Artykuł metodologiczny

Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65793

⸱

8 września 2023

 ,  , 
1Center for Infectious Disease Research, School of Systems Biology, George Mason University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) jako platformy do szybkiej oceny zakaźności wariantów SARS-CoV-2 i ich wrażliwości na przeciwciała neutralizujące.

Streszczenie

Pandemia choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) uwypukliła potrzebę szybkich testów, aby dokładnie zmierzyć zakaźność pojawiających się wariantów SARS-CoV-2 oraz skuteczność indukowanych szczepionką przeciwciał neutralizujących przeciwko wariantom wirusa. Testy te są niezbędne do nadzoru nad pandemią i walidacji szczepionek i dawek przypominających specyficznych dla wariantu. Niniejszy manuskrypt demonstruje zastosowanie nowego hybrydowego pseudowirusa alfawirusa SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) do szybkiej oceny ilościowej zakaźności wariantu SARS-CoV-2 i indukowanych szczepionką przeciwciał neutralizujących warianty wirusa. Ha-CoV-2 to cząsteczka podobna do wirusa SARS-CoV-2 składająca się z białek strukturalnych wirusa (S, M, N i E) oraz szybko eksprymującego się genomu RNA pochodzącego z alfawirusa, wirusa lasu Semliki (SFV). Ha-CoV-2 zawiera również zarówno białko zielonej fluorescencji (GFP), jak i geny reporterowe lucyferazy, które pozwalają na szybkie ilościowe określenie zakaźności wirusa. Na przykład określa się ilościowo zakaźność wariantów SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529), a także mierzy się ich wrażliwość na przeciwciało neutralizujące (27VB). Przykłady te pokazują ogromny potencjał Ha-CoV-2 jako solidnej platformy do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i ich podatności na przeciwciała neutralizujące.

Wprowadzenie

Od maja 2023 roku odnotowano już ponad 766 milionów przypadków COVID-191. Pomimo ogólnoświatowych kampanii szczepień, SARS-CoV-2 stale krąży i zakaża ludzi, głównie z powodu pojawienia się nowych wariantów, takich jak Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529), które napędzają nowe fale infekcji2,3,4. Biorąc pod uwagę, że SARS-CoV-2 stale ewoluuje, ważne jest, aby opracować szybkie testy, które mogą dokładnie mierzyć zakaźność pojawiających się wariantów i skuteczność przeciwciał neutralizujących wywołanych szczepionką przeciwko tym wariantom. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla nadzoru nad pandemią oraz dla określenia skuteczności szczepionek i ich dawek przypominających specyficznych dla danego wariantu.

Ze względu na wysoce zaraźliwy charakter SARS-CoV-2, Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) wymaga, aby badanie SARS-CoV-2 i jego wariantów było prowadzone w obiektach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL) 35,6. Ten wymóg BSL-3 ogranicza stosowanie żywych wirusów do ilościowego określania zakaźności wariantów wirusa i ich przeciwciał neutralizujących we wspólnych laboratoriach badawczych i klinicznych. Ponadto tradycyjne testy neutralizacji SARS-CoV-2, takie jak testy oparte na efektach blaszkowych lub cytopatycznych przy użyciu żywych wirusów kompetentnych do replikacji, są czasochłonne i wymagają długich okresów inkubacji7. Kilka pseudotypowanych białek kolców (S) pseudowirusów SARS-CoV-2 zostało opracowanych w celu ilościowego określenia skuteczności przeciwciał neutralizujących8,9,10,11,12. W SARS-CoV-2 białko S jest głównym białkiem, które pośredniczy w wnikaniu wirusa13 i jest głównym antygenem stosowanym w szczepionkach przeciwko SARS-CoV-29,10,14,15,16. Wiriony pseudotypowane białkiem S, takie jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G) lub lentiwirus, zostały wykorzystane do ilościowego określenia przeciwciał neutralizujących17,18,19. Niemniej jednak pseudowirus oparty na lentiwirusie zwykle wymaga od 2 do 3 dni infekcji w celu ilościowego określenia sygnałów reporterowych. Systemy pseudowirusowe oparte na VSV często zawierają szczątkowe wirusy VSV, które mogą powodować wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich i zazwyczaj wymagają 24 godzin infekcji20.

