Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

Od maja 2023 roku odnotowano już ponad 766 milionów przypadków COVID-19¹. Pomimo ogólnoświatowych kampanii szczepień, SARS-CoV-2 stale krąży i zakaża ludzi, głównie z powodu pojawienia się nowych wariantów, takich jak Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529), które napędzają nowe fale infekcji^2,3,4. Biorąc pod uwagę, że SARS-CoV-2 stale ewoluuje, ważne jest, aby opracować szybkie testy, które mogą dokładnie mierzyć zakaźność pojawiających się wariantów i skuteczność przeciwciał neutralizujących wywołanych szczepionką przeciwko tym wariantom. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla nadzoru nad pandemią oraz dla określenia skuteczności szczepionek i ich dawek przypominających specyficznych dla danego wariantu.

Ze względu na wysoce zaraźliwy charakter SARS-CoV-2, Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) wymaga, aby badanie SARS-CoV-2 i jego wariantów było prowadzone w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 35^,6. Ten wymóg BSL-3 ogranicza stosowanie żywych wirusów do ilościowego określania zakaźności wariantów wirusa i ich przeciwciał neutralizujących we wspólnych laboratoriach badawczych i klinicznych. Ponadto tradycyjne testy neutralizacji SARS-CoV-2, takie jak testy oparte na efektach blaszkowych lub cytopatycznych przy użyciu żywych wirusów kompetentnych do replikacji, są czasochłonne i wymagają długich okresów inkubacji⁷. Kilka pseudotypowanych białek kolców (S) pseudowirusów SARS-CoV-2 zostało opracowanych w celu ilościowego określenia skuteczności przeciwciał neutralizujących^8,9,10,11,12. W SARS-CoV-2 białko S jest głównym białkiem, które pośredniczy w wnikaniu wirusa¹³ i jest głównym antygenem stosowanym w szczepionkach przeciwko SARS-CoV-2^{9,10,14,15,16}. Wiriony pseudotypowane białkiem S, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) lub lentiwirus, zostały wykorzystane do ilościowego określenia przeciwciał neutralizujących^17,18,19. Niemniej jednak pseudowirus oparty na lentiwirusie zwykle wymaga od 2 do 3 dni infekcji w celu ilościowego określenia sygnałów reporterowych. Systemy pseudowirusowe oparte na VSV często zawierają szczątkowe wirusy VSV, które mogą powodować wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich i zazwyczaj wymagają 24 godzin infekcji²⁰.

Nowy system pseudowirusów SARS-CoV-2, hybrydowy pseudowirus alfawirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), został niedawno opracowany przez Hetrick et al¹². Ha-CoV-2 zapewnia nowe narzędzie do szybkiej kwantyfikacji zakaźności wirusa i wrażliwości wirusa na przeciwciała neutralizujące we wspólnych laboratoriach BSL-2. Strukturalnie Ha-CoV-2 przypomina cząstkę wirionu SARS-CoV-2, składającą się z białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym białka S (S), błony (M), nukleokapsydu (N) i otoczki (E) i nie ma białka strukturalnego z innych wirusów. Dodatkowo cząstka Ha-CoV-2 zawiera szybko ulegający ekspresji genom RNA z alfawirusa do szybkiej ekspresji reporterowej w komórkach. Wykazano, że Ha-CoV-2 szybko mierzy neutralizującą aktywność przeciwciał w surowicy osób zaszczepionych i rekonwalescentów¹². Jak wykazano przez Hetricka i wsp., w porównaniu z pseudowirusem SARS-CoV-2 opartym na lentiwirusie w teście przebiegu czasu, Ha-CoV-2 wykazywał ekspresję reportera Luc już 2-4 godziny po zakażeniu, podczas gdy pseudowirus lentiwirusa wyrażał Luc po 24 h¹². Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV (patrz rysunek uzupełniający 1)¹². W niniejszej pracy szczegółowo opisano wykorzystanie platformy Ha-CoV-2 do szybkiego oznaczania zakaźności wariantów SARS-CoV-2 na przykładzie wariantów Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529). Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV¹².

