Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena zużycia tlenu w mitochondriach za pomocą testu fluorescencyjnego opartego na czytniku płytek

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65760

⸱

12 kwietnia 2024

 ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Biology Department, Elon University

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ocena zużycia tlenu dostarcza integralnych informacji o funkcji mitochondriów. Za pomocą sondy fosforyzującej z czytnikiem płytek fluorescencyjnych można łatwo uzyskać dokładne i powtarzalne dane bez specjalistycznego sprzętu. Ten test umożliwia każdemu laboratorium pomiar zużycia tlenu przez izolowane mitochondria i obliczenie współczynników kontroli oddechowej.

Streszczenie

Mitochondria pełnią wiele ważnych funkcji, w tym oddychanie komórkowe, produkcję ATP, kontrolę apoptozy i działanie jako centralny węzeł szlaków metabolicznych. Dlatego eksperymentalna ocena funkcjonalności mitochondriów może zapewnić wgląd w różnice między różnymi populacjami lub stanami chorobowymi. Ponadto cenna jest ocena, czy izolowane mitochondria są wystarczająco zdrowe, aby kontynuować eksperymenty. Jedną z cech często używanych do porównywania funkcji mitochondriów w różnych próbkach jest szybkość zużycia tlenu. Zużycie tlenu i późniejsze obliczenie współczynnika kontroli oddechowej w nienaruszonych komórkach lub mitochondriach wyizolowanych z tkanki może służyć wszystkim trzem celom. Korzystając z mitochondriów wyizolowanych z wątroby jaszczurek szczotkowych w połączeniu z sondą fosforyzacyjną, która jest wrażliwa na wahania stężenia tlenu w roztworze, zmierzyliśmy zużycie tlenu za pomocą czytnika fluorescencyjnego. Metoda ta jest nie tylko szybka i skuteczna, ale także może być przeprowadzona przy niewielkiej ilości mitochondriów i bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Opisany tutaj protokół krok po kroku zwiększa dostępność oceny funkcjonalnej mitochondriów dla badaczy.

Wprowadzenie

Mitochondria to organelle, mniej więcej wielkości bakterii, znajdujące się w komórkach eukariotycznych. Są wyjątkowymi organellami, ponieważ zawierają DNA i mają dwie błony, zewnętrzną i wewnętrzną. Zewnętrzne i wewnętrzne błony mitochondriów są oddzielone przestrzenią międzybłonową, a błona wewnętrzna składa się w struktury zwane cristae wokół najbardziej wewnętrznego przedziału, zwanego macierzą. Te grzebienia zwiększają powierzchnię błony wewnętrznej, dzięki czemu wiele procesów wykorzystujących grzebienia może zachodzić jednocześnie. Chociaż mitochondria są zaangażowane w wiele funkcji komórkowych, takich jak kontrolowanie apoptozy i przechowywanie wielu szlaków metabolicznych, ich istotna rola w produkcji ATP jest niezbędna do przetrwania komórek. W rzeczywistości 90% energii komórki pochodzi z mitochondriów1. Produkcja ATP polega na wytwarzaniu różnicy elektrochemicznej na błonie zewnętrznej i wewnętrznej, zwanej potencjałem błony mitochondrialnej (Δψ), która powstaje, gdy jony H+ są pompowane z matrycy do przestrzeni międzybłonowej. Produkcja ATP jest ostatecznie wykorzystywana podczas utleniania redukujących odpowiedników poprzez ruch elektronów przez mitochondrialny łańcuch oddechowy (ETC). Końcowym akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy (O2). W miarę zużywania tlenu różnica stężeń H+ narasta do maksimum, w którym to momencie jony H+ przemieszczają się w dół gradientu stężeń z przestrzeni międzybłonowej do matrycy, przechodząc przez kompleks syntazy ATP. Ruch jonów H+ powoduje zmianę konformacyjną w syntazie ATP, a ADP zbliża się do nieorganicznego fosforanu, aby reagować i wytwarzać ATP. Wreszcie, ATP jest translokowany z macierzy mitochondrialnej do cytozolu i może być przechowywany lub wykorzystywany do ułatwiania reakcji ze względu na dużą ilość darmowej energii uwalnianej podczas hydrolizy jego fosforanów. Cały ten proces nazywa się fosforylacją oksydacyjną, a ponieważ zużywany jest tlen, mówi się, że mitochondria oddychają2.

Nagromadzenie i siła Δψ, ilość zredukowanego O2 (określane jako zużycie tlenu), jak również wytwarzanie ATP mogą być używane jako wskaźniki zdrowia komórek. Mitochondrialne badania funkcjonalne, takie jak pomiar Δψ, całkowitej zawartości i produkcji ATP oraz zużycia tlenu, można określić ilościowo za pomocą tradycyjnych metod biochemicznych lub fluorescencji i luminescencji w testach na płytkach. Na przykład potencjał błony mitochondrialnej można porównać między różnymi próbkami przy użyciu barwników fluorescencyjnych, takich jak ester etylowy tetrametylorodaminy, który wiąże się specyficznie z mitochondriami. Wytwarzanie ATP można monitorować, dodając do reakcji białko luminescencyjne, którego zmiany korelują ze stężeniem ATP. Kwantyfikacja wskaźników zużycia tlenu lub bezwzględnych wskaźników oddychania podczas OXPHOS może pomóc w wyjaśnieniu przyczyn rozbieżności w funkcjonowaniu mitochondriów i metabolizmie energetycznym. Ocena zużycia tlenu może być wykorzystana do obliczenia współczynników kontroli oddechu (RCR). Wartości RCR opisują zdolność mitochondriów do wytwarzania ATP w odpowiedzi na napływ ADP, co jest główną funkcją mitochondriów. Wartości RCR oznaczają ogólny stan izolowanych mitochondriów i pozwalają na porównanie odpowiedzi na różne eksperymentalne terapie. Różnice w wartościach RCR mogą reprezentować dysfunkcję mitochondriów lub wskazywać na różnicę biologiczną między różnymi mitochondriami wyizolowanymi z dwóch lub więcej źródeł. Inną ważną miarą funkcji w izolowanych mitochondriach jest wydajność mitochondriów zdefiniowana jako mole ATP syntetyzowane na molO2 lub stosunek P/O3.

Biorąc pod uwagę ilość informacji, które można zebrać z pomiaru parametrów mitochondriów i różne przypadki, w których te informacje mogą być wykorzystane, możliwość efektywnego gromadzenia danych funkcjonalnych może być przydatna w wielu różnych obszarach badawczych. Pomiary zużycia tlenu w mitochondriach są wykonywane od dziesięcioleci za pomocą bardzo specyficznego oprzyrządowania - przy użyciu elektrody Clarka, która może być ograniczona przez wielkość próbki niezbędnej do przeprowadzenia pomiarów, a ostatnio zaawansowanych instrumentów, które mogą mierzyć oddychanie mitochondrialne i wiele innych parametrów, ale mogą być zbyt kosztowne. Protokół ten jest dostosowanym alternatywnym podejściem wykorzystującym czułą na tlen sondę fosforyzującą (MitoXpress)4,5. Sygnał sondy jest wykrywany za pomocą czytnika płytek w trybie fluorescencji czasowo-rozdzielczej w celu ciągłych pomiarów w czasie. Fosforescencja ma większą różnicę energii między pochłoniętym a wyemitowanym fotonem w porównaniu z fluorescencją i dlatego lepiej nadaje się do ciągłego monitorowania zmian sygnału. Dzięki temu prawie każde laboratorium może wykonać te pomiary, nie tylko te, które koncentrują się na metabolizmie mitochondrialnym lub które mogą sobie pozwolić na wysoce specjalistyczny sprzęt. Modelowy system, którego używamy, to wyizolowane mitochondria z trzech jaszczurek drzewnych, dwóch gatunków rodzicielskich i jednego introgresyjnego (zawierającego jądrowe DNA od jednego gatunku rodzicielskiego i mitochondria od drugiego – hybryd). Te jaszczurki zostały wybrane, ponieważ postawiliśmy hipotezę, że istnieją konsekwencje metaboliczne i energetyczne dla hybryd mających różne źródła jądrowego i mitochondrialnego DNA. Wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw testowy z wielotrybowym czytnikiem płytek, który może zwiększyć dostęp do tego typu testów dla większej liczby badaczy i dziedzin badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Jaszczurki zostały poddane eutanazji przez uduszenie CO2, a następnie natychmiastowe ścięcie głowy, zgodnie z zasadami określonymi przez Biuro Opieki nad Zwierzętami i wytyczne Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Elona.

