Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65740

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy metodologię oceny, czy nowotwory układu nerwowego u genetycznie modyfikowanych myszy dokładnie odwzorowują patologię ich ludzkich odpowiedników. Tutaj stosujemy te techniki histologiczne, zdefiniowane kryteria patologiczne i metodologie hodowli do nerwiakowłókniaków i złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych powstających w mysim modelu P 0-GGFβ3.

Streszczenie

Pacjenci z autosomalnym dominującym zespołem podatności na nowotwory typu 1 (NF1) często rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate (PN), które następnie przekształcają się w wysoce agresywne złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST). Zrozumienie procesu, w którym PN przekształca się w MPNST, byłoby ułatwione dzięki dostępności genetycznie modyfikowanych modeli myszy (GEM), które dokładnie replikują progresję PN-MPNST obserwowaną u ludzi z NF1. Niestety, modele GEM z ablacją Nf1 nie oddają w pełni tego procesu. To skłoniło nas do opracowania myszy P 0-GGFβ3, modelu GEM, w którym nadekspresja mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) w komórkach Schwanna powoduje rozwój PN, które z dużą częstotliwością przekształcają się w MPNST. Jednak, aby ustalić, czy nowotworzenie i progresja nowotworowa u myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy obserwowane u pacjentów z NF1, musieliśmy najpierw udowodnić, że patologia guzów osłonki nerwów obwodowych P0-GGFβ3 podsumowuje patologię ich ludzkich odpowiedników.

Tutaj opisujemy specjalistyczne metodologie używane do dokładnego diagnozowania i oceniania nowotworów obwodowego układu nerwowego w modelach GEM, używając P 0-GGFβ3 i P0-GGFβ3; Na przykład myszy Trp53 +/-. Opisujemy metody histologiczne, immunohistochemiczne i histochemiczne stosowane do diagnozowania PN i MPNST, jak odróżnić te nowotwory od innych typów nowotworów, które naśladują ich patologię, oraz jak ocenić te nowotwory. Omawiamy tworzenie kultur wczesnopasażowych z MPNST GEM, jak scharakteryzować te kultury za pomocą immunocytochemii oraz jak zweryfikować ich rakotwórczość poprzez ustanowienie alloprzeszczepów. Łącznie techniki te charakteryzują patologię PN i MPNST, które pojawiają się w modelach GEM i krytycznie porównują patologię tych mysich guzów z ich ludzkimi odpowiednikami.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich trzech dekad liczne laboratoria próbowały stworzyć mysie modele ludzkich nowotworów, wprowadzając mutacje związane z ludzkim rakiem do genomu myszy lub poprzez nadekspresję produktu genetycznego, który ulega nadekspresji w ludzkich nowotworach. Powstałe w ten sposób modele myszy modyfikowanych genetycznie (GEM) można wykorzystać do różnych celów, takich jak ustalenie, że nowo wprowadzona modyfikacja genomu inicjuje nowotworzenie nowotworu, identyfikacja innych zachodzących później zmian genetycznych lub epigenetycznych, które przyczyniają się do progresji nowotworu, oraz zdefiniowanie kluczowych szlaków sygnałowych, które napędzają inicjację i progresję guza. W przeciwieństwie do ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów, które opierają się na wykorzystaniu myszy z niedoborem odporności, modele raka GEM mają w pełni funkcjonalny układ odpornościowy, a więc dokładniej modelują odpowiedzi na potencjalne środki terapeutyczne. Jednak przy użyciu modeli raka GEM do takich celów ważne jest, aby badacze potwierdzili, że obserwacje poczynione z nowotworami GEM są istotne dla ich ludzkich odpowiedników. Walidacja ta powinna obejmować dokładną ocenę patologii nowotworów GEM oraz ustalenie, czy cechy patologiczne nowotworów GEM odzwierciedlają patologię odpowiedniego typu nowotworu ludzkiego.

Zespół podatności na nowotwory nerwiakowłókniakowatość typu 1 (NF1) jest najczęstszą chorobą genetyczną atakującą ludzki układ nerwowy, występującą u około 1 na każde 3 000-3 500 żywych urodzeń1,2,3. U osób dotkniętych NF1 rozwijają się liczne łagodne guzy osłonki nerwów obwodowych znane jako nerwiakowłókniaki w skórze (nerwiakowłókniaki skórne) oraz w dużych nerwach i splotach nerwowych (nerwiakowłókniaki splotowate). Podczas gdy zarówno nerwiakowłókniaki skórne, jak i splotowate pogarszają jakość życia pacjenta, powodując upośledzenie fizyczne, behawioralne i/lub społeczne, nerwiakowłókniaki splotowate (PN) są szczególnie niebezpieczne4,5. Dzieje się tak, ponieważ PN często przekształcają się w złośliwe guzy osłonki nerwów obwodowych (MPNST), które są agresywnymi nowotworami wrzecionowatokomórkowymi o wyjątkowo niskim wskaźniku przeżycia1,2. W dużej mierze ten niski wskaźnik przeżycia wynika z tego, że schematy radio- i chemioterapeutyczne, które są obecnie stosowane w leczeniu MPNST, są nieskuteczne. Jednak opracowanie nowych, skuteczniejszych terapii było wyzwaniem. Dzieje się tak dlatego, że pomimo tego, jak często MPNST występują u pacjentów z NF1, nadal są to rzadkie nowotwory. W rezultacie bardzo trudno jest uzyskać dużą liczbę ludzkich nowotworów do badań; wyzwaniem jest również rekrutacja wystarczającej liczby pacjentów z MPNST do badań klinicznych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono kilka modeli GEM, których celem jest uzyskanie dalszych informacji na temat nieprawidłowości napędzających patogenezę nerwiakowłókniaka i progresję PN-MPNST oraz ułatwienie badań przedklinicznych z potencjalnymi środkami terapeutycznymi.

