Artykuł metodologiczny

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

DOI:

10.3791/65757

⸱

16 stycznia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Physiology and Biochemistry, Oregon Health and Science University, 2Casey Eye Institute, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dwubiegunowe oraz poziome komórki siatkówki kręgowców są pierwszymi neuronami, które przetwarzają informacje wzrokowe po wykryciu fotonów przez fotoreceptory. Wykonują podstawowe operacje, takie jak adaptacja do światła, czułość na kontrast oraz przestrzenna i kolorowa przeciwstawność. Pełne zrozumienie precyzyjnych obwodów i mechanizmów biochemicznych rządzących ich zachowaniem przyczyni się do rozwoju badań w neurobiologii wzrokowej oraz medycyny okulistycznej. Jednak obecne przygotowania do badania komórek dwubiegunowych i poziomych (całość siatkówki i pionowe cięcia) są ograniczone pod względem zdolności do uchwycenia anatomii i fizjologii tych komórek. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę usuwania ciał komórek fotoreceptorowych z żywych, płaskich siatkówek myszy, zapewniając lepszy dostęp do komórek dwubiegunowych i poziomych dla efektywnego patch clampingu i szybkiego immunoznakowania. Rozdzielone siatkówki przygotowuje się przez umieszczenie odizolowanej siatkówki myszy między dwoma kawałkami nitrocelulozy, a następnie delikatne ich rozdzielanie. Rozdzielenie rozdziela siatkówkę tuż nad zewnętrzną warstwą pleksiformną, tworząc dwa fragmenty nitrocelulozy: jeden zawierający ciała komórek fotoreceptorowych, a drugi zawierający pozostałą wewnętrzną siatkówkę. W przeciwieństwie do pionowych przecinków siatkówki, rozszczepienie siatkówki nie przerywa wyrostków dendrytycznych neuronów wewnętrznych, umożliwiając rejestrację komórek dwubiegunowych i poziomych, które integrują wkład sieci sprzężonych z połączeniem szczelinowym oraz szerokopolnych komórek amakrynowych. Prace te pokazują wszechstronność tego przygotowania do badania komórek poziomych i dwubiegunowych w elektrofizjologii, immunohistochemii oraz eksperymentach hybrydyzacji in situ .

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka to cienka tkanka nerwowa zlokalizowana w tylnej części oka, gdzie światło jest przechwytywane i przetwarzane na sygnał elektrochemiczny, który mózg może interpretować. Z tyłu siatkówki fotoreceptory pręcików i czopków są stymulowane przez światło, co zmniejsza tempo uwalniania toniku neuroprzekaźnika, glutaminianu1. Pierwszymi neuronami, które doświadczają i reagują na tę zmianę stężenia glutaminianu wywołaną światłem, są komórki dwubiegunowe (BC) oraz komórki poziome (HC), których soma znajdują się w najbardziej zewnętrznym obszarze wewnętrznej warstwy jądrowej (INL). Te neurony drugiego rzędu wykonują pierwszy etap przetwarzania sygnału w siatkówce i kształtują kluczowe cechy widzenia, takie jak adaptacja do światła, czułość na kontrast oraz przestrzenna/kolorowa opozycja2. Chociaż te funkcje przypisuje się BC i HC, obwody i mechanizmy biochemiczne leżące u ich podstaw nie są w pełni poznane3. Dlatego rozwój narzędzi i metod do badania fizjologii BC i HC ma kluczowe znaczenie.

Pionowe (poprzeczne) przekroje siatkówki od dawna okazują się najbardziej praktycznym modelem badania BC i HC; jednak niektóre aspekty fizjologii BC i HC są niedostępne dla eksperymentatora w tym modelu. Bezpośrednie zapisy z HC lub pośrednie pomiary ich wpływu na BC nie odzwierciedlają endogennej łączności siatkówki, ponieważ boczne procesy tych komórek są przerywane podczas cięcia. Preparaty całokształtnego zamontowania siatkówki omijają ten problem, zachowując te boczne wyrostki, ale otaczające warstwy siatkówki stanowią wyzwanie w dostępie do tych komórek4. Chociaż istnieje wiele przykładów immunobarwienia 5,6,7,8 oraz patch clamp9 z neuronów INL w całych siatkówkach, istnieje możliwość przyspieszenia i uproszczenia zbierania tych danych. Ograniczenia przekroju poprzecznego oraz wyzwania całego modelu montażowego zainspirowały więc rozwój alternatywnego przygotowania siatkówki na płasko.

Poniższe opracowanie opisuje protokół umożliwiający łatwe usuwanie warstwy fotoreceptorowej z żywych, płaskich siatkówek, aby poprawić dostęp do BC i HC dla uproszczonego patch clamping oraz szybszego, bardziej efektywnego immunoznakowania. Rozerwanie dwóch kawałków błony nitrocelulozowej przymocowanych po obu stronach izolowanej siatkówki rozrywa tkankę przez aksony fotoreceptorów, pozostawiając rozdzieloną siatkówkę, która zachowuje zewnętrzną warstwę pleksiformną (OPL) oraz wszystkie wewnętrzne warstwy siatkówki. Chociaż inni opisywali protokoły mechanicznego rozdzielania warstw siatkówki, metody te są albo słabo przystosowane do stosowania patch clamping i mikroskopii, albo wymagają żmudnej manipulacji tkanką. Kilka z tych metod wymaga mrożonej lub liofilizowanej tkanki do separacji warstw, co czyni je niekompatybilnymi z eksperymentami elektrofizjologii10, 11, 12. Inne są przeznaczone do żywej tkanki, ale wymagają 5-15 kolejnych peelingów z papierem filtracyjnym 4,11 lub leczenia trypsyną13 w celu usunięcia fotoreceptorów. Opisana tutaj technika udoskonala swoje poprzedniki, upraszczając procedurę usuwania fotoreceptorów i rozszerzając zakres dalszych zastosowań.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy otrzymywały wodę i jedzenie ad libitum oraz były utrzymywane w cyklu światła i ciemności po 12 godzin. Myszy zostały uśpione przez ekspozycję na izofluran, a następnie na przemieszczenie szyjki macicy. Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Zdrowia i Nauki Oregonu.

UWAGA: Enukleacja oka, rozwarstwienie siatkówki oraz rozszczepienie siatkówki powinny być wykonywane jak najszybciej, aby zachować zdrowie żywej tkanki. Staraj się ukończyć sekcję w < 4 minuty na oko. Te trzy kroki mają być wykonywane kolejno. Myszy typu dzikiego: Dorosłe (>3 miesiące) samce i samice C57BL/6J były wykorzystywane do eksperymentów. Do morfologii synaps użyto myszy wyrażających zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod wpływem promotora Pcp2 (Pcp2-cre/GFP)14 . Myszy transgeniczne: Do wizualizacji komórek poziomych za pomocą GFP podczas eksperymentów immunohistochemicznych lub elektrofizjologicznych użyto myszy potrójnie transgenicznej: vGATFLPo; vGlut2Cre; Ai80d. Szczepy vGATFlpo i vGluT2Cre to myszy typu knock-in, które ekspresują rekombinazę Flpo lub Cre poniżej swoich promotorów. Mysz Ai80d jest intersekcyjną myszą reporterową (CatCh/EYFP) i wykazuje jedynie Ca2+ przepuszczalną kanałową rodopsynę (ChR2) w komórkach ekspresyjnych rekombinaz Cre i Flpo. W związku z tym potrójna mysz transgeniczna wyraża ChR2 tylko w komórkach z historią zarówno VGAT, jak i vGluT2.

1. Przygotowanie materiałów do rozwarstwienia siatkówki i jej rozszczepienia

  1. Przygotuj kawałki membrany nitrocelulozowej
    UWAGA: Odłączenie rozdzielonej siatkówki od błony nitrocelulozy zmniejsza fluorescencję tła w mikroskopii i upraszcza rejestrację za pomocą patch clamp. Usunięcie błony może być wykonane przed lub po utrwaleniu tkanek. W przypadku stałych rozszczepionych siatkówek nie jest konieczne leczenie fragmentów błony nitrocelulozy. W przypadku żywych rozszczepionych siatkówek należy traktować błonę zgodnie z krokami 1.1.3 - 1.1.5, aby ułatwić delikatne odłączenie się od tkanki.
    1. Wytnij 16 kawałków (lub więcej) błony nitrocelulozowej na kwadraty o wymiarach 5 mm x 5 mm. Dodatkowe można przygotować hurtowo i przechować do przyszłego użytku.
    2. Odłóż połowę kawałków membrany na późniejsze użycie. Te elementy nie będą traktowane roztworem blokującym.
    3. Pozostałe składniki inkubuj w bezdetergentowym roztworze blokującym IHC (np. 3% surowicy końskiej + 0,025% NaN3 rozcieńczonej w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając.
      UWAGA: Stosuj odpowiednie środki ochrony osobistej podczas kontaktu z NaN3, ponieważ jest to silna toksyna.
    4. Dokładnie umyj fragmenty membrany przez inkubację w mediach Ames z buforem wodorowęglanowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając.
    5. Całkowicie wysusz na powietrzu zatkane fragmenty błony (~20 min). Oznacz i przechowuj elementy membrany w temperaturze pokojowej, oddzielając je od nieprzetworzonych fragmentów.
  2. Przygotuj medie Amesa
    1. Przygotuj podłoże Ames z buforem wodorowęglanowym i utrzymuj roztwór w temperaturze pokojowej przy stałej karbogenacji (95%O2 i 5%CO2).