1. Izolacja mitochondriów6

UWAGA: Utrzymuj wszystkie roztwory w niskiej temperaturze (Tabela 1) i próbki na lodzie podczas tych kroków.

  1. Wyjmij wątrobę, zważ ją, a następnie przepłucz ~3 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x, -/-).
  2. Zmiel wątrobę w 1 ml L-MIB za pomocą świeżej żyletki.
  3. Doprowadzić całkowitą objętość tkanki wraz z L-MIB do 2 ml i mechanicznie rozbić komórki wątroby przez cztery przejścia za pomocą homogenizatora Dounce.
  4. Odwirować homogenat w temperaturze 300 × g (37 °C, 10 min).
  5. Przenieść supernatant do świeżej probówki i umieścić go na lodzie.
  6. Zawiesić osad w 2 ml L-MIB, ponownie homogenizować i ponownie odwirować w temperaturze 300 × g (37 °C, 10 minut).
  7. Połączyć supernatanty z obu wirów i odwirować w temperaturze 10 000 × g (37 °C, 10 min).
  8. Zawiesić osad w ~0,350 ml L-MIB.
  9. Określ ilość białka ogółem (mg mitochondriów/ml L-MIB), która ma być używana jako przybliżenie zawartości mitochondriów4,5,6.

2. Zużycie tlenu

  1. Podgrzej wszystkie roztwory użyte w poniższych krokach (Tabela 1) do temperatury 30 °C w łaźni wodnej.
  2. Rozcieńczyć mitochondria w LEB do 6 mg/ml na podstawie wyników testu stężenia białka w kroku 1.9.
  3. Umieść test w sterylnej, 96-dołkowej, przezroczystej, czarnej płytce dolnej (Tabela 2).
    1. Dodać 50 μl próbki (bufor L-EB lub próbka mitochondriów) do odpowiednich studzienek.
    2. Dodać 50 μl preparatu (L-EB, glutaminian/jabłczan lub glutaminian/jabłczan z ADP).
    3. Rozcieńczyć sondę w stosunku 1:10 w L-EB, a następnie dodać 100 μl sondy fluorescencyjnej do każdej studzienki.
    4. Delikatnie dodaj 50 μl ciężkiego oleju mineralnego do każdej studzienki, aby wykluczyć tlen z otoczenia.
  4. Odczyt pomiarów fluorescencyjnych od spodu płytki przy wzbudzeniu/emisji 380/650 nm co 1,5 minuty przez 45 minut. Użyj trybu kinetycznego z opóźnieniem czasowym 30 000 μs i oknem pomiarowym 100 μs.

3. Analiza danych

  1. Wyeksportuj plik danych surowych z komputera czytnika płyt jako plik .xls.
  2. Otwórz plik, a następnie skopiuj i wklej nieprzetworzone dane do nowej karty, a następnie odpowiednio oznacz wiersze i kolumny.
  3. Wykreślić L-EB z samym buforem do próbki kontrolnej i L-EB + G/M jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU) w funkcji czasu.
    UWAGA: Linie te powinny być stosunkowo płaskie, ponieważ nie ma mitochondriów, a zatem nie należy wykrywać żadnych zmian w stężeniu tlenu.
  4. Wykreśl wartości próbki L-EB + G/M jako RFU w funkcji czasu.
  5. Określ, gdzie odczyty stają się bardziej spójne i spłaszcz je dla kontrolek.
    UWAGA: W tym miejscu powinna rozpocząć się analiza danych dla próbek eksperymentalnych (oznaczona strzałkami w Rysunek 1A). Reakcje mogą trwać 10-15 minut, aby się spłaszczyć i osiągnąć maksimum.
  6. Utwórz nowy wykres zawierający tylko dane po punkcie czasu ustalonym w kroku 3.5 (nazywanym "przyciętymi" danymi) i dodaj linię o najlepszym dopasowaniu, aby zwizualizować nieprzetworzone dane do analizy.
  7. Oblicz średnią wartość RFU dla przyciętych danych tylko bufora sterującego (zaznaczonych na żółto). Wartość ta jest używana jako minimalna wartość RFU jako linia bazowa w poniższych obliczeniach tlenu.
  8. Obliczanie wskaźnika zużycia tlenu (μM O2/min)
    1. Skopiuj i wklej obszar liniowy surowych danych z kroku 3.6 (tj. przycięte dane), aby określić stężenie tlenu w próbkach mitochondrialnych w traktowaniu G/M + ADP w każdym punkcie czasowym7,8,9,10.
    2. Użyj równania (1)5, aby określić stężenie tlenu w każdym punkcie czasowym. [O2]a oznacza stężenie tlenu w buforze nasyconym powietrzem (235 mM w temperaturze 30 °C). I(t), Ia i Io są odpowiednio sygnałem fluorescencyjnym próbki + sondy w czasie t (np. próbka + G/M + ADP), średnim sygnałem sondy w buforze nasyconym powietrzem obliczonym w kroku 3.7 oraz maksymalnym sygnałem w buforze odtlenionym (ustawionym na maksymalny możliwy do osiągnięcia sygnał).
      figure-protocol-1 (1)
    3. Wykreśl wartości [O2]t obliczone w kroku 3.8.2 w funkcji czasu i dodaj liniową linię trendu wraz z równaniem najlepiej dopasowanej linii.
      UWAGA: Użyj nachylenia każdej linii jako wskaźnika zużycia tlenu. Duplikaty lub trzy egzemplarze dla każdej próbki mogą być agregowane i wykorzystywane do porównania wielkości zużycia.
  9. Oblicz RCR, dzieląc oddychanie mitochondrialne z ADP i bez ADP, które reprezentują odpowiednio stany 3 i 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wskaźnik zużycia tlenu i mitochondrialny RCR zostały określone z mitochondriów trzech różnych jaszczurek za pomocą zestawu testowego z fosforyzującą sondą wykrywającą tlen i standardowym czytnikiem płytek fluorescencyjnych. Wcześniejsze badania wykazały, że sonda w tym zestawie bezpośrednio koreluje ze zużyciem tlenu, gdzie fosforescencja jest wygaszana przez tlen cząsteczkowy, a sygnał fluorescencyjny wzrasta wraz ze spadkiem poziomu tlenu z powodu oddychania mitochondrialnego7,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomiar funkcji mitochondriów jest przydatny podczas porównywania różnych próbek, takich jak stany chorobowe i niechorobowe, różne typy tkanek tego samego zwierzęcia lub między różnymi typami próbek. Użyliśmy późniejszego porównania, aby przetestować naszą hipotezę, że istnieje metaboliczna konsekwencja dla hybrydowych jaszczurek drzewnych, które mają introgresję mitochondriów. Istnieje wiele sposobów eksperymentalnego ustalenia funkcji mitochondriów, w tym ilościowe określenie Δψ, całkowita zawartość ATP, produkcja ATP o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez NSF CHE-1229562 (VDGM) oraz granty z Komitetu Badań i Rozwoju Uniwersytetu Elon (VDGM i GH) oraz Programu Badań Licencjackich (AJ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowe czarne/optyczne płyty dolneThermo Fisher265301Nieobrobione płyty o czarnych ściankach z przezroczystym dnem.
ADPSigmaA2754Rozcieńczony 100 &mikro; M kolby z EB bezpośrednio przed użyciem.
BSAThermo FisherBP1600-100Przygotować 2 mg/ml bulionu w wodzie do oznaczania białka.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)SigmaD8537Upewnij się, że PBS jest bez jonów Mg2+ lub Ca2+.
EGTASigmaE3889
K2HPO4SigmaP3786
KH2PO4SigmaP0662
Kwas L-glutaminowySigmaG1251
Kwas L-glutaminowy sól potasowaSigmaS372226
Kwas L-jabłkowySigmaM8304
Sól monopotasowa kwasu L-jabłkowegoSigma49601
Zestaw zużycia tlenu MitoXpressZestaw AgilentMX-200-4zawiera sondę i olej mineralny HS.
MOPSSigmaM3183
Test Protien Barwnik (5x)BioRad500-0006Każdy test białkowy może zastąpić.
R wersja 3.3 R Core Development Team 2016
Czytnik mikropłytek Thermomax EnSpire Multi-mode Czytnik płytek i oprogramowaniePerkinElmerStandardowy czytnik płytek fluorescencyjnych
Baza TrismaSigmaT6066Można wykorzystać dowolną wersję podstawy Tris.