Nowy system pseudowirusów SARS-CoV-2, hybrydowy pseudowirus alfawirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), został niedawno opracowany przez Hetrick et al12. Ha-CoV-2 zapewnia nowe narzędzie do szybkiej kwantyfikacji zakaźności wirusa i wrażliwości wirusa na przeciwciała neutralizujące we wspólnych laboratoriach BSL-2. Strukturalnie Ha-CoV-2 przypomina cząstkę wirionu SARS-CoV-2, składającą się z białek strukturalnych SARS-CoV-2, w tym białka S (S), błony (M), nukleokapsydu (N) i otoczki (E) i nie ma białka strukturalnego z innych wirusów. Dodatkowo cząstka Ha-CoV-2 zawiera szybko ulegający ekspresji genom RNA z alfawirusa do szybkiej ekspresji reporterowej w komórkach. Wykazano, że Ha-CoV-2 szybko mierzy neutralizującą aktywność przeciwciał w surowicy osób zaszczepionych i rekonwalescentów12. Jak wykazano przez Hetricka i wsp., w porównaniu z pseudowirusem SARS-CoV-2 opartym na lentiwirusie w teście przebiegu czasu, Ha-CoV-2 wykazywał ekspresję reportera Luc już 2-4 godziny po zakażeniu, podczas gdy pseudowirus lentiwirusa wyrażał Luc po 24 h12. Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV (patrz rysunek uzupełniający 1)12. W niniejszej pracy szczegółowo opisano wykorzystanie platformy Ha-CoV-2 do szybkiego oznaczania zakaźności wariantów SARS-CoV-2 na przykładzie wariantów Delta (B.1.617.2) i Omikron (B.1.1.529). Ponadto potencjalne zastosowanie wariantów Ha-CoV-2 do ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących jest dodatkowo demonstrowane przy użyciu standardowego przeciwciała neutralizującego monoklonalnego, 27BV12.

Protokół

1. Wirus i cząsteczki wirusa

  1. Wektory: Kup komercyjnie wektory ekspresyjne dla SARS-CoV-2 M, E lub N, a także SARS-CoV-2 S (typ dziki, Wt), Delta (B.1.617.2) i Omicron (B.1.1.529).
    UWAGA: Sekwencje białek wektorów ekspresyjnych znajdują się w pliku uzupełniającym 1. Dostawcę tych wektorów wyrażeń można również znaleźć w tabeli materiałów.
  2. Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj HEK293T komórek w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
    UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza. Transfekcja polietylenoiminy (PEI) zwykle wymaga 5-6 godzin inkubacji. Godziny rozpoczęcia muszą być wcześniej dokładnie przemyślane.
  3. Składanie wirusa i kotransfekcja oparta na PEI: Składanie cząstek Ha-CoV-2 przez kotransfekcję komórek HEK293T. Komórki nasienne w 10 cm kulturze komórkowej na szalce Petriego (4-5 x 106 komórek na szalkę) w 10 ml kompletnej pożywki DMEM na dzień przed kotransfekcją. W tym badaniu trzy szalki Petriego są używane do wysiewu komórek do składania Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta i Omicron, odpowiednio.
  4. Inkubować szalki Petriego przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C. Sprawdź szalki następnego ranka, aby upewnić się, że komórki zlewają się w 80%. Usuń całe podłoże i zastąp je 9 ml pożywki bez surowicy DMEM.
  5. Dla każdej potrawy należy przygotować mieszaninę kotransfekcji zawierającą 2,5 μg każdego z wektorów ekspresji białek strukturalnych SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (genom HaCoV2) i 2,5 μg wektora ekspresji białka S, wariantu Delta lub Omicron S oraz 45 μl odczynnika do transfekcji na bazie PEI. Pozostawić mieszaninę kotransfekcji do utworzenia kompleksów przez inkubację przez 13 minut (nie inkubować dłużej niż 30 minut).
  6. Po inkubacji powoli dodawać mieszaninę kotransfekcji do każdej szalki Petriego, kropla po kropli. Umieścić naczynia w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 6 godzin. Po 6 godzinach usuń DMEM bez surowicy i zastąp go kompletnym podłożem DMEM. Zebrać wirusa po 48-60 godzinach od kotransfekcji.
  7. Zbieranie i przechowywanie wirusa: Zbieranie cząstek po 48 godzinach od kotransfekcji. Oderwać komórki, kilkakrotnie pipetując po powierzchni monowarstwy i zebrać komórki z każdego naczynia, umieścić w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml i wirować przy 400 x g przez 5 minut. Zebrać supernatant i przepuścić go przez filtr 0,22 μM. Pseudowirus Ha-CoV-2 należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Test zakaźności wirusa