NF1 pacjenci mają mutacje inaktywujące w jednej kopii genu NF1. Patogeneza nerwiakowłókniaka jest wywoływana, gdy mutacja inaktywująca w pozostałym funkcjonalnym genie NF1 występuje w komórce w linii komórkowej Schwanna. Co zaskakujące, gdy myszy zostały wygenerowane z mutacjami Nf1 inaktywującymi linię zarodkową, nie rozwinęły się u nich nerwiakowłókniaki6,7. Późniejsze wykazanie, że myszy z komórkami Schwanna Nf1-null i haploinsuficjencją Nf1 we wszystkich innych typach komórek (Krox20-Cre;U myszy Nf1flox/- rozwinęły się nerwiakowłókniaki splotowate, co sugerowało, że zmniejszona dawka genu Nf1 w dodatkowych typach komórek była wymagana do patogenezy nerwiakowłókniaka8. Nawet wtedy nerwiakowłókniaki splotowate w Krox20-Cre; Myszy Nf1flox/- nie rozwinęły się, aby stać się MPNST, a więc tylko częściowo naśladowały biologię swoich ludzkich odpowiedników. Patogeneza MPNST występowała, gdy mutacje Nf1 były powiązane z mutacjami w dodatkowych genach supresorowych nowotworów, takich jak Trp539 lub Cdkn2a10, ale MPNST w tych modelach GEM rozwinęły się de novo lub z atypowych nowotworów nerwiakowłókniakowatych o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs)11,12, a nie z wcześniej istniejących łagodnych nerwiakowłókniaków splotowatych (patrz13,14 za doskonałe recenzje tych modeli, jak również innych modeli wprowadzających dodatkowe mutacje powodujące utratę funkcji w genach związanych z MPNST, takich jak Suz12 i Pten15).

Te mysie modele były nieocenione dla ustalenia roli, jaką geny takie jak NF1, TP53 i CDKN2A odgrywają w patogenezie nowotworów obwodowego układu nerwowego związanych z NF1 oraz dla badań przedklinicznych testujących potencjalne środki terapeutyczne. Jednak nadal mamy niepełne zrozumienie procesu, w którym nerwiakowłókniaki splotowate przekształcają się w atypowe nowotwory nerwiakowłókniakowate o niepewnym potencjale biologicznym (ANNUBPs16), a następnie MPNST. Ostatnio poczyniono pewne postępy w zrozumieniu tego procesu dzięki niedawnemu raportowi, że myszy z delecjami w Nf1 i Arf rozwijają ANNUBPs, które stają się MPNSTs11. Jednak mysie modele oparte na mutacji Nf1, które w pełni podsumowują proces progresji nerwiakowłókniaka splotowatego-MPNST obserwowany u ludzi, jeszcze nie istnieją. Ponadto nie jest jasne, czy istnieje wiele odrębnych ścieżek, które prowadzą do rozwoju MPNST. Biorąc to pod uwagę, możliwe jest, że opisane powyżej GEM modelują tylko podzbiór kilku różnych szlaków, które prowadzą do progresji nerwiakowłókniaka-MPNST i patogenezy MPNST. Podkreśla to fakt, że MPNST również występują sporadycznie i że niektóre sporadyczne MPNST najwyraźniej nie mają mutacji NF117,18.

Chociaż ten ostatni punkt został zakwestionowany przez niedawną sugestię Magollon-Lorenz et al., że przynajmniej niektóre sporadyczne MPNST pozbawione mutacji NF1 to czerniaki lub inny typ mięsaka19, ostatnio informowaliśmy o sporadycznym MPNST i linii komórkowej pochodzącej z tego guza (komórki 2XSB), która była NF1 wild-type20. Podczas charakterystyki guza macierzystego i linii komórkowej 2XSB systematycznie wykluczaliśmy alternatywne możliwości diagnostyczne, w tym czerniaka i wiele innych typów mięsaków, które są rutynowo brane pod uwagę w diagnostyce różnicowej sporadycznego złośliwego guza osłonki nerwu obwodowego20. Ponadto zauważamy, że Magollon-Lorenz i in. przyznali, że ich odkrycia w trzech sporadycznych liniach komórkowych MPNST, które badali, nie mogą być uogólnione, aby wskazać, że wszystkie guzy zidentyfikowane jako sporadyczne MPNST nie są MPNST.

Aby skonstruować model GEM, w którym neurofibroma i patogeneza MPNST niekoniecznie były zależne od specyficznych mutacji genu supresorowego nowotworu, wygenerowaliśmy transgeniczne myszy, u których nadekspresja silnego mitogenu neureguliny-1 z komórek Schwanna (NRG1) była napędzana przez promotor białka mieliny specyficznego dla komórek Schwanna (P0) (myszy P0-GGFβ3)21. Wcześniej wykazaliśmy, że ludzkie nerwiakowłókniaki, MPNST i linie komórkowe MPNST wyrażają kilka izoform NRG1 wraz z kinazami tyrozynowymi receptora erbB (erbB2, erbB3 i erbB4), które pośredniczą w sygnalizacji NRG1 i że te receptory erbB są konstytutywnie aktywowane22. Wykazaliśmy również, że farmakologiczne inhibitory kinaz erbB silnie hamują proliferację MPNST22, survival23 i migration24. Zgodnie z naszymi obserwacjami na ludziach, myszy P 0-GGFβ3 rozwijają nerwiakowłókniaki splotowate25, które stają się MPNST z dużą częstotliwością21,25. Wykazaliśmy, że MPNST P 0-GGFβ3, podobnie jak ich ludzkie odpowiedniki, często rozwijają mutacje Trp53 i Cdkn2a, a także wiele innych nieprawidłowości genomowych, które potencjalnie przyczyniają się do nowotworzenia25. MPNST powstające u myszy P 0-GGFβ3 nie mają inaktywujących mutacji Nf1. Jednak za pomocą komplementacji genetycznej wykazaliśmy, że NRG1 promuje nowotworzenie u myszy P 0-GGFβ3 głównie poprzez te same kaskady sygnałowe, które są zmieniane przez Nf1 loss26; wniosek ten opiera się na naszym ustaleniu, że zastąpienie nadekspresji NRG1 utratą Nf1 w obecności haploinsuficjencji Trp53 (P 0-GGFβ3;Myszy Trp53 +/-) produkują zwierzęta, u których MPNST rozwijają się de novo, jak widać w cis-Nf1 +/-; Trp53+/- myszy27.

