Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Komórki trz β ustkowe produkują i wydzielają insulinę, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne, a dysfunkcja komórek β jest odpowiedzialna za hiperglikemię i początek cukrzycy zarówno w cukrzycy typu 1, jak i typu 2. Komórki β łączą metabolizm glukozy z wydzielaniem insuliny poprzez energetykę mitochondrialną i produkcję metaboliczną, które zależą od rezerwy funkcjonalnej masy mitochondrialnej^1,2,3. Aby utrzymać optymalne funkcjonowanie komórek β, komórki β polegają na mechanizmach kontroli jakości mitochondriów w celu usunięcia starych lub uszkodzonych mitochondriów i zachowania funkcjonalnej masy mitochondrialnej⁴. Selektywna autofagia mitochondrialna, znana również jako mitofagia, jest kluczowym elementem szlaku kontroli jakości mitochondriów.

Oceny mitofagii w żywych komórkach często opierają się na zmianach pH mitochondriów, które zachodzą podczas mitofagii. Mitochondria mają lekko zasadowe pH, a zdrowe mitochondria zwykle znajdują się w cytozolu o neutralnym pH. Podczas mitofagii uszkodzone lub dysfunkcyjne mitochondria są selektywnie włączane do autofagosomów i ostatecznie usuwane w kwaśnych lizosomach⁵. Kilka transgenicznych modeli myszy reporterowych mitofagii in vivo, takich jak mt-Keima⁶, mitoQC⁷ i CMMR⁸, a także transfekcyjne sondy mitofagii, takie jak Cox8-EGFP-mCherry plasmid⁹, wykorzystuje tę zmianę pH do zapewnienia ilościowej oceny mitofagii. Wykorzystanie myszy transgenicznych z ekspresją wrażliwej na pH sondy metrycznej mt-Keima o podwójnym współczynniku wzbudzenia zostało zoptymalizowane pod kątem oceny mitofagii w wyspach trzustkowych i komórkach β za pomocą cytometrii przepływowej^10,11. Stosunek emisji długości fali mt-Keima kwasowej do obojętnej (stosunek wzbudzenia kwasowego 561 nm do obojętnego 480 nm) można wykorzystać do solidnego ilościowego określenia mitofagii^6,12.

Ten protokół opisuje zoptymalizowane podejście do oceny strumienia mitofagii w pierwotnych wyspach trzustkowych i komórkach β wyizolowanych od transgenicznych myszy mt-Keima^10,11. Chociaż mt-Keima jest bardzo czułą sondą, wymaga albo skomplikowanych schematów hodowli zwierząt, albo transfekcji komórek, co często może być wyzwaniem w przypadku pracy w połączeniu z innymi modelami genetycznymi lub z pierwotnymi ludzkimi wyspami trzustkowymi. Ponadto zastosowanie wielu laserów fluorescencyjnych i detektorów do identyfikacji obojętnych i kwaśnych populacji komórek może ograniczyć kombinatoryczne zastosowanie innych reporterów fluorescencyjnych.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, ten protokół opisuje również komplementarną, jednokanałową metodę opartą na barwniku do solidnego wykrywania mitofagii w β-komórkach z izolowanych mysich wysp trzustkowych. Podejście to, określane jako metoda MtPhagy, wykorzystuje kombinację trzech barwników przepuszczalnych dla komórek do selekcji komórek β, ilościowego określenia populacji komórek aktywnie przechodzących mitofagię i jednoczesnej oceny potencjału błony mitochondrialnej (MMP lub Δψm).

Pierwszym z tych barwników jest Fluozin-3-AM, przepuszczalny dla komórek wskaźnik Zn²⁺ o Ex/Em 494/516 nm¹³. Mysie wyspy trzustkowe stanowią niejednorodną populację funkcjonalnie odrębnych komórek, w tym komórek α-, β-, δ- i PP. Komórki β stanowią około 80% komórek w mysiej wyspie trzustkowej i można je odróżnić od innych typów komórek wysp trzustkowych ze względu na ich wysokie stężenie Zn²⁺ w ziarnistościach insuliny^14,15, co pozwala na identyfikację komórek β jako populacji^{o wysokiej zawartości} Fluozyny-3-AM. Barwnik MtPhagy, barwnik wrażliwy na pH, który jest unieruchomiony w mitochondriach za pomocą wiązania chemicznego i emituje słabą fluorescencję, jest również stosowany w tym protokole¹⁶. Po indukcji mitofagii uszkodzone mitochondria są włączane do kwaśnego lizosomu, a barwnik MtPhagy zwiększa swoją intensywność fluorescencji w środowisku o niskim pH (Ex/Em 561/570-700 nm).

Dodatkowo, Tetramethylrhodamine, ester etylowy (TMRE), jest używany do oceny MMP. TMRE jest przepuszczalnym dla komórek dodatnio naładowanym barwnikiem (Ex/Em 552/575 nm), który jest sekwestrowany przez zdrowe mitochondria ze względu na względny ładunek ujemny podtrzymywany przez ich potencjał błonowy¹⁷. Uszkodzone lub niezdrowe mitochondria rozpraszają swój potencjał błonowy, co skutkuje zmniejszoną zdolnością do sekwestracji TMRE. Wykorzystując te barwniki razem, β-komórki poddawane mitofagii można zidentyfikować^{jako populację} o^{wysokim poziomie}Fluozin, MtPhagy^{i wysokim}TMRE, za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ mitofagia jest procesem dynamicznym, a nie statycznym, protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny strumienia mitofagii przy użyciu walinomycyny, jonoforu K⁺, który indukuje mitofagię po rozproszeniu MMP¹⁸. Porównanie mitofagii w obecności i braku walinomycyny pozwala na ocenę strumienia mitofagii w różnych grupach próbek.

Oparty na barwniku charakter obecnego podejścia pozwala na ekstrapolację go na ludzkie wyspy trzustkowe i inne trudne do transfekcji typy komórek i omija potrzebę skomplikowanych schematów hodowli zwierząt, w przeciwieństwie do protokołu mt-Keima. Nadrzędnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie mitofagii w komórkach β na poziomie pojedynczej komórki za pomocą dwóch niezależnych metod opartych na cytometrii przepływowej. Podsumowując, protokół ten opisuje dwie potężne i uzupełniające się metody, które pozwalają zarówno na precyzję, jak i elastyczność w ilościowym badaniu kontroli jakości mitochondriów.

Badania na zwierzętach przedstawione w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Do tego badania wykorzystano dwudziestotygodniowe samce myszy C57BL / 6J, na 15-tygodniowej regularnej diecie tłuszczowej (RFD) lub diecie wysokotłuszczowej (HFD).

1. Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwniku (Metoda 1)

