Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65767

⸱

17 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Streszczenie

W dziedzinie medycyny regeneracyjnej i zastosowań terapeutycznych, badania nad komórkami macierzystymi szybko zyskują na popularności. Komórki macierzyste miazgi zęba (DPSC), które są obecne zarówno w zębach mlecznych, jak i stałych, stały się istotnym źródłem komórek macierzystych ze względu na ich dostępność, zdolność adaptacji i wrodzone zdolności różnicowania. DPSC stanowią łatwo dostępny i obfity rezerwuar mezenchymalnych komórek macierzystych, wykazując imponującą wszechstronność i potencjał, szczególnie w celach regeneracyjnych. Pomimo ich obietnicy, główną przeszkodą jest skuteczne wyizolowanie i scharakteryzowanie DPSC, biorąc pod uwagę ich reprezentację jako drobna frakcja w komórkach miazgi zęba. Równie ważne jest odpowiednie zachowanie tego bezcennego zasobu komórkowego. Dwie dominujące metody izolacji DPSC to trawienie enzymatyczne (ED) i wyrastanie z eksplantatów tkanek (OG), często określane jako spontaniczny wzrost. Protokół ten koncentruje się przede wszystkim na podejściu do trawienia enzymatycznego do izolacji DPSC, szczegółowo opisując etapy obejmujące ekstrakcję, przetwarzanie w laboratorium i konserwację komórek. Poza ekstrakcją i konserwacją, protokół zagłębia się w zdolność różnicowania DPSC. W szczególności przedstawia procedury stosowane w celu indukowania tych komórek macierzystych do różnicowania się w adipocyty, osteoblasty i chondrocyty, prezentując ich multipotencjalne atrybuty. Późniejsze wykorzystanie technik barwienia kolorymetrycznego ułatwia dokładną wizualizację i potwierdzenie udanego różnicowania, potwierdzając w ten sposób kaliber i funkcjonalność izolowanych DPSC. Ten kompleksowy protokół funkcjonuje jako plan obejmujący całe spektrum ekstrakcji, hodowli, konserwacji i charakterystyki komórek macierzystych miazgi zęba. Podkreśla to znaczny potencjał, jaki drzemie w DPSC, napędzając naprzód badania nad komórkami macierzystymi i dając nadzieję na przyszłe przełomy regeneracyjne i terapeutyczne.

Wprowadzenie

Badania nad komórkami macierzystymi rozkwitły w naukach biomedycznych dzięki obiecującym zastosowaniom w medycynie regeneracyjnej i inżynierii tkankowej. Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC), pochodzące z tkanki miazgi zarówno ludzkich zębów mlecznych, jak i stałych, cieszą się dużym zainteresowaniem jako źródło komórek macierzystych ze względu na ich łatwą dostępność i zdolność multipotencjalną1,2. Komórki te mają potencjał do różnicowania się w różne typy komórek, w tym adipocyty, osteoblasty i chondrocyty, co potwierdzają liczne badania3.

W ciągu ostatnich kilku dekad nastąpił gwałtowny wzrost badań i zastosowań terapeutycznych komórek macierzystych. Ekspansywny potencjał komórek macierzystych wymaga dywersyfikacji źródeł, z których są pozyskiwane. Na wydajność, żywotność i zdolność macierzystą wybranych komórek wpływa kilka czynników. Pomimo istnienia różnych znanych rezerwuarów komórek macierzystych, takich jak szpik kostny i tkanka tłuszczowa, inwazyjne procedury, zachorowalność na miejsca i problemy etyczne związane z tymi źródłami często ograniczają ich eksplorację4,5. Wśród różnych źródeł komórek macierzystych, dentystyczne komórki macierzyste zyskały uwagę ze względu na ich łatwą dostępność, wysoką plastyczność i różnorodne potencjalne zastosowania. W szczególności ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej zostały szeroko przebadane pod kątem ich perspektyw terapeutycznych6. Zęby, powszechnie wyrzucane jako odpady medyczne, zawierają bogactwo mezenchymalnych komórek macierzystych7. Ochrona tej cennej puli komórek macierzystych wymaga wspólnych wysiłków pacjentów, dentystów i lekarzy, aby zapewnić, że zasoby te nie zostaną zmarnowane, dzięki czemu każda komórka macierzysta miazgi zęba będzie dostępna dla przyszłych potrzeb regeneracyjnych.

Komórki macierzyste pochodzące z miazgi zębowej, takie jak ludzkie dorosłe komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) i komórki macierzyste z złuszczonych ludzkich zębów mlecznych (SHED), znajdują się w niszy okołonaczyniowej miazgi zębowej. Uważa się, że komórki te pochodzą z komórek grzebienia nerwowego czaszki i wykazują wczesne markery zarówno mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), jak i neuroektodermalnych komórek macierzystych. DPSC i SHED wykazały się wielomocą i zdolnością do regeneracji różnych typów tkanek8.