Aby uzyskać te i inne informacje pokazujące, że myszy P 0-GGFβ3 dokładnie modelują procesy patogenezy nerwiakowłókniaka i progresji nerwiakowłókniaka-MPNST obserwowanej u ludzi z NF1, opracowaliśmy specjalistyczne metodologie przetwarzania tkanek od tych zwierząt, dokładnego diagnozowania ich guzów, oceny MPNST powstających u tych myszy, ustalenia i scharakteryzowania wczesnych pasaży P0-GGFβ3 i P0-GGFβ3;Trp53 +/- hodowle MPNST i krytyczne porównanie patologii P 0-GGFβ3 PN i MPNST oraz P0-GGFβ3; Trp53 +/- MPNST do swoich ludzkich odpowiedników. Wiele z tych metodologii można uogólnić na inne modele GEM nowotworu układu nerwowego. Ponadto kilka z tych metodologii ma szersze zastosowanie do modeli GEM, w których nowotwory powstają w innych miejscach narządów. W związku z tym poniżej przedstawiamy szczegółowy opis tych metodyk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny i zostały wykonane przez odpowiednio przeszkolony personel zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz wytycznymi MUSC dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Określanie penetracji guza i przeżywalności u myszy P 0-GGFβ3 oraz identyfikacja nowotworów u tych zwierząt w celu dalszej charakterystyki

  1. Wygeneruj kohortę myszy, które zostaną ocenione pod kątem nowotworzenia. Wymagana liczba myszy zależy od penetracji fenotypu guza. Aby zrekompensować takie straty, zacznij od kohorty, która jest o 10-15% wyższa niż pożądana końcowa liczba zwierząt.
    UWAGA: Określiliśmy penetrację guza u myszy P 0-GGFβ3 empirycznie w początkowej kohorcie 50 myszy (z których sześć zostało utraconych z przyczyn niezwiązanych z neoplazją (np. walka))25.
  2. Oceniaj stan zdrowia zwierząt trzy razy w tygodniu i rejestruj wyniki kondycji ciała, w tym wagę i zmiany zachowania podczas każdego badania. Zakończ myszy z guzem lub w stanie agonalnym (patrz uwaga poniżej) za pomocą eutanazji dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Rekordowy wiek w chwili śmierci w dniach. Jeśli guzy są widoczne na zewnątrz, zapisz wymiary guza (długość, szerokość i wysokość).
    UWAGA: Istotne jest, aby zwierzęta nie mogły przekroczyć zatwierdzonego przez IACUC maksymalnego dopuszczalnego rozmiaru guza i/lub humanitarnego punktu końcowego.
  3. Korzystając z wieku w chwili śmierci, ustal krzywą przeżycia Kaplana-Meiera, aby określić średni wiek w chwili śmierci i zakres przeżycia.
    UWAGA: Myszy P 0-GGFβ3 miały średni wiek w chwili śmierci 261,5 dnia, w zakresie 74-533 dni; 91% naszej kohorty miało nerwiakowłókniaki mnogie, a 71% miało MPNSTs21.
  4. Ustal, czy obecne są rażąco widoczne guzy, a jeśli tak, wypreparuj je w sterylnych warunkach, aby ustalić, czy guz jest związany z nerwem obwodowym, a następnie wyciąć guz. w P 0-GGFβ3 i P0-GGFβ3; Myszy Trp53 +/- guzy osłonki nerwów obwodowych najczęściej występują w nerwach trójdzielnych i kulszowych. Nawet jeśli rażąco widoczne guzy nie są widoczne w połączeniu z tymi nerwami, napraw i osadź te nerwy zgodnie z poniższym opisem, aby można je było zbadać pod kątem obecności mikroguzów. Mikroguzy zwykle występują w zwojach związanych z tymi nerwami.
  5. Pokrój rażąco widoczne guzy na trzy części (Rysunek 1A). Użyj elementu 1 do histologii (skrawki parafiny, immunohistochemia i histochemia). Użyj elementu 2, aby założyć kultury wczesnego przejścia. Zamroź fragment 3 (przy użyciu ciekłego azotu) do ewentualnych przyszłych eksperymentów (np. Immunobloty, izolacja RNA i DNA).
  6. Utrwalić kawałek 1 do 4% paraformaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez noc w temperaturze 4 oC. Resztę ciała zwierzęcia utrwalić przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na noc w temperaturze 4 °C.

2. Osadzanie w parafinie rażąco widocznych guzów i przygotowanie skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną do wstępnej oceny diagnostycznej