Bibliografia

  1. Drew, B., Leeuwenburgh, C. Method for measuring ATP production in isolated mitochondria: ATP production in brain and liver mitochondria of Fischer-344 rats with age and caloric restriction. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative andComparative Physiology. 285 (5), R1259-R1267 (2003).
  2. Ballard, J. W. O., Pichaud, N. Mitochondrial DNA: more than an evolutionary bystander. Functional Ecology. 28 (1), 218-231 (2014).
  3. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 437 (3), 575-575 (2011).
  4. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1 (6), 2563-2572 (2006).
  5. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences. 92 (1), 186-200 (2006).
  6. Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), 52076(2015).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle, and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  8. Dunn, D. A., Pinkert, C. A. Nuclear expression of a mitochondrial DNA gene: mitochondrial targeting of allotopically expressed mutant ATP6 in transgenic mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-7 (2012).
  9. Irwin, R. W., et al. Medroxyprogesterone acetate antagonizes estrogen up-regulation of brain mitochondrial function. Endocrinology. 152 (2), 556-567 (2011).
  10. Ma, D., et al. Cancer cell mitochondria targeting by pancratistatin analogs is dependent on functional complex II and III. Scientific Reports. 7 (1), 42957(2017).
  11. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
  12. Haenel, G. J., Del Gaizo Moore, V. Functional divergence of mitochondria and coevolution of genomes: cool mitochondria in hot Llzards. Physiological and Biochemical Zoology. 91 (5), 1068-1081 (2018).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1 G93A mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  14. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. Journal of Clinical Investigation. 117 (1), 112-121 (2007).
  15. Chonghaile, T. N., et al. Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science. 334 (6059), 1129-1133 (2011).
  16. Del Gaizo, V., MacKenzie, J. A., Payne, R. M. Targeting proteins to mitochondria using TAT. Molecular Genetics and Metabolism. 80 (1-2), 170-180 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/65760

Tagi

Funkcja mitochondriówszybkość zużycia tlenuwspółczynnik kontroli oddechowejizolowane mitochondriaoddychanie komórkowesonda fosforescencyjnaprodukcja ATP

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.