2. Enukleacja oka myszy

  1. Uśpij mysz dowolną dostępną metodą zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi IACUC.
  2. Odwróć mysz na bok i delikatnie dociskaj dwoma palcami wokół oczodołu. To spowoduje, że oko wypuknie z czaszki.
  3. Za pomocą zakrzywionych nożyczek do sekcji przeciń pod wypukłym okiem, aby przeciąć nerw wzrokowy i oddzielić oko od czaszki.
  4. Nabierz oko nożyczkami i umieść je w szalce Petriego wypełnionej lodowatym medium Amesa.
    UWAGA: W zastosowaniach położonych dalej, gdzie tkanka zostanie utrwalona po rozszczepieniu, zamiast medium Ames można stosować lodowato zimne PBS.
  5. Powtórz kroki 2.1 - 2.4 dla pozostałego oka.

3. Sekcja siatkówki

  1. Użyj niestandardowej szklanej pipety transferowej, aby przenieść jedno oko na nową szalkę Petriego zawierającą świeże, lodowato zimne media Amesa.
    UWAGA: Szerokie otwarcie niestandardowej pipety transferowej zapobiega przypadkowemu ściskaniu tkanki, a stosowanie szkła minimalizuje przyczepność tkanki do ścian pipety. Jednak szerokie otwory plastikowe pipety transferowe są również akceptowalne, jeśli eksperymentator jest już biegły w obsłudze tego narzędzia.
  2. Użyj kleszczy, aby ustabilizować oko, przypinając jego dodatkową tkankę łączną do dna szalki Petriego. Następnie przebij oko wzdłuż linii ora serrata igłą 25G, aby stworzyć punkt wejścia do nożyczek Vannas.
  3. Użyj nożyczek Vannas, aby przeciąć wzdłuż linii ora serrata, aż rogówka oddzieli się od reszty oka (Ilustracja uzupełniająca 1A). Usuń soczewkę z oczka za pomocą kleszczy (Ilustracja uzupełniająca 1B).
  4. Użyj niestandardowej szklanej pipety, aby przenieść szklankę do dużej objętości (≥100 mL) węglowodanego Amesa i powtórz kroki 3.1 - 3.3 z pozostałym okiem.
    UWAGA: Oczka umieszcza się w węglowodanowych Ames, aby utrzymać zdrowie tkanek, podczas gdy drugie oko przeprowadza się sekcję.
  5. Przełóż jedną szklankę do szalki Petriego wypełnioną świeżo węglowodanym Amesem.
  6. Używając nożyczek Vannasa, wykonaj małe cięcie do środka od krawędzi twardówki, a następnie użyj dwóch par kleszczy, aby oderwać twardówkę od siatkówki (Ilustracja uzupełniająca 1C). Unikaj chwytania siatkówki kleszczemi. Zamiast tego rozchyl płaty twardówki powstałe przez cięcie nożyczkami.
  7. Użyj nożyczek Vannas, aby przeciąć nerw wzrokowy łączący twardówkę z siatkówką (Ilustracja uzupełniająca 1D), a następnie delikatnie odciągnij siatkówkę od twardówki nożyczkami lub kleszczami, aby odizolować siatkówkę. (Rysunek 1A).
    UWAGA: Chociaż RPE zazwyczaj pozostaje przymocowany do okularu, nie są wymagane dodatkowe kroki, aby usunąć RPE w przypadku przyłączenia do siatkówki. W tym momencie krawędzie siatkówki można opcjonalnie przyciąć skalpelem, aby zapobiec zgięciom podczas etapu spłaszczania (Rysunek 1B).
  8. Użyj skalpela, aby pociąć siatkówkę na pół lub ćwiartki (rysunek 1C), a następnie użyj niestandardowej pipety transferowej, aby przywrócić kawałki do dużej objętości (≥ 100 mL) nieprzerwanie węglowodanego medium Amesa.
    UWAGA: Wybór połow lub ćwierćdolarówek jest subiektywny. Wybierz najlepszą opcję do wybranego zastosowania.
  9. Powtórz kroki 3,5 - 3,8 dla pozostałego oka, zanim przejdziesz do rozszczepienia siatkówki.

4. Rozszczepienie siatkówki

  1. Usuń medium Amesa z szalek Petriego i zamień je świeżo węglowodanym Amesem.
    UWAGA: Aby utrzymać karbogenację przez resztę procesu rozdzielania siatkówki, wymieniaj medium w szalce Petriego świeżo węglowodanym Amesem mniej więcej co 5 minut.
  2. Używając niestandardowej pipety transferowej, umieść kawałek siatkówki na szklanym szkiełku (7,5 cm x 5 cm), zwojową stroną do góry, a następnie spłaszcz ją, usuwając otaczającą ciecz delikatną przecieczką (rysunek 1D). Jeśli trzeba, delikatnie pociągnij krawędzie siatkówki cienkim pędzelkiem pod mikroskopem sekcyjnym.
  3. Użyj kleszczy, aby opuścić suchy kawałek błony nitrocelulozowej o wymiarach 5 mm x 5 mm na siatkówkę, powodując jej przyleganie do boku komórek zwojowych (Rysunek 1E).
    UWAGA: Jeśli konieczne jest usunięcie błony z żywej tkanki (np. w elektrofizjologii), do tego kroku użyj suchego kawałka błony impregnowanej surowicą (szczegóły patrz kroki 1.1.3 - 1.1.5). Zmniejsza to wytrzymałość przyczepności do warstwy komórek zwojowych, ułatwiając usunięcie siatkówki z nitrocelulozy po rozszczepieniu.
  4. Odwróć siatkówkę tak, aby nitroceluloza spoczywała na szklanym szkiełku i umieść suchy kawałek błony o wymiarach 5 mm x 5 mm na stronę fotoreceptorową siatkówki (rysunek 1F).
  5. Dotknij zwilżoną końcówką pędzla przestrzeń między dwoma błonami i pozwól, by działanie kapilarne wciągnęło Ames do kanapki (Rysunek 1G). Zmniejsza to przyczepność błon do siatkówki i jest konieczne tylko wtedy, gdy siatkówka została nadmiernie wysuszona delikatnym zabiegiem wycieńczeniowym.
    UWAGA: Jeśli siatkówka straciła błyszczący wygląd, została zbyt mocno wysuszona i konieczny jest krok 4.5.
  6. Aby zapewnić równomierne przyleganie, delikatnie naciskaj w dół na górną błonę mokrym pędzlem (rysunek 1H).
  7. Podczas przypinania dolnej błony do szkła jedną parą kleszczy, powolnym, równomiernym ruchem delikatnie odklejając górną błonę za pomocą drugiej pary kleszczy. To spowoduje pęknięcie siatkówki tuż nad OPL (Rysunek 1I).
  8. Usuń górną błonę zawierającą fotoreceptory (rysunek 1J, po lewej). Dolna błona zawiera wewnętrzną siatkówkę, dalej nazywaną rozszczepioną siatkówką (Rysunek 1J, po prawej).
  9. Natychmiast przywróć rozdzieloną siatkówkę do węglowodanowego ośrodka Amesa.
    UWAGA: W eksperymentach na żywej tkance siatkówka może skorzystać z okresu rekonwalescencji trwającej 15-30 minut w karbogenezowanych Amesach po rozszczepieniu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Zabieg rozdzielenia siatkówki. (A) Po enukleacji i przygotowaniu szklanki w zimnych ośrodkach PBS lub Amesa, izoluj siatkówkę myszy od szklanki i zastąp PBS ośrodkiem Amesa w temperaturze pokojowej, węglowodenowanym. (B) Skalpelem przycinam krawędzie siatkówki tak, że nie ma już miejsc z wygięciem do wewnątrz (opcjonalnie). (C) Przetnij siatkówkę na ćwiartki lub połówki skalpelem. (D) Umieść jeden kawałek siatkówki na szklanym szkiełku (komórka zwojowa do góry) za pomocą niestandardowej pipety transferowej i usuń nadmiar Amesa delikatnym wycieraniem zadaniowym. Upewnij się, że półsucha siatkówka leży płasko na szkle, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Użyj końcówki pędzla zwilżonej Amesem, aby delikatnie rozłożyć obszary siatkówki, które nie są płaskie. (E) Za pomocą kleszczy umieść na spłaszczonej siatkówce wstępnie wycięty kawałek suchej błony nitrocelulozowej (5 mm x 5 mm). (F) Odwróć kawałek nitrocelulozy tak, aby strona fotoreceptorowa siatkówki była teraz skierowana do góry. Następnie przyłóż kolejny suchy kawałek błony na siatkówkę. (G) Dotknij mokrą końcówką szczoteczki przestrzeń między dwiema błonami i pozwól, by działanie kapilarne wciągnęło Amesa do kanapki. Zmniejsza to przyczepność błon do siatkówki i jest konieczne tylko wtedy, gdy siatkówka została nadmiernie wysuszona delikatnym zabiegiem do czynności. (H) Użyj mokrej końcówki pędzla, aby delikatnie docisnąć w dół środek zaciśniętej siatkówki. (I) Użyj jednej pary kleszczy, aby przypiąć dolny kawałek membrany do szklanego szkła, a inną parą kleszczy delikatnie odklej górny kawałek membrany od dolnego. (J) Wewnętrzna siatkówka (po lewej) pozostaje na dolnej błonie, podczas gdy fotoreceptory (po prawej) są odciągane wraz z górną błoną. Panele (A), (B), (C), (D) i (J) zostały pozyskane za pomocą mikroskopu sekcyjnego; pasek skali reprezentuje około 1 mm; panele (E-I) były nagrywane aparatem smartfona bez powiększenia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