  1. Osadzanie parafiny w rażąco widocznych guzach
    1. Po utrwaleniu kawałka guza 1 przez noc w 4% paraformaldehydzie, przepłucz tkankę, umieszczając ją w objętości PBS, która jest co najmniej 10 razy większa niż objętość tkanki przez 15 minut; używaj tej samej objętości do wszystkich kolejnych płukań. Powtórz dwa kolejne 15-minutowe płukania PBS, używając świeżej objętości PBS do każdego płukania.
    2. Przenieś kawałek guza 1 do 70% etanolu. Przechowywać tkankę w 70% etanolu przez 24 godziny w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby przechowuj tkankę przez długi czas w tych warunkach.
      UWAGA: Kroki od 2.1.1 do 2.1.7 są dostępne z myślą o badaczach, którzy nie mają dostępu do komercyjnej maszyny do przetwarzania tkanek. Jeśli badacz ma dostęp do procesora tkanek, tkanka zostanie przetworzona za pomocą klasyfikowanych etanoli i ksylenów zgodnie z zaprogramowanym protokołem instrumentu.
    3. Przenieś kawałek guza od 1 do 80% etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtarzać inkubację przez dodatkowe 30 minut w świeżej objętości 80% etanolu.
    4. Przenieś kawałek guza od 1 do 95% etanolu przez 75 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć inkubację jeszcze dwa razy, za każdym razem przez dodatkowe 75 minut w świeżej objętości 95% etanolu.
    5. Przenieś kawałek guza od 1 do 100% etanolu i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć 60-minutową inkubację jeszcze dwa razy, za każdym razem używając świeżej objętości 100% etanolu.
    6. Przenieś fragment guza 1 do rozpuszczalnika na bazie d-limonenu i inkubuj przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś fragment guza 1 do świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu i inkubuj przez dodatkowe 30-60 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieść fragment guza 1 do rozpuszczalnika na bazie parafiny/d-limonenu w stosunku 1:1 przez 1 godzinę w temperaturze 60 oC. Odrzucić rozpuszczalnik na bazie parafiny 1:1 / d-limonenu i przenieść kawałek guza od 1 do 60 oC parafiny i inkubować przez 20 minut w temperaturze 60 oC. Powtórzyć inkubację w świeżej objętości parafiny o temperaturze 60 oC ponownie przez 20 minut. Inkubować fragment guza 1 w parafinie przez noc w temperaturze 60 oC.
    8. Wlej warstwę bazową parafiny do stalowej formy histologicznej i pozwól jej zastygnąć. Przenieś kawałek guza 1 na powierzchnię parafiny bazowej i natychmiast po umieszczeniu przykryj tkankę parafiną o temperaturze 60 oC i umieść kasetę z tkanką na wierzchu stopionej parafiny i w kontakcie z nią. Przenieś formę na zimną stronę stacji zatapiania i pozwól jej zastygnąć przez 10-15 minut.
    9. Wyjmij blok parafiny z dołączoną kasetą na chusteczki z formy. Użyj dołączonej kasety na tkanki, aby zacisnąć blok w mikrotomie podczas cięcia.
      UWAGA: Blok parafiny może być teraz przechowywany w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotuj barwione hematoksyliną i eozyną skrawki rażąco widocznych guzów.
    1. Wytnij 4-5 μm skrawki tkanki nowotworowej za pomocą mikrotomu i zamontuj je na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych.
    2. Aby przeprowadzić barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), należy odparafinować skrawki tkanki poprzez inkubację szkiełek w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć inkubację w świeżej objętości rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 10 minut.
    3. Przenieś szkiełka do 100% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść szkiełka do świeżej objętości 100% etanolu i inkubować przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Przenieś szkiełka do 95% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełka do świeżej objętości 95% etanolu i inkubuj przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przenieś szkiełka do 70% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś do 50% etanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przenieś szkiełka do wody destylowanej i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Wybarwić szkiełka, zanurzając je w hematoksylinie na 5 minut w temperaturze pokojowej. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 1-2 min. Wyróżnij się, zanurzając szkiełka 2-5 razy w 0,5% kwasie solnym w 70% etanolu. Płukać pod bieżącą kąpielą z kranu przez 1-2 minuty. Umieść szkiełka w 95% etanolu z 0,5% kwasem octowym na 10 s.
    8. Barwieć szkiełka eozyną-Y przez 30 s w temperaturze pokojowej, a następnie przenieść szkiełka do 100% etanolu na 5 minut. Próbki należy oczyścić w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 5 minut.
    9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu, gdy szkiełko jest jeszcze mokre rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu. Poczekaj, aż podłoże montażowe zastygnie przez noc.
      UWAGA: Nie używaj medium montażowego na bazie wody.
  3. Przygotuj tkanki bez rażąco widocznych guzów w celu identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych i mikro-MPNST. Zanurz tkanki w parafinie, przygotuj skrawki histologiczne i wybarwij te skrawki hematoksyliną i eozyną.
    1. Usuń narządy wewnętrzne i osadź reprezentatywne części każdego narządu w parafinie, aby przygotować skrawki wybarwione H&E, które zostaną zbadane pod kątem mikroskopijnych dowodów guzów (Rysunek 1B). Usuń głowę, kończyny przednie, kończyny tylne i ogon (Rysunek 1C). Aby zbadać rdzeń kręgowy i korzenie nerwowe in situ pod kątem oznak guzów korzeni nerwowych, należy odwapnić kręgosłup i związane z nim żebra oraz tkanki miękkie przez zanurzenie w 0,3 M EDTA/4% paraformaldehye (pH 8,0) przez 48-72 godzin w temperaturze 4 oC; następnie przepłukać próbki 1x PBS. Pod koniec odwapniania upewnij się, że odwapnienie zostało zakończone, próbując przebić kręgosłup igłą. Odwapnienie jest skuteczne, jeśli igła łatwo wnika w kość bez chrupania.
    2. Wytnij odwapniony kręgosłup i związane z nim struktury na bloki, które zmieszczą się w kasecie na tkanki. Odwodnić za pomocą klasyfikowanych etanoli, a następnie rozpuszczalnika na bazie d-limonenu, jak opisano w krokach 2.1.2-2.1.7. Zanurzyć w parafinie i przygotować skrawki 4-5 μm zgodnie z opisem w krokach 2.1.7-2.2.1. Wykonaj barwienie H&E zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.9; Poczekaj, aż medium montażowe stwardnieje przez noc.

3. Zidentyfikuj potencjalne nerwiakowłókniaki splotowate i wykonaj specjalne barwienie, aby potwierdzić diagnozę

UWAGA: Zdecydowanie zalecamy włączenie doświadczonego patologa ludzkiego lub weterynaryjnego do oceny H&E i specjalnych plam na odcinkach guza GEM.