  1. Komórki i hodowla komórkowa: Utrzymuj komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
  2. Wysiewanie komórek HEK293T (ACE2 / TMPRSS2): Dzień przed testem zakaźności wirusa należy wysiać komórki HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Na każdą 96-dołkową płytkę należy zasiać 2,5 x 104 komórki do każdej płytki, a na jedną płytkę potrzeba łącznie 2,5 x 106 komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na noc.
  3. Zakażenie HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Użyj cząstek wariantów Ha-CoV-2 do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Rano w dniu infekcji usuń 50 μl DMEM z wstępnie wysianej płytki 96-dołkowej. Zastąp pożywkę 50 μl Ha-CoV-2 typu dzikiego, Delta lub Omicron na 18 godzin w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji, a płytka nie będzie gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy. Powodzenie infekcji zależy od testu lucyferazy wynikającego z genu reporterowego lucyferazy ulegającego ekspresji w zakażonych komórkach, dlatego im więcej sygnału jest wytwarzane, tym skuteczniejsza jest infekcja wariantem Ha-CoV-2.
  4. Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy komórek bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całej 96-dołkowej płytce połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.
  6. Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.

3. Ekstrakcja RNA Ha-CoV-2 i ilościowa odwrotna transkryptaza PCR (RT-qPCR)

  1. Ekstrakcja wirusowego RNA: Wyodrębnij wirusowe RNA z cząstek Ha-CoV-2 typu dzikiego oraz Ha-CoV-2 Delta i wariantu Omicron za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Wyekstrahowany wirusowy RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast użyć do RT-qPCR.
  2. RT-qPCR: Wykonaj RT-qPCR na wirusowym RNA przy użyciu jednoetapowej mieszanki głównej. Przeprowadź reakcję w komercyjnej maszynie do PCR. Należy pamiętać, że celem amplifikacji jest genomowy RNA Ha-CoV-2. Użyj wektora DNA Ha-CoV-2 jako standardu do tworzenia krzywej standardowej i obliczania liczby kopii RNA każdego wariantu.

