Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wstrzyknięcie dooponowe jest powszechnie stosowaną procedurą zarówno w klinikach pediatrycznych jak i dla dorosłych, służąc jako skuteczny sposób podawania leków i leczenia. Poprzez bezpośrednie dostarczanie leków i zabiegów do płynu mózgowo-rdzeniowego ośrodkowego układu nerwowego, metoda ta pozwala osiągnąć wyższe miejscowe stężenia leków, jednocześnie zmniejszając ogólnoustrojowe skutki uboczne w porównaniu z innymi drogami, takimi jak wstrzyknięcia dożylne, podskórne lub domięśniowe. Jego znaczenie wykracza poza warunki kliniczne, ponieważ wstrzyknięcie dooponowe odgrywa istotną rolę w badaniach przedklinicznych skoncentrowanych na leczeniu zaburzeń neurogenetycznych u gryzoni i innych dużych zwierząt, w tym naczelnych innych niż ludzie. Jednak pomimo powszechnego zastosowania, wstrzyknięcie dooponowe u młodych, zwłaszcza nowonarodzonych szczeniąt, stanowi poważne wyzwanie techniczne ze względu na ich niewielkie rozmiary i delikatną naturę. Skuteczne i niezawodne podawanie wstrzyknięć dooponowych nowonarodzonym myszom wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły i starannego rozważenia różnych czynników. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania ustandaryzowanego protokołu, który nie tylko zawiera instrukcje, ale także podkreśla kluczowe kwestie techniczne i dobre praktyki laboratoryjne w celu zapewnienia spójności procedur, a także bezpieczeństwa i dobrostanu zwierząt.
Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, przedstawiamy szczegółowy i kompleksowy protokół wykonywania iniekcji dokanałowych, szczególnie u nowonarodzonych szczeniąt w 1. dniu po urodzeniu (P1). Postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku, naukowcy mogą bez obaw wykonywać zastrzyki dooponowe u nowonarodzonych szczeniąt, umożliwiając dokładne dostarczanie leków, oligonukleotydów antysensownych i wirusów w celu wymiany genów lub leczenia opartego na edycji genomu. Ponadto podkreśla się znaczenie przestrzegania dobrych praktyk laboratoryjnych w celu utrzymania dobrostanu zwierząt i zapewnienia wiarygodnych wyników eksperymentalnych. Protokół ten ma na celu sprostanie wyzwaniom technicznym związanym z iniekcjami dooponowymi u noworodków myszy, ostatecznie ułatwiając postępy w dziedzinie badań neurogenetycznych, które mają na celu opracowanie potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Wprowadzenie
Wstrzyknięcie dokanałowe (IT) jest powszechną procedurą kliniczną stosowaną do podawania leków, zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego i utrzymywania ciśnienia śródczaszkowego zarówno u pacjentów pediatrycznych, jak i dorosłych w klinikach1,2. Podawanie leków we wstrzyknięciu dooponowym jest skutecznym podejściem do zwiększania stężenia leków w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przy jednoczesnym zminimalizowaniu narażenia ogólnoustrojowego. W związku z tym metoda ta zwiększa skuteczność terapeutyczną i zmniejsza skutki uboczne, szczególnie w przypadku leków wrażliwych na temperaturę i o krótkim okresie półtrwania3.
W badaniach przedklinicznych testujących nowe leki i terapie z wykorzystaniem modeli gryzoni, konieczne jest zastosowanie niezawodnej metody podawania leków, która zapewnia większą precyzję i powtarzalność wyników4,5. W przypadku badań przedklinicznych oceniających nowe metody leczenia zaburzeń neurogenetycznych i neurorozwojowych, wczesne leczenie ma kluczowe znaczenie dla wstępnych badań potwierdzających słuszność koncepcji, ponieważ zwykle przewiduje się, że wcześniejsze interwencje przyniosą korzystniejsze wyniki6,7,8.
W porównaniu do konwencjonalnych iniekcji domózgowo-komorowych (ICV), zastrzyki IT niosą ze sobą znacznie mniejsze ryzyko, ponieważ eliminują potrzebę bezpośredniej penetracji przez korę mózgową. Ta zaleta znacznie zmniejsza potencjalne uszkodzenie regionalnej tkanki korowej i otaczających nerwów. Co więcej, zastrzyki IT pozwalają na co najmniej pięciokrotne zwiększenie możliwej do podania ilości leków za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia, co znacznie zwiększa wykonalność wielokrotnego podawania. Jednak ze względu na mały rozmiar i delikatną naturę nowonarodzonych myszy, wykonywanie zastrzyków dooponowych u nowonarodzonych szczeniąt jest technicznie trudne i wymaga specjalistycznych technik, sprzętu i skrupulatnej obsługi.
Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku dotyczącymi wykonywania iniekcji dokanałowych u nowonarodzonych szczeniąt P1. Podkreślono tu kluczowe względy i dobre praktyki laboratoryjne w celu zapewnienia spójności podawania oraz bezpieczeństwa i dobrostanu zwierząt podczas zabiegu. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą pewnie przeprowadzać eksperymenty z precyzją i powtarzalnością, jednocześnie minimalizując potencjalne ryzyko lub dyskomfort dla zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane procedury i protokoły były zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Dodatkowo procedury uzyskały aprobatę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Yale University School of Medicine. Do prezentowanych badań wykorzystano nowonarodzone myszy typu dzikiego (WT) C57BL/6J samce i samice. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).
1. Przygotowanie miejsca pracy
- Najpierw przygotuj następujące elementy: mokry lód do krioznieczulenia, pustą klatkę do oddzielenia szczeniąt od matki, mikroskop preparacyjny, źródło światła, czystą powierzchnię do umieszczenia zwierzęcia podczas wstrzyknięcia, waciki, poduszkę grzewczą, strzykawkę 25/10 μl i igłę 34 G/ 0,375"/ 12 stopni (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Krioznieczulenie dla szczeniąt myszy przy użyciu mokrego lodu jest opcjonalnym krokiem mającym na celu ułatwienie obsługi, zmniejszenie ruchu szczeniąt i zminimalizowanie potencjalnego dyskomfortu zwierzęcia. Ten etap krioanestezjologii może również przynieść korzyści w postaci obniżenia ciśnienia śródczaszkowego i zmniejszenia powikłań związanych z objętością9,10. - Przenieś szczenięta do oddzielnej klatki z dala od matki podczas obchodzenia się z nimi.
- Zważ każde szczenię i udokumentuj jego wagę.
- Wytrzyj tylną część myszy gazą i etanolem. Potwierdź przestrzeń międzykręgową lub co najmniej linię środkową kanału kręgowego (która powinna być czerwona u szczeniąt P1) za pomocą mikroskopu preparacyjnego (film uzupełniający 1).
2. Procedura iniekcji
- Aby znieczulić pojedyncze szczenię, delikatnie umieść je na wodoodpornej barierze, takiej jak rękaw lateksowy lub folia aluminiowa, na kąpieli lodowej na 3-5 minut. Ważne jest, aby unikać pozostawiania zwierzęcia na lodzie przez dłuższy czas, ponieważ może to stwarzać potencjalne ryzyko powikłań związanych z hipotermią, w tym migotania komór, niedotlenienia tkanek i kwasicy metabolicznej.
UWAGA: Czas trwania 3-5 minut może się różnić w zależności od przypadku. Oceń objawy znieczulenia, takie jak brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, aby określić odpowiedni czas trwania. - Gdy zwierzę znajduje się na lodzie, napełnij strzykawkę 10 μl preparatu leczniczego, preparatu wirusowego lub sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego itp.
UWAGA: Podczas fazy uczenia się rozważ opcję wstrzyknięcia tej samej objętości zmieszanego 1% barwnika Fast Green z materiałami do dostarczania (patrz Tabela materiałów). Może to pomóc w wizualizacji procesu wstrzykiwania oraz pomóc w nauce i doskonaleniu techniki. Szczenięta, którym wstrzyknięto Fast Green Dye lub podobne materiały, powinny zostać poddane eutanazji wkrótce po wstrzyknięciu zgodnie z zatwierdzonym protokołem, ponieważ materiały te mogą powodować reakcje zapalne lub inne skutki uboczne u zwierząt. - Gdy zwierzę jest w pełni znieczulone, co potwierdza zmniejszony ruch ciała lub jego brak, delikatnie umieść szczenięta pod mikroskopem.
- Lewym palcem wskazującym i kciukiem ostrożnie zbadaj palpacyjnie przestrzeń międzykręgową wzdłuż linii środkowej, znajdującą się między obustronnymi obręczami miednicznej (Dodatkowe wideo 1). Delikatnie obróć lekko podstawę ogona, aby pomóc zidentyfikować linię środkową kręgosłupa.
- Przed wstrzyknięciem należy ustawić skos igły w kierunku głowy zwierzęcia.
