiększenie: 40x. (C) Stopień WHO II MPNST. Guz ten ma niższy stopień komórkowości niż MPNST stopnia IV WHO zilustrowany w B. Jednak jest więcej atypii jądrowej i hiperchromazji niż jest to widoczne w nerwiakowłókniaku splotowatym zilustrowanym w A. Strzałka wskazuje jedną z okazjonalnych figur mitotycznych, które napotkano w tym nowotworze. Powiększenie: 63x. (D) Widok włókniakomięsaka typu dorosłego o niskiej mocy, ilustrujący wzór "jodełki" (przeplatające się osłonki komórek nowotworowych) typowo obserwowany w tym typie nowotworu. Niestety, architektura jodełki występuje również w niektórych ludzkich MPNST i dlatego nie może być używana do rozróżnienia włókniakomięsaków od MPNST. Powiększenie: 20x. (E) Widok włókniakomięsaka o wyższej mocy zilustrowany w D. Zwróć uwagę na podobieństwo między morfologią komórkową w tym włókniakomięsaku a morfologią komórkową widoczną w MPNST IV stopnia WHO pokazanym w B. Powiększenie: 40x. (F) Obraz mięśniakomięsaka gładkokomórkowego o dużej mocy, pokazujący morfologię komórkową, która mieści się w zakresie zmienności obserwowanej w MPNST. Powiększenie: 40x. (G) Barwienia immunologiczne dla aktyny mięśni gładkich w mięśniakomięsaku gładkokomórkowym zilustrowane na F. Należy zauważyć, że komórki nowotworowe wykazują jednolitą intensywną immunoreaktywność dla tego antygenu. Powiększenie: 40x. (H) Barwienia immunologiczne dla aktyny mięśni gładkich w innym mięśniakomięsaku gładkokomórkowym. W tym guzie występuje większa zmienność stopnia immunoreaktywności, przy czym niektóre komórki barwią się intensywniej niż inne. Nierzadko zdarza się, że immunoreaktywność tego samego antygenu jest jednolicie obecna w jednym guzie i jest obecna tylko w podzbiorze komórek nowotworowych w innym nowotworze. Powiększenie: 40x. (I) Barwienie immunologiczne desminy w trzecim mięśniakomięsaku gładkokomórkowym. W tym guzie tylko podzbiór komórek nowotworowych jest intensywnie immunoreaktywny dla tego antygenu. (J) Czerniak z przerzutami. Czerniaki są znane z bardzo zmiennej morfologii, która może wahać się od prostopadłościennej do wrzecionowatej; Guzy o tej drugiej morfologii są najprawdopodobniej mylone z MPNST, szczególnie biorąc pod uwagę, że zarówno czerniaki, jak i MPNST mogą wykazywać immunoreaktywność S100β i Sox10. Powiększenie: 40x. (K) Immunoreaktywność markera czerniaka MART1 w guzie zilustrowanym w J. Powiększenie: 40x. (L) Immunoreaktywność jądrowa dla czynnika transkrypcyjnego Sox10 w czerniaku pokazanym w J. Powiększenie: 40x, podziałka = 100 μm. Skrót: MPNST = złośliwy guz osłonki nerwu obwodowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Reprezentatywne obrazy MPNST klasy II-IV WHO P. 0-GGFβ3. (A) Mikrofotografie o niskiej i (B) dużej mocy MPNST klasy II WHO. Należy zauważyć, że komórkowość jest niższa niż MPNST stopnia III WHO zilustrowany w panelu C i że jądra komórek nowotworowych w D są bardziej hiperchromatyczne (ciemniejsze) niż te widoczne w panelu B. (C) Mikrofotografie o małej i (D) dużej mocy klasy III MPNST WHO. Guz ten wykazywał >4 figury mitotyczne na 10 pól o dużej mocy, z komórkami, które były gęściej upakowane i bardziej hiperchromatyczne, nietypowe jądra. (E) Widoki małej i (F) dużej mocy MPNST klasy IV WHO. Zwróć uwagę na ognisko martwicy w dolnej środkowej części panelu F. Niska moc = 20x. Wysoka moc = 40x, podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Reprezentatywne obrazy komórek MPNST 0-GGFβ3 o wczesnym pasażu i ich rakotwórczości, co wykazano przez wzrost w miękkim agarze i ich zdolność do wzrostu jako przeszczepy allogeniczne. (A) Obrazy kontrastu fazowego o niskiej i (B) dużej mocy komórek MPNST_0-GGFβ3 we wczesnym pasażu. (C) Komórki P 0-GGFβ3 MPNST wyhodowane w miękkim agarze i barwione czernią sudańską; Kolonie są widoczne jako puncta w agarze . (D) Obraz guza wybarwiony hematoksyliną i eozyną, który powstał po tym, jak komórki P 0-GGFβ3 MPNST zostały przeszczepione podskórnie u myszy z niedoborem odporności, jak opisano w protokole. (E) Proliferacja komórek MPNST P 0-GGFβ3 o wczesnym pasażu w okresie 5 dni, jak określono za pomocą cytometru obrazowego Celigo. Niska moc = 10x, wysoka moc = 40x; Podziałka = 100 μm dla wszystkich paneli Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: jedn. powiedział: powiedział: powiedział: jedn. powiedział:

