Method Article

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świdry leśne (FWB) powodują poważne uszkodzenia drzew i straty ekonomiczne na całym świecie. Uwalnianie grzybów entomopatogenicznych (EPF) w okresie pojawienia się FWB jest uważane za akceptowalną alternatywę dla kontroli chemicznej. Zasoby EPF zostały jednak znacznie mniej zbadane w odniesieniu do FWB, w przeciwieństwie do agrofagów owadzich. W artykule przedstawiono protokół badania zasobów EPF z FWB na przykładzie dzikich populacji Monochamus alternatus. W tym protokole przypisanie pułapek z przynętą M. Atraktanty Alternatus dla różnych populacji gwarantowały pobranie odpowiednich próbek z naturalnymi objawami infekcji w okresach pojawienia się chrząszcza. Po dokładnym rozwarstwieniu powłok i umieszczeniu ich na selektywnym podłożu, gatunki grzybów wyizolowano z każdej części ciał chrząszczy i zidentyfikowano je na podstawie cech molekularnych i morfologicznych.

Kilka gatunków grzybów zostało certyfikowanych jako pasożytnicze EPF poprzez ponowne zakażenie zdrowego M. alternatus zawiesinami zarodników. Ich fenotypy behawioralne na M. alternatus obserwowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, a następnie porównywano z tymi na modelowym owadzie Coleopteran Tribolium castaneum. W przypadku EPF, które wykazują spójne fenotypy pasożytnictwa na obu gatunkach chrząszczy, ocena ich aktywności na T. Castaneum dostarczyło cennych informacji na temat śmiertelności dla przyszłych badań nad M. alternatus. Protokół ten pomógł w odkryciu EPF nowo zgłoszonych w populacjach M. alternatus w Chinach, co może być zastosowane jako skuteczne podejście do eksploracji większej ilości zasobów EPF z innych FWB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dewastacja spowodowana przez szkodniki owadzie doprowadziła do ogromnych strat ekologicznych i ekonomicznych zarówno w ekosystemach leśnych, jak i rolniczych. Większość szkodników rolniczych naraża się na naturalnych wrogów lub sztuczne środki kontrolne, uszkadzając rośliny żywicielskie. Zamiast tego świdry leśne (FWB) prawie kończą swoje cykle rozwojowe w pniach drzew żywicielskich1, co stwarza duże wyzwania dla zbadania wydajnych organizmów kontroli biologicznej z FWB na dzikim polu. Jeszcze gorsze jest to, że FWB przenoszą dużą liczbę fitopatogenów2 lub mają bliski związek z tymi patogenami jako ich potencjalnymi wektorami3,4, co znacznie zwiększa negatywny wpływ FWB na zdrowie lasów. Nadmierne stosowanie chemicznych środków owadobójczych może złagodzić nasilenie FWB, ale pojawienie się odporności na środki owadobójcze5,6 ogranicza ich zastosowanie w środowisku. W niektórych przypadkach parazytoidy owadów, drapieżne stawonogi, a także mikroorganizmy entomopatogeniczne zostały uwolnione jako środki kontroli biologicznej do obszarów dystrybucji FWB7 i udowodniono, że są one skuteczną i ekonomicznie akceptowalną alternatywą dla kontroli chemicznej8,9,10.

Uważa się, że grzyby entomopatogeniczne (EPF) mają przewagę w zwalczaniu FWB nad większością innych grup mikroorganizmów. Ich zarodniki mogą być przenoszone przez owadzich gospodarzy i stabilnie utrwalane na powierzchni ciała poprzez penetrację naskórka lub powłoki8,11. EPF wykazuje również doskonałe zdolności adaptacyjne do stresów środowiskowych, a niektóre gatunki dobrze kolonizują tkanki drzew jako endofity12,13, ułatwiając ich wzrost, przetrwanie i przenoszenie. Jednak w porównaniu z branżą rolniczą, różnorodność gatunkowa EPF stosowanego w naturalnych ekosystemach leśnych jest znacznie ograniczona14,15,16. Beauveria bassiana (szczep PPRI 5339) został uznany za najbardziej obiecujący szczep promujący program IPM dla ryjkowców eukaliptusowych w RPA17 i połączenie dwóch obiecujących izolatów B. Bassiana stworzyła okazję do praktycznej kontroli mikrobiologicznej ryjkowca palmowego, Rhynchophorus ferrugineus, na różnych etapach życia na polach palmowych18. Oprócz Beauveria i dobrze znanego Metarhizium, inne rodzaje EPF z rzędu Hypocreales, zwłaszcza gatunki Lecanicillium (z których wiele jest obecnie klasyfikowanych do rodzaju Akanthomyces19,20), wykazały silną chorobotwórczość i wysoki potencjał w zwalczaniu szkodników leśnych, takich jak mszyca cyprysowa w Chile21.

Chrząszcz sosnowy Monochamus alternatus jest znanym szkodnikiem lasu sosnowego w Chinach i sąsiednich krajach, który grzebie w gałęziach i pniach sosen, aby utrudnić transport składników odżywczych i wody22,23,24. Ponadto M. Alternatus sprzyja również inwazji pasożytującego na roślinach nicienia sosnowego (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) jako głównego chrząszcza wektorowego. Inny gatunek pokrewny chrząszcza, M. galloprovincialis, rozpowszechnił węgorka sosnowca w kilku krajach Europy w ostatnich latach25. Wcześniejsze badania wykazały kilka rodzajów naturalnych EPF z Monochamus spp., takich jak Beauveria, Metarhizium i Lecanicillium (Verticillium, nawet dawna nazwa Lecanicillium), w Hiszpanii, Japonii i prowincjach Anhui/Zhejiang w Chinach26,27,28,29. Niemniej jednak wydaje się, że te zbiory EPF są powszechnie ograniczone w pewnym miejscu, w porównaniu z szerokim występowaniem chrząszczy Monochamus na naturalnych polach. Ponieważ chrząszcz M. alternatus ma szerokie rozmieszczenie geograficzne w Chinach, można go uznać za reprezentatywny świdrowiec w celu zbadania większej liczby potencjalnych EPF w różnych populacjach.

W obecnym protokole wprowadzamy specyficzną procedurę badającą EPF z kilku geograficznych populacji M. alternatus w południowych Chinach. W protokole tym wykorzystano modelowego chrząszcza Coleopteran jako substytut do przeprowadzania testów entomopatogeniczności, pod warunkiem, że badany gatunek grzyba ma spójny fenotyp behawioralny dla obu gatunków chrząszczy. Protokół ten może również dostarczyć informacji na temat eksploracji EPF w przypadku innych świdrowców leśnych, w których różnorodność ich entomopatogenicznych gatunków grzybów jest niedoceniana lub mniej zbadana.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja grzybów z M. alternatus (Rysunek 1)