5. Przygotowanie rozszczepionych siatkówek do eksperymentów immunofluorescencyjnych

UWAGA: Rozdzielona siatkówka będzie nadal przyczepiona do błony nitrocelulozowej aż do kroku 5.5. Wykonaj albo krok 5.1, 5.2, 5.3 lub 5.4, nie wszystkie cztery, ponieważ są one przeznaczone dla różnych eksperymentów.

UWAGA: Używaj odpowiedniej ochrony osobistej i ostrożnie postępuj przy obsłudze paraformalnego dehydu (utrwalającym).

  1. Przygotowanie do immunofluorescencji płaskiej
    1. Inkubuj rozdzieloną siatkówkę w 4% paraformaldehydzie na lodzie przez 30 minut, używając wystarczającej ilości roztworu, aby całkowicie pokryć siatkówkę.
    2. Umyj rozszczepione siatkówki 3 razy w 5-10 ml PBS w temperaturze pokojowej. Opcjonalna przerwa: Rozszczepione siatkówki można pozostawić w PBS w temperaturze 4 °C do 24 godzin.
  2. Przygotowanie do immunofluorescencji z pionowymi przekrojami rozszczepionej siatkówki
    1. Inkubuj rozdzieloną siatkówkę w 4% paraformaldehydzie na lodzie przez 30 minut, używając wystarczającej ilości roztworu, aby całkowicie pokryć siatkówkę.
    2. Umyj rozszczepione siatkówki 3 razy w 5-10 ml PBS w temperaturze pokojowej. Opcjonalna przerwa: Rozszczepione siatkówki można pozostawić w PBS w temperaturze 4 °C do 24 godzin.
    3. Przy pozostającej błonie przymocowanej, kolejno zanurz rozszczepioną siatkówkę w 10%, 20% i 30% sacharozy w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby kryochronić tkankę.
    4. Osadzić kriochronione rozszczepione siatkówki w optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) i przechowywać je w temperaturze -80 °C (do 6 miesięcy) do czasu kriosekcji.
    5. Usuń rozszczepione siatkówki z temperatury -80 °C i użyj kriostatu do cięcia fragmentów o grubości 20 μm. Zamontuj sekcje na elektrostatycznie naładowanych szkiełkach szklanych mikroskopów, pozwól im wyschnąć na powietrzu, a następnie przechowuj je w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
  3. Przygotowanie do podwójnej fluorescencji in situ hybrydyzacji i immunohistochemii
    1. Inkubuj rozdzieloną siatkówkę w 4% paradehydzie na lodzie przez 2 godziny, używając wystarczającej ilości roztworu, aby całkowicie pokryć siatkówkę.
    2. Umyj rozszczepione siatkówki 3 razy w 5-10 ml PBS w temperaturze pokojowej. Opcjonalna przerwa: Rozszczepione siatkówki można pozostawić w PBS w temperaturze 4 °C do 24 godzin.
  4. Przygotowanie do elektrofizjologii
    1. Przygotuj pipety patch, wyciągając grubościenne pipety z borosilikatu za pomocą filamentu za pomocą mikropipety. Używaj tylko pipet o zmierzonej rezystancji między 6 a 10 MΩ.
    2. Wypełnij wyciągnięte pipety roztworem wewnętrznym zawierającym (w mM): 125 K-glukonianu, 8 KCl, 5 HEPES, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 0,2 EGTA, 3 ATP-Mg i 0,5 GTP-Na.
  5. Usunięcie rozdzielonej siatkówki z błony nitrocelulozy
    1. Używając hydrofobowego długopisu barierowego, przygotuj okrągłe wgłębienia na szkiełku mikroskopowym (~1 cm średnicy) i pozwól im wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut.
    2. Umieść rozszczepione siatkówki w przygotowanych dołkach bariery hydrofobowej i dodaj tyle PBS, by całkowicie je pokryć.
    3. Pod mikroskopem sekcyjnym wpchnij włosie cienkiego pędzla pod krawędzie tkanki i delikatnie unieś w górę. W ten sposób pracuj wokół siatkówki w okręgu, aby unieść ją z dala od błony.
    4. Użyj kleszczy, aby usunąć błonę spod unoszącej się części siatkówki.
    5. Ostrożnie zachłysaj pozostałe PBS, tak aby fragment siatkówki spoczął na szkiełku mikroskopu, zwojem do dołu.
      UWAGA: Poniższe kroki nie powinny być wykonywane kolejno. Wybierz odpowiedni protokół dla pożądanego zastosowania (tj. immunobarwienie lub podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ [FISH] oraz immunohistochemia [IHC] lub elektrofizjologia).

6. Immunobarwienie

  1. Jeśli nie są jeszcze przygotowane, użyj hydrofobowego pióra barierowego, aby stworzyć okrągłe wgłębienia na szkiełku mikroskopowym (~1 cm średnicy) i pozwól im wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Wszystkie etapy inkubacji i mycia będą wykonywane w tych dołkach do zagrody.
  2. Inkubuj rozdzielone siatkówki lub pionowe fragmenty siatkówki w roztworze inkubacyjnym przeciwciał (AIS: 3% surowica końska, 0,5% Triton X-100, 0,025% NaN3 w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubuj rozszczepione siatkówki lub pionowe fragmenty siatkówki z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w AIS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Czas inkubacji przeciwciał pierwotnych będzie wymagał optymalizacji pod kątem różnych celów białkowych i przeciwciał.
  4. Umyj tkankę 3 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  5. Inkubuj tkankę przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi w AIS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj tkankę 3 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  6. Jeśli pożądane jest barwienie jądrowe, inkubuj tkankę rozcieńczonym DAPI w PBS przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Umyj tkankę 1 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  7. Nałóż kroplę materiału montującego preparaty na każdy kawałek chubułki i zamontuj szklaną pokrywkę.
  8. Nałóż lakier wokół krawędzi pokrywki, aby zabezpieczyć próbkę. Przechowuj zjeżdżalnię w temperaturze 4 °C.

