Artykuł metodologiczny

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/65777

⸱

1 grudnia 2023

 , 
1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ES) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) mają potencjalne zastosowanie w medycynie regeneracyjnej opartej na komórkach do leczenia poważnie chorych narządów ze względu na ich nieograniczoną proliferację i właściwości pluripotencjalne. Jednak różnicowanie ludzkich komórek ES/iPS w 100% czyste typy komórek docelowych jest wyzwaniem ze względu na ich wysoką wrażliwość na środowisko. Nowotworzenie po przeszczepie jest spowodowane przez zanieczyszczone, proliferujące i niezróżnicowane komórki, co sprawia, że technologia wysokiego stopnia oczyszczania jest niezbędna do bezpiecznej realizacji medycyny regeneracyjnej. Aby zmniejszyć ryzyko nowotworzenia, opracowano technologię zaawansowanego oczyszczania ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek iPS. Metoda wykorzystuje FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją) przy użyciu kombinacji wysokiej zawartości mitochondriów i markera powierzchni komórki ALCAM (aktywowana cząsteczka adhezyjna komórek leukocytów) bez modyfikacji genetycznej. 97% ± 0,38% (n = 5) oczyszczonych hepatocytów tą metodą wykazywało ekspresję białka albuminowego. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie szczegółowych procedur dla tej metody, zastosowanej do najnowszej metody dwuwymiarowego różnicowania ludzkich komórek iPS do hepatocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (odpowiednio ES i iPS) są uważane za obiecujące źródła komórek do terapii regeneracyjnych. Jednak skuteczność różnicowania tych komórek w określone typy komórek docelowych może się różnić, nawet przy użyciu tej samej linii komórkowej, protokołu i eksperymentatora1,2,3,4. Zmienność tę można przypisać wysokiej wrażliwości ludzkich komórek ES/iPS na środowisko. W związku z tym obecnie trudno jest konsekwentnie uzyskiwać czyste komórki docelowe. Aby osiągnąć wysoce bezpieczną medycynę regeneracyjną, kluczowe jest wyeliminowanie komórek proliferacyjnych i niezróżnicowanych komórek macierzystych w komórkach terapeutycznych, a zaawansowana technologia oczyszczania komórek docelowych jest niezbędna5,6,7.

Sorter komórek to urządzenie, które natychmiast analizuje pojedyncze komórki i sortuje żywe komórki na podstawie siły sygnału fluorescencyjnego, oferując obiecujące rozwiązanie. Można to osiągnąć poprzez barwienie przeciwciałami markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki lub poprzez wykorzystanie ekspresji genów reporterowych specyficznych dla typu komórki. Korzystając z tej techniki, istnieje kilka doniesień na temat metod oczyszczania pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych8,9,10 i hepatocytes11,12. Hattori i wsp. opracowali innowacyjną metodę oczyszczania mitochondriów przy użyciu sortera komórek13. Wykorzystując fakt, że kardiomiocyty mają wysokie zapotrzebowanie na energię poprzez aktywność mitochondriów, barwienie komórek żywym barwnikiem wskazującym na mitochondria TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy) może być używane do znakowania i wysoce oczyszczania kardiomiocytów za pomocą FACS z ludzkich ciał embrionalnych pochodzących z komórek ES zawierających różne typy komórek. Brak rakotwórczości potwierdzono w testach tworzenia potworniaków z oczyszczonymi kardiomiocytami. Co więcej, Yamashita i wsp. nieoczekiwanie odkryli metodę oczyszczania hepatocytów z ludzkich embrionów pochodzących z komórek ES poprzez izolowanie frakcji o wysokiej aktywności mitochondrialnej i ekspresji ALCAM-dodatniej14. Uzasadnieniem dla tej metody jest to, że hepatocyty mają również stosunkowo dużą liczbę mitochondriów ze względu na wysokie zużycie ATP do metabolizmu składników odżywczych i detoksykacji15, a hepatocyty wyrażają ALCAM, członka nadrodziny immunoglobulin, która odgrywa rolę w adhezji i migracji komórek16.

