Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65750

⸱

22 września 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Streszczenie

Opisana tutaj technika może być użyta do identyfikacji specyficznych izoform ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) w segmentach poszczególnych włókien mięśniowych za pomocą dot blotting, zwanego dalej Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Protokół ten opisuje proces liofilizacji ludzkich mięśni szkieletowych i izolowania segmentów pojedynczych włókien mięśniowych. Za pomocą MyDoBID włókna typu I i II są klasyfikowane odpowiednio z przeciwciałami specyficznymi dla MHCI i IIa. Sklasyfikowane włókna są następnie łączone w próbki specyficzne dla danego rodzaju włókien dla każdej biopsji.

Całkowita zawartość białka w każdej próbce jest określana za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) i technologii żelu aktywowanego promieniowaniem UV. Rodzaj włókien w próbkach jest weryfikowany za pomocą western blot. Opisano również znaczenie normalizacji obciążenia białkami w celu poprawy wykrywania białek docelowych w wielu western blot. Korzyści płynące z konsolidacji sklasyfikowanych włókien w próbkach specyficznych dla typu włókien w porównaniu z pojedynczymi włóknami zachodnimi obejmują wszechstronność próbek, zwiększoną przepustowość próbek, krótszą inwestycję czasową i środki oszczędnościowe, a wszystko to przy zachowaniu cennych informacji specyficznych dla typu włókna, które są często pomijane przy użyciu homogenizowanych próbek mięśni. Celem protokołu jest osiągnięcie dokładnej i efektywnej identyfikacji włókien typu I i typu II wyizolowanych z liofilizowanych próbek ludzkich mięśni szkieletowych.

Te pojedyncze włókna są następnie łączone w celu utworzenia próbek specyficznych dla typu włókna typu I i II. Ponadto protokół został rozszerzony o identyfikację włókien typu IIx, przy użyciu aktyny jako markera dla włókien, które były ujemne dla MHCI i MHCIIa, które są potwierdzone jako włókna IIx przez western blotting. Każda próbka specyficzna dla rodzaju włókna jest następnie wykorzystywana do ilościowego określenia ekspresji różnych białek docelowych przy użyciu technik western blotting.

Wprowadzenie

Mięsień szkieletowy to niejednorodna tkanka, z wyraźnymi komórkowymi właściwościami metabolicznymi i kurczliwymi, które zależą od tego, czy komórka (włókno) jest wolnokurczliwa (typ I) czy szybkokurczliwa (typ II). Typ włókna można zidentyfikować, badając izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC), które różnią się od siebie na kilka sposobów, w tym czasem skurczu, szybkością skracania i odpornością na zmęczenie1. Główne izoformy MHC obejmują typ I, typ IIa, typ IIb i typ IIx, a ich profile metaboliczne są albo oksydacyjne (typ I i IIa), albo glikolityczne (IIx, IIb)1. Proporcje tych rodzajów włókien różnią się w zależności od rodzaju mięśni i gatunków. Typ IIb jest powszechnie spotykany w mięśniach gryzoni. Mięśnie ludzkie nie zawierają żadnych włókien typu IIb i składają się głównie z izoform MHC typu I i IIa, z niewielką ilością włókien IIx2. Profile ekspresji białek różnią się w zależności od rodzaju włókien i mogą być zmieniane wraz z starzeniem się3, exercise4,5, oraz disease6.

Pomiar odpowiedzi komórkowych w różnych typach włókien mięśni szkieletowych jest często pomijany lub niemożliwy ze względu na badanie homogenatów mięśniowych (mieszanka wszystkich typów włókien). Pojedynczy błonnik western blot pozwala na badanie wielu białek w poszczególnych włóknach mięśniowych7. Metodologia ta była wcześniej wykorzystywana do tworzenia nowatorskich i pouczających cech pojedynczych włókien, które nie były możliwe do uzyskania przy użyciu preparatów homogenatycznych. Istnieją jednak pewne ograniczenia oryginalnej metodologii western blot z pojedynczym włóknem, w tym czasochłonny charakter, niemożność wygenerowania kontrprób próbek oraz stosowanie drogich, czułych odczynników do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Jeśli używana jest świeża tkanka, metoda ta jest dodatkowo ograniczona ze względu na ograniczenia czasowe związane z koniecznością wyizolowania pojedynczych włókien w ograniczonym czasie (tj. 1-2 godziny). Na szczęście to ograniczenie jest złagodzone przez wyizolowanie pojedynczych segmentów włókien z liofilizowanej tkanki8. Jednak pobieranie włókien z próbek liofilizowanych jest ograniczone rozmiarem i jakością tkanki poddanej biopsji.