- Ostrożnie wprowadzić igłę, przechylając ją lekko pod kątem 70°-80° w miejscu przecięcia wgłębienia, upewniając się, że strzykawka pozostaje wyrównana z centralną płaszczyzną strzałkową. Gdy igła zetknie się z kością, stopniowo zmniejszaj kąt do około 30°, a następnie wsuń igłę o około 2 mm w przestrzeń międzykręgową.
UWAGA: Zdolność igły do lekkiego uniesienia całego ciała jest oznaką udanego wejścia w przestrzeń oponową wewnątrzoponową. - Powoli wstrzyknąć do 10 μl objętości w ciągu 50-60 s. Trzymaj igłę na miejscu przez 10-20 s po zakończeniu podawania. Wyjmować igłę, delikatnie obracając, aby uniknąć wycieku.
UWAGA: Móżdżek zmieni kolor na zielony przed wycofaniem igły. Ponadto powolne parcie ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia śródczaszkowego związanego z porodem i zminimalizować potencjalne powikłania. Opierając się na naszym doświadczeniu z iniekcjami u ponad 500 szczeniąt, dostarczanie objętości 10 μl w ciągu 50-60 s jest optymalne.
3. Po wstrzyknięciu
- Przyłóż bawełniany wacik do miejsca wstrzyknięcia, jeśli występuje wyciek lub krew.
UWAGA: W większości przypadków nie powinno ich być. Z naszego doświadczenia wynika, że szczenięta leczone ze śladami wycieku lub krwi są nadal użyteczne, ale podczas analizy danych może być konieczne rozważenie zmniejszonej dawki leków lub leczenia. - Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i odczekaj 10-15 minut, aby szczenięta w pełni się zregenerowały i ponownie rozgrzały. Uważnie obserwuj szczenięta, aby upewnić się, że są czujne i aktywnie się poruszają, zanim wrócisz do klatki domowej. Na odpowiednią regenerację myszy wskazuje przywrócenie różowego koloru skóry, zwiększenie spontanicznych ruchów ciała i reagowanie na dotyk.
- Umieść szczeniaka z powrotem w klatce domowej i upewnij się, że szczenię jest odpowiednio przykryte ściółką, gniazdem lub jednym i drugim. Gwarantuje to, że młode otrzyma niezbędną opiekę matczyną ze strony matki.
- Oceniaj ogólny wygląd i aktywność codziennie przez co najmniej 3 dni po wstrzyknięciu. Chory wygląd i zmniejszona aktywność mogą zwiększać możliwość infekcji, skutków ubocznych związanych z leczeniem lub innych powikłań itp. W razie potrzeby skonsultuj się z lekarzem weterynarii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skuteczne wstrzyknięcie do przestrzeni dokanałowej doprowadziło do natychmiastowego, szerokiego rozprowadzenia podanego roztworu, choć rzeczywista penetracja komórkowa zależała od charakteru dostarczonych leków i materiałów. W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy Fast Green do wizualizacji bezpośrednich efektów po wstrzyknięciu dokanałowym (IT) u noworodków typu dzikiego (Rycina 1A-K) i porównaliśmy je z konwencjonalnym wstrzyknięciem do komór mózgowych (ICV) ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano krok po kroku procedurę wstrzykiwania dooponowego u nowonarodzonych myszy (P1), powodującą powszechną dystrybucję leku w ich mózgach. W porównaniu z powszechną metodą iniekcji domózgowo-komorowej do dostarczania leków noworodkom myszy, która polega na przekłuciu kory mózgowej11, wstrzyknięcie dooponowe pozwala uniknąć bezpośredniego uszkodzenia mózgu nowonarodzonej myszy z powodu penetracji igły. Ze względu na minimalną inwazyjność, wstrzyknięcie dooponowe może być wykonywane wielokrotnie,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
YHJ jest współzałożycielem Couragene, ale w przypadku tego projektu nie ma konfliktu interesów.
Podziękowania
XNL jest wspierany przez Foundation for Angelman Syndrome Therapeutic (FAST) Postdoctoral Fellowship. YHJ jest również wspierany przez FAST i NIH Grant R01HD110195 i R01MH117289.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J | Mikroskop cyfrowy Jackson Laboratory | 000664 | |
| RWD | DOM-1001 | ||
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Poduszka grzewcza | RWD | 69020 | |
| Igły | Hamilton | 6PK (34/0.375"/4/12DEG)S | |
| Strzykawka | Hamilton | 1702RN | |
| Filtry strzykawkowe | Sigma | SLGVM33RS |
Bibliografia
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077(2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863(2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680(2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
