Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65791

⸱

21 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency Department, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Haematology, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 4Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje szybką i skuteczną metodę analizy składników komórkowych skrzepów krwi w mózgu poprzez rozpuszczanie skrzepów, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi.

Streszczenie

Zakrzepica mózgu, zakrzep krwi w tętnicy lub żyle mózgowej, jest najczęstszym rodzajem zawału mózgu. Badanie składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu jest ważne dla diagnozy, leczenia i rokowania. Jednak obecne podejścia do badania składników komórkowych skrzepów opierają się głównie na barwieniu in situ, które nie nadaje się do kompleksowego badania składników komórkowych, ponieważ komórki są ciasno owinięte w skrzepy. Wcześniejsze badania z powodzeniem wyizolowały enzym fibrynolitytyczny (sFE) z Sipunculus nudus, który może bezpośrednio degradować usieciowaną fibrynę, uwalniając składniki komórkowe. W badaniu tym opracowano kompleksową metodę opartą na sFE do badania składników komórkowych skrzepliny mózgowej. Protokół ten obejmuje rozpuszczanie skrzepu, uwalnianie komórek, barwienie komórek i rutynowe badanie krwi. Zgodnie z tą metodą składniki komórek można badać ilościowo i jakościowo. Przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentów przeprowadzonych przy użyciu tej metody.

Wprowadzenie

Choroba naczyniowo-mózgowa jest jedną z trzech głównych chorób, które mogą zagrażać zdrowiu ludzkiemu, wśród których niedokrwienna choroba naczyniowa mózgu stanowi ponad 80%. Zakrzepica mózgu i zakrzepica żył mózgowych są obecnie najbardziej niepokojącymi chorobami niedokrwiennymi naczyń mózgowych, głównie spowodowanymi przez zakrzepy krwi mózgowej1,2. Jeśli leczenie nie zostanie przeprowadzone prawidłowo, będzie miało wysoki wskaźnik niepełnosprawności i śmiertelności oraz wysoki wskaźnik nawrotów po wypisie ze szpitala3.

Ostatnio, rosnąca liczba badań wykazała, że składniki komórkowe zakrzepów krwi w mózgu są ściśle skorelowane z diagnozą, leczeniem i rokowaniem zakrzepicy mózgu4,5,6. Dlatego dostępność danych dotyczących składu skrzepliny, zwłaszcza składników komórek, jest ważna dla diagnozy klinicznej i leczenia. Niestety, obecnie dostępne metody nie są w stanie kompleksowo przeanalizować składnika skrzepu krwi pod względem ilościowym i jakościowym. Na przykład, barwienie in situ oparte na Martius Scarlett Blue może badać tylko czerwono-białe krwinki niektórych wycinków skrzepu7. Barwienie in situ oparte na immunohistochemii (IHC) może badać tylko ograniczone składniki krwi niektórych wycinków skrzepu przy użyciu ich przeciwciał8. Metody mikroskopowe oparte na obrazach dotyczą tylko specyficznej struktury skrzepu9. Co więcej, wszystkie te metody są pracochłonne i czasochłonne10. Do tej pory nie opisano procedur ilościowego i jakościowego badania składników komórek skrzeplinowych mózgu. Powszechnie wiadomo, że usieciowana fibryna szczelnie owija komórki krwi w skrzepy11. W związku z tym specyficzna degradacja usieciowanej fibryny i uwolnienie nienaruszonych komórek ma kluczowe znaczenie dla dokładnej analizy składników komórkowych.

Poprzednie prace wyizolowały enzym fibrynolitytyczny z Sipunculus nudus (sFE), który może szybko i specyficznie rozkładać fibrynę12. W tym artykule zaproponowano metodę analizy składników komórkowych skrzeplin mózgowych w oparciu o unikalną aktywność sFE. Protokół ten wykorzystywał sFE do degradacji fibryny skrzepów, a następnie analizował składniki komórek za pomocą barwienia Wrighta i rutynowego badania krwi13,14. Zgodnie z tą metodą składniki komórkowe skrzeplin mózgowych można badać ilościowo i jakościowo. Ten prosty i skuteczny protokół może być stosowany do analizy składników komórkowych innych skrzepów krwi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Komisji Etyki Medycznej Uniwersytetu Huaqiao. Skrzepy krwi mózgowej zostały chirurgicznie usunięte i pobrane w Pierwszym Szpitalu Quanzhou, powiązanym z Uniwersytetem Medycznym Fujian, za świadomą zgodą pacjentów.