4. Test przeciwciał neutralizujących

  1. Wysiew komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Dzień przed testem wysiewać komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) na 96-dołkowej płytce w 50 μl kompletnej pożywki DMEM. Ogniwa HEK293T(ACE2/TMPRSS2) są kupowane komercyjnie.
  2. Do liczenia komórek należy uzyskać 20 μl komórek z kolby T75 zawierającej HEK293T(ACE2/TMPRSS2) komórek i wymieszać z 20 μl roztworu błękitu trypanowego. Dodać 20 μl tej mieszaniny do komory do liczenia komórek i policzyć liczbę komórek na ml. Aby wysiać 96-dołkową płytkę do infekcji, użyj 2,5 x 104 komórek na dołek, a w sumie potrzebnych będzie 2,5 x 106 komórek. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na noc.
  3. Test przeciwciał neutralizujących: Na sterylnej 96-dołkowej płytce polipropylenowej przygotować standardowe przeciwciało neutralizujące 27BV i mieszaninę Ha-CoV-2. Dodać 8 μl 27BV (45 mg/mL) do płytki i wykonać seryjne rozcieńczenia przeciwciała 6 μl DMEM.
    UWAGA: Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między dokładnymi transferami i upewnić się, że przeciwciało i pożywka bez surowicy są dokładnie wymieszane, aby uzyskać dokładne wyniki.
  4. Do seryjnie rozcieńczonego przeciwciała dodać 54 μl cząstek Ha-CoV-2 i wymieszać wirusa z przeciwciałem. Wstępnie inkubować cząstki Ha-CoV-2 z seryjnie rozcieńczanym 27BV przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Po 1 godzinnej inkubacji nanieść 50 μl mieszaniny przeciwciał i Ha-CoV-2 na 96-dołkową płytkę zawierającą komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 komórki na basenik) wysiane dzień wcześniej.
  5. W przypadku kontroli pozostaw co najmniej trzy studzienki zawierające tylko komórki HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Dodaj 50 μl kompletnej pożywki do tych studzienek, aby służyły jako niezainfekowane studzienki dla sygnału tła odczytów testu lucyferazy.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym miejscu, dopóki infekcja nie osiągnie 18 godzin inkubacji w temperaturze 37 °C, a następnie płytka jest gotowa do analizy za pomocą testu lucyferazy.
  6. Test lucyferazy: Po 18 godzinach inkubacji dodać 7,5 μl buforu do lizy bezpośrednio do każdej studzienki i mieszać przez wytrząsanie orbitalne przez 2 minuty. Lizować komórki w buforze do lizy przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotuj roztwór do testu lucyferazy świetlika, mieszając roztwór D-lucyferyny z roztworem do testu lucyferazy świetlika w stosunku 1:50. Na całą 96-dołkową płytkę połącz 3 ml roztworu substratu lucyferazy z 60 μl roztworu D-lucyferyny z 2940 μl roztworu buforowego lucyferazy świetlika.
  8. Dodać 25 μl roztworu testowego lucyferazy świetlika do lizatów komórkowych i mieszać płytkę przez wytrząsanie orbitalne przez 1 minutę. Analizować aktywność lucyferazy za pomocą komercyjnego czytnika mikropłytek lucyferazy.

5. Kwantyfikacja i analiza statystyczna

  1. Gromadzenie danych: Wykonaj testy infekcji i lucyferazy w trzech egzemplarzach, jak wskazano (Rysunek 1). Określ ilościowo ekspresję lucyferazy za pomocą odczytów testu lucyferazy. Średnia to średnia wartość trzech odczytów testu lucyferazy. Odczyty sygnału tła z niezainfekowanych studni są odejmowane od tej średniej wartości. Odchylenie standardowe (SD) określa się na podstawie średniej wartości odczytów testu lucyferazy.
  2. Analiza danych: Wykreśl aktywność neutralizacji przeciwciał i oblicz wartości ID50 (50% dawki hamującej) za pomocą komercyjnego oprogramowania do tworzenia wykresów. Wartość ID50 definiuje się jako rozcieńczenia hamujące przeciwciała, przy których uzyskuje się 50% zmniejszenie infekcji komórek HEK293T(ACE2 / TMPRSS2) (na podstawie odczytów testu lucyferazy).

Wyniki

Cząsteczki Ha-CoV-2 zmontowano przy użyciu pięciu różnych wektorów DNA kodujących genom RNA Ha-CoV-2 oraz białka strukturalne (M, N, E i S) SARS-CoV-2 w komórkach HEK293T. Wektor białka S różni się w zależności od wariantu S. Jako kontrolę pozytywną wykorzystano białko S z pierwotnego szczepu Ha-CoV-2 z Wuhan (typ dziki, Wt), które zmontowano wraz z białkiem S z każdego z dwóch pozostałych wariantów: Delta (B.1.617.2) lub Omicron (B.1.1.529). W przypadku wszystkich wariantów zastosowano te same białka M, N i E. Cząsteczki Ha-CoV-2(Wt) oraz wariantów zebrano 48 h po kotransfekcji, a następnie wykorzystano je do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Zakaźność mierzono na podstawie ekspresji lucyferazy 18 h po zakażeniu. W tym systemie wyższe poziomy sygnału lucyferazy odzwierciedlają silniejszy stopień zakażenia komórek przez Ha-CoV-2. Sygnał lucyferazy znormalizowano względem liczby kopii RNA genomowego za pomocą RT-qPCR dla każdego wariantu. Jak pokazano na rycinie 1, wariant Omicron Ha-CoV-2 generował sygnał od 4 do 10 razy wyższy niż pierwotny Ha-CoV-2(Wt), co sugeruje wyższą zakaźność.