1. Przygotowanie i leczenie mysich wysepek
   1. Wykonaj hodowlę wysp trzustkowych i ekspozycję na walinomycynę, wykonując poniższe czynności.
      1. Wyizoluj wysepki z regularnej diety tłuszczowej (RFD) lub diety wysokotłuszczowej (HFD, 60 kcal% Fat¹⁹) myszy, postępując zgodnie z wcześniej opisanymi metodami^2,10.
      2. Próbki wysepek trzustkowych hodować przez noc w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI uzupełnione 100 jednostkami/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (patrz tabela materiałów). Podłoże to będzie określane jako "podłoże wysepkowe".
      3. Za pomocą pipety pobrać 100 wysepek na 6-centymetrowe szalki Petriego w 2 ml pożywki z wysepek.
         UWAGA: Warunki zastosowane w tym protokole: (1) Niebarwiona kontrola: niebarwione wysepki RFD; (2) Kontrola tylko DAPI: wysepki RFD barwione DAPI; (3) Kontrola tylko Fluozyna-3-AM: wysepki RFD barwione Fluozyną-3-AM; (4) Kontrola tylko MtPhagy: wysepki RFD barwione MtPhagy; (5) Kontrola tylko TMRE: wysepki RFD barwione TMRE; (6) RFD nieleczone: wysepki RFD barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (7) Wysepki RFD narażone na działanie walinomycyny: Wysepki RFD wystawione na działanie walinomycyny i barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (8) HFD nieleczone: wysepki HFD barwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI; (9) Wysepki HFD narażone na działanie walinomycyny: Wysepki HFD wystawione na działanie walinomycyny i wybarwione MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI.
      4. W warunkach (7) i (9) (patrz UWAGA powyżej) narażonych na walinomycynę, dodać 2 μl 250 nΜ walinomycyny (patrz tabela materiałów) do wysepek na szalce Petriego przez 3 godziny w celu wywołania mitofagii.
   2. Wykonaj dysocjację pojedynczej komórki.
      1. Po 3 godzinach ekspozycji na walinomycynę pobrać 100 wysepek z każdego stanu do oddzielnych probówek do mikrowirówek za pomocą pipety.
      2. Obracać wysepki w temperaturze 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
      3. Próbki przemywać 2x 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), z etapami wirowania (350 x g/1 min, 10 °C) między każdym płukaniem. Po każdym przemyciu wyrzucić sklarowany osad pipetą.
      4. Aby rozdzielić wyspy trzustkowe na pojedyncze komórki, dodaj 500 μl 0,05% trypsyny (wstępnie podgrzanej do 37 °C) do probówki mikrowirówkowej jednej próbki, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu wysp. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aż wysepki zostaną widocznie rozproszone.
      5. Natychmiast dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki z wysepek, aby zneutralizować trypsynę. Powtórz trypsynizację i neutralizację dla każdej próbki, pojedynczo.
      6. Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu.
         UWAGA: Osad będzie delikatny w przypadku próbek wystawionych na działanie walinomycyny.
      7. Przemyj próbki 2x pożywką RPMI, bez czerwieni fenolowej, uzupełnioną 100 jednostkami/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Medium to będzie określane jako "medium przepływowe z wysepek". Uwzględnij etapy wirowania (350 x g/1 min, 10 °C) między każdym praniem. Po każdym przemyciu wyrzucić sklarowany osad pipetą.
   3. Wybarwić komórki za pomocą MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM i DAPI, aby przygotować się do cytometrii przepływowej.
      1. Zawiesić próbki wysepek w 500 μl pożywki przepływowej z wysepek.
      2. Dodaj 0,25 μl 100 μM materiału MtPhagy (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik MtPhagy (warunki 4, 6, 7, 8 i 9, UWAGA do kroku 1.1.1).
      3. Dodaj 0,25 μl 100 μM zapasu TMRE (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik TMRE (warunki 5, 6, 7, 8 i 9).
      4. Dodaj 0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM (patrz Tabela materiałów) do probówek otrzymujących barwnik Fluozyna-3-AM (warunki 3, 6, 7, 8 i 9).
      5. Wiruj rurki z niską prędkością przez 5 sekund, aby wymieszać.
      6. Owinąć probówki do mikrowirówek folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W połowie inkubacji probówki wirować z niską prędkością przez 5-10 sekund, aby się wymieszać.
      7. Po inkubacji odwirować próbki o masie 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.
      8. Zawiesić próbki w podłożu przepływowym o objętości 500 μl. Dodać 0,2 μg/ml DAPI (patrz Tabela materiałów) do warunków 2, 6, 7, 8 i 9.
      9. Wirować próbki w temperaturze 350 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić w 500 μl pożywki przepływającej na wysepkach.
      10. Umieść próbki na lodzie.
2. Cytometria przepływowa
   1. Uruchom przyrząd (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Każdy cytometr przepływowy z odpowiednimi filtrami będzie działał. W pracy wykorzystano następujące filtry: (1) VL1 dla DAPI: wzbudzenie/emisja - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 dla fluozyny-3-AM: wzbudzenie/emisja - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 dla barwnika MtPhagy: wzbudzenie/emisja - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 dla TMRE: wzbudzenie/emisja - 561 nm/585 nm (16 nm).
   2. Dostosuj napięcia dla rozproszenia do przodu (FSC) i bocznego (SSC), aby upewnić się, że populacje komórek znajdują się w środku wykresu punktowego. W przypadku tego protokołu zastosowano napięcia 120 V dla FSC i 260 V dla SSC, aby zapewnić równomierne opadanie ogniw w FSC-A vs. Wykres SSC-A (Rysunek 1A).
   3. Aby wykluczyć komórki inne niż pojedyncze, dodaj bramkę prostokątną na FSC-H vs. FSC-W, a następnie SSC-H vs. SSC-W (Rysunek 1B,C).
   4. Dostosuj napięcia i kompensację DAPI, aby filtrować pod kątem ogniw β pod napięciem. Ustaw bramki fluorescencyjne dla każdego użytego fluoroforu na podstawie niebarwionej próbki RFD (Rysunki 1D-F).
      UWAGA: Napięcia używane dla każdego kanału: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.
   5. Po ustanowieniu bramek zbierz 10 000 zdarzeń na próbkę.
      UWAGA: Wykorzystując to podejście do bramkowania, poziomy mitofagii w warunkach podstawowych i po indukcji walinomycyny oceniano zarówno w wysepkach RFD, jak i HFD (Ryc. 2).
   6. Zapisywanie danych jako plików FCS do analizy.

2. Ocena mitofagii za pomocą genetycznie kodowanego reportera mt-Keima (Metoda 2)

1. Przygotowanie mysich wysp trzustkowych i dysocjacja pojedynczych komórek
   1. Wykonaj hodowlę wysp trzustkowych i ekspozycję na walinomycynę, wykonując poniższe czynności.
      1. Wyizoluj wyspy trzustkowe od myszy typu dzikiego (WT) i mt-Keima/+ (mt-Keima)⁶. W tej metodzie wykorzystano 20-tygodniowe samce myszy RFD karmione WT lub mt-Keima/+
      .
      2. Hodować próbki wysepek przez noc w temperaturze 37 °C w pożywce z wysepek.
      3. Za pomocą pipety pobierz 100 wysepek na 6-centymetrowe szalki Petriego z 2 ml pożywki dla wysepek.
         UWAGA: Warunki zastosowane w tym protokole: (1) Niebarwiona kontrola: Niebarwione wysepki WT; (2) Kontrola tylko DAPI: wysepki WT barwione DAPI; (3) Kontrola tylko Fluozyna-3-AM: wysepki WT barwione Fluozyną-3-AM; (4) Tylko kontrola mt-Keima: niebarwione wysepki mt-Keima/+; (5) Nieleczone: wysepki mt-Keima/+ barwione Fluozin-3-AM i DAPI; (6) Walinomycyna: wysepki mt-Keima/+ wystawione na działanie walinomycyny i barwione Fluozyną-3-AM i DAPI.
      4. W przypadku warunku (6) z ekspozycją na walinomycynę, dodać 2 μl 250 nM bulionu walinomycyny do wysepek na szalce Petriego przez 3 godziny w celu wywołania mitofagii.
   2. Wykonaj dysocjację pojedynczej komórki.
      1. Wykonaj kroki dysocjacji pojedynczej komórki, jak opisano w kroku 1.1.2.
   3. Wybarwiaj komórki za pomocą Fluozin-3-AM i DAPI.
      1. Zawiesić próbki wysepek w 500 μl pożywki przepływowej z wysepek.
      2. Dodaj 0,25 μl 1 mM bulionu Fluozin-3-AM do probówek otrzymujących barwnik Fluozin-3-AM (warunki 3, 5 i 6).
      3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i przystąpić do poddawania działaniu DAPI, jak opisano w krokach 1.1.3.5-1.3.10.
2. Cytometria przepływowa
   1. Uruchom instrument. Będzie działał każdy cytometr przepływowy z odpowiednimi filtrami.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano następujące filtry: (1) VL1 dla DAPI: Wzbudzenie/Emisja - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 dla fluozyny-3-AM: wzbudzenie/emisja - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 dla neutralnego mt-Keima: wzbudzenie/emisja - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 dla kwasu mt-Keima: wzbudzenie/emisja - 561 nm/620 nm (15 nm).
   2. Dostosuj napięcia FSC i SSC i wyklucz ogniwa inne niż pojedyncze, jak opisano w krokach 1.2.2-1.2.3 (Rysunki 3A-C).
   3. Dostosuj napięcia i kompensację dla DAPI, Fluozin-3-AM i mt-Keima za pomocą niebarwionych i jednododatnich kontroli (warunki 1-4), aby upewnić się, że populacje komórek fluorescencyjnie dodatnich są możliwe do odróżnienia od komórek niebarwionych. Po zastosowaniu odpowiedniej kompensacji do każdego kanału, ustaw bramkę ujemną DAPI i bramki dodatnie Fluozin-3-AM, aby filtrować żywe komórki β (Rysunki 3D-E).
   4. Ustaw schemat bramkowania trójkąta, używając dodatniej próbki mt-Keima (warunek 4), aby zidentyfikować kwaśne i obojętne populacje komórek (Rysunek 3F).
      UWAGA: Napięcia zwykle używane dla każdego kanału: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.
   5. Po ustanowieniu bramek zbierz 10 000 zdarzeń na próbkę. Schematy bramkowania dla warunków 5 i 6 są zilustrowane w Rysunek 3A-G.
   6. Zapisywanie danych jako plików FCS do analizy.

Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwniku
To podejście oparte na barwniku zostało zoptymalizowane pod kątem analizy strumienia mitofagii w pierwotnych komórkach β myszy bez potrzeby stosowania reportera genetycznego, przy użyciu Fluozin-3-AM, TMRE i MtPhagy, a także DAPI w celu wykluczenia martwych komórek. Łącząc te barwniki z walinomycyną w celu wywołania mitofagii, protokół ten przedstawia metodę opartą na barwniku do selektywnego pomiaru strumienia mitofagii w pierwotnych komórkach β myszy 18. W przypadku danych pokazanych przy użyciu tej metody MtPhagy, zarówno podstawowa, jak i indukowana walinomycyną mitofagia została przeanalizowana w wysepek wyizolowanych z regularnej diety tłuszczowej (RFD) lub diety wysokotłuszczowej (HFD, 60 kcal% tłuszczu) karmionych myszami w celu oceny wpływu stresu metabolicznego na przepływ mitofagii. Aby zidentyfikować populację będącą przedmiotem zainteresowania, komórki bramkowano przy użyciu nieleczonych wysepek RFD. Napięcia FSC i SSC zostały najpierw dostosowane, aby uzyskać równomierny rozkład ogniw na wykresie SSC-A vs. FSC-A (Rysunek 1A). Aby wybrać pojedyncze komórki, zarówno FSC-H, jak i FSC. FSC-W oraz SSC-H vs. Wykorzystano wykresy SSC-W, na których multiplety zostały wykluczone ze względu na ich większą szerokość wartości sygnału w porównaniu z pojedynczymi komórkami (Rysunek 1B,C). Następnie wybrano komórki DAPI-ujemne, aby wykluczyć martwe komórki20 (Rysunek 1D). Po ustaleniu bramek pierwotnych, wykorzystano pojedyncze barwione kontrole do ustalenia bramek fluorescencyjnych dla Fluozin-3-AM, MtPhagy i TMRE (Rysunek 1E-G), a także kontrole kompensacyjne dla wielokolorowej fluorescencyjnej cytometrii przepływowej.

Po ustaleniu tych bramek pierwotnych i fluorescencyjnych, β-komórki o wysokim wykorzystaniu mitofagii zostały zdefiniowane jako populacja owysokimpoziomie MtPhagy iniskimTMRE w kwadrancie 3 (Q3) przy użyciu RFD bez ekspozycji na walinomycynę (Rysunek 1H). Korzystając z tej strategii bramkowania, scharakteryzowano podstawowe i indukowane walinomycyną poziomy mitofagii zarówno w wysepkach RFD, jak i HFD (Rysunek 2). Aby określić ilościowo strumień mitofagii, podstawowy vs. Poziomy mitofagii indukowanej walinomycyną porównano przy użyciu następującego stosunku:

Korzystając z tego stosunku, strumień mitofagii został określony ilościowo i porównany w RFD vs. HFD β komórek do oceny różnic w mitofagii po indukcji otyłości i insulinooporności obwodowej. Kwantyfikacja strumienia mitofagii w RFD vs. Próbki HFD są pokazane w Rysunek 2E. Wynik ten podkreśla wykonalność tego testu do ilościowego określenia mitofagii w komórkach β przy użyciu prostego podejścia opartego na barwniku. Metoda ta może być również stosowana w ludzkich wyspach trzustkowych, trudnych do transfekcji komórkach i wyizolowanych ze złożonych modeli genetycznych, w których krzyżowanie z modelem transgenicznym mt-Keima byłoby kłopotliwe.

Ocena mitofagii za pomocą genetycznie kodowanego reportera mt-Keima
Mt-Keima jest białkiem fluorescencyjnym o podwójnym wzbudzeniu połączonym z sekwencją lokalizacyjną Cox8, która umożliwia jego skierowanie do wewnętrznej błony mitochondrialnej. Bimodalna właściwość fluorescencyjna mt-Keima pozwala na zmianę widm wzbudzenia z neutralnej (405 nm) na kwaśną (561 nm), w zależności od pH przedziału wewnątrzkomórkowego6. Umożliwia to solidną ratiometryczną analizę fluorescencyjną mitofagii, w której wzrost stosunku kwasów do obojętnych wskazuje na indukcję mitofagii. W tym protokole Fluozin-3-AM został również wykorzystany do selekcji komórek β za pomocą cytometrii przepływowej. W tych reprezentatywnych badaniach przepływ mitofagii oceniano przy użyciu wysepek wyizolowanych od myszy karmionych dietą RFD10,11. Napięcia FSC i SSC zostały najpierw dostosowane, aby uzyskać równomierny rozkład ogniw na SSC-A vs. Wykres FSC-A (Rysunek 3A). Aby wybrać pojedyncze komórki, zarówno FSC-H, jak i FSC. FSC-W oraz SSC-H vs. Użyto wykresów SSC-W, gdzie multiplety zostały wykluczone ze względu na ich większą szerokość wartości sygnału w porównaniu z pojedynczymi komórkami ( Rysunek 3B, C). Napięcie i strategię bramkowania dla DAPI i Fluozin-3-AM określono przy użyciu pojedynczo barwionych wysepek (Rysunek 3D, E). Bramki trójkątne dla populacji kwaśnych i obojętnych zostały następnie zidentyfikowane przy użyciu próbki dodatniej mt-Keima bez ekspozycji na walinomycynę (Rysunek 3F).