1. Wstępne leczenie zakrzepów krwi

  1. Umieść skrzepy na czystym naczyniu, dodaj pęsetą 5 ml soli fizjologicznej, delikatnie potrząśnij naczyniem i usuń sól fizjologiczną pipetą.
    UWAGA: Powtórz płukanie trzy razy.
  2. Pokrój skrzepy na mniejsze kawałki (mniejsze niż 5 mm x 5 mm x 5 mm) nożyczkami. Dodać 5 ml soli fizjologicznej, delikatnie wstrząsnąć naczyniem i usunąć sól fizjologiczną pipetą.
    UWAGA: Powtórz płukanie trzy razy. Upewnij się, że podczas płukania nie są zasysane żadne kawałki skrzepu.
  3. Przenieś skrzepy na inną czystą płytkę U.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu (przechowywać płytkę w temperaturze 2-8 °C) i ponownie uruchomić później.

2. Tromboliza

  1. Przygotować roztwór roboczy sFE, dostosowując stężenie sFE do 2000 U/ml za pomocą soli fizjologicznej.
    UWAGA: sFE został przygotowany zgodnie z dobrze znanymi protokołami Tang Lab15.
  2. Dodać 300 μl roztworu roboczego sFE do wstępnie potraktowanych skrzepów.
  3. Wykonaj pierwszą rundę degradacji.
    1. Inkubować mieszaninę sFE i skrzepów w temperaturze 37 °C przez 0,5 h.
      UWAGA: Blot potraktowany solą fizjologiczną ustawiono jako kontrolę ujemną. Nie obracaj sample na wytrząsarce.
    2. Delikatnie wymieszać próbkę. Przenieś płynną część do innej czystej probówki za pomocą czystej pipety.
      UWAGA: Pozostałe skrzepy zostały wykorzystane do kolejnej rundy degradacji.
    3. Odwirować płynną część o stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść supernatant do innej czystej probówki za pomocą pipety, aby uzyskać odzyskany roztwór sFE.
    5. Delikatnie wymieszać wytrącanie się komórek z 50 μl soli fizjologicznej.
      UWAGA: Mieszanina komórek była przechowywana w temperaturze 2-8 °C do późniejszego wykorzystania.
  4. Wykonaj późniejszą degradację.
    1. Skompletować pozostałe skrzepy (etap 2.3.2) odzyskanym roztworem sFE (etap 2.3.4) w temperaturze 37 °C przez 0,5 h.
      UWAGA: Pozostałe kroki były takie same jak w pierwszej rundzie degradacji. Proces degradacji był zakończony aż do degradacji całych skrzepów.
  5. Wykonaj zbieranie komórek.
    1. Przygotuj próbkę krwinek, zbierając mieszaninę komórek z każdej rundy degradacji.

3. Barwienie Wrighta

  1. Wykonaj rozmaz komórek.
    1. Dostosuj komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml.
    2. Dodać 5 μl komórek do szkiełka podstawowego pokrytego poli-lizyną, a następnie rozsmarować je za pomocą szkiełka nakrywkowego.
    3. Odparować ciecz w temperaturze pokojowej.
  2. Wykonaj barwienie.
    1. Dodaj 200 μl barwnika Wrighta (patrz tabela materiałów) do delikatnie rozmazu komórek i dodaj 600 μl barwnika B Wrighta, aby równomiernie wymieszać. Plamić przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Delikatnie spłucz barwnik czystą wodą.
      UWAGA: Wybarwiony rozmaz komórkowy można przechowywać w temperaturze pokojowej do późniejszego wykorzystania.
  3. Wykonaj obrazowanie mikroskopowe.
    1. Zbadaj wybarwione komórki za pomocą mikroskopu świetlnego (patrz Tabela materiałów).