Ponadto określono zdolność przeciwciała 27BV do neutralizacji wariantów HaCoV-2(Wt), Delta oraz Omicron. 27BV jest króliczym przeciwciałem monoklonalnym opracowanym przeciwko domenie RBD białka S1 SARS-COV-2. W testach neutralizacji przeprowadzono seryjne rozcieńczenia 27BV na płytce 96-dołkowej, poddano je preinkubacji z Ha-CoV-2, a następnie dodano do komórek docelowych HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Wyniki wykazały, że 27BV posiadało aktywność neutralizującą wobec wszystkich badanych wariantów (Rycina 2). Co ciekawe, ID50 27VB dla wariantu Omicron było około 10 razy niższe niż ID50 dla Ha-CoV-2(WT) oraz Ha-CoV-2(Delta; Rycina 2). Wyniki te dowodzą, że platforma Ha-COV-2 może być wykorzystana jako szybka metoda ilościowego oznaczania przeciwciał neutralizujących indukowanych szczepionką w przypadku pojawiających się wariantów.

Metoda kotransfekcji SARS-CoV-2 z komórkami HEK293T; schemat i wykres słupkowy wyników sygnału lucyferazy.
Rysunek 1. Montaż i kwantyfikacja wariantów Ha-CoV-2. (A) Ilustracja montażu cząsteczek Ha-CoV-2 i jego wariantów. Wektory ekspresyjne genomu reporterowego i białek strukturalnych (M, S, N i E) Ha-CoV-2 są kotransfekowane do komórek HEK293T. Cząsteczki zebrano 48 h po kotransfekcji (wizualizacja cząsteczki wirionu i komórek HEK293T została wykonana w Biorender.com). (B) Kwantyfikacja zakaźności wariantów Ha-CoV-2. Względna zakaźność dwóch wariantów (Delta i Omicron) została skwantyfikowana i znormalizowana przy użyciu kopii genomowego RNA poszczególnych wariantów Ha-CoV-2 (Luc). Typem dzikim jest Ha-COV-2 (Wt), który służy jako kontrola do porównania. Testy zakaźności i lucyferazy przeprowadzono 3x. RU, jednostka względna. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywe neutralizacji przeciwciał: względna zakaźność w funkcji Log10 stężenia; warianty WT, Delta, Omicron.
Rysunek 2. Ilościowe określenie aktywności neutralizacyjnej 27BV przeciwko wariantom Ha-CoV-2(Luc) Aktywność neutralizacyjną 27BV analizowano 18 h po zakażeniu komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). ID50 obliczono na podstawie względnego wskaźnika zakażeń (aktywność lucyferazy) w zależności od stężenia 27BV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Komórki zakażone Ha-CoV-2; mikroskopia w polu jasnym i fluorescencyjna GFP; metoda wizualizacji wirusa.
Rycina 3. Zakażenie komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2) wirusem Ha-CoV-2(GFP). Cząsteczki Ha-CoV-2(GFP) zostały zmontowane, a następnie wykorzystane do zakażenia komórek HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Ekspresję GFP obserwowano 48 h po zakażeniu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Po lewej stronie przedstawiono pole jasne zakażonych komórek, a po prawej obrazowanie GFP. Biały pasek odpowiada 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1. Abstrakt graficzny. Struktura i zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2. Obraz utworzony za pomocą Biorender.com. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1. Sekwencje białek. Lista sekwencji białek S, M, N i E wirusa SARS-CoV-2. Sekwencje białka S obejmują również warianty SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) i Delta (B.1.617.2). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Platforma Ha-CoV-2 zapewnia szybki, niezawodny i prosty przepływ pracy w celu ilościowego oznaczania wariantów wirusa i neutralizacji przeciwciał. Jest jednak kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Produkcja pseudowirusa Ha-CoV-2 powinna odbywać się przy użyciu komórek HEK293T o wysokiej żywotności. Efektywność kotransfekcji można monitorować 24 godziny po transfekcji za pomocą genu reporterowego GFP z genomu Ha-CoV-2. Genom Ha-CoV-2 może zawierać dwa reportery (GFP i Luc), a GFP może ulegać ekspresji podczas kotransfekcji i po zakażeniu Ha-CoV-2 komórek docelowych12. Komórki GFP+ z infekcji są zwykle na niskim poziomie procentowym (od 1% do 5%), ale każda zakażona komórka wyraża silne sygnały GFP (ryc. 3). Ten niski odsetek GFP może ograniczać stosowanie GFP jako solidnego odczytu do ilościowego określania neutralizacji przeciwciał, w porównaniu z reporterem Luc, który określa ilościowo całą populację zakażonych komórek.

Podczas wykonywania testu neutralizacji należy zmieniać końcówki pipet między dołamkami i upewnić się, że przeciwciało i pożywka wolna od surowicy są dokładnie wymieszane, aby uzyskać dokładne wyniki. Dodatkowo, podczas przeprowadzania protokołu testu lucyferazy, komórki muszą być w pełni poddane lizie przez co najmniej 3 minuty, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i uwolnienie enzymu lucyferazy. Zapewni to dokładność testu. Dodatkowo, po dodaniu roztworu testowego lucyferazy świetlika do optycznych płytek 96-dołkowych o białych ściankach, płytkę należy przeanalizować w ciągu 10 minut, ponieważ początkowa emisja światła jest wysoka, ale zmniejsza się z czasem, gdy ATP jest wyczerpane21.

Ponieważ coraz więcej wariantów SARS-CoV-2 nadal ewoluuje, istnieje zwiększone zapotrzebowanie na platformy takie jak Ha-CoV-2 do szybkiego badania przesiewowego pod kątem zakaźności wariantu i wrażliwości wariantu na przeciwciała neutralizujące wywołane szczepionką. Platforma Ha-CoV-2 oferuje większą prędkość, wyższy stosunek sygnału do szumu i prosty protokół w porównaniu z istniejącymi testami neutralizacji opartymi na pseudowirusach 8,9,10,11. Platforma Ha-CoV-2 ma również tę zaletę, że może być stosowana w laboratoriach BSL-2 i nie wymaga korzystania z urządzeń BSL-3. Dzięki temu SARS-CoV-2 może być badany we wspólnych laboratoriach badawczych i klinicznych. Co więcej, platforma Ha-CoV-2 daje szybkie wyniki w porównaniu z innymi systemami. Na przykład w badaniu przeciwciał neutralizujących przeciwko zakaźnemu wirusowi SARS-CoV-2 często wykorzystuje się test neutralizacji z redukcją płytki nazębnej (PRINT)22. Chociaż PRINT daje wiarygodne wyniki, ręczne liczenie jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) jest powolne i wymaga 3-5 dni na uzyskanie wyników23,24. Inne systemy pseudotypów, takie jak lentiwirus-pseudowirus, potrzebują 24-72 godzin, aby wytworzyć wykrywalny sygnał reporterowy12. Dla porównania, test neutralizacji Ha-CoV-2 może przynieść wyniki w ciągu 18 godzin. Ha-CoV-2 stanowi wygodne narzędzie do szybkich badań przesiewowych i kwantyfikacji wariantów wirusa oraz przeciwciał neutralizujących do monitorowania pandemii.

Monitorowanie zakaźności SARS-CoV-2 jest niezbędne, ponieważ wciąż pojawia się więcej wariantów budzących obawy (LZO). Ha-CoV-2 ma tę zaletę, że szybko określa zakaźność LZO. W poprzednich badaniach wykorzystano modelowanie oparte na sztucznej inteligencji (AI) do ilościowej analizy zakaźności podwariantu Omikron i innych wariantów SARS-CoV-2, takich jak wariant Delta25. Badania te wykazały, że wariant Omikron jest bardziej zaraźliwy niż oryginalny wirus i ma większe szanse na uniknięcie przeciwciał neutralizujących25. W badaniach tych z użyciem Ha-CoV-2 zaobserwowano podobne fenotypy. Dodatkowo, w testach neutralizacji przeciwciał, wariant Omikron jest dziesięciokrotnie mniej podatny na neutralizację przez 27BV niż szczepy Wuhan i Delta. Wyniki te są również zgodne z zgłaszaną wyższą transmisyjnością wariantu Omicron, który ma co najmniej 15 mutacji w domenie wiążącej receptor (RBD), co prawdopodobnie zwiększa powinowactwo wiązania wirusa z receptorem ACE2 w celu uzyskania wyższej zdolności przenoszenia i większej ucieczki immunologicznej26.