nazwa	zwyczaj	Reaktywność/klasa gatunku
CD117	Wstępnie rozcieńczony	monoklonalny królik
Płyta CD163	1:200	monoclonl myszy
Płyta CD31	1:50	królik poliklonalny
CD34	1:2000	monoklonalny królik
Płyta CD86	1:1000	monoklonalny królik
Cytokeratyna	1 μg/ml	mysz monoklonalna
Desmin powiedział:	1:50	mysz monoklonalna
Iba1	1:500	Królik poliklonalny
Czołg Ki-67	1:50	monoklonalny królik
MART1	1 μg/ml	mysz monoklonalna
Gniazdo	1:1,000	mysz monoklonalna
PMEL (liczba ogniw PMEL	1:100	Rabbot monoklonalny
Zobacz materiał S100B	1:200	królik poliklonalny
Sma	1:100	mysz monoklonalna
Sox10	Godzina 1:10	mysz monoklonalna
TCF4/TCFL2	1:100	monoklonalny królik

Tabela 1: Przeciwciała stosowane w diagnostyce nerwiakowłókniaka splotowatego i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych. Przeciwciała stosowane do rutynowej identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnozy MPNST i pełnej oceny innych typów komórek obecnych w nerwiakowłókniakach. Skrót: MPNST = złośliwy guz osłonki nerwu obwodowego.

powiedział: powiedział: powiedział:

		S100β	Gniazdo	Sox10	MART1	PMEL (liczba ogniw PMEL	Desmin powiedział:	Aktyna mięśni gładkich	Cytokeratyna	SS18-SSX Fuzja
MPNST		50-90%, zwykle ogniskowe	Pozytywne1	~30%	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus
Mięsak włóknistomięsak		Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus
mięśniakomięsak gładkokomórkowy		rzadki	Minus	Minus	Minus	Minus	50-100%	Plus	~40%	Minus
Mięsak nabłonkowy		Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Plus	Minus
Czerniak		Plus	Plus	85%	Plus	Plus	Minus	Minus	Minus	Minus
Mięsak maziowy jednofazowy		~30%	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Minus	Plus	Plus

Tabela 2: Markery używane do ustalenia tożsamości guza u ludzi. Te markery immunohistochemiczne i histochemiczne, wraz z oceną mikroskopowej morfologii guza, są wykorzystywane do odróżniania MPNST od innych nowotworów, które je naśladują. Diagnostyka różnicowa zwykle brana pod uwagę w przypadku ludzkich MPNST obejmuje włókniakomięsaka typu dorosłego, mięsaka nabłonkowego, mięśniakomięsaka gładkokomórkowego, jednofazowego mięsaka maziówkowego i czerniaka. Włókniakomięsaki typu dorosłego mają mikroskopijny wzór w jodełkę i plamią się na wimentynę, ale nie S100β. Mięśniakomięsaki gładkokomórkowe, ale nie MPNST, są immunoreaktywne na desminę; Mięśniakomięsaki gładkokomórkowe mają również jądra o wyraźnie morfologii. Mięsaki nabłonkowe, ale nie MPNST, są immunoreaktywne dla cytokeratyny. Czerniaki, takie jak MPNST, mogą być S100β-dodatnie, ale są również immunoreaktywne dla MART-1 i PMEL. Skrót: MPNST = złośliwy guz osłonki nerwu obwodowego. ¹Połączenie S100β i gniazda wysoce predykcyjne MPNST.

