Śledzenie uwalniania miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

Summary

Tutaj opisujemy prosty protokół, który umożliwia in vitro ocenę obfitości znakowanych fluorescencyjnie mikroRNA w celu zbadania dynamiki pakowania mikroRNA i eksportu do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Abstract

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są ważnymi mediatorami komunikacji komórkowej, które są wydzielane przez wiele różnych komórek. Te EV przenoszą bioaktywne cząsteczki, w tym białka, lipidy i kwasy nukleinowe (DNA, mRNA, mikroRNA i inne niekodujące RNA), z jednej komórki do drugiej, co prowadzi do konsekwencji fenotypowych w komórkach biorcy. Spośród wszystkich różnych ładunków EV, mikroRNA (miRNA) przyciągnęły wiele uwagi ze względu na ich rolę w kształtowaniu mikrośrodowiska i edukacji komórek biorców ze względu na ich wyraźną dysregulację i obfitość w EV. Dodatkowe dane wskazują, że wiele miRNA jest aktywnie ładowanych do EV. Pomimo tych wyraźnych dowodów, badania nad dynamiką eksportu i mechanizmami sortowania miRNA są ograniczone. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący analizę EV-miRNA za pomocą cytometrii przepływowej, który można wykorzystać do zrozumienia dynamiki obciążenia EV-miRNA i identyfikacji mechanizmów zaangażowanych w eksport miRNA. W tym protokole miRNA z góry określone do wzbogacenia w EV i zubożenia z komórek dawcy są sprzężone z fluoroforem i transfekowane do komórek dawcy. Znakowane fluorescencyjnie miRNA są następnie weryfikowane pod kątem ładowania do EV i zubożenia komórek za pomocą qRT-PCR. Zarówno jako kontrola transfekcji, jak i narzędzie do bramkowania transfekowanej populacji komórek, dołączono znakowane fluorescencyjnie komórkowe RNA (zatrzymane w komórce i zubożone w EV). Komórki transfekowane zarówno miRNA EV, jak i miRNA zatrzymanym w komórce są oceniane pod kątem sygnałów fluorescencyjnych w ciągu 72 godzin. Intensywność sygnału fluorescencji specyficzna dla EV-miRNA gwałtownie zmniejsza się w porównaniu z miRNA zachowanym w komórce. Korzystając z tego prostego protokołu, można teraz ocenić dynamikę ładowania miRNA i zidentyfikować różne czynniki odpowiedzialne za ładowanie miRNA do EV.

Introduction

MikroRNA (miRNA) są jednym z najlepiej scharakteryzowanych podzbiorów małych niekodujących RNA, które są znane ze swojej kluczowej roli w posttranskrypcyjnej regulacji genów. Ekspresja i biogeneza większości miRNA następuje po skoordynowanej serii zdarzeń, która rozpoczyna się od transkrypcji pierwotnych miRNA (pri-miRNA) w jądrze. Po przetworzeniu jądrowym przez kompleks mikroprocesorowy na prekursorowe miRNA (pre-miRNA), pre-miRNA są eksportowane do cytoplazmy, gdzie są poddawane dalszemu przetwarzaniu przez endonukleazę RNazy III, kostkowującą do 21-23 dojrzałych nukleotydów miRNA duplexes¹. Jedna z nici przetworzonego dojrzałego miRNA wiąże się z docelowymi informacyjnymi RNA (mRNA), prowadząc do degradacji lub represji translacyjnej celów². Opierając się na plejotropowej roli miRNA w jednoczesnej regulacji wielu różnych docelowych mRNA, nie jest zaskakujące, że ekspresja miRNA jest ściśle regulowana³. Rzeczywiście, niewłaściwa ekspresja przyczynia się do różnych stanów chorobowych, zwłaszcza w przypadku raka. Nieprawidłowa ekspresja miRNA nie tylko reprezentuje sygnaturę specyficzną dla choroby, ale pojawiła się również jako cel dla potencjału prognostycznego i terapeutycznego^4,5,6. Oprócz ról wewnątrzkomórkowych miRNA pełnią również role nieautonomiczne. Na przykład, miRNA mogą być selektywnie pakowane do EV przez komórki dawcy i eksportowane do miejsc biorczych, gdzie wywołują różnorodne odpowiedzi fenotypowe w fizjologii normalnej i choroby^7,8,9.