Identyfikacja typu światłowodu za pomocą metody dot blotting9 została znacznie rozbudowana i rozszerzona w tym kompleksowym protokole. Wcześniej wykazano, że zaledwie ~2-10 mg mokrej masy tkanki mięśniowej jest odpowiednie do liofilizacji i analizy białka izoformy MHC z pojedynczym włóknem9. Christensen et al.9 wykorzystali 30% segmentu włókna o grubości ~1 mm do wykrycia izoformy MHC za pomocą kleksu punktowego, co zostało potwierdzone przez western blotting. Praca ta wykazała, że dzięki zastąpieniu western blotting metodą dot blotting, całkowite koszty zostały zmniejszone o ~40-krotnie (dla 50 segmentów włókien). Włókna zostały następnie "połączone" w próbki typu I i typu II, co pozwoliło na replikację eksperymentalną9. Niemniej jednak ograniczeniem było to, że uzyskano tylko dwie próbki specyficzne dla typu włókna: typ I (MHCI dodatni) i typ II (MHCII dodatnie włókna), przy czym próbki typu II zawierały mieszaninę MHCIIa i MHCIIx6,10. Warto zauważyć, że obecny protokół pokazuje, w jaki sposób można zidentyfikować czyste włókna typu IIx i zapewnia bardzo szczegółowy przepływ pracy (podsumowany w Rysunek 1), w tym strategie rozwiązywania typowych problemów z protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki mięśni ludzkich pobrano z obszernego bocznego od n = 3 (2 mężczyzn, 1 kobieta), w wieku 70-74 lat, w sterylnych warunkach przy użyciu znieczulenia miejscowego (Xylocaine) i igły Bergstrom zmodyfikowanej do ręcznego odsysania11,12. Próbki były podzbiorem poprzedniego badania zatwierdzonego przez Komitet Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Wiktorii (HRETH11/221) i przeprowadzonego zgodnie z Deklaracją Helsińską13. Uczestnicy wyrazili pisemną, świadomą zgodę na udział w tym badaniu. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów wymaganych do tego protokołu znajdują się w Tabeli Materiałów. Ponadto w tabeli 1 znajduje się lista strategii rozwiązywania typowych problemów z protokołem.

1. Liofilizacja

  1. Trzymając biopsyjne próbki mięśni zamrożone na suchym lodzie, zważ i wytaruj pustą zamrożoną probówkę na wadze.
  2. Szybko zważyć co najmniej 10 mg zamrożonej tkanki o mokrej masie. Zapisz wagę z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
  3. Umieść chusteczkę w wstępnie schłodzonej probówce wirówki, która miała 3-4 otwory przebite w pokrywie i umieść ją w małej zlewce z 2-3 granulkami suchego lodu.
  4. Postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta liofilizatora.
  5. Upewnij się, że wszystkie zawory w liofilizatorze są zamknięte i włącz liofilizator.
  6. Użyj panelu sterowania, aby sprawdzić, czy nastawa próżni jest zaprogramowana na optymalne warunki liofilizacji tkanek ludzkich, 0,12 milibara (mBar) (Rysunek 2).
  7. Naciśnij instrukcję na liofilizatorze i poczekaj, aż komora ostygnie do -40 oC.
  8. Gdy komora osiągnie tę temperaturę, zdejmij pokrywkę, a następnie szklaną komorę i umieść zlewkę (z próbką mięśni) na metalowym stoliku.
  9. Wymień szklaną komorę i pokrywę. Zamknij zawór spustowy podciśnienia na pokrywie i poczekaj, aż kontrolka skali podciśnienia zmieni kolor na zielony, aby upewnić się, że suszarka jest uszczelniona próżniowo.
  10. Liofilizować próbki mięśni przez 48 godzin. Po zakończeniu liofilizacji wyłącz pompę próżniową, naciskając przycisk próżni i otwórz zawór spustowy podciśnienia na pokrywie.
  11. Zdjąć pokrywę komory i pobrać liofilizowaną próbkę. Zważ tkankę i zapisz wagę z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
  12. Oblicz procentową utratę masy; ~75% spadek masy wskazuje, że tkanka została pomyślnie liofilizowana (w tej pracy średnia ± SD, 76 ± 9%, n = 11 próbek mięśni).
  13. Naciśnij AUTO, aby wyłączyć pompę próżniową i zamrażarkę. Pozwól urządzeniu osiągnąć temperaturę otoczenia.
  14. Oczyść wężownice chłodzące zgodnie z instrukcjami producenta i spuść nagromadzoną ciecz z kolektora.
    UWAGA: Pobieranie włókien można rozpocząć natychmiast. Jeżeli tkanka nie jest używana do izolacji włókien, liofilizowaną próbkę należy przechowywać w temperaturze -80 °C w szczelnie zamkniętym pojemniku z kulkami eksykatora. UWAGA: Suchy lód jest niebezpieczny (klasa 9); zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby uzyskać informacje na temat zalecanego bezpiecznego obchodzenia się z kartą.