Discussion

Przedstawione tu metody histologiczne i biochemiczne stanowią ramy do diagnozowania i charakteryzowania modeli GEM nerwiakowłókniaka i patogenezy MPNST. Z biegiem lat stwierdziliśmy, że te metodologie są bardzo przydatne do oceny patologii guzów osłonek nerwów obwodowych powstających w modelach GEM 21,25,26. Jednakże, chociaż przedstawione tutaj protokoły są przydatne do określenia, jak dokładnie guzy w modelach GEM podsumowują patologię swoich ludzkich odpowiedników, istnieją pewne ograniczenia tych strategii, które należy docenić. Po pierwsze, myszy P 0-GGFβ3 wykazują prawie całkowitą penetrację fenotypu guza, co sprawia, że stosunkowo łatwo jest uzyskać dużą liczbę myszy z nerwiakowłókniakami i MPNSTs 21,25,26, które można wykorzystać do badań genomicznych i badań przesiewowych shRNA w skali genomu. Wysoka penetracja fenotypu w tym modelu sprawia również, że myszy P 0-GGFβ3 są bardzo przydatne w badaniach przedklinicznych. Należy jednak pamiętać, że nie będzie tak w przypadku wszystkich modeli raka GEM. Dlatego podkreśliliśmy znaczenie określenia frakcji zwierząt, u których można przewidzieć, że rozwiną się nowotwory. Podczas pracy z modelem zwierzęcym, w którym rzadziej rozwijają się nowotwory, stwierdziliśmy, że korzystne jest stosowanie metod obrazowania, takich jak rezonans magnetyczny lub pozytonowa tomografia emisyjna, w celu ostatecznej identyfikacji zwierząt będących nosicielami nowotworów, które można wprowadzić do badań przedklinicznych lub innych badań. Takie podejście może być jednak zbyt kosztowne, jeśli wymagane jest wielokrotne skanowanie. Dlatego też podkreśliliśmy również znaczenie ustalenia średniego czasu przeżycia interesującego modelu GEM:²⁶ zrozumienie, kiedy można się spodziewać, że u zwierzęcia rozwinie się guz, zmniejsza liczbę skanów, które są wymagane do identyfikacji zwierząt o pożądanym fenotypie i związanych z tym kosztów.

Ważne jest również, aby zdać sobie sprawę, że duży guz u myszy jest nadal raczej niewielką ilością tkanki. W tym protokole zalecamy proces, w którym tkanka nowotworowa jest dzielona na trzy części, z porcjami poświęconymi histologii/immunohistochemii, ustanawianiu kultur komórkowych wczesnego pasażu i izolacji interesujących biomolekuł (białek, RNA, DNA). Jednak rozmiar guza będzie się różnił, a jeśli guz jest dość mały, może to wykluczyć posiadanie wystarczającej ilości tkanki do podziału w ten sposób. W takim przypadku badacz musi określić, czy priorytetem jest diagnoza nowotworu, czy inne wykorzystanie tkanki nowotworowej³². W tych okolicznościach nasze nastawienie jest takie, że musimy mieć właściwą diagnozę, aby zrozumieć, z czym pracujemy, zanim rozpoczniemy inne eksperymenty. Odkryliśmy, że diagnozę guza można zwykle łatwo ustalić przy użyciu mniej niż jednej trzeciej nowotworu. Kiedy mamy do czynienia z małymi guzami, zamiast tego zazwyczaj usuwamy niewielki fragment tkanki nowotworowej, owijamy go w tkankę histologiczną i umieszczamy w kasecie na tkanki, aby upewnić się, że tkanka nie zostanie utracona podczas przetwarzania. Wadą tego podejścia jest to, że może ono spowodować, że badacz zaniży ocenę nowotworu, jeśli pożądana jest klasyfikacja WHO; Dzieje się tak, ponieważ regiony o niższym i wyższym stopniu złośliwości często współistnieją w nowotworach, a jeśli zostanie pobrana bardzo mała próbka, uzyskany stopień będzie zależał od tego, skąd pobrano próbkę guza.