Poprzednie wysoce oczyszczające hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych wymagały modyfikacji genetycznych, a metody oczyszczania niegenetycznego miały niską skuteczność17. Niegenetyczna metoda mitochondrialna ma zalety w osiąganiu wysokiej czystości. Gdy potrzebne są komórki progenitorowe wątroby, można wybrać metody oparte na CD133 i CD13 lub Dlk118,19. Chociaż dokładność technologii edycji genomu uległa postępowi, nie można całkowicie wyeliminować potencjalnego ryzyka nieprzewidzianych zmian genomowych (np. kancerogenezy). Metody oparte na aktywności mitochondrialnej, bez ingerencji w modyfikację genetyczną, mogą być wolne od takich zagrożeń.

W wyniku badania różnych wskaźników mitochondrialnych w kardiomiocytach noworodków szczurów, zaobserwowano, że TMRM znika całkowicie w ciągu 24 godzin, podczas gdy inne barwniki pozostają przez co najmniej 5 dni13. Ponadto należy zauważyć, że TMRM i JC-1 nie wpłynęły na żywotność komórek, gdy oceniano je za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylo-tiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT), podczas gdy inne barwniki wykazywały różny wpływ na żywotność komórek13. TMRM wykazuje większe bezpieczeństwo.

Do tej pory opracowano kilka metod dwuwymiarowego (2D) różnicowania jako bardziej efektywne podejścia do wywoływania różnicowania w porównaniu do trójwymiarowego (3D) tworzenia ciał zarodkowych. Dzieje się tak, ponieważ stopniowe związki lub cytokiny indukujące różnicowanie mogą być równomiernie podawane komórkom na płaszczyźnie 2D, a nie w przestrzeni 3D. W tym badaniu wcześniej opisana metoda20 została zmodyfikowana w celu wywołania różnicowania w ludzkie hepatocyty pochodzące z komórek iPS. W tym miejscu opisano szczegóły procedur aktualnego różnicowania 2D i oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu użyto komercyjnie uzyskanych ludzkich komórek iPS (szczep 253G1) (zobacz Tabelę materiałów).

1. Utrzymanie ludzkich komórek iPS

  1. Utrzymuj ludzkie komórki iPS w warunkach wolnych od karmienia w pożywce AK02 na szalkach hodowlanych pokrytych 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (patrz tabela materiałów).

2. Wątrobowe różnicowanie ludzkich komórek iPS w hodowlach 2D

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1A dla dziennego harmonogramu różnicowania wątroby. W trakcie całego procesu należy używać 6-dołkowych płytek hodowlanych i dodawać 2 ml wyznaczonego roztworu do płukania lub pożywki do każdej studzienki. Utrzymuj stan hodowli komórkowej przy 100% wilgotności, 5% CO2 i 20% O2 w temperaturze 37 °C.

  1. Pokryć każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml macierzystej matrycy błony podstawnej (rozcieńczonej w stosunku 1:25 w PBS (-)) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Przejście ludzkich komórek iPS na powlekane naczynie o gęstości 20 000-30 000 komórek/cm² przy użyciu pożywki AK02N uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632) (patrz tabela materiałów). Wymień pożywkę bez Y-27632 następnego dnia i hoduj przez dodatkowe 2 dni.
  3. Umyj ogniwa raz za pomocą pożywki RPMI-1640. Zainicjuj różnicowanie endodermy, zastępując pożywkę RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 Insulina + 1% Dipeptyd L-Alanylo-L-Glutamina) uzupełnioną 3-6 μM CHIR-99021 i 100 ng/ml Activiny A przez 24 godziny (patrz Tabela Materiałów).
  4. Zastąp pożywkę RPMI-B27-Glu uzupełnioną 50 ng/ml Activiny A na 24 godziny.
  5. Aby wywołać różnicowanie progenitorów wątroby, należy zastąpić pożywkę RPMI-B27-Glu uzupełnionym 1% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) przez 5 dni.
  6. Aby przyspieszyć dojrzewanie hepatocytów, przełącz się na pożywkę do dojrzewania hepatocytów: pożywkę L-15 firmy Leibovitz zawierającą 10 μM hydrokortyzonu 21-hemibursztynian, 8,3% bulionu z fosforanu tryptozy, 100 nM deksametazonu (DEX), 50 μg/ml L-askorbinianu sodu, 0,58% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 8,3% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy i 100 nM N-heksanoicznego-try-Ile-(6)-amino-sześcioheksanowego amidu (Dihexa) (patrz tabela materiałów).
  7. Zmieniaj podłoże co 2 dni przez 20 dni. Sortuj komórki około 27 dni po zainicjowaniu różnicowania.

3. Przygotowanie komórek do oczyszczania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS

  1. Przemyć zróżnicowane komórki wątroby 2 ml PBS (-) na studzienkę.
  2. Dodaj 1 ml roztworu enzymatycznego na studzienkę, który zawiera 0,1% kolagenazy, 0,083% trypsyny, 10 μM inhibitora ROCK (Y-27632), 20 nM cyklosporyny A i 50 μg/ml L-askorbinianu sodu w buforze Ads (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM glukozy i 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) (patrz tabela materiałów). Oderwij komórki od płytek, obracając je poziomo w temperaturze 37 °C przez około 2 godziny.
  3. Po upewnieniu się, że komórki są odłączone i zaokrąglone pod mikroskopem, rozproszyj je na pojedyncze komórki za pomocą delikatnego pipetowania i zbierz je do probówki o pojemności 50 ml.
  4. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C w celu ich granulowania. Usunąć supernatant za pomocą aspiratora.
  5. Wybarwić mitochondria komórek, rozpraszając je w 5 ml pożywki do dojrzewania hepatocytów zawierającej 100 nM TMRM (tetrametylodamina, ester metylowy) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem, zawijając w folię aluminiową.
  6. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C w celu ich osadzenia. Usunąć supernatant.
  7. Ponownie zawieś komórki za pomocą 1-5 ml zimnego buforu reklamowego zawierającego 2% FBS.
  8. Policz liczbę komórek za pomocą 0,4% roztworu błękitu trypanowego i płytki do liczenia komórek.
  9. Odwirować komórki o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu ich osadzenia. Usunąć supernatant.
  10. Rozcieńczyć przeciwciało anty-ALCAM (przeciwciało pierwszorzędowe, patrz tabela materiałów) w stosunku 1:50 w buforze Ads i dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała na 106 komórek. Plamić komórki przez 50 minut na lodzie. Przygotuj komórki, które nie są barwione pierwszorzędowym przeciwciałem jako kontrolę negatywną.
  11. Umyj komórki zimnym buforem reklamowym zawierającym dwukrotnie 2% FBS.
  12. Rozcieńczyć IgG (przeciwciało drugorzędowe) osła Alexa Fluor 488 (przeciwciało drugorzędowe, patrz tabela materiałów) w stosunku 1:100 w buforze Ads i dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała na 10-6 komórek. Barwić komórki przez 30 minut na lodzie. Wybarwić komórki, które nie zostały wybarwione przeciwciałem pierwszorzędowym, przy użyciu przeciwciała drugorzędowego.
  13. Umyj komórki zimnym buforem reklamowym zawierającym dwukrotnie 2% FBS.
  14. Ponownie zawieś komórki w buforze Ads i przefiltruj je przez sitko zatrzaskowe (siatka 35 μm) tuż przed sortowaniem przez FACS, aby usunąć duże grudki komórek i zanieczyszczenia.