Pomimo wyraźnych dowodów na to, że miRNA związane z EV są funkcjonalnymi biomolekułami, nie jest do końca zrozumiałe, w jaki sposób określone podzbiory miRNA są rozregulowane w stanach chorobowych, takich jak rak, oraz jak maszyneria komórkowa wybiera i sortuje miRNA do Evs^10,11. Biorąc pod uwagę potencjalną rolę EV-miRNA w modulowaniu mikrośrodowiska, kluczowe znaczenie ma identyfikacja mechanizmów zaangażowanych w eksport wybranych miRNA, aby w pełni wyjaśnić rolę EV w komunikacji międzykomórkowej i patogenezie choroby. Zrozumienie procesu uwalniania miRNA do pojazdów elektrycznych nie tylko podkreśli ważne mediatory eksportu miRNA, ale może również dostarczyć informacji na temat potencjalnych środków terapeutycznych. Aby osiągnąć ten poziom wiedzy, należy dostosować narzędzia, które wiernie odpowiedzą na te nowe pytania eksperymentalne. Rzeczywiście, liczba badań oceniających pojazdy elektryczne rośnie wykładniczo ze względu na wprowadzenie nowych technik i kontroli^12,13. W odniesieniu do oceny obfitości eksportowanych miRNA do EV, sekwencjonowanie nowej generacji i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) są obecnie standardowymi narzędziami. Chociaż narzędzia te są przydatne do oceny obfitości miRNA w EV, istnieją ograniczenia co do ich czułości i swoistości, a stosowanie tych statycznych podejść do oceny dynamiki jest niewystarczające. Nakreślenie dynamiki eksportu miRNA do EV wymaga połączenia specjalistycznych narzędzi. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół wykorzystujący fluorescencyjnie sprzężone miRNA do analizy dynamiki uwalniania miRNA z komórek dawcy i włączenia do EV. Omawiamy również zalety i ograniczenia metody oraz przedstawiamy zalecenia dotyczące optymalnego stosowania. Wszechstronna metoda przedstawiona w tym artykule będzie przydatna dla badaczy zainteresowanych badaniem uwalniania miRNA do EV i ich potencjalnej roli w komunikacji komórkowej i chorobie.

Protocol

UWAGA: Jako warunek wstępny do użycia tej techniki, wymagana jest identyfikacja i walidacja selektywnie eksportowanych miRNA. Ponieważ różne linie komórkowe różnią się w zależności od ładunku miRNA posortowanego do ich EV, zaleca się, aby interesująca linia komórkowa i powiązane EV zostały ocenione pod kątem miRNA przed użyciem. Dodatkowo, transfekcja oparta na lipofektamnie jest jednym z krytycznych kroków w protokole; Zaleca się wstępne określenie wydajności transfekcji przed rozpoczęciem eksperymentu.