  1. Zbierz próbkę chrząszcza
    1. Zbierz chrząszcze sosnowe M. alternatus przy użyciu pułapek handlowych (patrz tabela materiałów) zanęconych atraktantami przed przewidywanymi okresami pojawienia się populacji chrząszczy w naturalnie zakażonych lasach sosnowych.
      UWAGA: W tym badaniu chrząszcze zebrano z pięciu regionów geograficznych południowych Chin (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). Ustawienie pułapki od góry do dołu jest następujące: okrągły blat (50 cm średnicy), panel w kształcie krzyża (35 cm szerokości i 66 cm długości), lejek (35,5 cm średnicy górnej i 5,5 cm średnicy dolnej okrągłej), kubek zbiorczy (10,5 cm średnicy i 26,5 cm długości). Jako przynętę stosuje się substancje lotne żywiciela (np. etanol i α-pinen) oraz feromon agregacyjny (2-undecyloksy-1-etanol) jako przynętę30.
    2. Oznacz próbkę przed przekazaniem jej do laboratorium. Umieść każdego chrząszcza w osobnych wysterylizowanych rurkach ze świeżymi gałązkami. Wymieniaj gałązki na świeże co 2 dni.
    3. Żywe chrząszcze należy hodować w temperaturze 25 ± 1 °C w nienawilżanym inkubatorze (16-8 cykli L/D) i obserwować je codziennie.
    4. Rejestruj próbki wykazujące zmniejszone karmienie i mobilność. Przenieś martwego M. alternatus, które stają się stwardniałe i sztywne do mokrych komór, aby obserwować wzrost grzybni grzybni i konidii.
      UWAGA: Po zakażeniu przez grzyby entomopatogeniczne chrząszcze wykazywały spadek żerowania i mobilności w początkowej fazie infekcji31,32. Po śmierci ich ciała stawały się stwardniałe i sztywne, a grzybnia i konidia pojawiały się kilka dni po przechowywaniu w wilgotnej komorze33.
    5. Zwłoki chrząszczy z infekcjami grzybiczymi należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy przetworzyć próbki natychmiast w ciągu kilku godzin, aby uniknąć zanieczyszczenia większą ilością grzybów saprotroficznych.
  2. Przygotowanie podłoża wzrostowego
    1. Dodać 39 g sproszkowanego agaru z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) do 1 l czystej wody i sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C.
    2. Schłodzić do temperatury operacyjnej (~50 °C), dodać 0,05 g streptomycyny, 0,05 g penicyliny G i 0,05 g tetracykliny i wstrząsnąć w celu rozprowadzenia pożywki.
    3. Umieść podłoże na szalkach Petriego pod czystą ławą i użyj po zestaleniu.
      UWAGA: Pożywka PDA z antybiotykami służy do izolacji od chrząszczy, co zapobiega rozwojowi bakterii bez wpływu na wzrost grzybów podczas izolacji. Jednak pożywka PDA bez antybiotyków jest używana do codziennej uprawy i konserwacji.
    4. Umieścić 35 g bulionu z dekstrozy ziemniaczanej (PDB) w proszku w 1 l ddH2O i sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Schłodzić do użycia.
  3. Sekcja próbki chrząszcza z objawami infekcji grzybiczej
    1. Przygotuj wysterylizowane nożyczki, skalpele i szpilki do owadów, a następnie pracuj pod czystą ławką z palnikiem alkoholowym.
      UWAGA: Użycie narzędzi preparacyjnych można dostosować do osobistych preferencji. Szpilki do owadów są ostrzejsze niż standardowe igły preparacyjne, a różne specyfikacje mogą zaspokoić potrzebę sekcji.
    2. Rozciąć powłoki ciała chrząszcza za pomocą narzędzi na sterylnych i jednorazowych szalkach Petriego. Uważaj, aby uniknąć możliwego uszkodzenia tkanek jelita środkowego i tylnego, które mogą wydzielać zawartość wewnętrzną.
    3. Podziel ciała chrząszcza na główne pozycje w następujący sposób: czułki, głowa, klatka piersiowa, brzuch, skrzydła (każda para) i nogi.
  4. Oczyszczanie z grzybów
    1. Pokrój powłoki każdej pozycji na małe kawałki nożyczkami. Delikatnie dociśnij zewnętrzną powierzchnię do powierzchni płytek PDA za pomocą antybiotyków.
      UWAGA: Upewnij się, że grzybnia grzybów na powłokach została zaszczepiona na płytce.
    2. Ostrożnie uszczelnić parafilmem i hodować w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C, aż tkanki zostaną dokładnie pokryte grzybnią.
    3. Przenieść pojedyncze kolonie zgodnie z właściwościami fenotypowymi (kolor, kształt) na nowy PDA z antybiotykami do hodowli w temperaturze 25 ± 1 °C.
    4. Powtórzyć krok 1.4.3 dwa lub trzy razy na PDA z antybiotykami, aż czyste kolonie zostaną wyizolowane oddzielnie.
      UWAGA: Jeśli na oryginalnych płytkach rośnie wiele szczepów grzybów, należy dokładnie wybrać grzybnię, aby ułatwić sortowanie większej liczby gatunków grzybów.
  5. Przechowywanie izolatów grzybów
    1. Przenieś bloki agaru (o średnicy ~5 mm) z kolonii na nowe płytki PDA.
    2. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C przez 1-2 tygodnie.
    3. Umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C do codziennego przechowywania do dalszego wykorzystania.
    4. Zaszczepić szczepy grzybów w 50 ml sterylnego PDB w kolbie o pojemności 250 ml, wstrząsając z prędkością 180 obr./min w temperaturze 25 °C przez 5-7 dni.
    5. Zbierz 1 ml świeżo wyhodowanej grzybni grzybów i zawieś ją w 1 ml wysterylizowanego 20% glicerolu w sterylnych probówkach do zamrażania o pojemności 2 ml (końcowe stężenie glicerolu wynosi 10%).
    6. Uszczelnić probówki parafilmem i schłodzić je w temperaturze -20 °C i -40 °C. Następnie utrzymuj probówki w temperaturze -80 °C jako zapasy.