4. Analizy FACS i sortowanie hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS

  1. Ustaw maszynę FACS do sortowania komórek zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Użyj dyszy o rozmiarze 85 μm lub 100 μm i filtra ND 2.0 dla hepatocytów. Użyj kanału FITC do wykrywania mąki Alexa 488 dla ALCAM oraz kanału PE do wykrywania fluorescencji TMRM dla mitochondriów.
  2. Dostosuj napięcia FSC (rozproszenie do przodu) i SSC (rozproszenie boczne), aby prawidłowo zobrazować populację komórek.
  3. Dostosuj napięcie kanałów fluorescencyjnych FITC i PE. Zacznij od nieoznaczonych komórek i wyśrodkuj populację komórek u dołu każdego wykresu kanału. Upewnij się, że oznaczone komórki są odpowiednio rozmieszczone na wykresie.
  4. Użyj wspólnej strategii bramkowania, aby wyeliminować dublety: Bramka główna FSC-A vs. Populacja SSC-A (Rysunek 2A), a następnie FSC-H vs. -W, a następnie SSC-H vs. -W (Rysunek 2B,C).
  5. Bramka TMRMhi i ALCAM+ populacja (P2 w Rysunek 2E) w celu sortowania hepatocytów. Bramka populacjiTMRM hi i ALCAM- (P1 w Rysunek 2E) w celu sortowania niehepatocytów. Zebrać posortowane hepatocyty i niehepatocyty do 15 ml probówek zbiorczych zawierających pożywkę do dojrzewania hepatocytów.
  6. Odwirować probówkę zbiorczą zawierającą posortowane komórki o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce do dojrzewania hepatocytów.
  8. Wysiewać komórki na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) traktowanych mitomycyną C lub żelowej macierzy błony podstawnej z pożywką do dojrzewania hepatocytów uzupełnioną 10 μM Y-27632 i 20 nM cyklosporyną A. Hodować komórki w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C przez 5 dni.

5. Immunocytochemia do wykrywania hepatocytów pochodzących z ludzkich komórek iPS

  1. Hodowane komórki należy myć przez 5 dni po sortowaniu za pomocą PBS (-).
  2. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj komórki buforem TBS-T (1x TBS z 1% Tween 20) dwukrotnie, aby usunąć paraformaldehyd.
  4. Inkubować komórki z 0,1% rozcieńczonym buforem TBS-T Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dwukrotnie przemyć ogniwa buforem TBS-T, aby usunąć Triton X-100.
  6. Dodaj dostępny w handlu roztwór blokujący (patrz tabela materiałów) do komórek na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko albuminie (marker hepatocytów) i ludzkiemu antygenowi jądrowemu (hNA, patrz tabela materiałów), rozcieńczone w stosunku 1:50 w roztworze blokującym.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc. Dwukrotnie przemyć ogniwa buforem TBS-T.
  9. Dodaj przeciwciała drugorzędowe: Alexa Fluor 488 anty-królicze IgG i Alexa Fluor 546 osło anty-mysie IgG, rozcieńczone w stosunku 1:100 w roztworze blokującym (patrz tabela materiałów).
  10. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dwukrotnie przemyć komórki buforem TBS-T.
  11. Oceń czystość hepatocytów, zliczając komórki albuminowo-dodatnie i hNA-dodatnie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Obliczyć procent komórek albuminowo-dodatnich na komórkę hNA-dodatnią zarówno dla populacji P1, jak i P2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano chronologię procesów indukujących ludzkie komórki iPS do różnicowania się w hepatocyty poprzez hodowlę 2D (Rysunek 1A) i reprezentatywne cechy komórek (Rysunek 1B). Około 12 dnia różnicowania komórki zaczęły wykazywać wielokątne kształty komórek i okrągłe jądra, charakterystyczne dla hepatocytów. Niektóre hepatocyty wykazywały również wielojądrowość.