1. Hodowla komórek w hodowli i transfekcja komórek za pomocą miRNA EV sprzężonego z fluoroforem

1. Umieść 200 000 do 400 000 komórek w trzech dołkach na 6-dołkowej płytce w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Delikatnie obracaj płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubuj komórki, aż osiągną zbieżność 70%-80%, około 24-48 godzin.
2. Dla każdej studzienki, która ma być poddana transfekcji, rozcieńczyć odczynnik do transfekcji w 100 μl pożywki wolnej od surowicy w probówce mikrowirówkowej zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Przed tą konfiguracją należy określić optymalne stężenie lipidów dla interesującej nas linii komórkowej.
3. Dla każdej studzienki, która ma być transfekowana, rozcieńczyć sprzężone z fluoroforem EV-miRNA (2nM) i miRNA komórki (2nM) oddzielnie w probówce mikrowirówkowej w 100 μl pożywki wolnej od surowicy.
   UWAGA: Całkowitą objętość należy obliczyć dla całkowitej liczby transfekowanych studzienek. W tym protokole fluorescencję oceniano w 7 punktach czasowych; w związku z tym całkowita objętość wynosiła 700 μl dla kroku 1.2 i 700 μL dla kroku 1.3. Dodatkowo, aby z pewnością uchwycić dodatnią fluorescencyjną populację komórek, użytkownik powinien transfekować komórki niefluorescencyjnie zaszyfrowanym miRNA i ustawić bramkę wykluczającą te komórki.
4. Dodać rozcieńczoną mieszaninę RNA (z kroku 1.3) do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (z kroku 1.2) i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę 3-4 razy. Pozostaw połączoną mieszaninę lipidów i RNA do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
5. Usuń zwykłą pożywkę hodowlaną z komórek i dodaj 800 μl pożywki bez surowicy do każdego dołka. Delikatnie dodawaj kroplami 200 μl mieszanki lipidów i RNA (z kroku 1.4) do komórek.
   UWAGA: Pożywka Opti-MEM została użyta do transfekcji interesującej linii komórkowej (komórki Calu6). Spróbuj dodać mieszaninę lipidów i RNA bezpośrednio do pożywki hodowlanej, unikając dodawania mieszaniny do boków płytki.

2. Pobieranie transfekowanych komórek w różnych punktach czasowych w celu analizy fluorescencji

1. Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C przez 7 h.
   UWAGA: Aby zweryfikować spójną transfekcję obu miRNA (EV-miRNA i komórka-miRNA), komórki pobiera się z jednej studzienki 3 godziny po transfekcji w celu analizy fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego.
2. Po 7 godzinnym okresie inkubacji usunąć kompleks transfekcji ze studzienek i zastąpić go kompletnymi pożywkami.
3. Aby ocenić 7-godzinny punkt czasowy, zbierz komórki i umyj je trzykrotnie 1x PBS.
   1. Jeśli pracujesz z przylegającymi komórkami, dodaj 200 μl trypsyny do jednego dołka i poczekaj, aż komórki oderwą się od płytki. Przenieś oderwane komórki do probówki mikrowirówkowej i osad przez odwirowanie w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
   2. Sklarowany osad należy wyrzucić ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia osadu komórkowego. Przy pierwszym myciu PBS ponownie zawieś granulat w ~500 μL 1x PBS i powtórz granulowanie, wykonując powyższe kroki wirowania. Powtórz pranie PBS dodatkowo dwa razy.
   3. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl 2% roztworu paraformaldehydu (PFA) i ocenić fluorescencję.
      UWAGA: Po dodaniu 2% PFA osad komórkowy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3-4 dni.
4. Zbierz pozostałe punkty czasowe, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 2.3. Zbierz wszystkie przechowywane granulki komórkowe i wykonaj czynności opisane w sekcji 3.

3. Analiza cytometrii przepływowej sygnału miRNA i EV-miRNA w komórkach

1. Przygotuj komórki do analizy cytometrii przepływowej. Przefiltrować zawiesinę komórek od sekcji 2 do 35 μm nasadek sitowych, które są częścią okrągłodennych probówek polistyrenowych FACS, aby umożliwić usunięcie zanieczyszczeń i agregatów komórkowych, które mogą zakłócać analizę fluoroforową.
2. Ustaw przyrząd zgodnie z instrukcjami kalibracji. Włącz cytometr przepływowy i pozwól mu się rozgrzać przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Zalać układ fluidyczny płynem osłonowym, a następnie sprawdzić i wyregulować wyrównanie lasera.
3. Uruchom kontrolę jakości, aby potwierdzić płynność urządzenia. Załaduj ultraczystą przefiltrowaną wodę do cytometru przepływowego i uruchom z odpowiednim natężeniem przepływu, aby zapewnić odpowiedni czas akwizycji.
   UWAGA: Odpowiednie natężenie przepływu i czas akwizycji będą zależeć od typu ogniwa, które jest przedmiotem zainteresowania, złożoności próbki i pożądanej jakości danych.
4. Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej i potwierdź działanie detektora i laserów. Ustaw parametry progowe i napięciowe do wykrywania w oparciu o linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania i wybrane fluorofory.
   UWAGA: We wszystkich dalszych eksperymentach użyto komórek Calu6.
   1. Ustaw próg przechwytywania sygnału dla ogniw Calu6 na FSC 5000. Wykonaj analizę dla 1 x 10⁴ komórek dla każdego powtórzenia eksperymentalnego.
   2. Aby uwzględnić nakładanie się widm między różnymi fluoroforami, użyj komórek nietransfekowanych i komórek niezależnie transfekowanych tylko jednym z fluoroforów, aby ustawić kontrole kompensacji.
   3. Do wykrywania eksportu miRNA należy użyć kandydujących EV-miRNA (miR-451a i miR-150) sprzężonych z Alexa-fluorem 488 oraz kontrolnego miRNA komórki (cel-miR-67) sprzężonego z Cy3.
   4. Dla każdego EV-miRNA sprzęgnij fluorofor z końcem 5′ nici 5p. Przed transfekcją wyżarzaj nić sprzężoną z fluoroforem do jej 100% komplementarnej nici 3p.
   5. W celu analizy ekspresji w transfekowanych komórkach należy przeanalizować próbki przy użyciu kanałów FSC, SSC, FITC i PE ustawionych odpowiednio na 258, 192, 269 i 423 jednostki napięcia (Rysunek 1A, B).
5. Wprowadzić ujemną próbkę kontrolną do cytometru przepływowego. Przechwytywanie sygnałów komórek po zdefiniowaniu intensywności rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) w niestandardowym arkuszu.
6. Na wykresie wybierz FSC dla osi X, SSC dla osi Y i bramkę dla interesującej populacji, rysując wokół niej wielokąt (patrz Rysunek 1B, dolny panel).
7. Utwórz nową działkę przy użyciu zamkniętej populacji.
   1. Ustaw oś X na sygnał fluorescencyjny 1 (FS1) do wykrywania miRNA komórki, a oś Y na sygnał fluorescencyjny 2 (FS2) do wykrywania EV-miRNA. Ustaw parametry kompensacji dla poszczególnych fluoroforów za pomocą komórek niezależnie transfekowanych każdym z fluorescencyjnie znakowanych miRNA. Na nowej działce brama na interesującą nas populację.
   2. Do wykrywania EV-miRNA należy użyć kanału FITC. Do oceny sygnału komórka-miRNA należy użyć kanału PE. W oprogramowaniu utwórz bramkę wokół komórek, które były dodatnie zarówno dla FITC, jak i PE, rysując wielokąt wokół populacji podwójnej fluorescencji, gdy FITC został wybrany dla osi X, a PE dla osi Y.
8. Rejestruj statystyki dla populacji zamkniętej.
   1. Należy zapisać odsetek komórek w populacji bramkowanej, które są dodatnie zarówno dla FITC, jak i PE, a także dla tych, które są dodatnie dla FITC lub PE.
9. Powtórz powyższe kroki dla wszystkich dodatkowych próbek lub kontroli w eksperymencie.