  1. Zbadaj szkiełka barwione H&E przygotowane zgodnie z powyższym opisem za pomocą mikroskopii jasnego pola w celu zidentyfikowania potencjalnych guzów osłonki nerwów obwodowych. Ponieważ nerwiakowłókniaki i MPNST powstają w nerwach obwodowych, ważne jest, aby ustalić, czy mikroskopijne guzy są związane z nerwem obwodowym. Zidentyfikuj bloki z potencjalnymi guzami osłonki nerwów obwodowych, aby można było wykonać barwienia immunologiczne i inne specjalne barwienia w celu potwierdzenia lub obalenia diagnozy.
  2. Odróżnienie potencjalnych PN od MPNST/innych nowotworów o wysokim stopniu złośliwości na podstawie cech histologicznych obserwowanych podczas badania w jasnym polu skrawków barwionych H&E. Ludzkie PN są łagodnie hiperkomórkowymi nowotworami złożonymi głównie z komórek o wydłużonych, często falistych jądrach. W wielu obszarach komórki są luźno upakowane i mogą być oddzielone przez śluzowaty materiał zewnątrzkomórkowy; PN u myszy P 0-GGFβ3 mają podobny wygląd. Mitozy zazwyczaj nie są obecne; jeśli tak jest, a guz jest umiarkowanie lub wysoce hiperkomórkowy, guz jest MPNST lub innym rodzajem nowotworu o wysokim stopniu złośliwości (patrz poniżej).
  3. PN składają się z mieszaniny nowotworowych komórek Schwanna i innych nienowotworowych typów komórek, takich jak komórki tuczne. Aby potwierdzić tożsamość PN, należy wykonać barwienie immunologiczne dla markerów komórek Schwanna S100β i Sox10 oraz markera komórek tucznych CD117 (c-Kit) na odcinkach z bloków zawierających potencjalne PN zidentyfikowane w badaniu H&E (patrz sekcja 3.4 dla alternatywnych opcji barwienia markerów komórek tucznych). Wykonaj barwienie immunologiczne Ki67, aby potwierdzić niskie tempo proliferacji.
    UWAGA: W tabeli 1 wymieniono markery antygenowe stosowane do rutynowej identyfikacji nerwiakowłókniaków splotowatych GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnozy MPNST oraz do pełnej oceny innych typów komórek obecnych w nerwiakowłókniakach; te ostatnie antygeny wybarwiamy tylko wtedy, gdy po raz pierwszy opisujemy nowy model GEM. Zapoznaj się z arkuszem danych producenta przeciwciał, aby uzyskać informacje na temat zalecanych warunków. Zwróć uwagę, czy ulotka producenta przeciwciała zaleca pobranie antygenu; Nie wszystkie antygeny wymagają pobrania, aby były wykrywalne.
    1. Z wybranych bloków parafinowych należy przygotować skrawki o wielkości 4-5 μm i zamontować je na dodatnio naładowanych szkiełkach. Odparafinować sekcje zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.6.
    2. Płukać sekcje 1x PBS przez 3-5 min.
    3. Jeśli producent przeciwciał zaleca pobranie antygenu, należy przygotować bufor cytrynianowy. Połącz 9 ml roztworu kwasu cytrynowego (10,5 g kwasu cytrynowego w 500 ml wody destylowanej) i 41 ml roztworu cytrynianu sodu (14,7 g cytrynianu sodu w 500 ml wody destylowanej).
    4. Wykonaj pobieranie antygenu, umieszczając szkiełka w buforze cytrynianowym na 20 minut w podgrzewanym urządzeniu do gotowania ryżu.
    5. Przenieś szkiełka do 3% nadtlenku wodoru/1x PBS na 10 minut, aby wyeliminować aktywność peroksydazy w tkance.
      UWAGA: Roztwór ten należy za każdym razem sporządzać świeżo i nie używać podstawowego roztworu nadtlenku wodoru, jeśli jest starszy niż 3-4 miesiące.
    6. Wypłucz sekcje w 1x PBS.
    7. Blokuj sekcje za pomocą bufora blokującego (2% BSA, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez 1 h. Krótko przepłukać szkiełka w 1x PBS.
    8. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe do skrawków tkanki. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczonym buforze blokującym. Inkubować szkiełka przez 2 godziny w temperaturze 37 oC lub przez noc w temperaturze 4 oC.
    9. Myj szkiełka w 1x PBS przez 5 min. Powtórz 3x.
    10. Inkubować tkankę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przez 1-2 godziny.
    11. Przygotuj roztwór diaminobenzydyny (DAB) w oparciu o protokół producenta i zanurz szkiełka w roztworze na 2-10 minut. Umyj szkiełka w wodzie na 5 minut.
    12. Przeciwdziałaj barwieniu skrawków, zanurzając je w hematoksylinie na 10-15 min. Wystawić na działanie bieżącej wody, aż będzie klarowna. Szybko zanurz szkiełka w alkoholu i opłucz szkiełka w wodzie.
    13. Odwodnić szkiełka w stopniowanych etanolach, szybko zanurzając szkiełka, 4-5 razy na roztwór, w 70% etanolu, 95% etanolu, a następnie 100% etanolu. Inkubować szkiełka w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 2 minuty. Inkubować szkiełka w drugiej partii rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 2 minuty.
    14. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu.
    15. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopii jasnego pola.
    16. W przypadku immunofluorescencji należy pominąć kroki 3.3.10-3.3.15. Zamiast tego inkubuj tkankę ze specyficznym dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w buforze blokującym przez 1-2 godziny.
    17. Płukać szkiełka w 1x PBS przez 5 min. Powtórzyć 3x.
    18. Zamontuj szkiełka za pomocą 1x PBS/glicerol.
    19. Zbadaj preparaty za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  4. Alternatywna metoda barwienia komórek tucznych: barwienie błękitem toluidynowym
    1. Przygotować roztwór podstawowy błękitu toluidynowego, rozpuszczając 1 g błękitu toluidynowego O w 100 ml 70% etanolu.
    2. Przygotować 1% roztwór chlorku sodu (NaCl), rozpuszczając 0,5 g NaCl w 50 ml wody destylowanej. Mieszaj do rozpuszczenia. Dostosuj pH do około 2,0-2,5 za pomocą HCl.
      UWAGA: Ten roztwór NaCl musi być świeży za każdym razem, gdy wykonywane są barwienia.
    3. Przygotować roztwór roboczy błękitu toluidynowego, dodając 5 ml roztworu podstawowego błękitu toluidyny do 45 ml 1% roztworu NaCl. Dobrze wymieszaj i upewnij się, że pH wynosi około 2,3,3,
      UWAGA: pH wyższe niż 2,5 spowoduje barwienie z mniejszą metachromazją. Spraw, aby ten roztwór był świeży za każdym razem, gdy wykonywane jest barwienie.
    4. Odparafinować sekcje 4-5 μm zamontowane na dodatnio naładowanych szkiełkach, jak opisano w krokach 2.2.2-2.2.6. Odparafinowane sekcje myć pod bieżącą wodą przez 2 min.
    5. Skrawki plamić w roztworze roboczym błękitu toluidynowego przez 2-3 min. Myć w wodzie destylowanej przez 2 min.
    6. Odwodnić sekcje, zanurzając 10x w 95% etanolu. Zanurz szkiełka w 100% etanolu 10x. Zanurz szkiełka w świeżym 100% etanolu jeszcze 10 razy.
    7. Inkubować szkiełka w rozpuszczalniku na bazie d-limonenu przez 2 minuty. Inkubować szkiełka w drugiej partii rozpuszczalnika na bazie d-limonenu przez 2 minuty.
    8. Szkiełka nakrywkowe należy zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu, gdy szkiełko jest jeszcze mokre rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu.
      UWAGA: Nie używaj medium montażowego na bazie wody.
    9. Zbadaj szkiełka za pomocą mikroskopii jasnego pola. Zidentyfikuj komórki tuczne na podstawie obecności ciemnofioletowych granulek w ich cytoplazmie. Inne typy komórek są zabarwione na jasnoniebiesko.