Po ustaleniu tych bramek pierwotnych i fluorescencyjnych, strumień mitofagii został oceniony za pomocą podstawowych i wywołanych przez walinomycynę zmian we fluorescencji mt-Keima (Rysunek 3F,G). Aby określić ilościowo strumień mitofagii, mitofagia podstawowa vs. Stężenia indukowane walinomycyną porównano przy użyciu następującego stosunku:

Korzystając z tego stosunku, strumień mitofagii został określony ilościowo w komórkach RFD. Kwantyfikacja tego wyniku jest pokazana w Rysunek 3H. Co ważne, wyniki te są porównywalne z wynikami dla wysepek RFD wygenerowanych przy użyciu podejścia MtPhagy (Rysunek 3H).

Rysunek 1: Schemat bramkowania dla metody MtPhagy. (A) Wykres przepływu przedstawiający schemat bramkowania do wyboru dla wszystkich komórek. (B) Bramkowanie w celu wyboru podkoszulków na podstawie FSC-H vs. FSC-W i (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Bramkowanie dla komórek DAPI-ujemnych w celu wykluczenia martwych komórek. (E) Bramkowanie dlakomórek o wysokiej zawartości Fluozyny-3-AM w celu wybrania komórek β. (F) Schemat bramkowania dla barwnika MtPhagy w celu identyfikacjipopulacji komórek o wysokiej iniskiej zawartości MtPhagy. (G) Schemat bramkowania dla TMRE w celu identyfikacji populacji komóreko wysokim iniskim TMRE. (H) Schemat bramkowania kwadrantowego ustalony z nieleczonymi wysepkami RFD w celuidentyfikacji komórek o wysokimpoziomie MtPhagy iwysokimTMRE Fluozin w kwadrancie 3 (Q3) jako komórek β przechodzących mitofagię. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ocena różnic strumienia mitofagii w komórkach myszy β po stresie metabolicznym przy użyciu schematu bramkowania MtPhagy. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej (A) nieleczonych komórek β RFD, (B) nieleczonych komórek β HFD, (C) komórek β RFD narażonych na działanie walinomycyny i (D) komórek β HFD narażonych na działanie walinomycyny. (E) Kwantyfikacja strumienia mitofagii w komórkach β, obliczona przy użyciustosunku komórek o wysokimpoziomie TMRE MtPhagy narażonych na walinomycynędo komórek MtPhagyo wysokimTMRE nienarażonych na walinomycynę, zarówno dla próbek RFD, jak i HFD. *p < 0,05 w niesparowanym teście t-Studenta. n = 3/grupę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat bramkowania dla metody mt-Keima i porównanie obu metod. (A) Wykres przepływu przedstawiający schemat bramkowania do wyboru dla wszystkich komórek. (B) Bramkowanie w celu wyboru podkoszulków na podstawie FSC-H vs. FSC-W i (C) SSC-H vs. SSC-W. (D) Bramkowanie dla komórek DAPI-ujemnych w celu wykluczenia martwych komórek. (E) Bramkowanie dlakomórek o wysokiej zawartości Fluozyny-3-AM w celu wybrania komórek β. (F) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej komórek niepoddanych działaniu mt-Keima/+ i (G) komórek mt-Keima/+ narażonych na działanie walinomycyny. (H) Kwantyfikacja strumienia mitofagii w komórkach β od myszy karmionych RFD, obliczona przy użyciu stosunku komórek kwaśnych/obojętnych wystawionych na działanie walinomycyny do stosunku komórek kwaśnych/obojętnych nienarażonych na walinomycynę przy użyciu metody mt-Keima i porównana z metodą MtPhagy (dane dla protokołu MtPhagy pierwotnie pokazane w Rysunek 2E). n = 3/grupę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SAS otrzymał dofinansowanie od Ono Pharmaceutical Co., Ltd. i jest konsultantem Novo Nordisk.