Opisane przez nas protokoły ustalania tożsamości guza osłonki nerwów obwodowych opierają się w dużej mierze na immunohistochemii. Chociaż od czasu do czasu istnieją alternatywne podejścia, które można zastosować w przypadku niektórych typów komórek (np. wykonywanie barwienia Unna w celu identyfikacji komórek tucznych), nie jest to jednolicie prawdziwe dla większości typów komórek obecnych w nerwiakowłókniakach i MPNST. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby ustalić, czy procedury immunohistochemiczne, które będą stosowane, zostały odpowiednio zoptymalizowane. Z naszego doświadczenia wynika, że kilka problemów może zagrozić immunohistochemii diagnostycznej. Niezwykle ważne jest, aby badacz wykonał serię rozcieńczeń z pierwszorzędowym przeciwciałem, którego wcześniej nie używał; Ponadto w przypadku stosowania nowej partii przeciwciała, które zostało wcześniej zoptymalizowane, należy przeprowadzić serię rozcieńczeń³³. Należy również zadbać o to, aby mieć pod ręką świeże partie odczynników. Z naszego doświadczenia wynika, że z wiekiem nadtlenek wodoru i DAB są szczególnie podatne na nieprawidłowe działanie, co może prowadzić badacza do niewłaściwej decyzji, że ich plamy są negatywne.

Profile immunohistochemiczne, które opisujemy dla nerwiakowłókniaków sploty, MPNST i różnych typów nowotworów, które są brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej MPNST, to te, z którymi najczęściej się spotykaliśmy 21,25,26,34. Ponieważ jednak rozbieżne różnicowanie nie jest rzadkością w MPNST i innych nowotworach złośliwych, badacz może napotkać profile barwienia, które różnią się nieco od tego, co tutaj opisujemy. Te niuanse są powodem, dla którego zdecydowanie zalecamy, aby w skład zespołu charakteryzującego nowy model nowotworzenia GEM wchodził doświadczony patolog ludzki lub weterynaryjny. W tym protokole zastosowaliśmy klasyfikację WHO do GEM i ludzkich MPNST. Preferujemy ten system oceniania, ponieważ kryteria oceniania są stosunkowo dobrze zdefiniowane i można je łatwo porównać między ludzkimi i mysimi MPNST ^2,28. Zwracamy jednak uwagę, że kryteria klasyfikacji WHO nie są jednolicie akceptowane przez patologów. Dzieje się tak, ponieważ nie jest jasne, czy trzy stopnie WHO, które są stosowane do MPNST, są predyktorem wyników klinicznych u pacjentów. Z tego powodu wielu patologów woli klasyfikować MPNST po prostu jako nowotwory złośliwe o niskim lub wysokim stopniu złośliwości. Stosując to podejście, około 85% MPNST uważa się za nowotwory złośliwe o wysokim stopniu złośliwości, charakteryzujące się energiczną aktywnością mitotyczną, wyraźną atypią komórkową i hiperchromazją, której może towarzyszyć martwica guza. MPNST o niskim stopniu złośliwości wykazują mniejszą komórkowość, hiperchromazję i aktywność mitotyczną.

Odkryliśmy, że przeszczep allogeniczny komórek MPNST wczesnego pasażu jest prostym sposobem weryfikacji rakotwórczości tych kultur. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne kwestie, gdy komórki nie tworzą przeszczepu allogenicznego³². Z naszego doświadczenia wynika, że podczas gdy przytłaczająca większość komórek MPNST we wczesnym pasażu tworzy przeszczep allogeniczny, od czasu do czasu spotykamy się z kulturami wczesnego pasażu, które tego nie robią. Pomimo tego niepowodzenia, macierzowa porównawcza hybrydyzacja genomowa (aCGH) i sekwencjonowanie całego egzomu wykazały, że te kultury wczesnego pasażu miały wiele nieprawidłowości genomowych zgodnych z tym, że są komórkami nowotworowymi^25,26. Znaleźliśmy również kultury wczesnopasażowe, które nie są zdrowe, zwykle dlatego, że kulturom pozwolono zlać się przed zebraniem ich do szczepienia. Komórki uszkodzone przez nieostrożne obchodzenie się (np. zbyt długa inkubacja z nieenzymatycznym roztworem dysocjacyjnym komórek pipetowanym w górę iw dół nadmierną liczbę razy) również osiągają słabe wyniki po przeszczepie. Zwracamy również uwagę, że wskazane przez nas czasy zakładania przeszczepów są szacunkowe oparte na naszym doświadczeniu. Od czasu do czasu spotykamy się z kulturami wczesnopasażowymi, które z powodzeniem zakładają przeszczepy allogeniczne, ale zajmuje to więcej czasu.