4. Specjalne plamy do diagnozowania MPNST i wykluczania alternatywnych diagnoz

  1. Wygląd histologiczny ludzkich MPNST jest bardzo zmienny, a kilka różnych typów nowotworów ma wygląd podobny do MPNSTs28. Ponieważ MPNST pochodzą z linii komórek Schwanna, określ, czy guz powstaje z nerwu obwodowego, czy w obrębie istniejącego łagodnego PN, poprzez badanie ogólne lub badanie mikroskopowe w jasnym polu skrawków barwionych H&E. Chociaż czasami MPNST nie są wykrywane w związku z nerwem obwodowym lub PN (zwykle z powodu nieumyślnego oddzielenia się od nerwu podczas rozwarstwienia, zniszczenia istniejącego wcześniej PN przez przerost MPNST lub dlatego, że zmiana jest przerzutowa), szukaj związku guza z nerwem lub PN, ponieważ diagnoza jest mniej prawdopodobna, jeśli guz nie jest związany z nerwem lub PN.
  2. Przygotuj skrawki o wielkości 4-5 μm z bloków parafinowych zawierających potencjalne MPNST i zamontuj je na dodatnio naładowanych szkiełkach, jak opisano w kroku 2.2.1. Odparafinować sekcje zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.6.
  3. Przeprowadzić immunohistochemię z panelem przeciwciał wskazanym w Tabeli 2, jak opisano w krokach 3.3.1-3.3.15.
  4. Zbadaj barwniki immunologiczne za pomocą mikroskopii jasnego pola. Ponieważ MPNST wykazują różnicowanie Schwanna, należy szukać jednolitej lub niejednolitej immunoreaktywności dla S100β, nestyny i Sox10. Jeśli guzy nie są dodatnie dla tych trzech markerów, zapoznaj się z Tabelą 2 w celu ustalenia diagnozy.
    UWAGA: Ludzkie i mysie MPNST mogą wykazywać rozbieżne różnicowanie. Na przykład niektóre ludzkie MPNST wykazują ogniskowe zróżnicowanie rabdomyoblastyczne (warianty te są znane jako złośliwe guzy trytona); chociaż nowotwory te będą barwić się na markery Schwanniana, wyrażają również markery mięśniowe, takie jak desmina, MyoD1 i miogenina. Immunoreaktywność tych ostatnich markerów nie powinna zniechęcać badaczy do diagnozowania guza jako MPNST. Chociaż wiele modeli myszy warunkowo wyrażających gen fuzyjny SS18-SSX zostało uznanych za modelujące patogenezę mięsaka maziowego29, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, modele mięsaka maziowego, które spontanicznie generują równoważny transkrypt fuzyjny, nie są znane. W związku z tym nie szukamy transkryptów fuzyjnych SS18-SSX w guzach GEM i zamiast tego polegamy na profilach immunohistochemicznych.

5. Klasyfikacja MPNST

  1. Określ, czy występuje martwica guza, cecha charakterystyczna MPNST stopnia IV WHO. W przypadku MPNST stopnia IV należy zwrócić uwagę na wyraźną hiperkomórkowość, energiczną aktywność mitotyczną (≥4 mitozy na 10 pól o dużej mocy (40x)) i atypię cytologiczną.
    1. Jeśli martwica nie jest obecna, oceń guz, aby określić, czy występuje hiperkomórkowość, energiczna aktywność mitotyczna i atypia cytologiczna. Jeśli wszystkie te cechy są obecne przy braku martwicy, należy ocenić guz jako MPNST stopnia III WHO.
    2. Guzy stopnia II WHO charakteryzują się zwiększoną komórkowością, ale w mniejszym stopniu niż MPNST stopnia III i IV WHO. Jądra komórek nowotworowych w MPNST stopnia II wg WHO wykazują zwiększony rozmiar (ponad 3 razy większy niż jądra komórek nowotworowych w nerwiakowłókniakach) i hiperchromazję. Zwiększona aktywność mitotyczna (><<4 mitozy na 10 pól o dużej mocy) jest związana z nowotworami II stopnia WHO, ale nie jest w nich wymagana. UWAGA: Ponieważ nowotwory o wyższym stopniu złośliwości zwykle rozwijają się od niższych stopni, regiony o niskim i wysokim stopniu złośliwości mogą być obecne w tym samym MPNST. W tej sytuacji stopień zaawansowania guza zależy od obecnego regionu o najwyższym stopniu złośliwości.
      UWAGA: Wśród patologów istnieją kontrowersje co do tego, czy opisany powyżej system klasyfikacji WHO jest predyktorem wyników pacjenta, a niektórzy z tych patologów wolą zamiast tego po prostu klasyfikować MPNST jako niskiego lub wysokiego stopnia. W ramach tego schematu MPNST o wysokim stopniu złośliwości mają wyraźną atypię cytologiczną, energiczną aktywność mitotyczną (>5 mitoz na 10 pól dużej mocy) i wyraźną hiperkomórkowość z martwicą lub bez. MPNST o niskim stopniu złośliwości nie mają martwicy, ale wykazują aktywność mitotyczną, atypię cytologiczną i komórkowość, która jest pośrednia między MPNST o wysokim stopniu złośliwości a atypowym nowotworem nerwiakowłókniakowym o nieznanym potencjale biologicznym (ANNUBP). Preferujemy system opisany powyżej, ponieważ rozróżnienie między ANNUBP a MPNST niskiej klasy może być wyzwaniem dla badaczy, którzy nie mają długiego doświadczenia z tymi jednostkami.

6. Przygotowanie kultur komórek MPNST 0-GGFβ3 wczesnego pasażu

  1. Hodowla komórek nowotworowych P 0-GGFβ3 we wczesnym pasażu ze świeżego fragmentu guza 2 (krok 1.5, Figura 1A). Od tego momentu należy utrzymywać sterylne warunki.
    1. Zdysocjuj guz, krojąc go na małe (2-4 mm) kawałki i mieląc DMEM10 (minimalna niezbędna pożywka Dulbecco) zawierającą 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 μmol/L forskoliny i 10 nmol/L neureguliny 1β (NRG1β) w 100 mm szalkach do hodowli tkankowych.
    2. Pozwolić komórkom wyrosnąć z rozdrobnionych fragmentów tkanek w temperaturze 37 oC w 5% CO2 aż do zlewania się płytek. Zmieniaj nośniki co 3-4 dni.
    3. Podziel kulturę komórkową. Wyjąć pożywkę z naczynia o średnicy 100 mm i umyć komórki PBS; Usuń i wyrzuć zmieloną tkankę. Usuń PBS i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć odwarstwienie komórek, delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy nie ma oderwania za pomocą mikroskopu świetlnego; W razie potrzeby przedłuż inkubację trypsyny.
    4. Zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml DMEM10. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i granulek o masie 500 × g przez 5 minut. Usuń pożywkę i dodaj 5 ml świeżego DMEM10 do osadu.
    5. Rozprowadzić zawiesinę komórek na dwie lub cztery szalki o średnicy 100 mm zawierające DMEM10. Nie należy dzielić komórek na więcej niż pięć pasaży (kroki 6.1.3 i 6.1.4) i utrzymywać je w DMEM bez forskoliny i NRG1β. Pamiętaj, aby zamrozić komórki w przejściu 2 do wykorzystania w przyszłości.

7. Weryfikacja tożsamości komórek MPNST wczesnego pasażu za pomocą immunocytochemii

  1. Umieść sterylne okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe 18 mm #1.5 w dołkach 6-dołkowych sterylnych naczyń do hodowli tkankowych.
    1. Umieścić roztwór poli-L-lizyny/lamininy w studzienkach w objętości wystarczającej do przykrycia szkiełka nakrywkowego. Uszczelnij płytkę folią, aby zminimalizować parowanie. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego ranka umyj szkiełka nakrywkowe 3x sterylnym PBS.
      UWAGA: Próbowaliśmy umieścić komórki MPNST o wczesnym pasażu na niepowlekanych szkiełkach nakrywkowych i stwierdziliśmy, że komórki nie przylegają dobrze przy braku powłoki poli-L-lizyny / lamininy.
    2. Umieść 10 000 komórek na szkiełku nakrywkowym, delikatnie dodając 2 ml zawiesiny komórkowej w pożywce wzrostowej do każdej studzienki zawierającej szkiełko nakrywkowe. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    3. Następnego ranka płukać szkiełka nakrywkowe przez 2 x 5 minut za pomocą PBS.
    4. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 18 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Szkiełka nakrywkowe płukać 3 x 5 min za pomocą PBS. W razie potrzeby uszczelnić płytkę folią z tworzywa sztucznego i przechowywać ją w tym momencie w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotuj świeże 50 mM NH4Cl w PBS. Ugasić aldehydy, inkubując szkiełka nakrywkowe w 50 mM NH4Cl w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przepuszczalność komórek poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w 0,3% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka nakrywkowe przez 3 x 5 min za pomocą PBS.
    8. Zablokuj niespecyficzne wiązanie poprzez inkubację szkiełek nakrywkowych w buforze blokującym (1x PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,2% odtłuszczonego mleka w proszku i 0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Usuń bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowe przeciwciała rozpoznające markery MPNST obecne w guzie macierzystym (zwykle S100β, Nestin i Sox10) rozcieńczone do wcześniej określonego optymalnego rozcieńczenia w buforze blokującym. Owinąć płytkę folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
    10. Przemyć 3 x 5 minut PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego. Dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.
    11. Mycie 3 x 5 min za pomocą PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w 1-5 μg barwnika Hoechst przez 10 minut. Kontynuować ochronę przed światłem.
    12. Myj szkiełka nakrywkowe PBS przez 5 minut. Zamontuj szkiełka za pomocą 1:1 1x PBS/glicerol. Obraz za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