Oświadczenia

Uniwersytet George'a Masona złożył wniosek patentowy i udzielił licencji firmie Virongy Biosciences Inc. na rozwój produktu. Y.W. jest założycielem i członkiem rady doradczej Virongy Biosciences. B. H jest obecnie dyrektorem generalnym i dyrektorem naukowym Virongy Biosciences. Autorzy nie mają innych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez wewnętrzny fundusz badawczy Uniwersytetu George'a Masona.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
27VB1 20 i mikro; g Standardowe przeciwciało neutralizujące SARS-CoV-2Virongy Biosciences27VBI-01
500 ml - Pochodzenie z USA FBSNeuromicsFBS001
AB Płytka mieszająca: Olympus 96-dołkowa płytka do PCR, ultracienka ścianka bez spódnicy, naturalna, 25 płytek/szt Genesee Scientific Cat# 24-300 
Wirówka Allegra 6RRedlica Beckman2043-30-1158
DMEM (1x) ThermoFisher 11995-073
- GenClone 25-209 - Kolby poddane działaniu TC, 250 ml, Powierzchnia wzrostu wentylacji: 75,0 cm2, 5 na rękaw, 100 kolb / jednostkęGenesee Scientfic25-209
Czytnik mikropłytek GlowMax DiscoverPromega GM3000 
Wektor Ha-CoV-2 E Virongy BiosciencespCoV2_E
Ha-CoV-2 M Wektor Virongy BiosciencespCoV2_M
wektor Ha-CoV-2 N Virongy BiosciencespCoV2_N
Ha-CoV-2 WT S VectorVirongy BiosciencespCoV2_WT S
Komórki Hek293TATCCCRL-3214
Oświetlenie Firefly Lucyferazy Ulepszony zestaw testowy 1000 testówGold Bio I-930-1000
: 96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej, Greiner Bio-One (z pokrywką, μ Przezroczysty biały płaski okrągły, komin) Firma VWR Kot# 82050-758 
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Genom Ha-CoV-2) Wektor Własny
odczynnik do transfekcji na bazie PEIVirongy BiosciencesTransfektyna
Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100X)Invitrogen10378016
Polietyleninamina, rozgałęzionaMillipore Sigma408727-100ML
System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 7 ProThermoFisher A43163
Gotowe do użycia (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) KomórkiVirongy BiosciencesGotowe do użycia komórki
SARS-CoV-2 S  Wektor Omicron (B.1.1.529)Virongy BiosciencespCoV2-B.1.1.529
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2)  VectorVirongy BiosciencespCoV2- B.1.617.2
Filtry strzykawkowe, PES, 0,22 i mikro; mGenesee Scientfic25-244
TaqMan Fast Virus 1-Step Master MixThermoFisher 
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%ThermoFisher 
Płytka infekcyjna 444443215250061

Bibliografia

  1. World Health Organization. Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1(2023).
  2. Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
  3. Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
  4. El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
  5. CDC. Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/lab-biosafety-guidelines.html (2021).
  6. Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
  7. Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116(2020).
  8. Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
  9. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  10. Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
  11. Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
  12. Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181(2022).
  13. Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
  14. Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
  15. Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  16. Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
  17. Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389(2021).
  18. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).
  19. Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386(2020).
  20. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963(2018).
  21. Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
  22. Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
  23. Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199(2023).
  24. Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
  25. Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
  26. Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test zaka no ci wirusacz stka wirusopodobnakom rki HEK293Treporter lucyferazowywariant Omicronwariant Deltaneutralizacja pseudowirusa
Zastosowanie pseudowirusa Ha-CoV-2 do szybkiej kwantyfikacji wariantów SARS-CoV-2 i przeciwciał neutralizujących
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.