2. Molekularna i morfologiczna identyfikacja izolatów grzybów

  1. Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
    1. Hodowla grzybów w PDB zgodnie z opisem w kroku 1.5.4.
    2. Zbierz grzybnię i przefiltruj ją, aby oddzielić ją od PDB. Homogenizować w ciekłym azocie za pomocą wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka.
    3. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA grzybów zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR w następujący sposób: 25 μl polimerazy DNA Taq, 1 μl matrycy, 2 μl starterów do przodu i do tyłu oraz ddH2O do całkowitej objętości 50 μL.
    2. Amplifikować region rDNA-ITS próbki DNA za pomocą par starterów ITS1 i ITS434 (patrz Tabela 1) zgodnie z następującą procedurą: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 4 minuty, a następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 60 s, wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 60 s, wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min, i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.
    3. Elektroforeza amplifikowanych produktów przy użyciu 1,5% żelu agarozowego przy napięciu 100 V, 100 mA.
    4. Sekwencjonuj PCR.
    5. Wyrównaj sekwencję za pomocą Clustal X2.0 i MEGA 6.0.
      UWAGA: Podczas wyrównywania sekwencji miejsca o niejednoznacznym wyrównaniu są wykluczane, a przerwy są traktowane jako brakujące dane.
    6. Porównaj uzyskaną sekwencję z tymi w bazie danych sekwencji ITS w GenBank za pomocą BLAST na stronie internetowej National Center for Biotechnology Information (NCBI). Wstępnie zidentyfikuj informacje o gatunkach szczepów grzybów.
  3. Identyfikacja morfologiczna
    1. Użyj aparatu, aby uchwycić morfologię dojrzałej czystej kolonii grzybów zarówno na przedniej, jak i na tylnej stronie płytek PDA.
    2. Zerwij konidia z kolonii grzybów czystej kultury za pomocą igły do zaszczepiania i przenieś je na szklane szkiełko z kroplą sterylnej wody.
    3. Przytrzymaj szkiełko nakrywkowe i powoli odłóż je pod kątem ~45°, tak aby szkiełko nakrywkowe mogło przykryć próbkę bez pęcherzyków.
    4. Wytnij skalpelem blok agaru o średnicy5 mm 2 z kolonii na skraju kolonii grzybów i przenieś go do czystego szklanego szkiełka z kroplą sterylnej wody. Ostrożnie rozdziel grzyby cienką igłą, aby zobaczyć konkretne struktury.
    5. Powtórz krok 2.3.3.
    6. Obserwuj bezpłciowy morf grzybów pod mikroskopem optycznym (OM), w tym kształt, przezroczystość i postawę strzępek, konidioforów, fialidów i konidiów. Zapisz i zmierz kształt i rozmiar cech bezpłciowych, aby odróżnić od siebie różne izolaty grzybów.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować możliwość obserwacji struktur grzybowych, użyj plam i podłoża montażowego35.