1. Wirus i cząsteczki wirusa

1. Wektory: Kup komercyjnie wektory ekspresyjne dla SARS-CoV-2 M, E lub N, a także SARS-CoV-2 S (typ dziki, Wt), Delta (B.1.617.2) i Omicron (B.1.1.529).
   UWAGA: Sekwencje białek wektorów ekspresyjnych znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Dostawcę tych wektorów wyrażeń można również znaleźć w tabeli materiałów.
2. Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj HEK293T komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
   UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza. Transfekcja polietylenoiminy (PEI) zwykle wymaga 5-6 godzin inkubacji. Godziny rozpoczęcia muszą być wcześniej dokładnie przemyślane.
3. Składanie wirusa i kotransfekcja oparta na PEI: Składanie cząstek Ha-CoV-2 przez kotransfekcję komórek HEK293T. Komórki nasienne w 10 cm kulturze komórkowej na szalce Petriego (4-5 x 106 komórek na szalkę) w 10 ml kompletnej pożywki DMEM na dzień przed kotransfekcją. W tym badaniu trzy szalki Petriego są używane do wysiewu komórek do składania Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta i Omicron, odpowiednio.
4. Inkubować szalki Petriego przez noc w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C. Sprawdź szalki następnego ranka, aby upewnić się, że komórki zlewają się w 80%. Usuń całe podłoże i zastąp je 9 ml pożywki bez surowicy DMEM.
5. Dla każdej potrawy należy przygotować mieszaninę kotransfekcji zawierającą 2,5 μg każdego z wektorów ekspresji białek strukturalnych SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (genom HaCoV2) i 2,5 μg wektora ekspresji białka S, wariantu Delta lub Omicron S oraz 45 μl odczynnika do transfekcji na bazie PEI. Pozostawić mieszaninę kotransfekcji do utworzenia kompleksów przez inkubację przez 13 minut (nie inkubować dłużej niż 30 minut).
6. Po inkubacji powoli dodawać mieszaninę kotransfekcji do każdej szalki Petriego, kropla po kropli. Umieścić naczynia w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C na 6 godzin. Po 6 godzinach usuń DMEM bez surowicy i zastąp go kompletnym podłożem DMEM. Zebrać wirusa po 48-60 godzinach od kotransfekcji.
7. Zbieranie i przechowywanie wirusa: Zbieranie cząstek po 48 godzinach od kotransfekcji. Oderwać komórki, kilkakrotnie pipetując po powierzchni monowarstwy i zebrać komórki z każdego naczynia, umieścić w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut. Zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 μM. Pseudowirus Ha-CoV-2 należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Test zakaźności wirusa

1. Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
2. Wysiewanie komórek HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): Dzień przed testem zakaźności wirusa należy wysiać komórki HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Na każdą 96-dołkową płytkę należy zasiać 2,5 x 10⁴ komórki do każdej płytki, a na jedną płytkę potrzeba łącznie 2,5 x 10⁶ komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C na noc.
3. Zakażenie HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Użyj cząstek wariantów Ha-CoV-2 do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Rano w dniu infekcji usuń 50 μl DMEM z wstępnie wysianej płytki 96-dołkowej. Zastąp pożywkę 50 μl Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta lub Omicron na 18 godzin w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji, a płytka nie będzie gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy. Powodzenie infekcji zależy od testu lucyferazy wynikającego z genu reporterowego lucyferazy ulegającego ekspresji w zakażonych komórkach, dlatego im więcej sygnału jest wytwarzane, tym skuteczniejsza jest infekcja wariantem Ha-CoV-2.
4. Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy komórek bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całej 96-dołkowej płytce połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.
6. Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.

3. Ekstrakcja RNA Ha-CoV-2 i ilościowa odwrotna transkryptaza PCR (RT-qPCR)

1. Ekstrakcja wirusowego RNA: Wyodrębnij wirusowe RNA z cząstek Ha-CoV-2 typu dzikiego oraz Ha-CoV-2 Delta i wariantu Omicron za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowany wirusowy RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do RT-qPCR.
2. RT-qPCR: Wykonaj RT-qPCR na wirusowym RNA przy użyciu jednoetapowej mieszanki głównej. Przeprowadź reakcję w komercyjnej maszynie do PCR. Należy pamiętać, że celem amplifikacji jest genomowy RNA Ha-CoV-2. Użyj wektora DNA Ha-CoV-2 jako standardu do tworzenia krzywej standardowej i obliczania liczby kopii RNA każdego wariantu.