Potencjalne źródła komórek macierzystych zębów obejmują zdrowe zęby mleczne i stałe. Komórki macierzyste stanowią tylko około 1% całkowitej populacji komórek w miazdze, co podkreśla znaczenie skutecznych technik izolacji i ekspansji9. W związku z tym ekstrakcja i ekspansja tych komórek macierzystych są kluczowymi etapami izolacji DPSC10. Usunięte lub złuszczone zęby muszą być przechowywane w bogatym w składniki odżywcze podłożu transportowym, takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) lub roztwór soli fizjologicznej buforowany przez Hanksa (HBSS).

Uzyskanie miazgi zębowej można osiągnąć różnymi metodami, w zależności od typu zęba7,11. W przypadku zębów mlecznych z korzeniami resorbowanymi ekstrakcję można przeprowadzić przez wierzchołek korzenia. Podobnie sterylne broszki kolczaste mogą być używane do pozyskiwania miazgi z zębów stałych z niedojrzałym otwartym wierzchołkiem. W przypadku zębów stałych z w pełni rozwiniętymi korzeniami, dostęp do komory miazgi polega na oddzieleniu korony zęba od korzenia. Osiąga się to poprzez przecięcie zęba za pomocą tarczy diamentowej na styku cementowo-szkliwa. To nacięcie odsłania komorę miazgi, umożliwiając pobranie tkanki miazgi12,13,14.

Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) mogą być izolowane poprzez trawienie enzymatyczne (ED) lub wyrostek z eksplantatów tkanek (OG), znane również jako spontaniczny wzrost. Metoda ED wykorzystuje enzymy, głównie kolagenazę I i dyspazę, do rozkładu tkanki na zawiesiny jednokomórkowe15,16. Metoda OG, prostsza i szybsza, polega na rozdrobnieniu fragmentów miazgi i bezpośrednim umieszczeniu ich na płytce hodowlanej, co pozwala komórkom wyrosnąć z eksplantatów tkankowych17. Naukowcy wykorzystali i porównali obie techniki do oceny tempa proliferacji komórek, zachowania właściwości izolowanych komórek macierzystych, różnicowania i ekspresji markerów powierzchniowych18. Ustanowienie i standaryzacja protokołów pozyskiwania DPSC o wysokiej skuteczności i skuteczności może utorować drogę do skutecznych i bezpiecznych terapii19. Protokół ten obejmuje ekstrakcję DPSC za pomocą trawienia enzymatycznego, przetwarzania laboratoryjnego, konserwacji i różnicowania komórek z barwieniem kolorymetrycznym w celu adipogenezy, osteogenezy i chondrogenezy.

Protokół opisany w tym artykule przedstawia procedurę krok po kroku, zaczynając od wstępnej izolacji miazgi zębowej od zęba, następnie hodowli i utrzymania DPSC w laboratorium, a kończąc na ich charakterystyce za pomocą specyficznych markerów komórek macierzystych (Rysunek 1). Opisano również techniki indukcji tych komórek macierzystych do różnych linii komórkowych, podkreślając ich wielomocność.

Protokół

Protokół opisany tutaj jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań na ludziach (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Wykorzystanie usuniętych zębów zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi w celu zapewnienia integralności, godności i praw uczestników. Uczestnikami wybranymi do tego badania były zdrowe osoby poniżej 30 roku życia, które wymagały ekstrakcji zęba w celu leczenia ortodontycznego. Osoby z rozległą próchnicą lub ciężkim zapaleniem przyzębia zostały wykluczone z badania. Zęby mleczne pobierano od dzieci, które wymagały ekstrakcji zębów zatrzymanych. Uzyskano również świadomą pisemną zgodę od uczestników biorących udział w tym badaniu.

1. Ekstrakcja i transport zębów

  1. Kolekcja zębów mlecznych i stałych
    1. Wyjaśnij uczestnikom cel zabiegu i potencjalne zastosowanie usuniętych zębów do celów badawczych.
    2. Ekstrakcję zębów należy wykonać w znieczuleniu miejscowym, podając środek znieczulający w okolice zęba, który ma zostać usunięty. W szczególności w tym badaniu wstrzyknięto 1,75 ml lidokainy zmieszanej z epinefryną (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:200 000. Preferowany jest wybór zębów, które nie wykazują ciężkiej próchnicy lub zapalenia przyzębia20,21.
  2. Transport usuniętych zębów
    UWAGA: Zaleca się pracę w warunkach aseptycznych, aby uniknąć zanieczyszczenia. Obejmuje to noszenie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice i fartuch laboratoryjny, oraz pracę w sterylnym środowisku, takim jak kaptur z przepływem laminarnym stanowiącym zagrożenie biologiczne.
    1. Po usunięciu zęba przepłucz go sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), aby usunąć krew i inne zanieczyszczenia. Za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela ostrożnie usuń wszelkie przyczepione resztki tkanek miękkich z powierzchni zęba (Rysunek 2A).
    2. Zanurz ząb w roztworze dezynfekującym, takim jak 70% etanol, na 10 sekund. Po dezynfekcji przepłucz ząb sterylnym PBS, aby zmyć resztki środka dezynfekującego.
    3. Umieść ząb w sterylnym pojemniku zawierającym podłoże transportowe.
      UWAGA: Pożywka transportowa składała się z Alpha-MEM, komercyjnej pożywki hodowlanej uzupełnionej antybiotykami: 100 U/ml penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Pożywka ta dostarczała niezbędnych składników odżywczych do komórek w usuniętym zębie, zapewniając im przetrwanie do czasu obróbki laboratoryjnej. Antybiotyki służyły do hamowania rozwoju bakterii.
    4. Utrzymuj temperaturę 4 °C podczas transportu, aby spowolnić komórkową aktywność metaboliczną i opóźnić śmierć komórki. Przetransportuj ząb do laboratorium w celu wykonania kolejnych kroków, w tym przetworzenia i wyizolowania komórek macierzystych miazgi zębowej.

2. Pobieranie tkanki miazgowej

  1. Zabezpiecz ząb za pomocą kleszczy dentystycznych, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu podczas zabiegu. Użyj tarczy diamentowej, aby przeciąć ząb w rękojeści dentystycznej (patrz Tabela materiałów) podłączonej do chłodziwa wodnego (Rysunek 2B).
    UWAGA: Celem jest odsłonięcie komory miazgi bez powodowania niepotrzebnych uszkodzeń znajdującej się w niej tkanki miazgi.
  2. Zatrudnij koparkę dentystyczną (patrz tabela materiałów), aby usunąć tkankę miazgi. Przyrząd ten umożliwia ekstrakcję miazgi bez powodowania uszkodzeń, zachowując w ten sposób żywotność komórek macierzystych miazgi zębowej (Rysunek 2C).
  3. Otrzymaną tkankę umieścić na szklanej szalce Petriego. Umyj tkankę miazgi solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.

3. Trawienie tkanki miazgi i izolacja komórek

  1. Rozdrabnianie i trawienie tkanek
    1. Za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego ostrożnie zmiel tkankę miazgi na małe fragmenty (Rysunek 2D) i umieść ją w mini maszynce do mielenia tkanek z PBS, aby uzyskać drobno zhomogenizowaną mieszaninę. Proces ten zwiększa powierzchnię tkanki, ułatwiając bardziej efektywne działanie enzymów podczas trawienia.
    2. Przenieść rozdrobnione fragmenty jednorodnej tkanki do probówki o pojemności 15 ml i trawić enzymatycznie, stosując mieszaninę 3 mg/ml kolagenazy typu I i 4 mg/ml dypazy (patrz tabela materiałów). Enzymy te rozpuszczono w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS), aby osiągnąć pożądane stężenia.
    3. Inkubować tkankę miazgi w mieszaninie enzymów (etap 3.1.2) przez około 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po inkubacji zneutralizować enzymy i zebrać komórki przez odwirowanie (etap 3.2.1) w celu dalszej hodowli.
  2. Wirowanie i ponowne zawieszenie
    1. Po inkubacji przenieść strawioną tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki. Ten etap oddziela komórki od pozostałych niestrawionych fragmentów tkanek i enzymów. Ostrożnie wyrzucić pożywkę sklarowaną nad osadem, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie probówki.
    2. Zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej. Pożywka ta zapewnia niezbędne składniki odżywcze i środowisko, aby izolowane komórki mogły przetrwać i namnażać się.

4. Hodowla komórkowa

  1. Posiewanie i inkubacja komórek
    1. Ostrożnie przenieść zawieszone komórki do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm².
      UWAGA: Cały materiał z pojedynczej miazgi przenosi się do pojedynczej kolbydo hodowli komórkowych o średnicy 25 cm. Objętość pożywki wynosząca 5-7 ml zapewnia wystarczające pokrycie i dostępność składników odżywczych dla komórek. Upewnij się, że pożywką hodowlaną dla DPSC jest zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełniona 10%-20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (patrz Tabela materiałów) w celu zapewnienia niezbędnych czynników wzrostu. Ponadto uzupełnij pożywkę 1% penicyliną/streptomycyną, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w kolbie, aby zapewnić jednorodny wzrost.
    2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  2. Zmiana medium i monitorowanie konfluencji
    1. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni, aby zapewnić świeże składniki odżywcze i usunąć odpady metaboliczne. Aby to zrobić, ostrożnie odessać starą pożywkę za pomocą sterylnej pipety serologicznej i zastąpić ją świeżą pożywką.
    2. Regularnie monitoruj hodowlę komórkową pod mikroskopem, aby śledzić wzrost komórek i sprawdzać, czy nie ma oznak zanieczyszczenia.
    3. Kontynuuj ten proces, aż komórki osiągną zbieżność 80%-90%, czyli punkt, w którym komórki pokrywają większość powierzchni kolby, ale nie są nadmiernie zatłoczone.
  3. Trypsynizacja komórek i pasażowanie lub zamrażanie
    1. Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć pozostałą pożywkę i komórki nieprzylegające.
    2. Dodać roztwór 0,25% trypsyny-EDTA do kolby, aby oderwać komórki od powierzchni kolby. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki oderwą się.
    3. Zneutralizuj trypsynę, dodając równą objętość pożywki hodowlanej, a następnie delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół, aby zapewnić całkowite oderwanie komórek.
    4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek.
    5. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej i albo ponownie je platerować (pasażowanie) w celu dalszego wzrostu, albo zamrozić do wykorzystania w przyszłości. Podczas zamrażania użyj pożywki do zamrażania, która zawiera krioprotektant, taki jak DMSO, aby chronić komórki przed uszkodzeniem podczas zamrażania.

5. Charakterystyka DPSC

  1. Analiza cytometrii przepływowej
    1. Aby potwierdzić charakter mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych komórek, wykonaj analizę cytometrii przepływowej22,23. Początkowo trypsynizuj i zbieraj komórki zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    2. Określić żywotność komórek za pomocą techniki wykluczania barwnika trypanowego. Przeprowadzić analizę za pomocą analizatora żywotności komórek (patrz tabela materiałów) podczas 2. i 8. przejścia. Wykonaj analizę fenotypową za pomocą cytometru przepływowego podczas 3. i 7. pasażu.
    3. Po inkubacji umyj komórki w buforze cytometrii przepływowej w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał i przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: Bufor cytometrii przepływowej składa się z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS), 1%-2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,1% azydku sodu (NaN3). FBS lub BSA blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał, podczas gdy azydek sodu działa jako środek konserwujący. Wysoki odsetek komórek powinien wykazywać ekspresję markerów mezenchymalnych komórek macierzystych i nie mieć markerów krwiotwórczych, co potwierdza ich tożsamość jako DPSCs24.
    4. Odłączyć DPSC i wybarwić je przeciwciałami immunofluorescencyjnymi do analizy metodą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Wybór markerów do analizy mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pomocą cytometrii przepływowej opiera się na konsensusie ustalonym przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT), który stwierdza, że MSCs powinny wyrażać CD105, CD73 i CD90 i nie mieć ekspresji CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79a lub CD19 oraz HLA klasy II25. Markery te są powszechnie stosowane w badaniach nad komórkami macierzystymi miazgi zęba26. Stężenia przeciwciał do barwienia mogą się różnić w zależności od konkretnego użytego przeciwciała i zaleca się przestrzeganie instrukcji producenta (patrz Tabela materiałów) dotyczących rozcieńczeń przeciwciał i warunków inkubacji25.
    5. Ustal kryteria klasyfikacji27,28 dla wyrażenia markerów CD, jak wspomniano: mniej niż 10%, brak wyrażenia; między 11% a 40%, niska ekspresja; zakres od 41% do 70%, umiarkowane wyrażenie; powyżej 71%, wysokie wyrażenie.
    6. Dodatkowo potwierdź brak markerów krwiotwórczych, inkubując oddzielną podwielokrotność komórki z przeciwciałami przeciwko CD34 i CD45.

6. Różnicowanie wieloliniowe

UWAGA: Poniższe kroki opisują protokoły osteogennego, adipogennego i chondrogenicznego różnicowania komórek macierzystych zębów. Rozpocznij od wysiewu kultur o gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę na płytce do hodowli tkankowej pokrytej fibronektyną z kompletnym podłożem (CM). Monitoruj wzrost komórek, aż do osiągnięcia 80%-90% konfluencji przed zainicjowaniem pożądanego protokołu różnicowania. Aby ocenić potencjał różnicowania wieloliniowego DPSC, należy zainicjować proces różnicowania w kierunku osteoblastów, adipocytów i chondrocytów poprzez wysiewanie komórek na 24-dołkowe płytki i hodowlę ich w odpowiednich podłożach różnicujących.