4. Izolowanie EV od transfekowanych komórek

1. W przypadku komórek hodowanych w pożywkach zawierających surowicę, należy usunąć EV z surowicy, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
   1. Aby wytworzyć surowicę zubożoną w EV, rozcieńczyć surowicę do 50% w pożywce do hodowli komórkowych w celu zmniejszenia lepkości i odwirować powstałą 50% surowicę przy 110 000 x g przez 18 godzin.
   2. Ostrożnie zebrać supernatant (surowicę wolną od EV) i przefiltrować go za pomocą zestawu filtrującego 0,2 μm. Użyj powstałego serum w 50% wolnego od EV, aby wygenerować kompletne podłoże, w tym przypadku RPMI plus 10% serum.
   3. Aby zebrać EVs, dodaj kompletną pożywkę zubożoną EV do komórek i zbierz EV 48 godzin po inkubacji.
      UWAGA: Opisany poniżej protokół został zmodyfikowany z Kowal et al.¹⁴.
2. Hoduj komórki w 15 cm naczyniach do hodowli tkankowej do 80% zgryźliwości. Transfekować komórki oddzielnie za pomocą miRNA komórki i miRNA EV w 10 ml Opti-MEM zgodnie z protokołem transfekcji w sekcji 1 protokołu.
   UWAGA: Nie wszystkie protokoły transfekcji skalują się liniowo. Konieczne może być najpierw dostosowanie i ocena warunków transfekcji na płytkach 15 cm.
3. Po 7 godzinach odessać pożywkę do transfekcji i zastąpić ją pożywką o pojemności EV (15 ml). Hoduj komórki w pożywce zubożonej w EV przez 48 godzin.
4. Usuń kondycjonowaną pożywkę z komórek i dozuj ją do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Odwirować kondycjonowane podłoże o sile 2000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia martwych komórek i resztek komórek. Przenieść powstały supernatant do świeżej probówki.
5. Odwirować supernatant przy 10 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przefiltrować go za pomocą zestawu filtrującego 0,2 μm.
6. Przenieś przefiltrowaną pożywkę do hodowli komórkowych do sterylnej probówki ultrawirówkowej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Zważ i zrównoważ probówki względem siebie. Wirować próbki w temperaturze 110 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości 1x PBS do przepłukania i odwirować w temperaturze 110 000 x g przez 90 min 4 °C.
   UWAGA: Granulat EV został ponownie zawieszony w 60 ml 1x PBS w oparciu o maksymalną objętość dozwoloną dla rur wirnika o stałym kącie zastosowanych w tym badaniu.
8. Odessać PBS i zawiesić granulat EV w odpowiedniej objętości (50-100 μL) świeżego 1x PBS i wirować. Przechowuj EV w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

5. Analiza cytometrii przepływowej sygnału komórka-miRNA i EV-miRNA w EVs

1. Aby przygotować zawiesinę EV do analizy cytometrii przepływowej, należy rozcieńczyć EV w odpowiedniej objętości ultrafiltrowanego 1x PBS.
   UWAGA: Objętość ładunku do analizy cytometrii przepływowej EV należy określić na podstawie liczby EV w próbkach. Z grubsza, jeśli w zawieszeniu EV znajduje się ~ 30 000 cząstek, końcowa objętość powinna wynosić ~500-600 μL w 1x PBS. Czysta próbka zawiera około 35-50 cząstek/μl.
2. Użyj cytometru nanoprzepływowego lub alternatywnego sprzętu o wystarczającej mocy do analizy nanocząstek.
   UWAGA: W tym przypadku zastosowano cytometr nanoprzepływowy Attune NxT.
3. Otwórz oprogramowanie i skonfiguruj przyrząd zgodnie z zalecanymi instrukcjami kalibracji. Wykonaj test wydajności za pomocą wydajnych nanokulek. Jeśli nanokulki zostaną wykryte w standardowym zakresie rozmiarów, wydajność jest optymalna. Określ odpowiednie natężenie przepływu do wykrywania cząstek EV.
4. Przeprowadź kontrolę jakości przy użyciu ultraczystej filtrowanej wody, aby potwierdzić płynność instrumentu oraz wydajność detektora i laserów.
5. Używając kulek kalibracyjnych odpowiednich do eksperymentu, ustaw cytometr przepływowy tak, aby dokładnie wykrywał kulki o różnych rozmiarach i mierzył sygnały fluorescencji.
   UWAGA: Do konfiguracji analizy EV za pomocą cytometrii przepływowej użyto kulek ApogeeMix. Koraliki te zawierają mieszaninę niefluorescencyjnych kulek krzemionkowych i fluorescencyjnych kulek polistyrenowych o rozmiarach od 80 nm do 1300 nm.
   1. Ustaw parametry, aby ocenić czułość i rozdzielczość różnych populacji w mieszance kulek zgodnie z protokołem producenta. Użyj odpowiedniego bramkowania, aby rozdzielić populację ściegów od szumu instrumentu.
6. Dokładnie zwiruj próbki, aby równomiernie rozprowadzić EV przed załadowaniem do analizy.
7. Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej i wprowadź ultrafiltrowany PBS. Ustaw bramkowanie dla cząstek EV za pomocą ultrafiltrowanego PBS, upewniając się, że bramkowanie odpowiada odpowiedniej wielkości cząstek na podstawie kulek w kroku 5.5.
8. Załadować próbkę kontroli ujemnej do analizy EV podczas ich przechodzenia przez cytometr przepływowy. Przechwytywanie sygnałów EV podczas wykreślania FSC na osi X i SSC na osi Y.
   UWAGA: Próg SSC dla przechwytywania EV został ustawiony na 300. Objętość akwizycji ustalono na 95 μl z całkowitej objętości pobranej 145 μl. Natężenie przepływu ustalono na 12,5 μl/min. Analizę przeprowadzono na cząstkach 1 x 10⁶ EV. Populacja pojazdów elektrycznych jest niejednorodna i spowoduje wyizolowanie niektórych szczątków wraz z pojazdami elektrycznymi. Ogólna detekcja cząstek na wykresie FSC vs. SSC uwydatnia cząstki w zróżnicowanym zakresie, co jest oczekiwane w przypadku stosowania surowych preparatów EV.
9. Utwórz nową działkę przy użyciu zamkniętej populacji.
   1. Tym razem wybierz sygnał fluorescencyjny 1 (FS1) do wykrywania miRNA komórki na osi X i sygnał fluorescencyjny 2 (FS2) do wykrywania EV-miRNA na osi Y.
   2. Ustaw parametry kompensacji dla fluoroforów przy użyciu próbek EV wyizolowanych z komórek transfekowanych pojedynczym miRNA. Na nowej działce brama na interesującej nas populacji EV.
   3. W celu analizy ekspresji miRNA sprzężonych z fluoroforem w EV wyizolowanych z transfekowanych komórek, przeanalizuj próbki EV przy użyciu kanałów FSC, SSC, BL1 i YL1 ustawionych odpowiednio na 370, 370, 400 i 400 jednostek napięcia (Rysunek 2A, B).
   4. Rejestruj statystyki dla populacji bramkowanej i wizualizuj je za pomocą histogramów i wykresów kropkowych.
10. Powtórz powyższe kroki dla wszystkich dodatkowych próbek lub kontroli w eksperymencie.