3. Indukcja objawów infekcji grzybiczej u M. alternatus w celu obserwacji ich fenotypów behawioralnych

  1. Przygotowanie zawiesiny konidialnej
    1. Przygotować 0,01% Tween-80 z czystą wodą i sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 121 °C. Stosować po schłodzeniu.
    2. Dodaj odpowiednią ilość sterylnych małych szklanych kulek i 0,01% roztworu Tween-80 do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
    3. Zeskrob kolonie grzybów do probówki i potrząśnij nią wystarczająco za pomocą wytrząsarki wirowej, aż kolonia zostanie rozbita. Przefiltruj przez dwie warstwy gazy, aby usunąć grzybnię.
      UWAGA: Wytrząsanie odbywa się w celu zapewnienia zawieszenia konidiospor w 0,01% roztworze Tween-80.
    4. Policz liczbę zarodników pod OM za pomocą hemocytometru, dostosuj do 1 × 108 konidiali/ml ze sterylnym 0,01% Tween-80 i utrzymuj w temperaturze 4 °C do użycia.
  2. Przygotowanie chrząszczy
    1. Gałązki sosny (mniej więcej tej samej wielkości) przeksmarować w autoklawie i wysuszyć w piekarniku (~ 60 °C).
    2. Zachowaj zebrane w terenie M. dorosłe osobniki alternatus z gałązkami sosny w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C.
    3. Głodzić chrząszcze przez 24 godziny i wysterylizować powierzchnię chrząszczy wybielaczem, etanolem i wodą destylowaną [10:10:80 (v:v)] przed użyciem.
  3. Indukcja infekcji grzybiczej
    1. Pracuj pod czystą ławką, zanurz gałązki sosny w zawiesinie konidialnej na 10 s i wysusz je na powietrzu.
    2. Zanurz chrząszcze w zawiesinie konidialnej na 10 s, a następnie przenieś do sterylnych probówek o pojemności 50 ml (jeden chrząszcz i jedna gałązka na probówkę). Wymieniaj gałązki na nowe co 2 dni.
    3. W celu kontroli ujemnej należy zmienić zawiesinę konidialną na sterylny 0,01% roztwór Tween-80. Wykonać pięć powtórzeń dla każdego szczepu grzyba i grupy kontrolnej.
    4. Oceń aktywność chrząszczy na podstawie ilości wiórów wytwarzanych na gałązkach sosny. Kiedy karmienie ustaje, uważaj je za martwe.
    5. Przenieś martwe chrząszcze do nowych sterylnych probówek o pojemności 50 ml i umieść kawałek sterylnej, wilgotnej bawełny. Inkubować w temperaturze 25 ± 1 °C.
      UWAGA: Mokrą bawełnę służy do utrzymania wilgotności, ponieważ rozwój grzybów wymaga odpowiedniej wilgotności, ale nie za dużo.
    6. Obserwuj i fotografuj zmianę powierzchni chrząszczy o tej samej porze każdego dnia.
  4. Ponowna izolacja i potwierdzenie gatunków grzybów
    1. Dopóki na powierzchni chrząszczy nie pojawią się wyraźne fenotypy infekcji grzybiczych, zbieraj grzybnię z różnych tkanek indywidualnie na nowe płytki PDA.
    2. Hodowlę w temperaturze 25 ± 1 °C i obserwować, aby upewnić się, że morfologia jest zgodna z morfologią zaszczepionych grzybów.
  5. Leczenie chrząszcza modelowego
    1. Powtórz kroki 3.2.1-3.3.6 na modelu chrząszcza Tribolium castaneum, używając otrębów pszennych jako pokarmu, i wysterylizuj otręby pszenne światłem UV.
    2. Delikatnie dotknij chrząszczy sterylną pęsetą. Załóżmy, że nie żyją, jeśli nie ma odpowiedzi.