4. Test przeciwciał neutralizujących

1. Wysiew komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Dzień przed testem wysiewać komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Ogniwa HEK293T(ACE2/TMPRSS2) są kupowane komercyjnie.
2. Do liczenia komórek należy uzyskać 20 μl komórek z kolby T75 zawierającej HEK293T(ACE2/TMPRSS2) komórek i wymieszać z 20 μl roztworu błękitu trypanowego. Dodać 20 μl tej mieszaniny do komory do liczenia komórek i policzyć liczbę komórek na ml. Aby wysiać 96-dołkową płytkę do infekcji, użyj 2,5 x 10⁴ komórek na dołek, a w sumie potrzebnych będzie 2,5 x 10⁶ komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C na noc.
3. Test przeciwciał neutralizujących: Na sterylnej 96-dołkowej płytce polipropylenowej przygotować standardowe przeciwciało neutralizujące 27BV i mieszaninę Ha-CoV-2. Dodać 8 μl 27BV (45 mg/mL) do płytki i wykonać seryjne rozcieńczenia przeciwciała 6 μl DMEM.
   UWAGA: Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między dokładnymi transferami i upewnić się, że przeciwciało i pożywka bez surowicy są dokładnie wymieszane, aby uzyskać dokładne wyniki.
4. Do seryjnie rozcieńczonego przeciwciała dodać 54 μl cząstek Ha-CoV-2 i wymieszać wirusa z przeciwciałem. Wstępnie inkubować cząstki Ha-CoV-2 z seryjnie rozcieńczanym 27BV przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ . Po 1 godzinnej inkubacji nanieść 50 μl mieszaniny przeciwciał i Ha-CoV-2 na 96-dołkową płytkę zawierającą komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 10⁴ komórki na basenik) wysiane dzień wcześniej.
5. W przypadku kontroli pozostaw co najmniej trzy studzienki zawierające tylko komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Dodaj 50 μl kompletnej pożywki do tych studzienek, aby służyły jako niezainfekowane studzienki dla sygnału tła odczytów testu lucyferazy.
   UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C, a następnie płytka jest gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy.
6. Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całą 96-dołkową płytkę połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.
8. Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.

5. Kwantyfikacja i analiza statystyczna

1. Gromadzenie danych: Wykonaj testy infekcji i lucyferazy w trzech egzemplarzach, jak wskazano (Rysunek 1). Określ ilościowo ekspresję lucyferazy za pomocą odczytów testu lucyferazy. Średnia to średnia wartość trzech odczytów testu lucyferazy. Odczyty sygnału tła z niezainfekowanych studni są odejmowane od tej średniej wartości. Odchylenie standardowe (SD) określa się na podstawie średniej wartości odczytów testu lucyferazy.
2. Analiza danych: Wykreśl aktywność neutralizacji przeciwciał i oblicz wartości ID₅₀ (50% dawki hamującej) za pomocą komercyjnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Wartość ID₅₀ definiuje się jako rozcieńczenia hamujące przeciwciała, przy których uzyskuje się 50% zmniejszenie infekcji komórek HEK293T(ACE2 / TMPRSS2) (na podstawie odczytów testu lucyferazy).

Cząsteczki Ha-CoV-2 zostały złożone przy użyciu pięciu różnych wektorów DNA, które wyrażają genom RNA Ha-CoV-2 i białka strukturalne (M, N, E i S) SARS-CoV-2 w komórkach HEK293T. Wektor białka S różni się w zależności od wariantu S. Jako kontrolę pozytywną zastosowano białko S z oryginalnego szczepu Ha-CoV-2 Wuhan (typu dzikiego, Wt) i ono złożono wraz z białkiem S z każdego z dwóch pozostałych wariantów: Delta (B.1.617.2) lub Omicron (B.1.1.529). We wszystkich wariantach zastosowano te same M, N, E. Cząstki Ha-CoV-2(Wt) i wariantowe zebrano 48 godzin po kotransfekcji, a następnie wykorzystano do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Zakaźność mierzono na podstawie ekspresji lucyferazy w 18 godzin po zakażeniu. W tym systemie wyższe poziomy ekspresji sygnału lucyferazy odzwierciedlają wyższe zakażenie komórek przez Ha-CoV-2. Sygnał lucyferazy znormalizowano kopiami genomowego RNA metodą RT-qPCR dla każdego wariantu. Jak pokazano na rysunku 1, wariant Omikron Ha-CoV-2 generował od 4 do 10 razy silniejszy sygnał niż oryginalny Ha-CoV-2(Wt), co sugeruje wyższą zakaźność.