7. Podwójne FISH i IHC

  1. Piecz rozszczepione siatkówki w temperaturze 40 °C przez 30 minut w piecu hybrydyzacyjnym, aby zwiększyć przyczepność do zlewki.
  2. Ukończ protokół RNAscope FISH zgodnie z protokołem producenta, z następującymi wyjątkami i zmianami:
    1. Nie jest wymagany żaden etap pobierania antygenu. Stosuj proteazę III z czasem inkubacji 18 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Wszystkie kroki mycia wykonuj na zjeżdżalni wewnątrz dołków wykonanych przez hydrofobową zagrodę barierową.
  3. Inkubuj próbki w pierwotnych przeciwciałach rozcieńczonych (patrz Tabela materiałów) w PBS przez 30 minut w temperaturze 40 °C w piecu hybrydyzacyjnym. Przemyj próbki 3 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  4. Inkubuj próbki w rozcieńczonych przeciwciałach wtórnych (patrz Tabela materiałów) w PBS przez 30 minut w temperaturze 40 °C w piecu hybrydyzacyjnym. Przemyj próbki 3 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  5. Inkubuj próbki w 1x DAPI przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Przemyj próbki 1 razy w temperaturze pokojowej PBS.
  6. Nałóż kroplę nośnika anty-blakowego na każdy kawałek chusteczki i zamontuj szklaną pokrywkę.
  7. Nałóż lakier wokół krawędzi pokrywki, aby zabezpieczyć próbkę. Przechowuj zjeżdżalnię w temperaturze 4 °C.

8. Elektrofizjologia

  1. Po usunięciu błony nitrocelulozowej przenieś rozdzieloną siatkówkę do komory rejestrującej patch-clamp i delikatnie zakotwicz ją platynową harfą.
  2. Przez cały eksperyment nieustannie perfuzuj rozdzieloną siatkówkę roztworem Ames karbogenyzowanym 95%O2 i 5%CO2. Utrzymuj roztwór w zakresie 32-34 °C.
    UWAGA: Podczas eksperymentu tkankę można zobrazować za pomocą mikroskopii gradientowej Dodt.
  3. W oświetleniu pokoju wykonaj zaciskanie napięcia całej komórki, aby rejestrować z neuronów INL.
    1. Podczas nagrywania symuluj odpowiedzi świetlne za pomocą mikrokomórkowej jednostki do wtrysku do stosowania związków farmaceutycznych lub diody LED o częstotliwości 470 nm do stymulacji channelrodopsyny (ChR2).
      UWAGA: Natężenie światła można mierzyć za pomocą cyfrowego miernika mocy optycznej.

9. Mikroskopia konfokalna

  1. W przypadku immunofluorescencji konfokalnej wykonuj zdjęcia mikroskopem konfokalnym za pomocą obiektywu immersyjnego olejowego 40x/1.3 lub 63x/1.40. Użyj FIJI do regulacji jasności i kontrastu oraz do generowania projekcji Z ze stosów obrazów.

  

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozdzielanie siatkówki zachowuje zakończenia fotoreceptorowe

Aby potwierdzić, że rozszczepienie siatkówki nie uszkadza dendrytów neuronów drugiego rzędu w OPL, pionowe sekcje rozszczepionych siatkówek zostały zabarwione przeciwciałami przeciwko synaptofizynie białka pęcherzyka synaptofizyny (zielone) oraz kinazy C alfa (PKCα; czerwonej). Intensywny pas znakowania synaptofizyny na górze rozdzielonej siatkówki wskazuje, że zakończenia synaptyczne fotoreceptorów są zachowane (Rysunek 2). Ponadto barwienie PKCα ujawnia prawidłową morfologię komórek dwubiegunowych pręcików (RBC). Nie widać jąder fotoreceptorów, co wskazuje, że siatkówka jest podzielona między OPL a najgłębsze rzędy ciał komórek fotoreceptorowych (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Rozszczepione siatkówki zachowują zakończenia fotoreceptorowe. Fluorescencyjne mikrografie konfokalne pokazujące pionowy przekrój poprzeczny siatkówki rożyny, która została kriosekcjonowana (o grubości 20 μm) po procedurze rozdzielania. Każdy obraz jest maksymalną projekcją konfokalnego stosu z. Sekcja została immunoznakowana przeciwciałami przeciwko PKCα (góra na środku) i synaptofizynie (na górze po prawej), aby zobrazować odpowiednio RBC i pęcherzyki synaptyczne. Połączony obraz (na dole) pokazuje pęcherzyki synaptyczne (zielone), które znajdują się w zakończeniach fotoreceptorów, tuż nad wyrostkami wierzchołkowymi czerwonych krwinek (czerwonymi) w OPL. Jądra komórkowe są oznaczane DAPI (niebieskim). W ONL nie są widoczne jądra fotoreceptorów. Skróty: ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa; OPL = zewnętrzna warstwa pleksiformowa; INL = wewnętrzna warstwa jądrowa; IPL = warstwa pleksiformna wewnętrzna; GC = komórki zwojowe (ganglion). Paski skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  

Morfologia synaps w OPL zachowana jest po rozdzieleniu siatkówki

Używając myszy ekspresyjnej GFP w czerwonych krwinkach pod wpływem promotora pcp2,14 białek przed- i postsynaptycznych w OPL zostało immunoznakowanych w celu oceny integralności tej warstwy synaptycznej po podziałie14. Pomimo sił ścinających występujących przez aksony fotoreceptorów, rozszczepienie nie zakłóca morfologii synaps fotoreceptorów BC w OPL, ponieważ obserwuje się prawidłowe położenie dendrytów RBC, oznaczonych dla RGS11, oraz wstęg synaptycznych fotoreceptorów, oznaczonych dlaCtBP2 15 (Rysunek 3). Dla każdego kontaktu synaptycznego między pręcikami a czerwonymi krwinkami, RGS11 można postrzegać jako czerwone punkty leżące w kształcie podkowy wstążek synaptycznych (zielone). W kolejnym eksperymencie zastosowano przeciwciało anty-GPR17916 do znakowania dendrytycznych końcówek dendrytycznych postsynaptycznych ON-BC16, a przeciwciało anty-PSD-95 do oznaczania końcówek fotoreceptorów pręcików presynaptycznych (Rysunek uzupełniający 2). Wyniki te ponownie potwierdzają stabilność OPL w przygotowaniu rozdzielonej siatkówki, ponieważ dendryty RBC wykazują bliskie powiązania ze swoim presynaptycznym partnerem, czyli końcówkami pręcików.

figure-results-2
Rysunek 3: Morfologia synapsy w OPL zachowana jest po rozszczepieniu siatkówki. Konfokalne obrazy immunofluorescencji rozdzielonej siatkówki u myszy transgenicznej ekspresyjnej w czerwonych krwinkach pod promotorem Pcp2. Poziomy ekspresji GFP (niebieskie) różnią się w zależności od czerwonych krwinek w siatkówce. Po rozszczepieniu siatkówka została utrwalona, a następnie inkubowana przeciwciałami przeciwko CtBP2 (zielony) i RGS11 (czerwony), aby znakować odpowiednio wstążki synaptyczne fotoreceptorów i końcówki dendrytyczne ON-BC. Każda para czerwono-zielona reprezentuje kontakt synaptyczny między pręcikiem a ON-BC. Paski skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozszczepienie siatkówki utrzymuje żywotność RBC

Aby ocenić żywotność neuronów wewnętrznych siatkówki po rozszczepie, użyto błonowo-nieprzepuszczalnego, bliskopodczerwieniowego barwnika jądrowego (MI-NIR), który umożliwia identyfikację martwych komórek. Po inkubacji z MI-NIR, rozszczepione siatkówki zostały utrwalone, a następnie znakowane anty-PKCα w celu identyfikacji czerwonych krwinek. Mikrografie konfokowe rozszczepionych siatkówek ujawniają regionalną zmienność żywotności komórek w tkance, przy czym niektóre regiony doświadczają wyższego wskaźnika śmierci komórek niż inne. Ta zmienność może wynikać z uszkodzeń zadanych określonym obszarom siatkówki podczas sekcji, rozszczepiania lub manipulacji (Rysunek 4). Biorąc pod uwagę, że ciała komórek RBC znajdują się w najbardziej zewnętrznym obszarze INL, blisko miejsca rozdzielenia, konieczne było dokładne ocenenie ich żywotności. Niewielka kolokalizacja PKCα i MI-NIR potwierdziła, że większość czerwonych krwinek pozostaje żywotna po rozszczepieniu siatkówki (Rysunek 4).

figure-results-3
Rysunek 4: Komórki dwubiegunowe pręcików są żywotne po rozdzieleniu siatkówki. Fluorescencyjne mikrofotografie konfokalne pokazujące obszar rozszczepionej siatkówki w perspektywie płaskiej. Po rozszczepieniu żywa siatkówka była inkubowana barwnikiem MI-NIR (czerwonym) przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie siatkówka została utrwalona i immunoznakowana przeciwciałami przeciwko PKCα, aby wizualizować czerwony krwinek (RBC). W tym obszarze siatkówki kolokalizacja PKCα i MI-NIR jest rzadka. MI-NIR współlokalizuje się z jądrami (niebieskimi), które nie należą do czerwonych krwinek. Skróty: MI-NIR = błonowo nieprzepuszczalne barwienie NIR żywe/martwe. Paski skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  

Rozszczepione siatkówki są przystosowane do podwójnych FISH i IHC

Wydłużając czas utrwalenia standardowego IHC, rozdzielone siatkówki mogą być sekwencyjnie przetwarzane przez FISH i IHC, aby jednocześnie oznaczać mRNA i białka 17,18. Eksperymenty potwierdziły, że utrwalenie 4% paradehydu o długości 2 godzin zapewnia solidne znakowanie mRNA, jednocześnie zachowując epitopy białkowe do wiązania przeciwciał. FISH wykonano na rozdzielonych siatkówkach, a następnie IHC, aby zobrazować ekspresję podjednostki receptora GABAA δ (GABRD; sondy mRNA antysensowne) w odniesieniu do pozycji RBC (przeciwciał anty-PKCα) w zewnętrznej części INL (Rysunek 5A). Ekspresja mRNA GABRD występuje rzadko w czerwonych krwinkach (rysunek 5A); jednak transkrypt jest obficie eksprymowany przez komórki amakrynowe i zwojowe, co potwierdza wzorzec znakowania na poprzecznych przekrojach nienaruszonej siatkówki (rysunek 5B). W zewnętrznym INL (rysunek 5A) mRNA GABRD jest bardziej równomiernie rozłożone w porównaniu do wewnętrznego INL (rysunek 5C), gdzie koncentruje się w odrębnych komórkach. Sondy antysensowne celujące w inne podjednostki receptorów GABA generują wyraźne wzorce znakowania, co pokazuje specyficzność sond (dane nie pokazano).

figure-results-4
Rysunek 5: Podwójne FISH i IHC w rozdzielonej siatkówce i nienaruszonej siatkówce. (A, C) Mikrografie konfokalne płaskiego rozdzielenia siatkówki oraz (B) pionowy przekrój nienaruszonej siatkówki. Obrazy w (A) i (C) to maksymalne projekcje przekroju optycznych odpowiednio w górnej i dolnej części INL. Przerywane prostokąty w (B) reprezentują przybliżone granice użyte do stworzenia rzutów pokazanych w (A) i (C). Rozdzielona siatkówka (A, C) była utrwalona przez 2 godziny, a następnie oznaczana sondami antysensownymi mRNA przeciwko GABRD (czerwony). Następnie rozdzielona siatkówka została zabarwiona przeciwciałami przeciwko PKCα, aby oznaczać czerwone krwinki (zielone). Kanał PKCα został pominięty z projekcji dolnego INL dla przejrzystości. Nienaruszona siatkówka w (B) została utrwalona przez 24 godziny przed przecięciem. Następnie unieruchomiona siatkówka została oznaczona antysensownymi sondami mRNA przeciwko GABRD (czerwony). Wszystkie próbki były barwione DAPI (niebieskim) przez 20 sekund przed montażem na pokrywce. Skróty: INL = wewnętrzna warstwa jądrowa. Paski skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdzielone siatkówki doskonale nadają się do rejestrowania elektrofizjologii patch-clamp z BC i HC

Aby załatać somę BC lub HC w tradycyjnej pełnej siatkówce, pipeta musi podejść od strony komórki zwojowy, albo od strony fotoreceptora. Oba podejścia wymagają przejścia przez kilka warstw siatkówki, aby dotrzeć do INL, podczas którego końcówka pipety często zostaje zablokowana przez zanieczyszczenia. W przygotowaniu wibratomu soma BC i HC są łatwo dostępne, jednak ich wyrostki dendrytyczne mogą zostać przerwane, zakłócając połączenia boczne. W rozdzielonych siatkówkach jednak ciała komórek czerwonych i HC znajdują się na powierzchni tkanki, zapewniając znacznie lepszy dostęp do pipet patch przy jednoczesnym zachowaniu bocznych obwodów OPL.

Rysunek 6 przedstawia chemicznie symulowane reakcje świetlne zarejestrowane przez BC w rozdzielonej siatkówce. Perfuzowane medium Amesa zostało uzupełnione L-AP4 (4 μM), agonistą grupy III mGluR, aby zasymulować uwalnianie glutaminianu z fotoreceptorów w ciemności. Antagonista mGluR6, CPPG (600 μM, w Ames), został napompowany na dendryty komórki z łatą (utrzymywanej na -60 mV), aby zasymulować błysk światła poprzez hamowanie mGluR6. Komórki reagowały na zaciągnięcia CPPG dwoma typami prądów do środka. Jeden typ pokazuje prąd przejściowy, po którym następuje plateau (rysunek 6A), podobny do kanonicznych prądów wywołanych światłem rejestrowanych przez erynetki w przecinkach siatkówki19. Drugi typ utrzymuje się przez cały czas trwania (rysunek 6B), przypominając prądy rejestrowane z komórek dwubiegunowych stożków ON (ON-CBC)19.

Przeprowadzono osobny eksperyment dotyczący HC, typu komórki o szerokim polu dendrytycznym, który często trudno zachować w preparatach plasterków. Linia myszy wyrażająca rodopsynę kanałową (ChR2) i GFP w HC została użyta, aby ułatwić identyfikację pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po pierwsze, prądy z HC były rejestrowane w odpowiedzi na serię kroków depolaryzacji (-100 mV do 50 mV, wielkość kroku = 15 mV), na które odpowiadały prądami wejściowymi, a następnie prądami wychodzącymi (rysunek 6C). Komórki te były następnie stymulowane krótkim impulsem niebieskiego światła (200 ms, 470 nm), generując duże, napędzane przez ChR2 prądy wewnętrzne w dwóch komórkach (rysunek 6D).

figure-results-5
Rysunek 6: Nagrania z neuronów INL w rozdzielonych siatkówkach. (A) Domniemany RBC i (B) CBC zostały objęte zaciskiem napięciowym przy -60 mV w perfuzowanym medium Amesa zawierającym L-AP4 (4 μM). Napłynięcie CPPG (600 μM) na dendryty zaciśniętych komórek wywoływało prąd dochodzący, który był przejściowy w krwinkach, ale utrzymywany w morfologii. Nagranie RBC w (A) to pojedynczy ślad, natomiast zapis CBC w (B) reprezentuje średnią 3 śladów. (C) Nagranie patch clamp z HC w vGATFLPo; vGlut2Cre; Mysz AI80d. Czerwona linia pokazuje czas trwania impulsu świetlnego o długości 200 ms o długości 470 nm, używanego do wywołania dużego, wewnętrznego prądu przez ChR2. (D) Odpowiedzi prądu wtryskowego z HC, który był zaciskany napięciem na -60 mV, następnie przechodził między -70 mV a +35 mV w odstępach 15 mV, a następnie wracał do -60 mV. Wstawka pokazuje te same ścieżki w oknie 6 ms otaczającym początek kroku napięciowego. (E) Immunofluorescencyjna mikrografia płaskiej siatkówki rozdzielonej pokazująca poziome komórki ekspresyjne GFP w vGATFLPo; vGlut2Cre; Mysz AI80d. Pasek skali = 20 μm. Dane elektrofizjologiczne były zbierane z częstotliwością próbkowania 20 kHz i filtrowane dolnoprzepustowym filtrem Bessela przy częstotliwości 5 kHz. Następnie eksportowano dane, a wizualizację i analizę offline wykonywano w Pythonie 3. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rozszczepienie siatkówki umożliwia szybkie badanie anatomii INL i OPL

Zewnętrzna błona ograniczająca siatkówki (ELM) i ONL tworzą barierę o grubości ~90 μm, która utrudnia dyfuzję przeciwciał do wewnętrznej siatkówki i tworzy nieoptymalne warunki immunobarwienia 20,21,22. Dlatego immunoznakowanie celów w OPL lub INL przy użyciu konwencjonalnej siatkówki płaskiej wymaga czasochłonnych protokołów barwienia, które często wymagają inkubacji przeciwciał trwających 48-96 godzin 5,6,7,8,20,22.

