Uzupełniające podejścia do badania strumienia mitofagii w komórkach β trzustki

Summary

Ten protokół przedstawia dwie metody analizy ilościowej mitofagii w komórkach β trzustki: pierwsza, kombinacja przepuszczalnych dla komórek barwników specyficznych dla mitochondriów, a druga, genetycznie kodowany reporter mitofagii. Te dwie techniki są komplementarne i mogą być wdrażane w zależności od konkretnych potrzeb, co pozwala na elastyczność i precyzję w ilościowym podejściu do kontroli jakości mitochondriów.

Abstract

Mitofagia to mechanizm kontroli jakości niezbędny do utrzymania optymalnej funkcji mitochondriów. Dysfunkcyjna mitofagia komórek β powoduje niewystarczające uwalnianie insuliny. Zaawansowane ilościowe oceny mitofagii często wymagają użycia reporterów genetycznych. Mysi model mt-Keima, który wyraża ukierunkowaną na mitochondria sondę ratiometryczną o podwójnym wzbudzeniu pH, do ilościowego określania mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej, został zoptymalizowany w komórkach β. Stosunek emisji długości fal mt-Keima z kwasowości do obojętności można wykorzystać do solidnego ilościowego określenia mitofagii. Jednak korzystanie z reporterów mitofagii genetycznej może być trudne podczas pracy ze złożonymi genetycznymi modelami myszy lub trudnymi do transfekcji komórkami, takimi jak pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe. Protokół ten opisuje nowatorską, komplementarną metodę opartą na barwniku do ilościowego oznaczania mitofagii komórek β w pierwotnych wyspach trzustkowych za pomocą MtPhagy. MtPhagy to wrażliwy na pH, przepuszczalny dla komórek barwnik, który gromadzi się w mitochondriach i zwiększa intensywność fluorescencji, gdy mitochondria znajdują się w środowiskach o niskim pH, takich jak lizosomy podczas mitofagii. Łącząc barwnik MtPhagy z Fluozin-3-AM, wskaźnikiem Zn^{2 +}, który selekcjonuje komórki β, oraz estrem etylowym tetrametylorodaminy (TMRE) w celu oceny potencjału błony mitochondrialnej, strumień mitofagii można określić ilościowo specyficznie w komórkach β za pomocą cytometrii przepływowej. Te dwa podejścia są wysoce komplementarne, co pozwala na elastyczność i precyzję w ocenie kontroli jakości mitochondriów w wielu modelach β-komórkowych.

Introduction

Komórki trz β ustkowe produkują i wydzielają insulinę, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne, a dysfunkcja komórek β jest odpowiedzialna za hiperglikemię i początek cukrzycy zarówno w cukrzycy typu 1, jak i typu 2. Komórki β łączą metabolizm glukozy z wydzielaniem insuliny poprzez energetykę mitochondrialną i produkcję metaboliczną, które zależą od rezerwy funkcjonalnej masy mitochondrialnej^1,2,3. Aby utrzymać optymalne funkcjonowanie komórek β, komórki β polegają na mechanizmach kontroli jakości mitochondriów w celu usunięcia starych lub uszkodzonych mitochondriów i zac....

Protocol

Badania na zwierzętach przedstawione w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Michigan. Do tego badania wykorzystano dwudziestotygodniowe samce myszy C57BL / 6J, na 15-tygodniowej regularnej diecie tłuszczowej (RFD) lub diecie wysokotłuszczowej (HFD).

1. Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwniku (Metoda 1)

1. Przygotowanie i leczenie mysich wysepek
   1. Wykonaj hodowlę wysp trzustkowych i ekspozycję na walinomycynę, wykonując poniższe czynności.
      1. Wyizoluj wysepki z regularnej diety tłuszczowej (RFD) lub diet....

Results

Ocena mitofagii za pomocą metody MtPhagy opartej na barwniku
To podejście oparte na barwniku zostało zoptymalizowane pod kątem analizy strumienia mitofagii w pierwotnych komórkach β myszy bez potrzeby stosowania reportera genetycznego, przy użyciu Fluozin-3-AM, TMRE i MtPhagy, a także DAPI w celu wykluczenia martwych komórek. Łącząc te barwniki z walinomycyną w celu wywołania mitofagii, protokół ten przedstawia metodę opartą na barwniku do selektywnego pomiaru strumienia mitofagii w pierwotnych komór.......

Discussion

W protokole tym opisano dwie uzupełniające się metody ilościowego określania strumienia mitofagii w zdysocjowanych pierwotnych wyspach trzustkowych myszy. Stosując metodę mt-Keima, wzrost mitofagii określono ilościowo jako zwiększony stosunek komórek kwaśnych (561 nm) / obojętnych (405 nm), podczas gdy w metodzie MtPhagy zwiększony strumień mitofagii określono ilościowo jako wzrost^{populacji komórek o wysokiej}zawartości Fluozin MtPhagy^{o wysokim}TMRE. Metody te pozwalają na szybką, ilościową.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Technologie życia	15240-062
Cytometr przepływowy Attune NxT	Thermofisher Scientific	A24858
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	317275
Szok cieplny bez kwasów tłuszczowych Proszek BSA	Equitech	BAH66
Płodowa surowica bydlęca	Gemini Bio	900-108
Fluozyna-3AM	Thermofisher Naukowy	F24195	100 μ g Proszek Fluozin-3AM rozpuszczony w 51 μ L DMSO oraz 51 μ L Pluronic F-127 do osiągnięcia 1 mM kolby.
Gibco  RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy barwnik	Dojindo	MT02-10	5 μ g Proszek MtPhagy rozpuszczony z 50 μ L DMSO, aby osiągnąć 100 μ M zapasów.
Barwnik MtPhagy	Dojindo	MT02-10
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Roztwór stosowany w prokotolu przez rozcieńczenie 1:10 w ddH2O
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Roztwór stosowany w prokotolu przez rozcieńczenie 1:10 w ddH2O
Pirogronian sodu (100x)	Życie Technologie	11360-070	5 μ g Proszek MtPhagy rozpuszczony z 50 μ L DMSO, aby osiągnąć 100 μ M zapasów.
TMRE [Tetrametylorodamina, ester etylowy, nadchloran]	Anaspec	AS-88061	Proszek TMRE odtworzony w DMSO do osiągnięcia 100 μ M zapasów.
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Proszek walinomycyny odtworzony w DMSO, aby osiągnąć 250 nM zapasu.