Zoptymalizowana technika odwróconej politransfekcji oparta na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do szybkiego badania proporcji kwasów nukleinowych

Summary

Obecny protokół opisuje metodę odwrotnej politransfekcji embrionalnych komórek macierzystych myszy podczas hodowli za pomocą pożywki 2i i LIF. Metoda ta zapewnia wyższą żywotność i wydajność niż tradycyjne protokoły transfekcji do przodu, a jednocześnie umożliwia jednoetapową optymalizację proporcji plazmidów.

Abstract

Ze względu na względną prostotę i łatwość użycia, przejściowa transfekcja linii komórkowych ssaków za pomocą kwasów nukleinowych stała się podstawą badań biomedycznych. Podczas gdy większość powszechnie stosowanych linii komórkowych ma solidne protokoły transfekcji w przylegającej dwuwymiarowej hodowli, protokoły te często nie przekładają się dobrze na mniej zbadane linie lub te o nietypowej, trudnej do transfekcji morfologii. Wykorzystując mysie pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w pożywce 2i/LIF, szeroko stosowanym modelu hodowli w medycynie regeneracyjnej, metoda ta przedstawia zoptymalizowany, szybki protokół odwrotnej transfekcji, który jest w stanie osiągnąć wyższą wydajność transfekcji. Wykorzystując ten protokół, przeprowadzana jest politransfekcja trójplazmidowa, wykorzystując wyższą niż normalna wydajność dostarczania plazmidu do badania rozszerzonego zakresu stechiometrii plazmidu. Ten protokół odwróconej politransfekcji pozwala na metodę eksperymentalną z jednym garnkiem, umożliwiając użytkownikom optymalizację proporcji plazmidu w jednym dołku, a nie w kilku kotransfekcjach. Ułatwiając szybkie badanie wpływu stechiometrii DNA na ogólną funkcję dostarczonych obwodów genetycznych, protokół ten minimalizuje czas i koszt transfekcji embrionalnych komórek macierzystych.

Introduction

Dostarczanie DNA i RNA do komórek ssaków służy jako główny filar badań biomedycznych¹. Powszechną metodą wprowadzania egzogennych kwasów nukleinowych (NA) do komórek ssaków jest transfekcja przejściowa^2,3. Technika ta polega na mieszaniu NA z dostępnymi na rynku odczynnikami do transfekcji, które są w stanie dostarczyć je do komórek biorcy. Zazwyczaj NA jest dostarczany przez transfekcję do przodu, w której komórki przylegające do dwuwymiarowej powierzchni otrzymują kompleks transfekcji. Podczas gdy transfekcja do przodu dla najpowszechniej ustalonych linii komórko....

Protocol

1. Przygotowanie odczynników do hodowli mPSC

1. Przygotuj suplement N2.
   1. W warunkach niesterylnych przygotować następujące roztwory podstawowe (etap 1.1.1.1) w dygestorium bezpieczeństwa chemicznego. Dodaj stały proszek każdej substancji chemicznej do wstępnie zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po dodaniu proszku zważyć każdą probówkę i dodać odpowiednią ilość rozpuszczalnika, aby osiągnąć poniższe stężenia. Dla jednej partii podłoża należy przygotować minimalną ilość podaną na liście.
      UWAGA: Następujące odczynniki są niebezpieczne i należy obchodzić się z nimi zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpiec....

Results

Zarówno transfekcja do przodu, jak i do tyłu opiera się na interakcji między błoną komórkową a przychodzącymi kompleksami odczynnika-DNA, co pozwala na dostarczenie NA do komórek biorcy. Tym, co różni te techniki, jest stan komórki w momencie dostarczenia - podczas gdy DNA jest zwykle dostarczane do przylegających monowarstw komórek w tradycyjnej transfekcji do przodu, transfekcja odwrotna polega na tym, że kompleks odczynnik-DNA spotyka się z komórkami w zawiesinie pojedynczej komórki. Różnica ta może być szczególnie is.......

Discussion

Głównym powodem powszechnego stosowania protokołów transfekcji jest ich odtwarzalność i dostępność; Protokoły te wymagają jednak optymalizacji w kontekstach eksperymentalnych. Nie wspomniano powyżej, że standardowe testy są wymagane przy próbie transfekcji nowej linii komórkowej po raz pierwszy. Po pierwsze, wybór odczynnika do transfekcji jest kluczowy, ponieważ dostępne na rynku odczynniki nie są uniwersalne i będą się różnić pod względem skuteczności dostarczania NA w zależności od typu komórek. Dodatkowo znalezienie .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akumulator	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferyna	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 suplement	ThermoFisher Naukowy
Beta-merkaptoetanol	ThermoFisher Scientific
BSA frakcja V (7,5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Koraliki standaryzacyjne cytometrii przepływowej	Spherotech	URCP-38-2K
Żelatyna	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX suplement	ThermoFisher Naukowy
Insulina	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Odczynnik do transfekcji
Neurobasel media	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesteron	MilliporeSigma	P8783	Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w okapie oparów chemicznych
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w okapie
oparów chemicznychRekombinowany mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Selenin sodu	MilliporeSigma	S5261-25G	Zagrożenie chemiczne - zapoznaj się z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa, upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej i pracuj ze stałym proszkiem tylko w chemicznym dygestoriach
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific