Ocena zużycia tlenu w mitochondriach za pomocą testu fluorescencyjnego opartego na czytniku płytek

Summary

Ocena zużycia tlenu dostarcza integralnych informacji o funkcji mitochondriów. Za pomocą sondy fosforyzującej z czytnikiem płytek fluorescencyjnych można łatwo uzyskać dokładne i powtarzalne dane bez specjalistycznego sprzętu. Ten test umożliwia każdemu laboratorium pomiar zużycia tlenu przez izolowane mitochondria i obliczenie współczynników kontroli oddechowej.

Abstract

Mitochondria pełnią wiele ważnych funkcji, w tym oddychanie komórkowe, produkcję ATP, kontrolę apoptozy i działanie jako centralny węzeł szlaków metabolicznych. Dlatego eksperymentalna ocena funkcjonalności mitochondriów może zapewnić wgląd w różnice między różnymi populacjami lub stanami chorobowymi. Ponadto cenna jest ocena, czy izolowane mitochondria są wystarczająco zdrowe, aby kontynuować eksperymenty. Jedną z cech często używanych do porównywania funkcji mitochondriów w różnych próbkach jest szybkość zużycia tlenu. Zużycie tlenu i późniejsze obliczenie współczynnika kontroli oddechowej w nienaruszonych komórkach lub mitochondriach wyizolowanych z tkanki może służyć wszystkim trzem celom. Korzystając z mitochondriów wyizolowanych z wątroby jaszczurek szczotkowych w połączeniu z sondą fosforyzacyjną, która jest wrażliwa na wahania stężenia tlenu w roztworze, zmierzyliśmy zużycie tlenu za pomocą czytnika fluorescencyjnego. Metoda ta jest nie tylko szybka i skuteczna, ale także może być przeprowadzona przy niewielkiej ilości mitochondriów i bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Opisany tutaj protokół krok po kroku zwiększa dostępność oceny funkcjonalnej mitochondriów dla badaczy.

Introduction

Mitochondria to organelle, mniej więcej wielkości bakterii, znajdujące się w komórkach eukariotycznych. Są wyjątkowymi organellami, ponieważ zawierają DNA i mają dwie błony, zewnętrzną i wewnętrzną. Zewnętrzne i wewnętrzne błony mitochondriów są oddzielone przestrzenią międzybłonową, a błona wewnętrzna składa się w struktury zwane cristae wokół najbardziej wewnętrznego przedziału, zwanego macierzą. Te grzebienia zwiększają powierzchnię błony wewnętrznej, dzięki czemu wiele procesów wykorzystujących grzebienia może zachodzić jednocześnie. Chociaż mitochondria są zaangażowane w wiele funkcji komórkowych, takich jak kontrolowanie apoptozy i przechowywanie wielu szlaków metabolicznych, ich istotna rola w produkcji ATP jest niezbędna do przetrwania komórek. W rzeczywistości 90% energii komórki pochodzi z mitochondriów¹. Produkcja ATP polega na wytwarzaniu różnicy elektrochemicznej na błonie zewnętrznej i wewnętrznej, zwanej potencjałem błony mitochondrialnej (Δψ), która powstaje, gdy jony H⁺ są pompowane z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. Produkcja ATP jest ostatecznie wykorzystywana podczas utleniania redukujących odpowiedników poprzez ruch elektronów przez mitochondrialny łańcuch oddechowy (ETC). Końcowym akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy (_O2). W miarę zużywania tlenu różnica stężeń H⁺ narasta do maksimum, w którym to momencie jony H⁺ przemieszczają się w dół gradientu stężeń z przestrzeni międzybłonowej do matrycy, przechodząc przez kompleks syntazy ATP. Ruch jonów H⁺ powoduje zmianę konformacyjną w syntazie ATP, a ADP zbliża się do nieorganicznego fosforanu, aby reagować i wytwarzać ATP. Wreszcie, ATP jest translokowany z macierzy mitochondrialnej do cytozolu i może być przechowywany lub wykorzystywany do ułatwiania reakcji ze względu na dużą ilość darmowej energii uwalnianej podczas hydrolizy jego fosforanów. Cały ten proces nazywa się fosforylacją oksydacyjną, a ponieważ zużywany jest tlen, mówi się, że mitochondria oddychają².

Nagromadzenie i siła Δψ, ilość zredukowanego O₂ (określane jako zużycie tlenu), jak również wytwarzanie ATP mogą być używane jako wskaźniki zdrowia komórek. Mitochondrialne badania funkcjonalne, takie jak pomiar Δψ, całkowitej zawartości i produkcji ATP oraz zużycia tlenu, można określić ilościowo za pomocą tradycyjnych metod biochemicznych lub fluorescencji i luminescencji w testach na płytkach. Na przykład potencjał błony mitochondrialnej można porównać między różnymi próbkami przy użyciu barwników fluorescencyjnych, takich jak ester etylowy tetrametylorodaminy, który wiąże się specyficznie z mitochondriami. Wytwarzanie ATP można monitorować, dodając do reakcji białko luminescencyjne, którego zmiany korelują ze stężeniem ATP. Kwantyfikacja wskaźników zużycia tlenu lub bezwzględnych wskaźników oddychania podczas OXPHOS może pomóc w wyjaśnieniu przyczyn rozbieżności w funkcjonowaniu mitochondriów i metabolizmie energetycznym. Ocena zużycia tlenu może być wykorzystana do obliczenia współczynników kontroli oddechu (RCR). Wartości RCR opisują zdolność mitochondriów do wytwarzania ATP w odpowiedzi na napływ ADP, co jest główną funkcją mitochondriów. Wartości RCR oznaczają ogólny stan izolowanych mitochondriów i pozwalają na porównanie odpowiedzi na różne eksperymentalne terapie. Różnice w wartościach RCR mogą reprezentować dysfunkcję mitochondriów lub wskazywać na różnicę biologiczną między różnymi mitochondriami wyizolowanymi z dwóch lub więcej źródeł. Inną ważną miarą funkcji w izolowanych mitochondriach jest wydajność mitochondriów zdefiniowana jako mole ATP syntetyzowane na mol_O2 lub stosunek P/O³.

Biorąc pod uwagę ilość informacji, które można zebrać z pomiaru parametrów mitochondriów i różne przypadki, w których te informacje mogą być wykorzystane, możliwość efektywnego gromadzenia danych funkcjonalnych może być przydatna w wielu różnych obszarach badawczych. Pomiary zużycia tlenu w mitochondriach są wykonywane od dziesięcioleci za pomocą bardzo specyficznego oprzyrządowania - przy użyciu elektrody Clarka, która może być ograniczona przez wielkość próbki niezbędnej do przeprowadzenia pomiarów, a ostatnio zaawansowanych instrumentów, które mogą mierzyć oddychanie mitochondrialne i wiele innych parametrów, ale mogą być zbyt kosztowne. Protokół ten jest dostosowanym alternatywnym podejściem wykorzystującym czułą na tlen sondę fosforyzującą (MitoXpress)^4,5. Sygnał sondy jest wykrywany za pomocą czytnika płytek w trybie fluorescencji czasowo-rozdzielczej w celu ciągłych pomiarów w czasie. Fosforescencja ma większą różnicę energii między pochłoniętym a wyemitowanym fotonem w porównaniu z fluorescencją i dlatego lepiej nadaje się do ciągłego monitorowania zmian sygnału. Dzięki temu prawie każde laboratorium może wykonać te pomiary, nie tylko te, które koncentrują się na metabolizmie mitochondrialnym lub które mogą sobie pozwolić na wysoce specjalistyczny sprzęt. Modelowy system, którego używamy, to wyizolowane mitochondria z trzech jaszczurek drzewnych, dwóch gatunków rodzicielskich i jednego introgresyjnego (zawierającego jądrowe DNA od jednego gatunku rodzicielskiego i mitochondria od drugiego – hybryd). Te jaszczurki zostały wybrane, ponieważ postawiliśmy hipotezę, że istnieją konsekwencje metaboliczne i energetyczne dla hybryd mających różne źródła jądrowego i mitochondrialnego DNA. Wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw testowy z wielotrybowym czytnikiem płytek, który może zwiększyć dostęp do tego typu testów dla większej liczby badaczy i dziedzin badawczych.

Protocol

Jaszczurki zostały poddane eutanazji przez uduszenie CO₂, a następnie natychmiastowe ścięcie głowy, zgodnie z zasadami określonymi przez Biuro Opieki nad Zwierzętami i wytyczne Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Elona.

1. Izolacja mitochondriów⁶

UWAGA: Utrzymuj wszystkie roztwory w niskiej temperaturze (Tabela 1) i próbki na lodzie podczas tych kroków.