6. Walidacja uwalniania miRNA w EV za pomocą qRT-PCR

1. Ekstrakcję RNA z EV i komórek rodzicielskich za pomocą zestawu do izolacji RNA miRVana zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Kwantyfikacja RNA wyizolowanego z EV nie jest możliwa, ponieważ całkowita ilość RNA wyizolowanego z EV zazwyczaj nie przekracza progu minimalnej ilości standardowej kropli Nano. Wynika to z wyczerpania rybosomalnego RNA z próbek EV, co można zwalidować za pomocą Bioanalizatora Agilent. W związku z tym wynik integralności dla kwantyfikacji EV-RNA zwykle nie jest wiarygodny i nie jest prawdziwym odzwierciedleniem ilości EV-RNA. Dlatego do kwantyfikacji qRT-PCR EV-RNA i komórki-RNA zastosowano równe objętości izolatów RNA po izolacji z równej liczby komórek. Do normalizacji qRT-PCR wykorzystano miRNA wszechobecne w wielu próbkach, jak określono na podstawie wcześniej uzyskanych danych sekwencjonowania RNA.
2. Przekształć wyekstrahowany RNA w cDNA za pomocą zestawu odwrotnej transkryptazy specyficznego dla małych RNA.
3. Skonfiguruj reakcję qRT-PCR przy użyciu matrycy cDNA i starterów specyficznych dla miRNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Do eksperymentów walidacyjnych użyto zestawu miRCURY LNA qRT PCR i odpowiednich starterów od producenta do oceny ekspresji miRNA komórki i EV-miRNA.

Results

Tutaj wykorzystujemy cytometrię przepływową jako potężne narzędzie do badania uwalniania miRNA z komórek do EV. Korzystając z tego protokołu, analiza cytometrii przepływowej komórek transfekowanych miRNA komórki i EV-miRNA ujawniła sekwencyjny spadek sygnału fluorescencji odpowiadającego EV-miRNA, podczas gdy sygnał odpowiadający miRNA komórki został zachowany w komórkach. Aby upewnić się, że koniugacja fluoroforu nie zakłóca uwalniania miRNA do EV, miR-451a sprzężono z dwoma oddzielnymi fluoroforami (tj. Alexa fluor 488...

Discussion

Nowo opracowany protokół umożliwia uchwycenie kinetyki uwalniania miRNA do EV po transfekcji EV-miRNA. Podejście to pozwala na jednoczesną analizę wielu EV-miRNA i miRNA komórek, w zależności od możliwości cytometru. Co więcej, chociaż analiza cytometrii przepływowej może dostarczyć cennych informacji na temat biologii miRNA EV, nie jest pozbawiona ograniczeń. Chociaż niektóre ograniczenia można przezwyciężyć, gdy są używane w połączeniu z innymi technikami w celu bardziej wszechstronnego zrozumienia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Fisher	05-408-129
15 ml probówki Falcon	Corning	352097
6-dołkowe, przezroczyste, z płaskim dnem Płytki do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	Do ustawiania bramkowania i parametrów wykrywania cząstek
Cytometr przepływowy Attune Nxt	ThermoFisher Scientific	N/A	Do analizy fluorescencji w EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A Do	analizy fluorescencji w komórkach
Inkubator do hodowli komórkowych	N/A	N/D	Utrzymanie temperatury 37  ° C i 5% CO2
Pożywka do hodowli komórkowych	Nie		Specyficzne dla interesującej linii komórkowej
Linia komórkowa będąca przedmiotem zainteresowania	N/A	N/A	Dowolna linia komórkowa testowana i oceniana pod kątem EV i komórkowej obfitości miRNA w zależności od zainteresowania.
Komórka-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNA predefiniowane do zachowania przez linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania i nie eksportowane selektywnie do EVs
EV-miRNA (miRNA sprzężone z fluoroforami)	Zintegrowane technologie DNA (IDT)		miRNA predefiniowane do selektywnego sortowania na EV
Mikroskop fluorescencyjny	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Medium o obniżonej surowicy	Fisher Scientific	31-985-070
Hemocytometr naukowy Hausser	Fisher	02-671-54
Hyclon 1x PBS (do hodowli komórkowych)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Odwrotna transkryptaza	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Zielony PCR	Qiagen
mirVana Izolacja RNA	Qiagen	AM1561
Woda wolna od nukleaz	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyd, 4% w PBS	Fisher	AAJ61899AK
Zbiornik odczynnika niesterylny	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsyna 0,25%	Fisher
Ultrawirówka	Nie dotyczy	dotyczy