Ponadto, zdolność 27BV do neutralizacji wariantów HaCoV-2(Wt), Delta i Omicron została określona ilościowo. 27BV to królicze przeciwciało monoklonalne, które zostało opracowane przeciwko domenie RBD białka SARS-COV-2 S1. W testach neutralizacji przeprowadzono seryjne rozcieńczenia 27BV na 96-dołkowej płytce, wstępnie inkubowane z Ha-CoV-2, a następnie dodane do komórek docelowych HEK293T (ACE2 / TMPRSS2). Wyniki wykazały, że 27BV wykazywał aktywność neutralizującą wobec wszystkich testowanych wariantów (Rysunek 2)". Co ciekawe, ID50 z 27VB dla Omicron był około 10 razy słabszy niż ID50 dla Ha-CoV-2(WT) i Ha-CoV-2(Delta; Rysunek 2). Wyniki te pokazują, że platforma Ha-COV-2 może być stosowana jako szybka metoda ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących indukowanych szczepionką w pojawiających się wariantach.

Rysunek 1. Montaż i oznaczanie ilościowe wariantów Ha-CoV-2. (A) Ilustracja złożenia Ha-CoV-2 i cząstek wariantowych. Wektory wyrażające genom reporterowy Ha-CoV-2 i białka strukturalne (M, S, N i E) są kotransfekowane w komórkach HEK293T. Cząstki zebrano 48 godzin po kotransfekcji (za pomocą Biorender.com utworzono obrazowanie cząstek wirionu i komórek HEK293T). (B) Kwantyfikacja zakaźności wariantów Ha-CoV-2. Względna zakaźność dwóch wariantów (Delta i Omikron) jest określana ilościowo i normalizowana za pomocą kopii genomowego RNA poszczególnych wariantów Ha-CoV-2 (Luc). Typ dziki to Ha-COV-2 (Wt), który jest używany jako kontrola dla porównania. Testy infekcji i lucyferazy przeprowadzono 3x. RU, jednostka względna. Pokazana jest średnia i odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Kwantyfikacja aktywności neutralizacji 27BV wobec wariantów Ha-CoV-2(Luc) Aktywność neutralizacyjną 27BV analizowano 18 godzin po zakażeniu komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ID50 obliczono na podstawie względnego wskaźnika infekcji (aktywność lucyferazy) w porównaniu ze stężeniem 27BV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zakażenie HEK293T(ACE2/TMPRSS2) Ha-CoV-2(GFP). Cząstki Ha-CoV-2(GFP) zostały połączone, a następnie wykorzystane do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ekspresję GFP obserwowano po 48 godzinach od zakażenia przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Białe pole zakażonych komórek jest pokazane po lewej stronie, a obrazowanie GFP jest pokazane po prawej. Biały słupek reprezentuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Streszczenie graficzne. Pseudowirus: budowa i zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2. Obraz utworzony za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1. Sekwencje białek. Lista sekwencji białek S, M, N i E SARS-CoV-2. Sekwencje białka S obejmują również warianty SARS-CoV-2 Omikron (B.1.1.529) i Delta (B.1.617.2). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uniwersytet George'a Masona złożył wniosek patentowy i udzielił licencji firmie Virongy Biosciences Inc. na rozwój produktu. Y.W. jest założycielem i członkiem rady doradczej Virongy Biosciences. B. H jest obecnie dyrektorem generalnym i dyrektorem naukowym Virongy Biosciences. Autorzy nie mają innych konfliktów interesów.