Przedstawione powyżej podejścia zapewniają kompleksowe sposoby scharakteryzowania kluczowych aspektów nowo opracowanego modelu GEM neoplazji obwodowego układu nerwowego i prawidłowego diagnozowania wszelkich nerwiakowłókniaków i MPNST, które rozwijają się u tych zwierząt. Przedstawione przez nas metody ustalania kultur MPNST z wczesnym pasażem i wykorzystywania tych kultur do przeszczepu allogenicznego również dostarczają wyraźnych dowodów na rakotwórczość nowotworów zidentyfikowanych w modelach GEM. Podkreślamy, że nie dokonujemy selekcji poszczególnych klonów przy zakładaniu kultur wczesnego pasażu. Chociaż zdajemy sobie sprawę, że pewna selekcja jest nieunikniona podczas umieszczania komórek nowotworowych w hodowlach, te wstępne odkrycia sugerują, że mutacje zidentyfikowane w kulturach GEM MPNST we wczesnym pasażu pozostają bardzo podobne do tych obecnych w guzie macierzystym. Jednak stosując aCGH, odkryliśmy również, że kontynuowanie przenoszenia tych wczesnych kultur pasażowych dla bardziej wydłużonych pasaży powoduje zmiany genomowe, które zaczynają odbiegać od tego, co widać we wcześniejszych pasażach tych komórek nowotworowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Płytki do hodowli tkankowych	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensydyna (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
Płytki 6-dołkowe	Corning Costar	3516
Kwas octowy	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Wtórny (kozi anty-mysz)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Wtórny (kozi przeciw myszy)	Invitrogen	A21043 lub A11004
Alexa Fluor 568 Wtórny (kozioł anty-króliczy)	Invitrogen	A11036
Chlorek amonu (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific	23225
Albumina	surowicy bydlęcejFisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Skrobak do komórek	Sarstedt	83.183
Ściągacz izolacji komórek	Corning	25-056-CI
Szkiełko nakrywkowe w kole	Fisher Scientific	12-545-100
Hybryda Citrisolve (rozpuszczalnik na bazie d-limonenu)	Decon Laboratories	5989-27-5
Kwas krytyczny	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratyna	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	klon D33 (M0760)
Diaminobensizdyna (DAB) Rozwiązanie	wektorowe Laboratoria	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eozyna Y	Thermo Scientific	7111
Etanol (200 dowodów)	Decon Laboratories	2716
Surowica cielęca płodu	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometr	Brightline-Hauser Scientific	1490
Kwas solny	Fisher Scientific	A144-212
Nadtlenek wodoru	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), mysz na myszy	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Inkubator	Thermo Scientific	Inkubator CO2 Heracell 240i
		12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Ciekły Azot
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Człowiek: MAD5236 (10C2), Człowiek: MAB353 (Szczur-401)
Neuregulina 1 beta	W domu	Wykonane przez SLC (dostępne również jako 396-HB-050 / CF od R& D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnologia	sc-67
SKINIENIE GŁOWY. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ myszy	Jackson Laboratory	5557
Beztłuszczowe mleko w proszku	Walmart	Marka
P0-GGFβ 3 myszy	W domu
Wosk parafinowy	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyd (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (ksylenowe podłoże montażowe)	Fisher Scientific	SP15-100
pH-metr	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Bromowodorek poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Przenośna maszyna do izoflurencji	VetEquip Systemy
PVA-DABCO (wodne podłoże montażowe)	Millipore Sigma	10981100ML
Urządzenie do gotowania ryżu	Buk Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (obecnie GA504)
	SMA Ventana Systemy Medyczne	klon 1A4
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S640
Cytrynian sodu (dwuwodny)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Stalowa forma
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Sygnalizacja komórkowa	(CH48H11) #2569
Kaseta
Toluidyna Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31