  1. Różnicowanie osteogenne
    1. Rozpocznij od hodowli DPSC w regularnym podłożu wzrostowym w standardowych warunkach, aż osiągną 70%-80% konfluencji.
    2. Usuń pożywkę wzrostową z komórek, a następnie umyj komórki raz 1x PBS. Dodaj pożywkę do różnicowania osteogennego (ODM) do komórek.
      UWAGA: ODM składa się z Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) uzupełnionego 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B, 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 mM beta-glicerofosforanu i 100 nM deksametazonu (patrz Tabela materiałów).
    3. Inkubować komórki w pożywce osteogennej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę osteogenną co 2-3 dni.
      UWAGA: Po 14 do 21 dniach DPSC powinny zróżnicować się w komórki podobne do osteoblastów. Można to potwierdzić, sprawdzając wzrost ekspresji markerów specyficznych dla osteoblastów, takich jak fosfataza alkaliczna, lub stosując techniki barwienia w celu wykrycia zmineralizowanej matrycy, takie jak barwienie czerwienią S alizaryny.
    4. Utrwalić komórki, inkubując je z 70% lodowatym etanolem przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
    5. Wybarwić utrwalone komórki roztworem barwiącym 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10-15 min. Wizualizuj barwienie pod mikroskopem, aby potwierdzić różnicowanie osteogenne (Rysunek 3). Potwierdź różnicowanie, barwiąc komórki czerwienią Alizaryny S, która identyfikuje złoża wapnia wskazujące na mineralizację29,30.
  2. Różnicowanie adipogenne
    1. Jak szczegółowo opisano we wcześniejszej sekcji, hoduj DPSC w standardowych warunkach w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 70%-80% konfluencji.
    2. Odessać pożywkę i raz umyć komórki 1x PBS. Wypłukaną pożywkę zastąpić pożywką różnicującą adipogenną. Pożywka ta zazwyczaj składa się z DMEM, 10% FBS, 10 μg/ml insuliny, 1 μM deksametazonu, 200 μM indometacyny i 0,5 mM IBMX (patrz tabela materiałów).
    3. Zmieniaj podłoże różnicujące co 3-4 dni. Po około 3 tygodniach przemyj DPSC zróżnicowane adipogennie PBS i utrwal je 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zabarwić utrwalone komórki czerwienią olejową O (patrz tabela materiałów), aby uwidocznić akumulację kropelek lipidów (Rysunek 4). Aby dodatkowo potwierdzić różnicowanie adipogenne, należy przeprowadzić analizę ekspresji genów markerów adipogennych, takich jak receptor gamma aktywowany proliferatorem peroksysomów (PPARγ) i adiponektyna31,32.
  3. Różnicowanie chondrogenne
    1. Kultury DPSC utrzymywane w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C stosuje się do różnicowania chondrogennego. Przejdź przez komórki, gdy osiągną około 70%-80% konfluencji.
    2. Odessać pożywkę i raz umyć komórki 1x PBS. Zastąp wypłukaną pożywkę chondrogenną pożywką różnicującą, która zazwyczaj zawiera zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle o wysokiej zawartości glukozy (DMEM), 1% ITS, 100 nM deksametazonu, 50 μg/ml askorbinian-2-fosforanu, 40 μg/ml proliny i 10 ng/ml transformującego czynnika wzrostu-beta 3 (TGF-β3) (patrz tabela materiałów).
    3. Utrzymuj komórki w pożywce różnicowania chondrogennego, zmieniając pożywkę co 2-3 dni. Po około trzech tygodniach DPSC powinny zróżnicować się w komórki podobne do chondrocytów.
    4. Utrwal komórki, inkubując je z 4% paraformaldehydem (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu wybarwić komórki błękitem Alcian (patrz Tabela Materiałów) i zobrazować je pod mikroskopem, aby potwierdzić różnicowanie chondrogenne (Ryc. 5).
    5. Potwierdź różnicowanie DPSC w chondrocyty za pomocą technik takich jak barwienie Alcian Blue dla proteoglikanów lub analiza ekspresji genów markerów chondrogennych, takich jak agrekan, SOX9 i kolagen typu II33,34.

Wyniki

Pomyślne wykonanie opisanego protokołu zaowocowało komórkami macierzystymi miazgi zębowej (DPSC) zdolnymi do różnicowania wieloliniowego, co świadczy o ich wielosile działania.

Testy żywotności
Żywotność DPSC oceniono za pomocą testu wykluczającego błękit trypanowy w różnych punktach czasowych. Wyniki wskazują na niezmiennie wysoką żywotność (ponad 95%) przez cały okres hodowli, co świadczy o solidności naszego protokołu izolacji i hodowli.

Testy jednostki tworzącej kolonie (CFU)
Testy CFU przeprowadzono w celu oceny zdolności DPSC do samoodnawiania się. Zawiesinę jednokomórkową posiano w niskiej gęstości i hodowano przez 14 dni. Powstałe kolonie były następnie barwione i liczone. Wyniki wskazują na wiele kolonii, co wskazuje na wysoki odsetek samoodnawiających się komórek w populacji DPSC.

Czas podwajania komórek
Czas podwajania komórek obliczono na podstawie krzywej wzrostu DPSC. Komórki wysiewano o określonej gęstości i regularnie liczono w celu skonstruowania krzywej wzrostu. Czas podwojenia został następnie obliczony przy użyciu wykładniczej fazy wzrostu krzywej. Wyniki pokazują czas podwojenia zgodny z tym zgłoszonym dla MSCs, co sugeruje zdrową i proliferacyjną populację komórek (Ryc. 6).

Analiza cytometrii przepływowej
Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że zdecydowana większość DPSC (np. >95%) była dodatnia dla CD90, CD73 i CD105, potwierdzając ich tożsamość jako MSC (Rysunek 7). Co więcej, mniej niż 2% komórek było dodatnich na CD45, CD34 i HLA-DR, co potwierdza brak znaczącego zanieczyszczenia komórek krwiotwórczych lub śródbłonka.

Zróżnicowanie osteogenne
Po zakończeniu różnicowania osteogennego komórki wykazywały zmineralizowaną matrycę, która jest wizualizowana przez barwienie czerwienią Alizarin S (Ryc. 3). Obecność czerwonego zabarwienia w barwionych komórkach wskazuje na pomyślne osadzanie się zmineralizowanej matrycy, która jest istotną cechą różnicowania osteogennego. Niemożność skutecznego uzyskania barwienia różnicującego może być potencjalnie związana z wyzwaniami, przed którymi stanęły podczas procedury pobierania próbki.

Zróżnicowanie adipogeniczne
Podczas różnicowania adipogennego DPSC gromadziły kropelki lipidów, co wskazuje na adipogenezę. Kropelki lipidów można zaobserwować za pomocą barwienia czerwienią olejową O (Rysunek 4). Udane różnicowanie doprowadziło do powstania pomarańczowo-czerwonych kropelek lipidów w komórkach.

Różnicowanie chondrogenne
Wreszcie, po różnicowaniu chondrogennym, DPSC wytwarzają glikozaminoglikany, krytyczny składnik chrząstki potwierdzony przez barwienie Alcian Blue, który wiąże się z tymi glikozaminoglikanami. Komórki, które pomyślnie przeszły chondrogenezę, wykazywały niebieskie zabarwienie po barwieniu (Ryc. 5).

Komórki, które nie wykazały odpowiednich zmian koloru w procedurach barwienia, mogą być spowodowane nieoptymalnym różnicowaniem, być może z powodu problemów z podłożem różnicującym lub początkową jakością DPSC. Zapewnienie jakości pożywek i suplementów oraz zdrowia i liczby pasażek użytych DPSC jest ważne. Pomyślne różnicowanie DPSC w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty potwierdza multipotencjalny charakter tych komórek i podkreśla ich potencjał w medycynie regeneracyjnej i zastosowaniach terapeutycznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych miazgi zębowej. Rysunek ten przedstawia schematyczne przedstawienie procesu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC). Proces ten rozpoczyna się od ekstrakcji zęba (lub zębów), po którym następuje izolacja tkanki miazgi, z której pochodzą DPSC. Po izolacji DPSC przechodzą różne testy charakteryzacyjne, aby potwierdzić ich tożsamość komórek macierzystych i ocenić ich żywotność, szybkość proliferacji i inne kluczowe cechy. Ostatni etap przedstawiony na tym diagramie obejmuje indukcję różnicowania, w której DPSC są traktowane określonymi czynnikami, które kierują ich transformacją w wyspecjalizowane typy komórek, takie jak osteoblasty, adipocyty lub chondrocyty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Pobieranie miazgi z usuniętych zębów. (A) Usunięty ząb przygotowany do ekstrakcji tkanki miazgi. (B) Przecięcie usuniętego zęba za pomocą wiertła diamentowego. (C) Usunięcie tkanki miazgi z komory miazgi. (D) Fragmentacja tkanki miazgi za pomocą ostrza chirurgicznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Osteogenne różnicowanie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) potwierdzone barwieniem czerwienią S alizaryny (40x). Jaskrawoczerwone zabarwienie ujawnia odkładanie się zmineralizowanej matrycy, charakterystycznej cechy osteoblastów, potwierdzającej pomyślne różnicowanie osteogenne. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Adipogenne różnicowanie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) wykazane przez barwienie czerwienią olejową. Obecność jaskrawoczerwonych kropelek świadczy o akumulacji lipidów, co jest cechą charakterystyczną adipocytów, potwierdzającą skuteczne różnicowanie adipogenne. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) wykazane przez barwienie Alcian Blue (40x). Intensywny niebieski kolor wskazuje na obecność bogatej w proteoglikany macierzy zewnątrzkomórkowej, charakterystycznej dla chondrocytów, potwierdzającej udane różnicowanie chondrogenne. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Czas podwojenia komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC). Wykres ten ilustruje krzywą wzrostu DPSC w czasie. Komórki początkowo wysiewano w określonej gęstości, a liczba komórek była pobierana w regularnych odstępach czasu (reprezentowanych na osi x) w celu monitorowania szybkości proliferacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Ekspresja markera powierzchni komórek macierzystych w hodowli DPSC. Rysunek ten przedstawia ekspresję określonych znaczników powierzchni na DPSC. Markery mezenchymalnych komórek macierzystych CD44, CD90 i CD105 wykazują wysoki poziom ekspresji, co wskazuje na obecność cech mezenchymalnych w tych komórkach. I odwrotnie, ekspresja markerów krwiotwórczych (CD34 i CD45) oraz cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (HLA-DR) jest prawie nieistotna, co potwierdza brak komórek linii krwiotwórczej w hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół przedstawia izolację, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC) z ludzkich zębów mlecznych i stałych. Zawiera opis przechowywania i proliferacji tych komórek, a także ocenę ich potencjału różnicowania in vitro do osteoblastów, adipocytów i chondrocytów35.

Chen i wsp.36 wykazali, że komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) można uzyskać z różnych źródeł, w tym z zakażonych ważnych ludzkich zębów dotkniętych stanami takimi jak zapalenie przyzębia, resorpcja korzeni, zapalenie okołokoronowe i złamania zębów, a także z zębów nadliczbowych i nieprawidłowo ustawionych. Odkrycie to zostało dodatkowo potwierdzone przez kolejne badania identyfikujące zakażone zęby życiowe jako potencjalne źródła DPSC 37,38,39,40. Jednak Bernardi i wsp.10 zwrócili uwagę, że zwiększona resorpcja korzeni może szkodliwie wpływać na żywotność tych komórek macierzystych. Istotną przeszkodą w tym procesie jest zachowanie komórek i zapobieganie ich degradacji, która rozpoczyna się natychmiast po ekstrakcji lub złuszczeniu zęba. Ponadto ważne jest, aby pamiętać, że zęby dotknięte ciężkimi stanami, takimi jak ropnie okołowierzchołkowe, guzy lub torbiele, nie powinny być wykorzystywane do ekstrakcji komórek macierzystych40,41.

DPSC można pozyskać za pomocą techniki trawienia enzymatycznego (ED) lub metody wyrastania z eksplantatów tkanek (OG), znanej również jako technika spontanicznego wzrostu14,15. Naukowcy wykorzystują te strategie do zbadania efektywności proliferacji komórek lub utrzymania cech morfologicznych i fenotypowych izolowanych komórek macierzystych17. Badania wykazały, że komórki macierzyste wyizolowane metodą OG wykazują wolniejsze tempo proliferacji i słabszą ekspresję markerów komórek macierzystych18. I odwrotnie, DPSC wyizolowane metodą ED wykazały szybszą proliferację, różnicowanie i zwiększoną ekspresję dodatkowych markerów powierzchniowych niż te wyizolowane metodą OG. Co ciekawe, niedojrzałe komórki macierzyste miazgi zębowej (IDPSC) pobrane z zębów mlecznych przy użyciu techniki OG wykazały, że hodowla komórkowa sprzyja selektywnej proliferacji IDPSC, zapobiegając w ten sposób wczesnemu różnicowaniu42.

Oczyszczanie DPSC ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysoce regenerujących się komórek i wymaga specyficznych markerów komórkowych. Selekcja komórek odbywa się przy użyciu metod sortowania komórek fluorescencyjnych lub aktywowanych magnetycznie. Oprócz wyżej wymienionych markerów, ze względu na niejednorodny charakterDSCs 43 stosuje się również wiele innych antygenów powierzchniowych. Nie zidentyfikowano jednak pojedynczego markera, który pozwoliłby na segregację subpopulacji.

W porównaniu z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi ze szpiku kostnego, DPSC zostały uznane za obiecujące źródło komórek multipotencjalnych ze względu na ich potencjał wieloliniowy44. Ta łodyga jest prawdopodobnie wynikiem względnej niedojrzałości tkanek źródłowych, ponieważ zęby mądrości, często źródło ekstrakcji DPSC, są ostatnimi zębami stałymi, które się rozwijają, a zatem są mniej dojrzałe niż szpik kostny45. Protokół ten z powodzeniem bada multipotencjalną naturę komórek macierzystych miazgi zębowej poprzez indukowanie tych komórek do ulegania adipogenezie, osteogenezie i chondrogenezie. Warto zauważyć, że DPSC są jedynym typem komórek, który zwiększa ekspresję DSPP podczas hodowli w warunkach osteogennych, co wskazuje na ich przyszłe różnicowanie w odontoblasty46.

Komórki macierzyste zębów, wyizolowane z różnych źródeł, wykazują duży potencjał proliferacji i różnicowania47. Znaczące postępy poczynione w systemach in vitro wywarły głęboki wpływ na biologię komórek macierzystych i terapię. Pomimo tych postępów, nadal istnieją wyzwania związane z przekładaniem terapii komórkami macierzystymi z laboratorium na łóżko pacjenta. Szczególną uwagę należy zwrócić na przeżywalność i stabilność komórek macierzystych, aby zagwarantować, że techniki konserwacji nie zagrażają żywotności tych komórek. Podczas gdy badania nad komórkami macierzystymi zębów przyniosły obiecujące wyniki w modelach zwierzęcych, istnieje pilna potrzeba rozszerzenia tych ustaleń na badania na ludziach. Kontynuując rygorystyczne badania i rozwój, dentystyczne komórki macierzyste mogą odegrać znaczącą rolę w postępie w dziedzinie bankowania komórek macierzystych.