4. Potwierdź fenotypy infekcji grzybów na M. alternatus i chrząszczu modelowym

  1. Przygotowanie próbki do obserwacji
    1. Przeprowadź sekcję zainfekowanego M. Alternatus zwłoki ostrożnie, jak w kroku 1.3.
    2. Wybierz T. ciała kacaneum z oczywistymi objawami infekcji grzybiczej.
    3. Wytnij 5-milimetrowe zatyczki dyskowe z czterech dojrzałych kolonii grzybów rosnących na PDA.
  2. Obróbka wstępna próbki
    1. Umieść zatyczki, zakażone tkanki chrząszczy i ciała we wstępnie schłodzonym 2,5% aldehydzie glutarowym w temperaturze 4 °C na 2 dni.
    2. Przemyć próbki trzykrotnie w 0,1% buforze fosforanowym (pH 7,2-7,4) przez 5 minut i odwodnić w 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% etanolu przez 10 minut.
    3. Wysuszyć próbki w liofilizatorze próżniowym.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas całego procesu obróbki wstępnej, w tym cięcia, namaczania, odwadniania, mycia i suszenia, aby zapobiec uszkodzeniu próbki.
  3. Obserwacja w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
    1. Wstępnie poddane obróbce próbki pokryć platyną za pomocą powlekarki napylającej i obserwować pod skaningowym mikroskopem elektronowym36.
    2. Zapisz cechy morfologiczne strzępek i konidiów rosnących na PDA, M. tkanki alternatusa i modelowe ciała chrząszczy.
    3. Porównaj, czy wyniki są zgodne z wynikami w sekcji OM w kroku 2.3.