2. Kolekcja włókien

  1. Przygotowanie kolekcji włókien
    1. Oznaczyć co najmniej 50 probówek do mikrofuge (włókno od 1 do 50) i odpipetować 10 μl buforu denaturującego do każdej probówki.
    2. Przygotuj obszar pobierania za pomocą dwóch par kleszczy do preparowania cienkich tkanek, niestrzępiącej się tkanki, lampy stołowej, mikroskopu stereoskopowego (z czarną sceną do góry), wirówki i wirówki stołowej.
    3. Umieścić liofilizowaną próbkę mięśni na pokrywie szalki Petriego. Umieść pokrywkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego.
    4. Obejrzyj film przedstawiający rozwarstwienie pojedynczego włókna. Przećwicz cały protokół od pobrania włókien do identyfikacji typu pojedynczego włókna co najmniej dwa razy przed rozpoczęciem badania.
    5. Przed pobraniem błonnika należy obliczyć całkowitą objętość wymaganą dla próbki typu włókna z każdej biopsji w następujący sposób. Na przykład, jeśli początkowa objętość 1 włókna = 10 μL, a objętość pozostała po MyDoBID wynosi (1 włókno × 10 μL) - 1 μL używany do iluminacji punktowej = 9 μL (objętość próbki), oblicz całkowitą wymaganą objętość próbki, mnożąc objętość próbki (μL) przez całkowitą liczbę Western Blot, które zostaną uruchomione, i podwój tę liczbę, aby uwzględnić redundancję: (9 μl × 4 zachodnie plamy) × 2 = 72 μl. Obliczyć liczbę włókien wymaganych na próbkę typową, dzieląc wymaganą końcową objętość próbki (μl) przez objętość próbki na próbkę specyficzną dla typu włókna (np. 72 μl ÷ 9 μl = 8 włókien na próbkę specyficzną dla typu włókna). Aby to osiągnąć, zbierz łącznie 50 włókien.
      UWAGA: Wymagana objętość próbki to minimalne stężenie białka wymagane do przeprowadzenia zarówno MyDoBID, jak i western blot, jeśli ilość załadowanego białka jest równoważna ~3 mm włókna (~12 μg mokrej masy) dla każdej próbki (szczegółowe informacje można znaleźć w pliku uzupełniającym 1). Jednak objętość ta nie ma wpływu na to, czy dla danego białka wymagane są powtarzające się żele. UWAGA: Kleszcze są ostre; Obchodzić się z nimi ostrożnie, aby uniknąć ryzyka nakłucia skóry.
  2. Izolacja jednowłóknowa
    1. Na małej kartce papieru o wymiarach 5 cm x 1 cm narysuj linijką linię o długości 1 cm. Zaznacz każdy 1 mm na tej linii.
    2. Włóż to pod pokrywkę szalki Petriego jako wskazówkę, aby oszacować długość zebranych włókien.
    3. Umieścić liofilizowaną próbkę mięśni pod mikroskopem stereoskopowym w małym powiększeniu (x 7,5). Użyj jednej pary kleszczy do preparowania cienkich tkanek, aby przytrzymać liofilizowany mięsień na miejscu, a drugą zacznij oddzielać małe wiązki włókien (jak widać na filmie).
    4. Odizoluj jedną wiązkę włókien i kontynuuj rozdzielanie, aż pojedyncze segmenty włókien zostaną odizolowane od wiązki.
    5. Zbierz co najmniej 50 włókien o długości co najmniej ~1 mm.
    6. Przenieś włókno do pustego miejsca na szalce Petriego. Sprawdź segmenty pojedynczego włókna w większym powiększeniu (x 50). Upewnij się, że jest to pojedyncze włókno, dalej oddzielając włókno na końcu. Jeśli włókno pęka zamiast się rozdzielać, jest to pojedyncze włókno.
  3. Denaturacja włókien
    1. Za pomocą kleszczy delikatnie zbierz włókno i umieść je bezpośrednio w podzielonym buforze denaturującym (nie pozwól, aby kleszcze napotkały bufor).
    2. Sprawdź kleszcze pod mikroskopem, aby upewnić się, że włókno zostało pomyślnie usunięte. Zamknij rurkę i mocno postukaj dnem rurki o ławkę trzy razy, aby upewnić się, że włókno przesunie się do bufora.
    3. Wytrzyj kleszcze do czysta za pomocą niestrzępiącej się chusteczki przed przejściem do następnego włókna. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie włókna zostaną zebrane.
    4. Zwirować próbki włókien i krótko odwirować przez 5 s w temperaturze 2 500 × g, aby wyciągnąć próbkę na dno probówki.
      UWAGA: Czas wirowania (5 s) jest mierzony od początku (0 × g) do momentu, gdy prędkość osiągnie ~2,500 × g.
    5. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Próbki należy zamrozić, a następnie rozmrozić przed użyciem.

3. Plamy punktowe

  1. Przygotowanie i aktywacja membrany
    1. Zmierz, oznacz i przytnij na wymiar jedną membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) (wielkość porów 0,2 μm), aby zmieściła się w 50 próbkach (~10,5 cm x 5,5 cm).
    2. Zaznacz lewą krawędź numerycznie od góry do dołu (od 1 do 10), a górną krawędź alfabetycznie od lewej do prawej (od A do E) w odstępach 1 cm.
    3. Przygotuj cztery arkusze bibuły filtracyjnej o wymiarach 12,5 cm x 7,5 cm.
    4. Ułóż dwa arkusze razem, aby utworzyć stos. Wstępnie zanurz stos bibuły filtracyjnej w 1x buforze transferowym.
    5. Umieść membranę w pojemniku. Wlej 95% etanolu na membranę, o objętości wystarczającej do całkowitego zanurzenia membrany (10-15 ml). Mieszać na bujaku przez 1 minutę.
    6. Odzyskaj etanol, zanurz membranę w 1x buforze transferowym (~15 ml) i kołysz przez kolejne 2 minuty
      UWAGA: Zarówno etanol, jak i bufor transferowy mogą być ponownie wykorzystane w przyszłych eksperymentach z kropkami, aż do powstania sedymentacji (zmiana po sześciu użyciach).
    7. Połóż stos bibuły filtracyjnej nasączonej buforem transferowym na płaskiej, ruchomej powierzchni, takiej jak duża pokrywa, i spłaszcz za pomocą wałka. Umieść membranę PVDF na stosie za pomocą zwalniacza żelu lub pęsety.
    8. Umieść pojedynczy arkusz suchej bibuły filtracyjnej na wierzchu membrany i przesuń wałek po bibule filtracyjnej, aby wchłonąć nadmiar bufora na powierzchni membrany. Usuń górną bibułę filtracyjną bez pocierania membrany.
      UWAGA: Metanol (klasa 3, podryzyko 6.1) i etanol (klasa 3) są niebezpieczne. Zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS), aby uzyskać zalecenia dotyczące bezpiecznego obchodzenia się z materiałem.
  2. Absorpcja próbki przez membranę
    1. Rozmrozić próbki włókien, przeprowadzić krótką wirówkę (5 s) w temperaturze pokojowej, jak w kroku 2.3.4 i dokładnie wymieszać próbkę.
    2. Nie dotykając membrany końcówką pipety, powoli nanieś kroplę ~1 μl każdej próbki na membranę w wyznaczonym obszarze. Wymiary wyznaczonego obszaru na próbkę włókna wynoszą ~1 cm x 1 cm. Staraj się dostrzec próbkę w środku tego obszaru.
    3. Pozwól kropelkom próbki przesiąknąć przez membranę przez co najmniej 15 minut. Upewnij się, że nie pozostał żaden bufor próbki i że został on całkowicie wchłonięty.
    4. Za pomocą plastikowej pęsety ostrożnie zdejmij membranę z wilgotnego stosu bibuły filtracyjnej, umieść ją na jednym suchym arkuszu bibuły filtracyjnej i odwadniaj membranę przez co najmniej 5 minut.
    5. Gdy plamki próbki zmienią kolor na całkowicie biały, ponownie aktywuj membranę.
  3. Reaktywacja i blok membrany
    1. Ponownie aktywować membranę, powtarzając kroki 3.1.5 i 3.1.6.
    2. Umieść membranę w buforze do płukania i płucz przez 5 minut z bujaniem. Wyrzuć bufor do mycia.
    3. Inkubować błonę w buforze blokującym przez 30 minut podczas kołysania.
    4. Przepłukać membranę 3x buforem do płukania, aż bufor przestanie być mętny.
    5. Pozostaw membranę w ostatnim praniu na bujaku.

4. Znakowanie immunologiczne

  1. Wykrywanie MHCIIa
    1. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało MHCIIa w stosunku 1 do 200 w 10 ml buforu albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
    2. Wyrzucić bufor płuczący z membrany, a następnie wlać rozcieńczone przeciwciało MHCIIa na membranę.
    3. Umieścić pojemnik (z membraną w MHCIIa) na bujaku w temperaturze pokojowej na 2 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Pobrać przeciwciało MHCIIa i przechowywać je w temperaturze 4 °C. Płukać membranę buforem blokującym przez 2 minuty na wahaczu.
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe mogą być ponownie użyte do pięciu razy, o ile bufor pozostaje czysty.
    5. Spłucz jeszcze dwa razy, za każdym razem 5 minut, w sumie trzy prania.
    6. Rozcieńczyć mysie przeciwciało drugorzędowe immunoglobuliny G peroksydazy chrzanowej (IgG-HRP) w stężeniu 1 na 20 000 w 10 ml buforu blokującego i dodać do błony.
    7. Odrzucić bufor do przemywania i inkubować błonę w mysim wtórnym IgG-HRP z kołysaniem przez 1 godzinę.
    8. Wyrzucić wtórny i umyć membranę w buforze do przemywania (2, 5, 5 min).
    9. Pozostaw membranę nasączoną w ostatnim praniu, aż będzie gotowa do obrazowania.
    10. Włącz kamerę żelową, odczekaj 15 minut, aż kamera osiągnie wymaganą temperaturę roboczą, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
    11. W oknie oprogramowania kliknij Nowy protokół jednokanałowy (Rysunek 3A). Aby uzyskać obraz membrany w świetle białym, w obszarze Aplikacje | Kleksy | kliknij Kolorymetria (Rysunek 3B).
    12. Kliknij obszar żelu; każda opcja jest zaprogramowana na określone wymiary, aby pasowała do rozmiaru różnych rodzajów żelu. Wybierz odpowiednią opcję, aby jak najlepiej dopasować wymiary membrany (Rysunek 3C).
    13. Przygotować ECL, łącząc odczynniki luminolu i peroksydazy w stosunku 1:1. Przygotować wystarczającą objętość mieszaniny ECL, aby pokryć całą membranę, zazwyczaj wymagana jest całkowita objętość 800-1 000 μl.
    14. Umieść membranę na dużej przezroczystej plastikowej tacce i rozprowadź mieszaninę ECL na membranie.
    15. Umieść membranę na płytce obrazowej.
    16. Kliknij Position Gel (żółty przycisk), aby wyświetlić podgląd z kamery na żywo. Kliknij przycisk przytrzymania i przeciągnij przycisk powiększenia, aby zmaksymalizować obszar obrazowania membrany. W tym momencie wyprostuj położenie membrany, jeśli jest to wymagane.
    17. Kliknij Uruchom protokół (zielony przycisk) i poczekaj na uzyskanie obrazu kolorymetrycznego membrany. Zapisz ten obraz, aby pomóc w dopasowaniu kropek do odpowiedniej próbki włókna.
    18. Nie przesuwając membrany, zmień aplikację w oprogramowaniu, klikając opcję binningu 2 x 2 (Chemi High Resolution) (Rysunek 3D).
    19. W obszarze Image exposure and software (Ekspozycja obrazu i oprogramowanie) zoptymalizuj czas ekspozycji (Faint Bands) (Rysunek 3E) | Tryb akumulacji sygnału.
    20. W obszarze Setup (Konfiguracja) wpisz 1 s dla pierwszego obrazu, 30 s dla ostatniego obrazu i łącznie 30 obrazów (Rysunek 3F).
    21. Kliknij przycisk Uruchom protokół.
    22. Zapisz obraz na następujących etapach: przed nasyceniem sygnału (wszystkie widoczne kropki są czarne), początkowym nasyceniem sygnału (niektóre kropki zaczynają się nasycać) i przesyconymi plamami (wszystkie miejsca, w których wykryto silny sygnał, są nasycone).
    23. Zapisz wszystkie wymagane obrazy przed zakończeniem akumulacji sygnału. Wyjmij membranę z imagera.
    24. Za pomocą zwalniacza żelu umieść membranę z powrotem w pojemniku z buforem do mycia.
  2. Wykrywanie MHCI
    1. Wylać bufor do płukania i traktować membranę buforem do oddzielania przez 30 minut w temperaturze 37 °C (upewnić się, że membrana jest całkowicie zanurzona).
    2. Zebrać bufor do oddzielania i płukać membranę w buforze do płukania przez 5 minut z kołysaniem.
      UWAGA: Bufor do usuwania izolacji może być ponownie użyty 10 razy przed wyrzuceniem.
    3. Wylać bufor do przemywania i tym razem nałożyć pierwszorzędowe przeciwciało MHCI rozcieńczone w stężeniu początkowym 1 do 200 (zakres: 1 do 200 do 1 do 500). Kołysz membranę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    4. Po inkubacji w przeciwciałie pierwszorzędowym MHCI należy przypomnieć przeciwciało i umyć błonę, jak w krokach 4.1.4 i 4.1.5.
    5. Rozcieńczyć mysie przeciwciało drugorzędowe IgM HRP w buforze blokującym w stężeniu 1 na 20 000. Wylej bufor blokujący z membrany i inkubuj w mysim IgM wtórnym, jak w kroku 4.1.7.
    6. Mycie i przechwytywanie obrazu wykryło MHCI, jak w krokach od 4.1.8 do 4.1.24.
      UWAGA: Bufor do odpędzania zawiera fosforowodór organiczny 3-5% (klasa 8). Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby uzyskać zalecenia dotyczące bezpiecznego obchodzenia się z kartą.
  3. Wykrywanie potencjału MHCIIx za pomocą aktyny
    1. Ponownie zdjąć membranę (kroki 4.2.1 i 4.2.2).
    2. Powtórzyć sekcję 4.1, tym razem stosując pierwszorzędowe przeciwciało aktyny rozcieńczone w stosunku 1 do 500 w buforze BSA, a następnie drugorzędowe przeciwciało królicze HRP rozcieńczone w stosunku 1 do 20 000 w buforze blokującym.

5. Identyfikacja typu włókna

  1. Analiza sygnału MHCI, MHCIIa i aktyny
    1. Zapoznaj się z panelem intensywności sygnału (Rysunek 4A). Zanotuj kroki od 5.1.2 do 5.1.4.
    2. Nasycone natężenie sygnału jakościowo wskazuje, że detekcja białka jest silna.
    3. Umiarkowany oznacza, że białko docelowe jest obecne na średnim poziomie.
    4. Słaby sygnał wskazuje, że obecna jest niewielka ilość białka docelowego.
    5. Użyj panelu intensywności sygnału, aby skategoryzować włókna o "nasyconym", "umiarkowanym" lub "słabym" natężeniu sygnału (Rysunek 4A).
    6. Przeprowadź identyfikację typu włókna, porównując najpierw wyniki MHCIIa i MHCI (Rysunek 4B, lewy i środkowy plam).
    7. Nagrywaj włókna o nasyconym lub umiarkowanym natężeniu sygnału tylko jednej izoformy MHC.
    8. Jeśli sygnał izoformy MHC jest "słaby", pozostaw światłowód nieoznaczony (patrz Rysunek 4B).
    9. Wreszcie, w przypadku zaobserwowania aktyny (umiarkowane lub nasycone natężenie sygnału) we włóknach, w których nie wykryto MHCI lub IIa, zapisz ją jako potencjalne włókno typu IIx (Rysunek 4B, prawa plama).
    10. Nagrywaj włókna ze słabym sygnałem izoformy MHC, ale aktyna wykryta (umiarkowana lub nasycona intensywność) jako niezidentyfikowana.
    11. Odrzuć próbki ze słabą detekcją lub bez wykrycia (bez zebranego włókna) dla wszystkich trzech białek docelowych (Rysunek 4C).
    12. Nagraj dowolne światłowód, w którym wykryte są zarówno sygnały MHCI, jak i MHCII z sygnałem "nasyconym" lub umiarkowanym. Próbki te nie są przeznaczone do stosowania w preparatach specyficznych dla rodzaju włókien.
  2. Przygotowanie próbek specyficznych dla danego rodzaju włókien
    1. Do każdej biopsji należy przygotować oddzielną próbkę typu I i typu II. W przypadku próbki typu II należy połączyć minimalną wymaganą liczbę włókien (obliczoną w kroku 2.1.5), w których MHCIIa jest wykrywana na poziomie nasyconym lub umiarkowanym.
    2. W osobnej probówce oznaczonej jako typ I powtórz ten proces dla włókien, w których wykryto MHCI (Rysunek 4D).
    3. Używaj światłowodów o umiarkowanej intensywności sygnału, jeśli nie ma wystarczającej ilości światłowodów z nasyconymi sygnałami.
    4. Połącz dowolne potencjalne włókna IIx.
    5. Natychmiast użyj próbek specyficznych dla rodzaju błonnika do western blotting lub przechowuj je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

6. Potwierdzenie typu włókna Western blot

  1. Wykorzystać 10 μl każdej próbki specyficznej dla danego rodzaju włókna (minimalna wymagana objętość próbki, patrz krok 2.1.5).
  2. Próbki należy oddzielić za pomocą określonego żelu prefabrykowanego za pośrednictwem SDS-PAGE zgodnie z protokołem producenta.
  3. Użyj imagera żelowego, aby wykryć białko w żelu zgodnie z protokołem producenta.
  4. Umieść żel w zimnym buforze transferowym 1x na 10 minut.
  5. Na mokro przenieść białka na membranę nitrocelulozową o grubości 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) zgodnie z protokołem producenta.
  6. Po przeniesieniu krótko przepłukać membranę ultraczystymH2Ow pojemniku. Wylej ultraczystą wodę.
  7. Dodaj 10 ml roztworu wzmacniacza sygnału przeciwciała do membrany i kołysz w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  8. Pobrać roztwór wzmacniający sygnał przeciwciał i przemyć 5x (5 s na pranie) ultraczystymH2O.
    UWAGA: Roztwór wzmacniający sygnał przeciwciał można użyć 5 razy przed wyrzuceniem.
  9. Wylej ostatnie pranie, dodaj roztwór blokujący i kołysz w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  10. Użyj czystego ostrza skalpela lub nożyczek, aby przeciąć poziomo w poprzek membrany o masie cząsteczkowej, która zapewnia, że białka o mocy 180 kDa i większej znajdują się w górnej części membrany.
  11. Użyj tej górnej sekcji, aby uzyskać dalsze potwierdzenie typu światłowodu.
  12. Użyj porcji poniżej 180 kDa do wykrycia różnych białek docelowych.
  13. W górnej części błony należy postępować zgodnie z sekcją 4.1 z pierwszorzędowym przeciwciałem MHCIIx i mysim przeciwciałem drugorzędowym HRP immunoglobuliny M (IgM).
  14. Zdjąć błonę (jak opisano w sekcjach 4.2.1 i 4.2.2) przed powtórzeniem procesu z pierwszorzędowym przeciwciałem MHCIIa IgG i mysim przeciwciałem drugorzędowym IgG HRP.
  15. Zdejmij ponownie i na koniec nałóż pierwszorzędowe przeciwciało MHCI IgM i mysie przeciwciało wtórne IgM HRP.
    UWAGA: Ten krok jest jakościowy, więc utrata białka spowodowana usuwaniem błony nie stanowi problemu.
  16. Porównaj sygnał wykryty w różnych izoformach MHC (jak pokazano na Rysunek 5B). Gdy intensywność sygnału zostanie wykryta na poziomie umiarkowanym do nasyconego w oczekiwanej próbce (MHCI - typ I, MHCIIa - typ II i MHCIIx - typ IIx), próbki specyficzne dla typu światłowodu zostaną zarejestrowane jako wiarygodne do wykorzystania w przyszłych badaniach.
  17. Próbkę należy zarejestrować jako niewiarygodną, jeżeli w próbce wykryto w równym stopniu więcej niż jedną izoformę MHC.
    UWAGA: Roztwór wzmacniający przeciwciała zawiera wodorotlenek sodu 50%. Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby uzyskać zalecenia dotyczące bezpiecznego obchodzenia się z kartą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Identyfikacja poszczególnych włókien mięśniowych MHCI, MHCIIa i MHCIIx za pomocą techniki dot blotting
Cechą charakterystyczną metody MyDoBID jest kategoryzacja różnego poziomu intensywności sygnału MHC i aktyny w danym włóknie (Rycina 4A). Typ włókna określano na podstawie obecności lub braku izoform MHCI i IIa (Rycina 4B). W sześciu przypadkach nie wykryto MHC ani aktyny, co wskazywało na brak pobranego włókna. Wynikami tego konkretnego te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kolekcja włókien
Opierając się na kilkuletnim doświadczeniu, większość badaczy może opanować tę technikę; Jednak praktyka prowadzi do szybszego i wydajniejszego zbierania włókien do dalszych analiz. Aby móc wyizolować 30 pojedynczych segmentów włókien o jakości przeznaczonej do łączenia, zaleca się pobranie 50 segmentów włókien na próbkę. Zaleca się dokładne przestudiowanie filmu z gromadzeniem włókien i po wykonaniu dwóch sesji treningowych (~50 włókien na sesję), aby osiągnąć rozsądny standard. Ws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Przeciwciała przeciwko MHC I (A4.840) i MHCIIa (A4.74) użyte w tym badaniu zostały opracowane przez Dr. H. M. Blau, a przeciwciało przeciwko MHCIIx (6H1) zostało opracowane przez Dr. C. A. Lucasa i uzyskane z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), dzięki auspicjom National Institute of Child Health and Human Development i utrzymywane przez University of Iowa, Wydział Nauk Biologicznych (Iowa City, IA). Dziękujemy Victorii L. Wyckelsmie za dostarczenie próbek mięśni ludzkich do tego badania. Większość obrazów na rysunku 1 pochodzi z BioRender.com.

Finansowanie:
Badanie to nie otrzymało żadnego zewnętrznego finansowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x Bufor denaturacyjnyWykonaj zgodnie z recepturąSkładniki mogą pochodzić z Sigma-Aldrich lub innych firm zajmujących się dystrybucją chemikaliów  1x bufor denaturujący jest wytwarzany przez rozcieńczenie 3x buforu denaturującego 1 na 3 v / v z 1X Tris-HCl (pH 6,8). Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
3x Bufor denaturacyjnyZrób według recepturySkładniki mogą pochodzić z Sigma-Aldrich lub innych dystrybutorów chemicznych3x bufor denaturujący zawiera: 0,125M Tris-HCI, 10% glicerol, 4% SDS, 4 M mocznik, 10% 2-merkaptoetanol i 0,001% błękit bromofenolowy, pH 6,8.  Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
95% etanolnie dotyczy100% etanol może pochodzić z dowolnej firmyRozcieńczony do 95% ultra czystym H2O.
Aktynowe królicze przeciwciało poliklonalneSigma-Aldrich  A2066Rozcieńczyć 1 do 1,000 buforem BSA.
Wagi analityczneMettler ToledoNumer modelu: MSZ042101
Wzmacniacz przeciwciałThermo Fischer Scientific32110Nazwa produktu to Miser Antibody Extender Solution NC.
Zlewka (100 mL)Nie dotyczyWirówka
stołowaEppendorf5452Nazwa modelu: Mini Spin.
Bufor blokujący: 5% odtłuszczonego mleka w buforze do mycia.Sklep z dyplomamikupił
bufor BSA: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3BSA: Sigma-Aldrich                          PBS: Laboratoria Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich BSA: A6003-25G                                                10x PBS: 1610780                                            NaN3: S2002Albumina surowicy bydlęcej (BSA), sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i azydek sodu (NaN3). Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Dźwignia otwierania kasety Bio-Rad Laboratories4560000Służy do otwierania prefabrykowanych kaset żelowych.
Chemidoc MP Imager Bio-Rad LaboratoriesNumer modelu: Kaptur uniwersalny IIIDowolny system obrazowania z możliwością obrazowania żelowego bez plam.
Bibuła CriterionBio-Rad Laboratories1704070Zawiera worek z lodem, tackę transferową, rolkę, 2 uchwyty na kasety, bibułę filtracyjną, podkładki piankowe i pokrywę z.
Criterion Cell (Bio-Rad)Bio-Rad Laboratories1656001
ECL (wzmocniona chemiluminescencja)Bio-Rad Laboratories1705062Nazwa produktu: Podłoże Clarity Max Western ECL.
Bufor do elektroforezy 1x Tris Glycine SDS (TGS)Bio-Rad Laboratories1610772Rozcieńczyć 10x TGS 1 w 10 ultra czystym H2O.
Bibuła filtracyjna, grubość 0,34 mmWhatmann3030917Format zbiorczy 3 MM, opakowanie 100 arkuszy, 315 x 335 mm.
Kleszcze do preparowania tkanekDumontF6521-1EAJubiler' Kleszcze S nr 5.
Płaska plastikowa taca/pokrywka   N/AN/AWystarczająco duży, aby umieścić na nim membranę. Upewnij się, że powierzchnia jest całkowicie płaska.
System liofilizacjiLabconco7750030Freezone 4,5 L ze szklanym stolikiem na próbki.
Zamrażarka -80 oC N/AN/ADowolna zamrażarka o stałej temperaturze -80 & deg; C jest odpowiednie.
Uwalniacze żelu1653320Bio-RadWsuń się pod membranę, aby zebrać lub przesunąć membranę.
Ołówek ołówekszary N/AN/A
  Oprogramowanie do laboratorium obrazowego Rysunki Bio-Rad LaboratoriesN/Aodnoszą się do wersji oprogramowania 5.2.1, ale można korzystać z innych wersji.
InkubatorBio-Rad Laboratories1660521Dowolny inkubator, który można ustawić na 37 & deg; C by wystarczyło.
LampaN/AN/A
Mieszadło magnetyczne z pchełkąN/AN/A
Membrana roller Bio-Rad Laboratories1651279Można kupić w pakiecie Transfer. Jeśli jednak ten produkt nie jest dostępny, wystarczy dowolna cylindryczna rurka o gładkiej powierzchni, wystarczająco długa, aby przetoczyć się przez membranę.
Probówki do mikrowirówek  (0,6 ml)N/AN/A
Mysia IgG HRP wtórnaThermo Fisher Scientific31430Kozia anty-mysia IgG (H+L), RRID AB_228341. Rozcieńczyć w stężeniu 1 na 20 000 w buforze blokującym.
Mysz IgM HRP wtórnyAbcamab97230Goat Anti-Mouse IgM mu łańcuch. Stosować w tym samym rozcieńczeniu, co mysie IgG.
Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko miozynie o ciężkim łańcuchu I (MHCI)DSHBA4.840 Zakres rozcieńczenia: od 1 do 200 do 1 do 500 w buforze BSA.
Przeciwciało pierwszorzędowe miozyny o ciężkim łańcuchu IIa (MHCIIa)DSHBA4.74 Zakres rozcieńczenia: od 1 do 200 do 1 do 500 w buforze BSA.
Pierwszorzędowe przeciwciało miozyny o ciężkim łańcuchu IIx (MHCIIx)DSHB6H1Zakres rozcieńczenia: 1 na 200 do 1 na 500 w buforze BSA.
Membrana nitrocelulozowa 0,45 i mikro; m Bio-Rad Laboratories1620115Do Western blotting.
Pokrywka szalki PetriegoN/AN/A
Pęseta plastikowaN/AN/A
Power Pack Bio-Rad Laboratories164-5050Nazwa produktu: Zasilacz podstawowy.
Drabinka białkowaThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa.
Membrana PVDF 0,2 i mikro; mBio-Rad Laboratories1620177
Rabbit HRP wtórnyThermo Fisher Scientific31460Kozia anty-królicza IgG (H+L), RRID AB_228341. Rozcieńczenie takie samo jak mysie przeciwciała drugorzędowe.
RockerN/AN/A
LinijkaN/AN/A
NożyczkiN/A/A
StereomikroskopMoticSMZ-168
Bufor do zdejmowaniaThermo Fisher Scientific21059Nazwa produktu: Przywróć bufor do usuwania Western Blot.
Chusteczka (niestrzępiąca się)Kimberly-Clark professional34120Nazwa produktu: Kimwipe.
Bufor transferowy (1x Bufor Tris Glycine (TG), 20% Metanol)TG: Bio-Rad Laboratories    Metanol: Bufor TG firmy Merck: 1610771                    Metanol: 1.06018rozcieńczyć 10x bufor TG ultra czystym H2O do 1x. Dodaj 100% metanolu do końcowego stężenia 20% metanolu. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Taca transferowaBio-Rad Laboratories1704089
  Prefabrykowany żel aktywowany promieniami UVBio-Rad Laboratories5678085Rodzaj żelu: 4– 15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 dołków, 15 &mikro;L.
Bufor doVortex N/A N/A
(1x TBST)10x TBS: Astral Scientific  Animacja 20: Sigma  BIOA0027-4L1x Receptura TBST: 10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS) rozcieńcza się do 1x ultra czystym H2O, Tween 20 dodaje się do końcowego stężenia 0,1%. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.
Pojemniki do myciaSistemaSklep kupionyWystarczy dowolny pojemnik tupperware, który odpowiada przybliżonym wymiarom membrany.
N izolacji płukania

Bibliografia

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273(2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

W kna mi ni szkieletowychci ki a cuch miozynydot blottingw kna typu Iw kna typu IIw kna typu IIxwestern blottingSDS PAGEizolacja w kien mi niowych
Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.