Usunięcie fotoreceptorów umożliwia szybkie przenikanie przeciwciał do wewnętrznych neuronów siatkówki. W rezultacie oznaczanie celów białek wewnętrznych siatkówki można osiągnąć już w ciągu 1 godziny, stosując przeciwciała pierwotne sprzężone z barwnikiem. Do znakowania RBC i HC INL użyto przeciwciał przeciwko PKCα i Calbindin-D odpowiednio (Rysunek 7). W przeciwieństwie do tradycyjnych pionowych przekrojów siatkówki, które odcinają boczne procesy neuronów szerokokątnych, rozszczepione przygotowanie siatkówki umożliwia wizualizację pełnego drzewa dendrytycznego komórek szerokopolnych, takich jak HC (Rysunek 6E, Rysunek 7).

figure-results-6
Rysunek 7: Szybkie znakowanie immunologiczne białek siatkówki wewnętrznej w rozdzielonej siatkówce. Konfokalne obrazy immunofluorescencji rozdzielonej siatkówki z perspektywy flatmount. Rozdzielona siatkówka była inkubowana przeciwciałami przeciwko PKCα (żółty) i kalbindynowi-D (zielony) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby odpowiednio oznaczać ON-BC i HC. (A) Każdy obraz pojedynczego kanału to średnia projekcja Z-z, składająca się z czterech sekcji optycznych: DAPI, średnia z10-13; Calbindin-D, średnia z11-14; PKCα, średnia z11-14. (B) W połączonym obrazie te same projekcje są nakładane na siebie. Paski skali = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Kluczowe etapy rozwarstwiania siatkówki. Wszystkie zdjęcia zostały wykonane aparatem smartfona zamontowanym na soczewkach ocznych mikroskopu sekcyjnego. (A) Zdjęcie z góry z okiem myszy po usunięciu rogówki. (B) Obraz z góry myszy po zdjęciu soczewki. (C) Małe nacięcie w twardówce na mysiej oczce jest wykonywane. Strzałki wskazują dwa płaty twardówki, które są ciągnięte w przeciwnych kierunkach przez kleszcze, aby zacząć oddzielać siatkówkę od twardówki. (D) Po częściowym odciągnięciu twardówki od siatkówki, między twardówką a siatkówką wprowadza się nożyczki Vannasa, a nerw wzrokowy zostaje przecięty, uwalniając siatkówkę. Czerwone kropkowane koło pokazuje głowicę nerwu wzrokowego, a nożyczki pokazują prawidłową trajektorię cięcia (wstaw nożyczki między twardówką a siatkówką). Odizolowana siatkówka po odcięciu twardówki. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Charakterystyka składników przed- i postsynaptycznych OPL w rozszczepionym siatkówce. Konfokalne obrazy immunofluorescencji z OPL w rozdzielonej siatkówce. Rozdzielona siatkówka była inkubowana przeciwciałami przeciwko GPR179 i PSD95 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby oznaczać odpowiednio końcówki dendrytyczne ON-BC oraz końcówki fotoreceptorów pręcikowych. Obrazy po lewej i środkowej stronie to maksymalne projekcje kilku sekcji optycznych; te same projekcje są nałożone na najbardziej prawy obraz. GPR179 puncta w końcówkach dendrytycznych ON-BC są ściśle związane z końcówkami fotoreceptorów pręcików, co świadczy o nienaruszonych kontaktach synaptycznych w OPL. Skala = 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Rozwiązywanie problemów: ocena jakości rozszczepionej siatkówki. Fluorescencyjne mikrografie rozdzielonej siatkówki barwionej DAPI w celu wizualizacji jąder komórkowych. Komórki można identyfikować na podstawie średnicy i głębokości tkanki jądra. (A) Jądra fotoreceptorów są mniejsze, jaśniejsze i bardziej powierzchowne, podczas gdy (B) jądra BC są większe, ciemniejsze i głębsze. (C) Obraz o niskim powiększeniu obszaru, z którego fotoreceptory zostały niecałkowicie usunięte. Jądra widoczne w ostrości pochodzą z BC, które są głębsze niż jądra fotoreceptorów na krawędziach obrazu, które wydają się nieostre. Paski skalowe dla (A) i (B) = 20 μm. Pasek skali dla (C) = 50 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po tym, jak fotoreceptory przekształcają absorpcję fotonów w uwalnianie neuroprzekaźników, BC i HC są pierwszymi neuronami siatkówki, które przetwarzają sygnał wzrokowy23. Choć znaczenie tych neuronów jest dobrze doceniane, wiele ich funkcji jest niedo do końca poznanych lub w ogóle niezbadanych. Wiele badań fizjologii BC i HC prawdopodobnie skorzystałoby na przygotowaniu siatkówki na płasko-mocowanym, które poprawiłoby dostęp do neuronów INL, zachowując jednocześnie łączność boczną. Opracowanie metody rozdzielonej siatkówki to wysiłek mający na celu zapewnienie łatwego protokołu do pozyskiwania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologicznych oraz danych mikroskopowych od BC i HC w orientacji flatmount. Opisane tutaj przygotowanie rozdzielonej siatkówki można wykonać w około 20 minut na mysz (10 minut na siatkówkę) po izolacji siatkówki, bez użycia specjalistycznego sprzętu. Metoda czerpie inspirację z istniejących procedur usuwania fotoreceptorów, ale oferuje znaczące ulepszenia w zakresie prostoty, szybkości i wszechstronności 4,10,11,12,13. W przeciwieństwie do wcześniejszych metod rozdzielania warstw siatkówki, rozszczepianie siatkówki nie wymaga zamrożenia, liofilizacji ani wielokrotnego nakładania klejów na siatkówkę. Dzięki praktyce niemal wszystkie fotoreceptory można usunąć jednym rozdarciem za pomocą błony nitrocelulozowej. Szybkość i łatwość tego podejścia pozwalają zminimalizować czas, jaki siatkówka spędza poza karbogenezowanym Amesem, co umożliwia wysoką żywotność komórek przez długi czas; rozszczepione siatkówki mogą być utrzymywane w karbogenezowanym medium Amesa przez kilka godzin po rozszczepieniu. Na dowód zdrowia neuronów INL w tym przygotowaniu, barwienie żywych/martwych komórek (Rysunek 4) oraz elektrofizjologia patch-clamp (Rysunek 6) potwierdzają żywotność czerwonych i HC po rozszczepie.

Usunięcie warstwy fotoreceptorowej w rozdzielonych siatkówkach daje znaczącą przewagę podczas immunoznakowania, drastycznie skracając czas dyfuzji przeciwciał do INL. Znakowanie przeciwciał pierwotnych i wtórnych można zakończyć w ciągu 2 godzin, co stanowi znaczną poprawę w porównaniu do konwencjonalnego barwienia płaskiego, które może trwać 72 godziny lub dłużej w zależności od celu: 5,6,7,7,8,20,22. W efekcie dane mikroskopowe mogą być pozyskiwane tego samego dnia co przygotowanie tkanek, co znacznie przyspiesza tempo eksperymentów immunofluorescencyjnych. Aby ułatwić wyżarzanie mRNA sondą, eksperymenty FISH zazwyczaj zalecają znacznie dłuższe czasy wiązania (~24 godziny) niż immunoznakowanie18. Jednak przedstawione tutaj eksperymenty pokazują, że utrwalanie trwające 2 godziny nadal powoduje wyjątkowe oznakowanie FISH (Rysunek 5). Pomimo wydłużenia czasu wiązania z 30 minut do 2 godzin, nie było konieczne wykonywanie etapów pobierania antygenów, aby uzyskać doskonałe znakowanie immunologiczne, ale może to się różnić w zależności od przeciwciała lub antygenu. Leczenie proteazą w protokole FISH może zakłócać znakowanie przeciwciał, prawdopodobnie z powodu zniszczenia celowych epitopów. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu poliklonalnych przeciwciał celujących w wiele epitopów, co zmniejszało prawdopodobieństwo, że zniszczenie epitopów utrudnia immunoznakowanie. Dodatkowo zastosowano umiarkowane leczenie proteazą (proteaza ACD III), aby zapobiec nadmiernej zmianie epitopów, jednocześnie zapewniając wystarczającą penetrację tkanek.

Czasami siatkówka rozdziela się przez zewnętrzną warstwę jądrową (ONL), pozostawiając warstwy somów fotoreceptorowych bez widocznych komórek INL. Aby temu zapobiec, należy upewnić się, że siatkówka leży całkowicie płasko na szkle oraz że wszelkie pozostałości płynu wokół siatkówki zostały usunięte. Mocniejsze naciskanie pędzlem na nitrocelulozę może również pomóc zapobiec pęknięciu ONL. Jeśli błona stanie się zbyt wilgotna lub siatkówka zostanie zgięta na siebie, szanse na skuteczne rozszczepienie znacznie się zmniejszyją. Zastosowanie DAPI do barwienia jąder komórkowych jest przydatne do oceny jakości rozszczepu oraz do określenia pokrycia pozostałych fotoreceptorów. Jądra fotoreceptorów są mniejsze, jaśniejsze i bardziej powierzchowne (Ilustracja uzupełniająca 3A), podczas gdy jądra BC są większe, ciemniejsze i głębsze (Ilustracja uzupełniająca 3B). W niektórych przypadkach płaszczyzna rozdarcia nieznacznie zmienia się na części siatkówki, co skutkuje miejscami, w których ciała komórek fotoreceptorów nie zostały całkowicie usunięte (Rysunek uzupełniający 3C). W zastosowaniach w mikroskopii i elektrofizjologii nie przeszkadza to w zbieraniu wysokiej jakości danych z regionów, gdzie fotoreceptory zostały prawidłowo usunięte; Duże pola odsłoniętej wewnętrznej siatkówki można łatwo znaleźć podczas obrazowania lub nagrywania pipetą patch. Jeśli pożądane jest bardziej pełne usunięcie fotoreceptorów, można wykonać drugie zerwanie dodatkowym kawałkiem błony nitrocelulozowej, choć 100% usunięcie fotoreceptorów nie jest gwarantowane. Dlatego zaleca się ostrożność przy stosowaniu rozdzielonych siatkówek w badaniach ekspresji genów lub proteomiki, gdzie resztki materiału fotoreceptorowego mogą wpływać na wyniki. W przypadku zastosowań pojedynczych komórek takie obawy są nieuzasadnione, ponieważ dane z fotoreceptorów mogą zostać wykluczone z analizy.

Zalety przygotowania rozdzielonej siatkówki są być może najbardziej widoczne w elektrofizjologicznych zapisach szerokopolowych interneuronów. Podczas gdy tradycyjne pionowe cięcia przerywają rozległe procesy komórek szerokopolnych, przygotowanie rozdzielonej siatkówki pozostawia OPL i IPL nienaruszone, pozwalając na przechwytywanie danych z komórek szerokopolnych, takich jak HC24, A1725, TH AC26 i NOS-1 AC27 , które w przeciwnym razie byłyby pomijane w pionowych przekrojach. Dlatego interpretacja wyników i porównanie z wcześniejszymi danymi zebranymi z nacięć siatkówki wymaga starannego przemyślenia. Niemniej jednak, w eksperymentach z farmakologicznymi naśladowcami stymulacji światła wyniki te przypominają dane zarejestrowane z przekrojów siatkówki19. Ekspresując ChR2 pod promotorami specyficznymi dla komórek, można stymulować pożądaną populację komórek, jednocześnie rejestrując BC w INL, aby zbadać wpływ pożądanej komórki na pionową ścieżkę informacyjną. Bezpośrednie rejestrowanie z głębiej neuronów INL, takich jak komórki amakryny, jest również możliwe w rozdzielonej siatkówce. Chociaż w tym przypadku elektroda plastrowa musi najpierw przejść przez bardziej powierzchowne neurony INL, znacznie mniej tkanek blokuje jej drogę w porównaniu do tradycyjnego przygotowania pełnego montażu.

Oprócz pomiaru wpływu komórek szerokokątnego na inne neurony, metoda ta umożliwia bezpośrednie zaciskanie łatek pojedynczych komórek przez HC, których dendryty tworzą rozległą sieć sprzężoną szczelinowo-złączową w OPL28. Komórki poziome wysyłają krytyczne sprzężenie zwrotne do fotoreceptorów, które kształtują przekazywanie informacji pionowych przez siatkówkę. Jednakże, ponieważ pola dendrytyczne HC są odcięte w pionowych fragmentach, brakuje danych rejestrujących pojedynczą komórkę. Prace te przedstawiają anatomicznie i fizjologicznie nienaruszone HC, z których zarejestrowano prądy wywołane ChR2 w potrójnej linii myszy transgenicznej (Rysunek 6 C-E). Poza stymulacją ChR2, rozdzielona siatkówka może być wykorzystywana do badania endogennych prądów HC oraz sprzężenia szczelinowego28. Choć rozdzielona siatkówka stanowi wygodny model do badania łączności synaptycznej i aktywności neuronalnej wywołanej przez chemiczne działanie lub stymulację ChR2, brak fotoreceptorów uniemożliwia bezpośrednie badanie naturalnych odpowiedzi świetlnych lub mechanizmów adaptacji do światła.