Analiza FACS została przeprowadzona przy użyciu komórek w 27 dniu różnicowania. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na swoje funkcje w metabolizmie składników odżywczych i detoksykacji, hepatocyty posiadają stosunkowo dużą liczbę mitochondriów w porównaniu z innymi typami komórek15. ALCAM należy do nadrodziny immunoglobulin i odgrywa rolę w adhezji i migracji komórek. Ulega ekspresji w różnych typach komórek, w tym w komórkach wątrobowych, nabłonkowych, limfocytarnych, szpikowych, fibroblastach i komórkach neuronalnych16. Wykorzystując połączenie metody opartej na mitochondria...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii numer [23390072].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
253G1 ludzka linia komórkowa iPSCentrum Badawcze RIKEN BioResource HPS0002
4% paraformaldehydFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-20145
Roztwór aktywiny A, ludzki, rekombinowanyNACALAI TESQUE, INC.18585
Przeciwciało antyjądrowe, klon 235-1ChemiconMAB1281Przeciwciało przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu
Suplement B-27 (50x), bez surowicyThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSAria IIIBD BiosciencesSortownik komórek
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182 
Cyklosporyna AFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation035-18961
KolagenazaFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnejCorning354230Żelowa matryca membrany podstawnej
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-24023Inhibitor ROCK
DeksametazonFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-18863
Dimetylosulfotlenek (DMSO)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation047-29353
Przeciwciało drugorzędowe anty-kozie IgG (H+L) z adsorbcją, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko myszy, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036
Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488Thermo FisherScientific A-21206
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórek Snap CapCorning352235
Płodowa surowicabydlęcaBiowest51820-500
GlutaMAX SuplementThermo Fisher Scientific35050061Dipeptyd L-alanylo-L-glutamina
Człowiek/Mysz/Szczur/Pies ALCAM/CD166 PrzeciwciałoR& D SystemsAF1172
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian sól sodowaSigma-AldrichH2270
iMatrix-511 jedwabNippi892021
ImmunoBlockKACCTKN001Roztwór blokujący
Suplement ITS-G(&razy; 100)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation090-06741
Leibovitz's L-15 MediumFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation128-06075
N-heksanonowy-try-ile-(6)-amino-sześciokątny amid (Dihexa)Toronto Research ChemicalsH293745
Poliklonalna albumina antyludzka królikaDakoA0001
Polioksyetylenosorbitan Monolaurate (Tween 20)NACALAI TESQUE, INC.28353-85
RPMI-1640FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation189-02025
L-askorbinian soduNACALAI TESQUE, INC.03422-32
StemFit AK02NREPROCELLRCAK02N
TBS (10x)NACALAI TESQUE, INC.12748-31
Tetrametylodamina, ester metylowy (TMRM)Thermo Fisher ScientificT668
Triton X-100NACALAI TESQUE, INC.28229-25
Roztwór błękitu trypanowegoNACALAI TESQUE, INC.20577-34
TRYPSYNA 250Difco215240
Roztwór bulionu z fosforanu tryptozySigma-AldrichT8159

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
  2. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  3. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  4. Chen, C. X. -Q., et al. Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons. bioRxiv. , (2021).
  5. Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).
  6. Nori, S., et al. Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition. Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).
  7. Hentze, H., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).
  8. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  9. Hidaka, K., et al. Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells. The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).
  10. Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).
  11. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  12. Takayama, K., et al. Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research. Biomaterials. 161, 24-32 (2018).
  13. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature methods. 7, 61-66 (2009).
  14. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  15. Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).
  16. Swart, G. W. M. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).
  17. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).
  18. Kamiya, A., Inagaki, Y. Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration. Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).
  19. Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential. PLOS One. 8 (7), e67541(2013).
  20. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).
  21. Hirata, H., et al. ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes. Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Live Mitochondria StainingCell SortingHuman Induced Pluripotent Stem CellsHepatocyte PurificationFluorescence Activated Cell SortingHepatic DifferentiationALCAM MarkerTMRM StainingAlbumin ExpressionHepatic Progenitor Cells

Powiązane artykuły