1. Wyjmij wątrobę, zważ ją, a następnie przepłucz ~3 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x, -/-).
2. Zmiel wątrobę w 1 ml L-MIB za pomocą świeżej żyletki.
3. Doprowadzić całkowitą objętość tkanki wraz z L-MIB do 2 ml i mechanicznie rozbić komórki wątroby przez cztery przejścia za pomocą homogenizatora Dounce.
4. Odwirować homogenat w temperaturze 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Przenieść supernatant do świeżej probówki i umieścić go na lodzie.
6. Zawiesić osad w 2 ml L-MIB, ponownie homogenizować i ponownie odwirować w temperaturze 300 × g (37 °C, 10 minut).
7. Połączyć supernatanty z obu wirów i odwirować w temperaturze 10 000 × g (37 °C, 10 min).
8. Zawiesić osad w ~0,350 ml L-MIB.
9. Określ ilość białka ogółem (mg mitochondriów/ml L-MIB), która ma być używana jako przybliżenie zawartości mitochondriów^4,5,6.

2. Zużycie tlenu

1. Podgrzej wszystkie roztwory użyte w poniższych krokach (Tabela 1) do temperatury 30 °C w łaźni wodnej.
2. Rozcieńczyć mitochondria w LEB do 6 mg/ml na podstawie wyników testu stężenia białka w kroku 1.9.
3. Umieść test w sterylnej, 96-dołkowej, przezroczystej, czarnej płytce dolnej (Tabela 2).
   1. Dodać 50 μl próbki (bufor L-EB lub próbka mitochondriów) do odpowiednich studzienek.
   2. Dodać 50 μl preparatu (L-EB, glutaminian/jabłczan lub glutaminian/jabłczan z ADP).
   3. Rozcieńczyć sondę w stosunku 1:10 w L-EB, a następnie dodać 100 μl sondy fluorescencyjnej do każdej studzienki.
   4. Delikatnie dodaj 50 μl ciężkiego oleju mineralnego do każdej studzienki, aby wykluczyć tlen z otoczenia.
4. Odczyt pomiarów fluorescencyjnych od spodu płytki przy wzbudzeniu/emisji 380/650 nm co 1,5 minuty przez 45 minut. Użyj trybu kinetycznego z opóźnieniem czasowym 30 000 μs i oknem pomiarowym 100 μs.

3. Analiza danych

1. Wyeksportuj plik danych surowych z komputera czytnika płyt jako plik .xls.
2. Otwórz plik, a następnie skopiuj i wklej nieprzetworzone dane do nowej karty, a następnie odpowiednio oznacz wiersze i kolumny.
3. Wykreślić L-EB z samym buforem do próbki kontrolnej i L-EB + G/M jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU) w funkcji czasu.
   UWAGA: Linie te powinny być stosunkowo płaskie, ponieważ nie ma mitochondriów, a zatem nie należy wykrywać żadnych zmian w stężeniu tlenu.
4. Wykreśl wartości próbki L-EB + G/M jako RFU w funkcji czasu.
5. Określ, gdzie odczyty stają się bardziej spójne i spłaszcz je dla kontrolek.
   UWAGA: W tym miejscu powinna rozpocząć się analiza danych dla próbek eksperymentalnych (oznaczona strzałkami w Rysunek 1A). Reakcje mogą trwać 10-15 minut, aby się spłaszczyć i osiągnąć maksimum.
6. Utwórz nowy wykres zawierający tylko dane po punkcie czasu ustalonym w kroku 3.5 (nazywanym "przyciętymi" danymi) i dodaj linię o najlepszym dopasowaniu, aby zwizualizować nieprzetworzone dane do analizy.
7. Oblicz średnią wartość RFU dla przyciętych danych tylko bufora sterującego (zaznaczonych na żółto). Wartość ta jest używana jako minimalna wartość RFU jako linia bazowa w poniższych obliczeniach tlenu.
8. Obliczanie wskaźnika zużycia tlenu (μM O₂/min)
   1. Skopiuj i wklej obszar liniowy surowych danych z kroku 3.6 (tj. przycięte dane), aby określić stężenie tlenu w próbkach mitochondrialnych w traktowaniu G/M + ADP w każdym punkcie czasowym^7,8,9,10.
   2. Użyj równania (1)⁵, aby określić stężenie tlenu w każdym punkcie czasowym. [O₂]_a oznacza stężenie tlenu w buforze nasyconym powietrzem (235 mM w temperaturze 30 °C). I(t), Ia i Io są odpowiednio sygnałem fluorescencyjnym próbki + sondy w czasie t (np. próbka + G/M + ADP), średnim sygnałem sondy w buforze nasyconym powietrzem obliczonym w kroku 3.7 oraz maksymalnym sygnałem w buforze odtlenionym (ustawionym na maksymalny możliwy do osiągnięcia sygnał).
      (1)
   3. Wykreśl wartości [O₂]_t obliczone w kroku 3.8.2 w funkcji czasu i dodaj liniową linię trendu wraz z równaniem najlepiej dopasowanej linii.
      UWAGA: Użyj nachylenia każdej linii jako wskaźnika zużycia tlenu. Duplikaty lub trzy egzemplarze dla każdej próbki mogą być agregowane i wykorzystywane do porównania wielkości zużycia.
9. Oblicz RCR, dzieląc oddychanie mitochondrialne z ADP i bez ADP, które reprezentują odpowiednio stany 3 i 2.

Results

Wskaźnik zużycia tlenu i mitochondrialny RCR zostały określone z mitochondriów trzech różnych jaszczurek za pomocą zestawu testowego z fosforyzującą sondą wykrywającą tlen i standardowym czytnikiem płytek fluorescencyjnych. Wcześniejsze badania wykazały, że sonda w tym zestawie bezpośrednio koreluje ze zużyciem tlenu, gdzie fosforescencja jest wygaszana przez tlen cząsteczkowy, a sygnał fluorescencyjny wzrasta wraz ze spadkiem poziomu tlenu z powodu oddychania mitochondrialnego^7,11. Wartości RFU są rejestrowane w czasie zarówno dla próbek kontrolnych, jak i eksperymentalnych, a następnie analizowane. Odczyty RFU dla studzienek kontrolnych (tylko bufor, bufor traktowany glutaminianem/jabłczanem i bufor traktowany glutaminianem/jabłczanem + ADP) zostały wykreślone w czasie, aby ustalić, że wszelkie zmiany fluorescencji w dołkach próbek eksperymentalnych są spowodowane obecnością mitochondriów. Co więcej, kontrola glutaminianu/jabłczanu + ADP pozwala na określenie wyjściowej ilości tlenu podczas zbierania danych. Próbki eksperymentalne zawierające izolowane mitochondria zostały również naniesione na ten sam wykres co kontrole.

Rysunek 1A pokazuje, że RFU rosną z czasem z próbki izolowanych mitochondriów, w przeciwieństwie do stosunkowo płaskich wartości RFU w kontrolach. Ponieważ zrównoważenie reakcji wymaga czasu, pierwsze 10 lub więcej odczytów, aż do momentu, gdy odczyty próbki kontrolnej nie będą tak hałaśliwe i wyrównają się, są usuwane ze zbioru danych (tabela uzupełniająca S1 i rysunek uzupełniający S1). Następnie pozostałe wartości z próbki mitochondriów poddanej działaniu glutaminianu/jabłczanu + ADP są przekształcane w stężenie tlenu w każdym punkcie czasowym za pomocą równania (1) (patrz krok protokołu 3.2), a następnie wykreślane w funkcji czasu. Rysunek 1B pokazuje wynik próbki eksperymentalnej widzianej w Rysunek 1A (przecina się), gdzie wartość R² jest bardzo bliska 1 i można obliczyć nachylenie linii. Nachylenie linii jest ujemne, ponieważ w miarę zużywania tlenu całkowite stężenie tlenu w tej próbce maleje. Ten sam proces powtarza się dla tych samych próbek mitochondrialnych poddanych działaniu glutaminianu/jabłczanu bez ADP w celu uzyskania wskaźników zużycia tlenu (tabela uzupełniająca S2 i rysunek uzupełniający S2). Następnie oddychanie mitochondrialne z ADP i bez ADP, które reprezentują odpowiednio stany 3 i 2, można wykorzystać do obliczenia RCR dla każdego typu próbki (rysunek uzupełniający S2). Porównując je obok siebie, średni RCR między trzema różnymi typami jaszczurek drzewnych wskazuje, że RCR hybrydy z introgresjowanymi mitochondriami jest znacznie niższy niż w przypadku któregokolwiek typu rodzicielskiego (Rysunek 1C). Mitochondria hybrydowych jaszczurek miały wskaźniki zużycia tlenu pośrednie w stosunku do dwóch typów rodzicielskich (Rysunek 2).

Rysunek 1: Przykładowe wyniki testu zużycia tlenu. (A) Surowe dane z reakcji kontrolnych tylko buforowych i reakcji obejmujących izolowane mitochondria, które były traktowane glutaminianem i jabłczanem (G/M), z dodatkiem ADP lub bez. Fluorescencję monitorowano w czasie. W miarę zużywania tlenu wzrasta fluorescencja. Reakcje tylko buforowe (G/M, oznaczone kółkami i G/M + ADP, oznaczone trójkątami) i mitochondria po leczeniu G/M (oznaczone kwadratami) nie wykazały żadnych zmian. Mitochondria traktowane G/M + ADP (oznaczone znakami plus) zużywały tlen. (B) Zmiany stężenia tlenu w czasie obliczone na podstawie surowych danych dla mitochondriów traktowanych G/M + ADP przedstawionych w A. (C) Wartości RCR dla mitochondriów trzech różnych typów jaszczurek mierzone w temperaturze pokojowej. Ten rysunek jest reprodukowany z Haenel and Del Gaizo Moore¹². Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu ANOVA w R. Skróty: G = glutaminian; M = jabłczan; RCR = współczynnik kontroli oddechu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wskaźniki zużycia tlenu przez mitochondria trzech typów jaszczurek. Wykresy skrzynkowe pokazują medianę zużycia tlenu jako słupek, a średnie jako kropkę. Typy rodzicielskie, Urosaurus graciosus i Urosaurus ornatus, znacznie się od siebie różniły. Forma introgresyjna (hybrydowa) była pośrednia w stosunku do typów rodzicielskich i nie różniła się znacząco od żadnego z nich. Ten rysunek jest reprodukowany z Haenel and Del Gaizo Moore¹². Skróty: Ug = Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład roztworów użytych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Mapa płytkowa do oznaczania zużycia tlenu. Dla każdej próbki należy odłożyć co najmniej 6 studzienek (3 studzienki kontrolne: tylko L-EB, L-EB z traktowaniem G/M, L-EB z traktowaniem G/M + ADP; 3 dołki eksperymentalne/próbka: mitochondria z traktowaniem L-EB, L-EB + G/M i L-EB G/M + ADP). Jeśli to możliwe, uruchom każdą próbkę eksperymentalną w dwóch lub trzech egzemplarzach. Skróty: G = glutaminian; M = jabłczan; L-EB = eksperymentalny bufor specyficzny dla jaszczurki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający S1: Wykresy danych. (A) Wykres wszystkich danych surowych do porównania próbek i kontroli. (B) Wykres surowych danych z zaznaczonymi kolumnami w tabeli uzupełniającej S1, wykazujący, że tylko studzienki, które zawierały próbki mitochondriów, miały znaczny wzrost RFU. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Zużycie tlenu i wskaźniki kontroli oddechu. (A) Wykreśl dane dotyczące zużycia tlenu z tabeli uzupełniającej S1 w celu wyznaczenia wartości stanu 2 i stanu 3 poprzez znalezienie równań najlepiej dopasowanych linii. (B) Obliczenie współczynnika RCR przy użyciu nachyleń linii w (A), które reprezentują stan 2 i stan 3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Reprezentatywny przykład surowych danych. Wyróżnione kolumny to dane, które są używane do rysowania i obliczeń (tj. przyciętych danych). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Reprezentatywny przykład przyciętych danych i późniejszych obliczeń zużycia tlenu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Pomiar funkcji mitochondriów jest przydatny podczas porównywania różnych próbek, takich jak stany chorobowe i niechorobowe, różne typy tkanek tego samego zwierzęcia lub między różnymi typami próbek. Użyliśmy późniejszego porównania, aby przetestować naszą hipotezę, że istnieje metaboliczna konsekwencja dla hybrydowych jaszczurek drzewnych, które mają introgresję mitochondriów. Istnieje wiele sposobów eksperymentalnego ustalenia funkcji mitochondriów, w tym ilościowe określenie Δψ, całkowita zawartość ATP, produkcja ATP oraz kontrola oddychania i szybkość zużycia tlenu. Pomiary zużycia tlenu w izolowanych mitochondriach można przeprowadzić za pomocą specjalistycznego sprzętu, takiego jak elektroda Clarka lub bardziej wyrafinowane SEHORSE XF. Metody te mogą być jednak albo ograniczone ze względu na wielkość próby niezbędnej do przeprowadzenia pomiarów, albo zbyt kosztowne. Wielotrybowe czytniki płytek, które mogą odczytywać fluorescencję, stały się standardowym wyposażeniem w laboratoriach biologii komórki i biochemii. Dlatego alternatywnym podejściem do ilościowej analizy zużycia tlenu w mitochondriach jest użycie dostępnego na rynku zestawu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych. Ten protokół krok po kroku opisuje, jak mierzyć zużycie tlenu, a także przeprowadzać obliczenia. i ekonomicznie w izolowanych mitochondriach. Precyzyjny pomiar zdolności mitochondriów do wytwarzania ATP po dostarczeniu ADP, określany jako oddychanie w stanie 3, pozwala na bezpośrednie porównanie OXPHOS między próbkami, a różnice mogą oznaczać rozbieżności funkcjonalne. Co więcej, oddychanie w stanie 3 wskazuje również jakość mitochondriów, które zostały wyizolowane, co może określić, czy procedura izolacji zadziałała i/lub próbka jest wystarczająco dobra, aby można ją było wykorzystać w innych testach. Wartości RCR, które są obliczane przy użyciu wartości stanu 2 (tylko glutaminian i jabłczan, w celu budowy Δψ) oraz stanu 3 (glutaminian i jabłczan plus ADP, aby umożliwić wykorzystanie Δψ do produkcji ATP), dostarczają jeszcze jednej informacji do porównania i na temat zdrowia izolowanych mitochondriów. Przedstawione dane pokazują, że metoda zaproponowana w tym artykule może pomóc w rozszyfrowaniu różnic między różnymi typami próbek oraz pomiarze wskaźników zużycia tlenu i wartości RCR bez konieczności stosowania wysoce specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu tego typu pomiary są bardziej dostępne.

W tym protokole świeżo wyizolowaliśmy mitochondria od jaszczurek, a zużycie tlenu określono za pomocą testu MitoXpress Xtra Hs zgodnie z protokołem producenta i zmodyfikowanym zgodnie z Hynes i wsp.4 i Will i wsp.5 Jaszczurki wahały się od 3,3 g do 5,1 g całkowitej masy ciała ze średnią 0,170 g tkanki wątroby / jaszczurki, co dało ~ 0,350 ml skoncentrowanych, surowych mitochondriów. Izolowane mitochondria wykorzystano w teście zużycia tlenu przy 6 mg/ml białka. Jeśli stężenie białka mitochondrialnego, określone w kroku protokołu 1.7, jest niskie, próbkę można ponownie odwirować z prędkością 10 000 × g, a osad zawiesić w mniejszej objętości L-MIB. Należy również zauważyć, że z powodzeniem stosowaliśmy zaledwie 4 mg/ml w przypadku małych próbek wątroby lub gdy cała wątroba nie była dostępna.

Aby zapewnić równowagę gazową i temperaturową próbek na początku badania, wszystkie roztwory użyte w sekcji 2 protokołu powinny zostać wstępnie podgrzane do 30 °C w łaźni wodnej. W sekcji 3 protokołu szybkości zmian tlenu rozpuszczonego (mM/min) ekstrapoluje się na podstawie początkowych nachyleń malejących profili stężenia tlenu dla każdej próbki (krok 3.3 protokołu; Tabela uzupełniająca S1 i rysunek uzupełniający S1). Próbka + wskaźniki leczenia G / M reprezentują oddychanie mitochondrialne stanu 2, podczas gdy próbka ze wskaźnikami leczenia G / M + ADP reprezentują oddychanie mitochondrialne stanu 3. W związku z tym RCR oblicza się dla każdej próbki, dzieląc wartości stanu 3 przez wartości stanu 2 dla każdej próbki (tabela uzupełniająca S2).

