Method Article

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

DOI:

10.3791/65788

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, 2Ilse Kats Institute for Nanoscale Science & Technology, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Plant Pathology and Microbiology, Faculty of Agriculture, Food and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 4The Scojen institute for synthetic biology, Reichman university

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pożyteczne i probiotyczne bakterie odgrywają istotną rolę w swoich gospodarzach, zapewniając różne korzyści zdrowotne, w tym odporność na choroby zakaźne. Rodzina Lactobacillaceae składa się z bakterii Gram-dodatnich o potwierdzonych właściwościach probiotycznych. W badaniu wykorzystano gatunki Lactobacillaceae jako model w celu wykazania skuteczności wysokoprzepustowej analizy pojedynczej komórki w badaniu agregacji komórek. Nacisk kładziony jest na analizę reakcji tych pożytecznych gatunków na węglowodany proste z diety.

Badanie pokazuje, jak obrazowanie cytometrii przepływowej (IFC) może przezwyciężyć fundamentalne różnice w tworzeniu bakterii probiotycznych w obecności i braku węglowodanów. IFC łączy moc i szybkość konwencjonalnej cytometrii przepływowej z rozdzielczością przestrzenną mikroskopii, umożliwiając wykonywanie złożonych pomiarów morfometrycznych o wysokiej szybkości w zdefiniowany fenotypowo sposób w bibliotece pożytecznych szczepów i warunków bakteryjnych. Protokół ten zapewnia wgląd w automatyczną agregację gatunków Lactobacillaceae i rzuca światło na ich reakcję na węglowodany w diecie, przyczyniając się do zrozumienia mechanizmów stojących za korzystnym działaniem tych bakterii probiotycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoagregacja bakterii jest uważana za podstawowy etap tworzenia biofilmu. W tym procesie (czasami nazywanym również autoaglutynacją lub flokulacją) bakterie tego samego typu tworzą wielokomórkowe grudki, które ostatecznie osiadają na dnie probówek hodowlanych lub przyczepiają się do docelowej tkanki lub powierzchni1.

Autoagregacja jest powszechnie obserwowanym zjawiskiem i do tej pory wykazano je w patogenach Gram-ujemnych, takich jak oportunistyczny patogen Acinetobacter baumannii2, patogen stomatologiczny Aggregobacter actinomycetemcomitans3, oraz p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plik .ast, z szablonem dla Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) jako przykładem, znajduje się w Dodatkowym Pliku Kodowania 1.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotować bulion Lactobacilli MRS zgodnie z instrukcjami producenta (55 g w 1 l wody dejonizowanej) i płytki agarowe Lactobacilli MRS z 1,5% (w/v) agarem (patrz Tabela Materiałów). Po sterylizacji w autoklawie pożywka jest gotowa do użycia bezpośrednio lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować 50% (15 g w 1 l wody dejonizowanej) tryptycznego bulionu sojowego (TSB) (patrz tabela materi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki pokazują, że ta metoda może łatwo zmierzyć różnice w autoagregacji w odpowiedzi na cukry w diecie u bakterii LAB. Oddzielając osobniki od agregatów, metoda pozwala na obliczenie procentu populacji zdarzeń agregacji spośród wszystkich zdarzeń w odpowiedzi na cukry fermentujące lub niefermentujące z diety. Ponadto możliwe było zmierzenie, czy istnieją różnice w średniej wielkości populacji agregatu między terapiami.

Reprezentatywne obrazy w Rysunek 3 pokazuje.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa jest szeroko stosowaną metodą ilościowego określania intensywności fluorescencji w komórkach eukariotycznych, ale może nie zapewniać dokładnych pomiarów dla komórek bakteryjnych ze względu na ich większy rozmiar lub małe agregaty. Czynniki te mogą mieć znaczący wpływ na precyzyjną kwantyfikację autoagregacji i podstawowy poziom tworzenia agregatów w różnych warunkach. Aby rozwiązać ten problem, zastosowano obrazową cytometrię przepływową (IFC), aby uzyskać lepszą rozdzielczość wpływu węglowodanów n.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (Grant 119/16) i IMoh grant (3-15656) dla IKG. R.S. wspierany przez stypendium Kreitmana.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 ml probówkihodowlane Falcon352051
15 ml probówka wirówkowaFalcon352096
Bacto AgarBaeton, Dickinson and Company214010
Bacto Typowy bulion sojowyBaeton, Dickinson and Company211825
D-(+)-GlukozaSigmaG7021-1KG
D-(+)-rafinoza pentahydratSigma83400-25G
Difco Lactobacilli MRS bulionBaeton,Dickinson and Company288130
EASY-LOCK MICROPR. 1,5 ml (Eppendorf)FL medical23053
IDEAS OprogramowanieAmnis/EMD MilliporeN/A  Szczegóły dostępne na stronie: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/A  Szczegóły dostępne pod adresem: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowyOdczynniki FisherBP308-500
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher Scientific, 174,18 g/molBP363-1
Fosforan potasu jednozasadowySigma, 136,09 g/molP0662-500G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. Bacterial autoaggregation. AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).
  2. Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating hig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Imaging Flow CytometryMicrobial AutoaggregationLactobacillaceae SpeciesProbiotic BacteriaSingle Cell AnalysisDietary CarbohydratesHigh Throughput ImagingAggregate Size DistributionBright Field MicroscopyCell Aggregation

Related Articles