4. Rutynowe badanie krwi

  1. Dostosuj komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml.
  2. Analizuj składniki komórek, takie jak płytki krwi, erytrocyty, białe krwinki, limfocyty, neutrofile, monocyty, eozynofile, bazofile i niedojrzałe granulocyty za pomocą analizatora autohematologicznego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W początkowej fazie procesu degradacji stwierdzono, że skrzepy krwi miały czerwoną, zwartą strukturę, a roztwór roboczy był bezbarwny. Po 30 min inkubacji roztwór roboczy przybrał jasnoczerwony kolor, co wskazywało na uwolnienie uwięzionych komórek krwi do roztworu roboczego. Większość skrzepów rozpuściła się po wydłużeniu czasu inkubacji do 5 h, a roztwór roboczy stał się jasnoczerwony. Przeciwnie, w grupie z fizjologicznym roztworem soli (NC) nie zaobserwowano istotnych zmian nawet po 10 h inkubacji (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

sFE jest środkiem fibrynolitycznym , który może bezpośrednio i skutecznie rozkładać fibrynę12,16. W tym przypadku sFE zastosowano do degradacji usieciowanej fibryny skrzepów krwi mózgowej, uwolnienia zamkniętych komórek w skrzepach i analizy składników komórkowych skrzepów jakościowo i ilościowo. Dane mikroskopowe i rutynowe badanie krwi wykazały, że zamknięte komórki zostały uwolnione ze skrzepów krwi. Co więcej, typy komórek i struktury uwolnionych komórek nie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (3502Z20227197) oraz Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070, No.2021Y0027).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka reakcyjna aglutynacji ROTESTRTB-4003
Automatyczny analizator hematologicznySYSMEXXNB2
Automatyczny pionowy ciśnieniowy sterylizator parowy SANYOMLS-3750
(1,5 ml)BiosharpBS-15-M
Czysta ławkaInkubator stałotemperaturowy AIRTECHBLB-1600
hodowlaneJINGHONGJHS-400
(100 mm)serii NEST
DHG SENXINDGG-9140AD
DENVERTP-213
Membrana filtracyjna (0,22 &mikro; m)Millex GP SLGP033NK
 CenceH1650-W
CITOGLAS01-30253-50
Milli-Q ReferencyjneMilliporeZ00QSV0CN
Normalna sólCISENH37022337
Mikroskop optycznyNikonECLIPSE E100
ParafilmBemisPM-996
sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBeyotimeC0221A Końcówka
L)Pipetor AxygeneT-200XT-C
(1 mL) PipetorThermo Fisher ScientificZY18723
(200 &mikro; L)Thermo Fisher ScientificZY20280
SkalpelMARTOR23111
Mały oscylator wirowyKylin-BellVORTEX KB3
PęsetaHysticHKQS-180
Wright Roztwór do barwieniaBeyotimeC0135-500ml
Probówka wirówkowa Naczynie Piec grzewczo-suszący 704001 Elektroniczna waga analityczna Wirówka z mikrochłodzeniem Szkiełka mikroskopowe fizjologiczna do pipet (1 ml ) Axygene T-1000XT-C Końcówka do pipet (200 &mikro;

Bibliografia

  1. Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
  2. Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  3. Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
  4. Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
  5. Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  6. Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
  7. Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
  8. Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
  9. Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).
  10. Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
  11. C W Francis, a, Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
  12. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  13. Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254(2015).
  14. Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).
  15. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631(2023).
  16. Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  17. Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
  18. Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zakrzepica m zguanaliza skrzepu krwianaliza sk adnik w kom rkowychenzym fibrynolitycznyrozpuszczanie skrzepubarwienie kom rekbarwienie metod Wrightamikroskopia wietlnailo ciowa analiza kom rekidentyfikacja p ytek krwi
Kompleksowe podejście do analizy składników komórkowych zakrzepów krwi w mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.