Obrazowanie in situ siatkówki poczyniło w ostatnich latach godne podziwu postępy. Jednak większość badań obrazowych ogranicza się do warstwy komórek zwojowe w całych przygotowaniach siatkówki29. Autorzy przewidują, że brak fotoreceptorów w rozdzielonej siatkówce uczyni ją idealnym modelem do obrazowania wapnia na żywo w OPL i INL. Poza obrazowaniem wapnia, model ten ma duży potencjał do wykorzystania z genetycznie kodowanymi biosensorami, takimi jak iGluSnFR30,31, iGABASnFR32 i pHluorin33. W połączeniu z przygotowaniem rozdzielonej siatkówki, te potężne narzędzia mogą zaoferować efektywne podejście do badania interakcji synaptycznych oraz biofizycznych właściwości BC i HC, które przyczyniają się do przetwarzania światła w siatkówce.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez następujące granty NIH: grant NIH R01EY031596 (dla C.M.); NIH grant R01EY029985 (dla C.M.); P30EY010572 grantu NIH (dla C.M.); NIH grant R01EY032564 (na licencjat). Dziękujemy Tammie Haley za wsparcie techniczne przy przygotowaniu sekcji siatkówki oraz dr Charlesowi Allenowi za hojny wkład w badania sond mRNA FISH użytych w tej pracy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Szklane pokrywkiFisherbrand12544E
2 pary kleszczy Dumont #5Ted Pella38125
Igła 25 gaugeBecton Dickenson305122
470 nm LEDTHORLABSM470L2
Nożyczki zakrzywione 5-306Miltex5-306
9" jednorazowe pipety pasteur Fisherbrand13-678-20Ddo budowy niestandardowych pipet transferowych
Mysz Ai80dJackson Laboratories25109RRID: IMSR_JAX:025109
Ames Medium z L-glutaminianemBiologia USAA1372-25
Oprogramowanie sterujące wzmacniaczemUrządzenia molekularneOprogramowanie Clampex 10.3
przeciwciało przeciwkalbątyny D28KInvitrogenPA-5 85669RRID: AB_2792808, gatunek gospodarza = królik; Rozcieńczenie 1:100
przeciwciało przeciw CtBP2BD Biosciences612044RRID:  AB_399431, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:5000
Przeciwciało przeciw GPR179NANAdar od Kirilla Martemianova; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; gatunek gospodarza = owce; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało alfa przeciw PKCSigma-AldrichP4334RRID: AB_477345, gatunek gospodarza = królik; Rozcieńczenie 1:5000
Przeciwciało alfa przeciw PKCSanta Cruz Biotechnologysc8393 AF594RRID: AB_628142, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000
przeciwciało przeciwciało przeciw PSD95Laboratoria Transdukcji BD610495RRID:  AB_397862, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-RGS11NANAprezent od Teda Wensela; Baylor College of Medicine w Houston, TX;   gatunek gospodarza = królik; rozcieńczenie między 1:1000 a 1:5000
przeciwciało przeciwsynaptofizyna P38SigmaS-S5768RRID: AB_477523, gatunek gospodarza = mysz; Rozcieńczenie 1:1000
Nośniki montażowe AquamountEpredia13800Nośniki montażowe na suwakach
Mysz C57BL/6JJackson Laboratories000664RRID: IMSR_JAX:000664
Zbiornik węglowodynowyMathesonNA95% O2 i 5% CO2
Niestandardowa pipeta transferowaBudowa na zamówienieNAInstrukcje: użyj nożyczek, aby odciąć końcówkę pipety transferowej plastyki w miejscu, gdzie zaczyna się zwężać. Użyj szczypiec, aby bezpiecznie odłamać ostatnie 2-3 cale szklanej pipety pasteur. Włóż wąski koniec szklanej pipety pasteura do szerokiego końca plastikowej pipety transferowej. Owiń parafilm wokół połączenia obu elementów, aby wzmocnić uszczelnienie.
Cyfrowy miernik mocy optycznejTHORLABS  PM100D
Mikroskop sekcjonującyZeissStemi 2000
Wzmacniacz elektrofizjologiiUrządzenia molekularneAxopatch 200B
Mikroskop elektrofizjologicznyOlympusOLIMP, BX50WIMikroskopia gradientowa z kontrastem Dodta
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
HC PL APO CS2 40x/1.3 Leica506358
HC PL APO CS2 63x/1.40 Leica15506350
Piec hybrydyzacyjnyRobbins ScientificModel 1000tylko dla protokołu RNAscope
Immedge hydrofobowe zagroda barieroweLaboratoria VectorH-4000
izofluranPiramal Intensywna Opieka Krytyczna66794-017-25
Kimwipe (delikatne wycieranie zadań)Nauka Kimtech34155
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 obiektyw immersyjny olejowyLeica506358
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 obiektyw immersyjny olejowyLeica15506350
Leica TCS SP8 X mikroskop konfokalny LeicaWycofane z produkcji
Średnia szalka Petriego 15 mmCorning25060-60Oczy są tu przechowywane podczas sekcji siatkówki
Nożyczki stalowe Merit 97-275Zasługi97-275
Ciągarka mikropipetSutter InstrumentP-97
Sonda mRNA Mm-Gabrd-C2ACD459481-C2
Komora eutanazji myszyNANAbudowa na zamówienie; szklana miska Petriego zakrywa mały szklany słoik.
Filtry membranowe z nitroceluloząGE Healthcare Life Sciences; Co, człowieku7184-0050,45 & mikro; Rozmiar porów m
PicospritzerGeneral Valve CorporationPicospritzer II w tekście określana jako jednostka mikrokomórkowa do wtrysków
Pipety transferowe plastikuFisherbrand13-711-7Mdo budowy niestandardowych pipet transferowych
Plastikowe rurkiTygonR-603Do podłączenia do zbiornika węglowodorowego
Platynowa harfaBudowa na zamówienieNAdo zakotwiczenia rozszczepionych siatkówek w komorze rejestrującej elektrofizjologii.   
Pędzel w rozmiarze 0GenerykaNAdo spłaszczania siatkówki podczas rozszczepiania.
Reagent antyfade SlowFade GoldSondy molekularneS36937 w tekście określane jako nośnik anty-fade
Mała szalka Petriego o średnicy 10 mmFalcon353001Oczy są tu umieszczane po enukleacji
Mała szyba (7,5 cm x 5 cm)GenerykaNAFragmenty siatkówki izolatdyjskiej są umieszczane na nim podczas procesu rozszczepiania
Superfrost plus szkiełka mikroskopoweFisherbrand12-550-15Elektrostatycznie naładowane szkiełka mikroskopowe szklane
Grubościenne pipety borosilikatowe z włóknem i filamentem;Sutter InstrumentBF150-86-10HP
nożyczki Vannas; prosteTitan MedicalTMS121nie specyficzne dla marki; Każde porównywalne nożyczki się sprawdzą
mysz vGATFLPoJackson Laboratories29591RRID: IMSR_JAX:029591
mysz vGlut2CreJackson Laboratories28863, 016963RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963
Zestaw do naprawy zombie NIRBioLegend423105w tekście określany jako MI-NIR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgans, C. W. Neurotransmitter release at ribbon synapses in the retina. Immunology & Cell Biology. 78 (4), 442-446 (2000).
  2. Euler, T., Haverkamp, S., Schubert, T., Baden, T. Retinal bipolar cells: elementary building blocks of vision. Nature Reviews Neuroscience. 15 (8), 507-519 (2014).
  3. Barnes, S., Grove, J. C. R., McHugh, C. F., Hirano, A. A., Brecha, N. C. Horizontal Cell Feedback to Cone Photoreceptors in Mammalian Retina: Novel Insights From the GABA-pH Hybrid Model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
  4. Walston, S. T., Chang, Y. C., Weiland, J. D., Chow, R. H. Method to remove photoreceptors from whole mount retina in vitro. Journal of Neurophysiology. 118 (5), 2763-2769 (2017).
  5. Stefanov, A., Novelli, E., Strettoi, E. Inner retinal preservation in the photoinducible I307N rhodopsin mutant mouse, a model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Comparative Neurology. 528 (9), 1502-1522 (2020).
  6. Matsuoka, R. L., Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Parray, A., Badea, T. C., Chédotal, A., Kolodkin, A. L. Transmembrane semaphorin signaling controls laminar stratification in the mammalian retina. Nature. 470 (7333), 259-263 (2011).
  7. Matsuoka, R. L., et al. Guidance-Cue Control of Horizontal Cell Morphology, Lamination, and Synapse Formation in the Mammalian Outer Retina. Journal of Neuroscience. 32 (20), 6859-6868 (2012).
  8. Wässle, H., Puller, C., Müller, F., Haverkamp, S. Cone Contacts, Mosaics, and Territories of Bipolar Cells in the Mouse Retina. Journal of Neuroscience. 29 (1), 106-117 (2009).
  9. Thoreson, W. B., Dacey, D. M. Diverse Cell Types, Circuits, and Mechanisms for Color Vision in the Vertebrate Retina. Physiological Reviews. 99 (3), 1527-1573 (2019).
  10. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  11. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28(2017).
  12. Todorova, V., et al. Retinal Layer Separation (ReLayS) method enables the molecular analysis of photoreceptor segments and cell bodies, as well as the inner retina. Scientific Reports. 12 (1), 20195(2022).
  13. Shiosaka, S., Kiyama, H., Tohyama, M. A simple method for the separation of retinal sublayers from the entire retina with special reference to application for cell culture. Journal of Neuroscience Methods. 10 (3), 229-235 (1984).
  14. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre-recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  15. Sarria, I., Orlandi, C., McCall, M. A., Gregg, R. G., Martemyanov, K. A. Intermolecular Interaction between Anchoring Subunits Specify Subcellular Targeting and Function of RGS Proteins in Retina ON-Bipolar Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (10), 2915-2925 (2016).
  16. Orlandi, C., Cao, Y., Martemyanov, K. A. Orphan Receptor GPR179 Forms Macromolecular Complexes With Components of Metabotropic Signaling Cascade in Retina ON-Bipolar Neurons. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 7153-7161 (2013).
  17. Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. -J. Simultaneous Visualization of RNA and Protein Expression in Tissue Using a Combined RNAscopeTM In Situ Hybridization and Immunofluorescence Protocol. Methods in Molecular Biology. 2148, Clifton, N.J. 301-312 (2020).
  18. Wang, F., et al. RNAscope. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  19. Morgans, C. W., et al. TRPM1 is required for the depolarizing light response in retinal ON-bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19174-19178 (2009).
  20. Alessio, E., Zhang, D. Q. Immunostaining of whole-mount retinas with the CLARITY tissue clearing method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (7), 5054(2020).
  21. Ferguson, L. R., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Grover, S., Chalam, K. V. Retinal Thickness Normative Data in Wild-Type Mice Using Customized Miniature SD-OCT. PLoS ONE. 8 (6), e67265(2013).
  22. Ivanova, E., Toychiev, A. H., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments JoVE. (82), e51018(2013).
  23. Kolb, H. Neurotransmitters in the Retina. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center. (1995).
  24. Chaya, T., et al. Versatile functional roles of horizontal cells in the retinal circuit. Scientific Reports. 7 (1), 5540(2017).
  25. Egger, V., Diamond, J. S. A17 Amacrine Cells and Olfactory Granule Cells: Parallel Processors of Early Sensory Information. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 600537(2020).
  26. Dacey, D. M. The dopaminergic amacrine cell. The Journal of Comparative Neurology. 301 (3), 461-489 (1990).
  27. Park, S. J., et al. Connectomic analysis reveals an interneuron with an integral role in the retinal circuit for night vision. eLife. 9, 56077(2020).
  28. Janssen-Bienhold, U., et al. Connexin57 is expressed in dendro-dendritic and axo-axonal gap junctions of mouse horizontal cells and its distribution is modulated by light. The Journal of Comparative Neurology. 513 (4), 363-374 (2009).
  29. Jain, V., et al. The functional organization of excitation and inhibition in the dendrites of mouse direction-selective ganglion cells. eLife. 9, 52949(2020).
  30. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  31. Strauss, S., et al. Center-surround interactions underlie bipolar cell motion sensitivity in the mouse retina. Nature Communications. 13 (1), 5574(2022).
  32. Marvin, J. S., et al. A genetically encoded fluorescent sensor for in vivo imaging of GABA. Nature Methods. 16 (8), 763-770 (2019).
  33. Beckwith-Cohen, B., Holzhausen, L. C., Wang, T. M., Rajappa, R., Kramer, R. H. Localizing Proton-Mediated Inhibitory Feedback at the Retinal Horizontal Cell-Cone Synapse with Genetically-Encoded pH Probes. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 39 (4), 651-662 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bipolar CellsHorizontal CellsPatch Clamp ElectrophysiologyImmunofluorescence LabelingPhotoreceptor RemovalMouse Retina DissectionNitrocellulose Membrane

Powiązane artykuły