Chociaż jest to szeroko stosowane, trawienie enzymatyczne do izolowania komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) ma kilka ograniczeń. Przede wszystkim proces ten może zagrozić żywotności komórek, ponieważ enzymy takie jak kolagenaza i dyspaza mogą nieumyślnie uszkadzać błony komórkowe, dając mniej żywych komórek macierzystych17. Ponadto metoda ta często prowadzi do degradacji ważnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która ma kluczowe znaczenie dla zachowania nieodłącznych właściwości komórek macierzystych48. Procedura może również zmieniać markery powierzchni komórki, utrudnia to dokładną identyfikację i charakterystykę DPSC43. Poza tymi ograniczeniami biologicznymi podejście to jest czasochłonne, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego z powodu długotrwałej inkubacji w temperaturze 37 °C. Co więcej, niespójność między partiami enzymów może prowadzić do zmiennych wyników, co podważa powtarzalność procedury izolacji. Nie można pominąć obciążenia finansowego, ponieważ wysokiej jakości enzymy odpowiednie do trawienia tkanek są drogie49. Co więcej, w następstwie trawienia może wystąpić szczątkowa aktywność enzymów, która może szkodliwie wpływać na hodowle komórkowe, wpływając na ich zdrowie, proliferację i różnicowanie. Wreszcie, potencjał trawienia enzymatycznego w celu preferencyjnego izolowania niektórych subpopulacji DPSC w stosunku do innych może nieumyślnie zniekształcić wynikową pulę komórek, wpływając na ich potencjał terapeutyczny50.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Dr. Mathew Mazhavancherilowi, dyrektorowi i szefowi Centrum Badawczego Pushpagiri w Thiruvalla, za jego wsparcie w dokumentowaniu procedur w Centrum Badawczym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-izobuty-L-metylo-ksantyna Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Kwas octowy Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Niebieski Alcjan Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Roztwór barwiący Alizarin Red SSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Zestaw do barwienia fosfatazy alkalicznejThermo Fisher Scientific, MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha-MEM lub Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha-MEM lub Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Antybiotyk/AntybiotykSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Askorbinian-2-fosforanSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glicerofosforan Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Szafa bezpieczeństwa biologicznego-okap z przepływem laminarnymLabconco Corporation, MO 64132-2696, USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 i HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, USA
Sitko do komórek (70 &mikro; m )Laboratoria HiMedia  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Wirówka do siatek komórkowych
REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
WirówkaHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Kolagenaza typu IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, Stany Zjednoczone
Kolagenaza typu IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Kompletne podłoże wzrostoweHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndieAT006 DMEM
Rurki stożkowe (15 lub 50Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 ml i 50 ml
Pojemnik do zamrażania CryoThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA15-350-50
Etykiety kriogeniczne EtykietaIndie:
Pudełka do przechowywania kriowialnego do przechowywania Cryostore
CryovialsThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Cryovials (1,8 ml)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAPW1282Wolnostojąca
kolba hodowlana (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Kolbyhodowlane HiMedia Laboratories  Ltd. Bombaj, IndieTCG4/TCG6T25/T75
Płytki hodowlaneHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndieTCP129 / TCP00860 mm / 100 mm
Dentystyczne tarcze diamentoweKomet SC 29730, USAKomet 
Koparka łyżkowa dentystycznaBrasseler, GA 31419, USA5023591U0
DeksametazonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DeksametozonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DeksametozonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics, Mannheim, Niemcy.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, Stany Zjednoczone
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, Stany Zjednoczone
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451,Stany Zjednoczone
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Etanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd. Bombaj, IndieMB106
Etanol -70%Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAFisher Scientific
Kleszcze ekstrakcyjne Dentsply Sirona, Stany Zjednoczone
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Surowica bydlęca płodu (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndieRM9954
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USAF2442-500ML
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USAF2442-500ML
Płytka do hodowli tkankowej pokryta fibronektynąCorning Inc. Corning, NY 14831, USA
Cytometr przepływowyBD Biosciences, CA 95131, USA
Bufor do cytometrii przepływowejBD Biosciences,CA 95131,USA
Szkiełko nakrywkowe szklane 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndieTCP017
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Bazylea, Szwajcaria
Szybkobieżna rękojeść dentystyczna NSK Ltd, Tokio 8216, JaponiaTi-Max Z series
Horse SerumThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
IBMX lub 3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndometacynaPfizer Inc. NY 10017, USA
Insulina-Transferyna-Selen (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451,USAI5523
Insulina-transferyna-selen (ITS)ThermoFisher Scientific, MA 02451, USAI5523
Premiks insulina-transferyna-selen (ITS)Corning Incorporated, MA 01876, USA
Mikroskop odwróconyOlympus Corp., Tokio 163-0914, Japonia
Izopropanol (60%)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Alkohol izopropylowy Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Okap z przepływem laminarnymThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Lidokaina zmieszana z epinefrynąDENTSPLY, NC 28277, USACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide, 75007 Paryż, Francja
Zbiornik magazynujący ciekły azotCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MikropipetyEppendorf AG,22339 Hamburg,Niemcy30020Accupipet-2-20 µ L
Mini młynek do tkanekBio-Rad Lab, Inc. CA 94547, USAMini młynki
ReadyPrep Zamrażarka Minus 80Blue Star Limited Komora
licząca NeubauerMarienfeld Superior, arktheidenfeld, Niemcy
Czerwona plama olejowa OSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Pożywka do różnicowania osteogennego (ODM) STEMCELL Technologies Inc. Vancouver, BC, V5Z 1B3, Kanada
Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicylina-StreptomycynaGibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451,USA
Roztwór buforowany fosforanem (PBS) bez Ca++ i Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USAGibco
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Solanka buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Prolina Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Rozmiar ostrza skalpela 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Podchloryn soduHiMedia Laboratories  Ltd. Mumbai, IndieAS102 4% w/v roztwór
Sterylne probówki wirówkoweTarsons Products Pvt. Ltd.
Sterylny pojemnik -20 ml3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Sterylne pipety (2, 5 i 10 ml )Eppendorf AG,22339 Hamburg,Niemcy
Sterylne pipety i końcówkiEppendorf India Limited
Ostrze chirurgiczne UchwytBecton, Dickinson and Co., NJ, USA371030BP Uchwyt 3
Transformujący czynnik wzrostu-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, USA
Transformujący czynnik wzrostu-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413,USA
Błękit trypanowy 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Błękit trypanowy 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Błękit trypanowy 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsyna-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA
Trypsin-EDTA 0,25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA
Łaźnia wodnaThermo Fisher Scientific, MA 02451, USABSW-01D
) Pudełka

Bibliografia

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja DPSCtrawienie enzymatyczneprzerost eksplantatu tkankowegomezenchymalne kom rki macierzystecytometria przep ywowar nicowanie kom rekr nicowanie osteogenner nicowanie adipogenner nicowanie chondrogenne

Powiązane artykuły