8. Przeszczep allogeniczny komórek nowotworowych wczesnego pasażu w celu wykazania rakotwórczości

  1. Hoduj komórki MPNST P 0-GGFβ3 o wczesnym pasażu w konfluencji DMEM10 do 80%. Wypłucz komórki raz zrównoważonym roztworem soli Hanksa o temperaturze pokojowej (HBSS). Traktuj komórki przez 30 s do 1 minuty nieenzymatycznym roztworem dysocjacyjnym komórek, aby usunąć je z podłoża. Dodać 5 ml DMEM10 na 1 ml nieenzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek.
    UWAGA: Dysocjacja komórkowa może trwać znacznie dłużej, do 10-20 minut. Proszę zapoznać się z protokołem producenta.
    UWAGA: Nie hoduj komórek do zbieżności, ponieważ zmniejszy to skuteczność przeszczepu.
    1. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Odwiruj komórki w ilości 5 × g przez 5 minut i ponownie je zawieś w stężeniu 1-2 ×10 6 komórek na 100 μl DMEM10. Komórki należy przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do wstrzyknięcia.
    2. Znieczulenie myszy NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) w komorze indukcyjnej parownika izofluranowego. Ułożyć zwierzę na brzuchu i wysterylizować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem. Przed wstrzyknięciem należy pozostawić miejsce do wyschnięcia na powietrzu. Przed wstrzyknięciem należy odczekać, aż komórki osiągną temperaturę pokojową.
    3. Wstrzyknąć 1-2 x 106 komórek podskórnie w prawą flankę. Umieść mysz samą w klatce bez ściółki i pozwól jej dojść do siebie. Upewnij się, że tylko część klatki znajduje się na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii. Zapewnia to strefę, do której mysz może się przenieść, jeśli się przegrzeje.
      UWAGA: Szczepimy co najmniej trzy myszy z każdą kulturą wczesnego pasażu, ponieważ niektóre przeszczepy mogą nie przyjąć.
    4. Pozwól przeszczepowi rosnąć przez 15-60 dni; oceniaj stan zdrowia zwierząt 3 razy w tygodniu i rejestruj wyniki kondycji ciała, w tym wagę i zmiany w zachowaniu podczas każdego badania. Zakończ myszy, które osiągnęły maksymalny dopuszczalny rozmiar przeszczepu lub myszy w stanie agonalnym, stosując eutanazję dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Rekordowy wiek w chwili śmierci w dniach. Gdy guzy stają się widoczne na zewnątrz, zapisuj wymiary guza (długość, szerokość i wysokość).
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że różne kultury MPNST z wczesnym pasażem szczepią się z różną wydajnością i różnią się czasem wymaganym do wzrostu przeszczepu. Zwierzętom nie wolno dopuścić do przekroczenia zatwierdzonego przez IACUC maksymalnego dopuszczalnego rozmiaru guza i/lub humanitarnego punktu końcowego.
  2. Pobrać guz, utrwalić go w 4% paraformaldehydzie, zanurzyć w parafinie i wykonać barwienie H&E, jak opisano w sekcjach 2.1-2.2.9, aby sprawdzić, czy przeszczep allogeniczny jest guzem, a nie tkanką reaktywną. W razie potrzeby należy wybarwić przeszczep immunologicznie pod kątem markerów, które były obecne w guzie macierzystym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia przykłady wyraźnie widocznych makroskopowo nowotworów występujących u myszy P0-GGFβ3. Guzy, które można łatwo zidentyfikować gołym okiem, mogą być widoczne jako masy rozciągające poszczególne regiony ciała, co pokazano na Rysunku 2A (strzałka). Przy określaniu, czy nowotwór jest potencjalnie guzem osłonki nerwu obwodowego, niezbędne jest ustalenie, że guz jest powiązany z nerwem obwodowym. W tym przypadku badanie MRI (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tu metody histologiczne i biochemiczne stanowią ramy do diagnozowania i charakteryzowania modeli GEM nerwiakowłókniaka i patogenezy MPNST. Z biegiem lat stwierdziliśmy, że te metodologie są bardzo przydatne do oceny patologii guzów osłonek nerwów obwodowych powstających w modelach GEM 21,25,26. Jednakże, chociaż przedstawione tutaj protokoły są przydatne do określenia, jak dokładnie guzy w modelach GEM podsumowują ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 i R01 NS109655 dla S.L.C.; R01 NS109655-03S1 do D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 do S.L.C.) oraz Departament Obrony (X81XWH-09-1-0086 i W81XWH-12-1-0164 do S.L.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 mm Płytki do hodowli tkankowychCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensydyna (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
Płytki 6-dołkoweCorning Costar3516
Kwas octowyFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Wtórny (kozi anty-mysz)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Wtórny (kozi przeciw myszy)InvitrogenA21043 lub A11004
Alexa Fluor 568 Wtórny (kozioł anty-króliczy)InvitrogenA11036
Chlorek amonu (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
Zestaw do oznaczania białek BCAThermo Scientific23225
Albuminasurowicy bydlęcejFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Skrobak do komórekSarstedt83.183
Ściągacz izolacji komórekCorning25-056-CI
Szkiełko nakrywkowe w koleFisher Scientific12-545-100
Hybryda Citrisolve (rozpuszczalnik na bazie d-limonenu)Decon Laboratories5989-27-5
Kwas krytycznyFisher ScientificA104-500
CytokeratynaABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako klon D33 (M0760)
Diaminobensizdyna (DAB) Rozwiązaniewektorowe LaboratoriaSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eozyna YThermo Scientific7111
Etanol (200 dowodów)Decon Laboratories2716
Surowica cielęca płoduOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlicerolSigma-AldrichG6279
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometrBrightline-Hauser Scientific1490
Kwas solnyFisher ScientificA144-212
Nadtlenek wodoruFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), mysz na myszyVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS Zestaw polimerów HRP (peroksydaza), Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
InkubatorThermo ScientificInkubator CO2 Heracell 240i
12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Ciekły Azot
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Człowiek: MAD5236 (10C2), Człowiek: MAB353 (Szczur-401)
Neuregulina 1 betaW domuWykonane przez SLC (dostępne również jako 396-HB-050 / CF od R& D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnologia sc-67
SKINIENIE GŁOWY. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ myszyJackson Laboratory5557
Beztłuszczowe mleko w proszkuWalmartMarka
P0-GGFβ 3 myszyW domu
Wosk parafinowyLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyd (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (ksylenowe podłoże montażowe)Fisher ScientificSP15-100
pH-metrMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Bromowodorek poli-L-lizynySigma-AldrichP5899-5MG
Przenośna maszyna do izoflurencjiVetEquip Systemy
PVA-DABCO (wodne podłoże montażowe)Millipore Sigma10981100ML
Urządzenie do gotowania ryżuBuk Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (obecnie GA504)
SMA Ventana Systemy Medyczne klon 1A4
Chlorek soduFisher ScientificS640
Cytrynian sodu (dwuwodny)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Stalowa forma
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Sygnalizacja komórkowa (CH48H11) #2569
Kaseta
Toluidyna BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25 Isopropanol Fisher Scientific A415 Ki-67 Sygnalizacja komórkowa o doskonałej wartościanestezjologii inhalacyjnejhistologicznana tkanki

Bibliografia

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620(2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834(2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096(2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588(2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Splotowate neurofibrolakigenetycznie zmodyfikowane myszyneurofibromatoza typu 1stopniowanie nowotworówimmunohistochemiaanaliza histologicznamarkery komórek Schwannahodowle wczesnych pasażyallografty nowotworowe
Identyfikacja, diagnozowanie i ocena złośliwych guzów osłonki nerwów obwodowych w genetycznie modyfikowanych modelach myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.