Zużycie tlenu można porównać między unikalnymi próbkami, jak pokazano tutaj, lub między różnymi zabiegami w jednej próbce. W tym drugim przypadku mogą być konieczne dodatkowe kontrole, takie jak kontrola samego nośnika z mitochondriami i bez nich, aby wykluczyć możliwość, że sama obróbka chemiczna nie wchodzi w interakcję z sondą fosforyzacyjną. Ponadto zebrane dane dotyczące zużycia tlenu i RCR można wykorzystać w połączeniu z danymi zebranymi z tych samych próbek w innych testach. Po wyizolowaniu mitochondriów można je wykorzystać w wielu testach, aby zapewnić pełniejszy obraz ich funkcji¹². Pomiar Δψ, całkowita zawartość ATP i szybkość obrotu ATP to tylko niektóre z testów, które zostały połączone. Co więcej, zastosowanie inhibitorów syntazy ETC, OXPHOS i ATP w testach daje jeszcze pełniejsze zrozumienie różnych typów próbek mitochondrialnych, wzmacniając wszelkie wnioski wyciągnięte z wygenerowanych danych.

Innym parametrem, który można zmierzyć w izolowanych mitochondriach, jest wydajność mitochondriów, która jest definiowana jako stosunek P/O moli ATP syntetyzowanych na mol O₂³. Współczynniki P / O można obliczyć w rozszerzeniu tego protokołu, pozwalając mitochondriom stanu 3 na wyczerpanie ADP dostarczonego w reakcji, a następnie dodanie podwielokrotności substratu ADP, a następnie zahamowanie syntazy ATP przez dodanie oligomycyny. Te dodatkowe kroki pozwalają na obliczenie stanu 4, który występuje, gdy mitochondria nadal zużywają tlen i utrzymują silne Δψ do wytworzenia maksymalnego ATP, dostarcza informacji o nieszczelności mitochondriów (jeśli jony H⁺ przechodzą z powrotem do macierzy bez użycia syntazy ATP, a tym samym rozpraszają Δψ), ostatecznie wskazując na dysfunkcję mitochondriów. Co więcej, pomiary stanu 4 mogą również ujawnić, czy translokator ADP/ATP, który przenosi nowo utworzone ATP z matrycy, jednocześnie wprowadzając substrat ADP, jest sprawny i czy występuje jakikolwiek wyciek ADP i ATP przez membrany. Dodanie oligomycyny, która hamuje syntazę ATP, jest kontrolą mającą na celu określenie, czy mitochondria są nieszczelne z powodu rzeczywistej dysfunkcji. Chociaż pomiar stanu 4 w celu obliczenia stosunku P/O wykraczał poza zakres informacji, których szukaliśmy do porównania między trzema typami próbek mitochondrialnych, jest to kolejna część danych na temat funkcji mitochondriów i może być wykonana jako rozszerzenie tego protokołu. Na koniec warto zauważyć, że mitochondria można wyizolować między innymi z komórek w hodowli i różnych tkanek myszy lub szczura (np. wątroby, serca, rdzenia kręgowego). Konieczne mogą być dostosowania formuł MIB i EB, a także protokołów izolacji 4,13,14,15,16. Ponadto, zgodnie z instrukcjami producenta, test ten można było wykonać na całych, nienaruszonych komórkach. W związku z tym przedstawiona metoda nie ogranicza się do jaszczurek lub mitochondriów wątroby, dzięki czemu może być odpowiednia dla szerokiej gamy modeli eksperymentalnych w wielu różnych subdyscyplinach naukowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-dołkowe czarne/optyczne płyty dolne	Thermo Fisher	265301	Nieobrobione płyty o czarnych ściankach z przezroczystym dnem.
ADP	Sigma	A2754	Rozcieńczony 100 &mikro; M kolby z EB bezpośrednio przed użyciem.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Przygotować 2 mg/ml bulionu w wodzie do oznaczania białka.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Upewnij się, że PBS jest bez jonów Mg2+ lub Ca2+.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
Kwas L-glutaminowy	Sigma	G1251
Kwas L-glutaminowy sól potasowa	Sigma	S372226
Kwas L-jabłkowy	Sigma	M8304
Sól monopotasowa kwasu L-jabłkowego	Sigma	49601
Zestaw zużycia tlenu MitoXpress	Zestaw Agilent	MX-200-4	zawiera sondę i olej mineralny HS.
MOPS	Sigma	M3183
Test Protien Barwnik (5x)	BioRad	500-0006	Każdy test białkowy może zastąpić.
R wersja 3.3	R Core Development Team 2016
Czytnik mikropłytek Thermomax EnSpire Multi-mode Czytnik płytek i oprogramowanie	PerkinElmer		Standardowy czytnik płytek fluorescencyjnych
Baza Trisma	Sigma	T6066	Można wykorzystać dowolną wersję podstawy Tris.