5. Ocena aktywności entomopatogenicznej

  1. Przygotowanie zawiesiny konidialnej
    1. Przygotowanie zawiesiny konidialnej przebiega tak samo, jak w krokach 3.1.1-3.1.4.
  2. Obróbka wstępna chrząszcza modelowego
    1. Hoduj, karm, sterylizuj i głodz T. Castaneum jak w kroku 3.5.1.
    2. Wysterylizuj otręby pszenne promieniami UV i umieść równą wagę na sterylnych szalkach Petriego.
  3. Test aktywności entomopatogenicznej
    1. Otręby pszenne potraktuj zawiesiną konidialną i wysusz je na powietrzu pod czystą ławką w temperaturze pokojowej.
    2. Zanurz T. chrząszcze kastanowe w zawiesinie konidialnej przez 10 s i przenieść je na szalkę Petriego (n = 20 na każdej szalce Petriego). Zastąp nowe otręby pszenne tym samym zabiegiem konidialnym co 4 dni.
    3. W celu kontroli ujemnej należy stosować tylko sterylny 0,01% roztwór Tween-80.
      UWAGA: Należy odłożyć co najmniej trzy kontrpróby dla każdej grupy badanej i grupy kontrolnej.
    4. Licz martwe chrząszcze codziennie.
      UWAGA: Delikatnie dotykaj chrząszczy sterylną pęsetą. Załóżmy, że nie żyją, jeśli nie ma odpowiedzi.
  4. Wielogenowa analiza filogenetyczna
    1. Wyodrębnić entomopatogeniczny genomowy DNA grzybów zgodnie z opisem w kroku 2.1.
      UWAGA: Identyfikacja wielogenowa jest przeprowadzana dla pasożytniczych EPF, które wykazują znaczące fenotypy infekcji i silne działanie entomopatogeniczne przeciwko modelowemu chrząszczowi.
    2. Amplifikacja następujących genów, w tym regionu obejmującego jądrowy rybosomalny gen SSU34, segment dużego podjednostkowego genu rRNA (LSU37,38), część genu czynnika elongacji 1-alfa (tef-1α39), drugie co do wielkości sekwencje podjednostkowe polimerazy RNA ІІ (rpb240) i część β-tubuliny41, używając par starterów NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R i TUB1/TUB22 (patrz Tabela 1).
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR jak w kroku 2.2.1.
      2. Amplifikację przeprowadzić w następujący sposób: wstępne denaturowanie w temperaturze 95 °C przez 4 minuty, następnie 35 cykli (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cykli (LSU) lub 39 cykli (β-tubulina) denaturacji w temperaturze 94 °C przez 60 s, wyżarzanie w temperaturze 47 °C przez 60 s (LSU), 55 °C przez 60 s (tef-1α), 54 °C przez 40 s (β-tubulina) i 50 °C przez 30 s (rpb2, SSU), wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    3. Uporządkuj i wyrównaj, wykonując te same czynności, jak pokazano w krokach 2.2.4-2.2.5.
    4. Wykonaj analizę filogenetyczną za pomocą MEGA 6.0 w oparciu o metodę maksymalnego prawdopodobieństwa (ML)42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i identyfikacja izolatów grzybów od M. alternatus
Za pomocą pułapek wabiących dużą liczbę (w sumie około 500 chrząszczy) M. Alternatus zebrano z pięciu regionów geograficznych. Pobrano zwłoki chrząszczy z typowymi objawami zakażenia grzybami entomopatogenicznymi; Następnie powłoki ciała każdego chrząszcza zostały wypreparowane w kilku pozycjach, jak opisano w kroku 1.3 protokołu. W rezultacie wyizolowano ponad 600 izolatów grzybów z różnych pozycji ciała. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różne populacje geograficzne FWB mogą rozwijać zróżnicowane interakcje z naturalnymi grzybami entomopatogenicznymi, ze względu na długotrwałą adaptację środowiskową gatunków EPF do lokalnych czynników klimatycznych i specyficznej populacji genotypowej owada żywiciela 44,45. Rozszerzenie miejsc pobierania próbek na wiele regionów występowania owadów pomaga zwiększyć możliwość pozyskiwania różnych szczepów lub gatunków EPF od ich naturalnych żywicieli, jak opisano ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2021YFC2600100) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki wirówkowe 1,5 mL, 2 mlBiosharpBS-15-M
10 µ L końcówki do pipetSangon BiotechF601216
10 & L, 20 i mikro; L, 100 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1,000 i mikro; Pipety LRainin
1 000 µ Końcówki do pipetL Sangon BiotechF630102
2 ml fiolki kriogeniczneCorning430659
20x bufor PBSSangon BiotechB548117-0500
200 µ Końcówki do pipet LSangon BiotechF601227
2,000 bp EkspresTaKaRarSD0531
Probówki 50 mlNest602052
50% roztwór aldehydu glutarowegoSangon BiotechG916054
50x bufor TAESandon, BiotechB548101
6x bufor ładującyTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Bezwodny etanolJkchemicalLB10V37
Biochemia Gabinet uprawowyShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Komercyjne pułapki na chrząszczeFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Imager żelowyBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon Biotech A600232
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkościSigmaD-37520
Garnek do sterylizacji parowej pod wysokim ciśnieniemMettler ToledoJA5003
Alkohol izopropylowyOdczynnik ogólnyG75885B
Barwnik kwasu nukleinowegoSangon BiotechA616696
Mikroskop optyczny, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
HealForceTrident960
Penicylina GMarklinGB15743
Agar z dekstrozą ziemniaczaną, PDAOxoidCM0139
Bulion z dekstrozy ziemniaczanej, PDBSolarbioP9240
StarterySangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Zestaw do szybkiej izolacji genomowego DNA grzybówSangon BiotechB518229
, SEMHitachiS-3400N
StreptomycynaMarklinS6153
TetracyklinaMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Liofilizator próżniowyYamatoDC801
Wytrząsarka wirowaHLDWH-861
β-MerkaptoetanolMarklinM6230
Miernik PCR Skaningowy mikroskop elektronowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles