Artykuł metodologiczny

Narzędzie do automatycznego tworzenia stabilnych i powtarzalnych przerw bezkomórkowych w celu poprawy wiarygodności testu gojenia się ran komórkowych

DOI:

10.3791/65794

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzez włączenie projektowania doświadczeń interakcji i analizy wymagań użytkownika, wprowadzamy innowacyjny skrobak do komórek, który poprawia testy gojenia się ran komórkowych pod względem odtwarzalności, niezawodności, praktyczności, integralności komórkowej i doświadczenia użytkownika.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiarygodność pomiaru migracji komórkowej w testach gojenia ran jest często podważana przez powszechną niestabilność metodologiczną, tj. metodę opartą na końcówkach. Wprowadzamy innowacyjny instrument, który ma na celu wyeliminowanie tych ograniczeń. Nasz nowatorski skrobak do komórek przewyższa obecne podejście, generując bardziej spójną i stabilną lukę wolną od komórek. Powtarzające się eksperymenty biologiczne ujawniają, że bezkomórkowa szczelina wytworzona przez skrobak komórkowy wykazuje prostsze krawędzie oraz jednolity rozmiar i kształt w porównaniu z techniką opartą na końcówce (p < 0,05). Jeśli chodzi o konstrukcję produktu, skrobak do komórek może pochwalić się wyrafinowaną kolorystyką dostosowaną do środowisk laboratoryjnych, usprawniającą monitorowanie wyników eksperymentów i umożliwia sterylizację poprzez autoklawowanie w celu ponownego użycia. Warto zauważyć, że po leczeniu skrobak do komórek wykazuje znikomy wpływ na żywotność i proliferację komórek (odpowiednio 97,31% i 24,41%). I odwrotnie, metoda oparta na końcówkach zapewnia niższą żywotność komórek (91,37%) i proliferację (18,79%). W niniejszym badaniu przedstawiono skrobak do komórek jako nowatorskie urządzenie wielokrotnego użytku, zdolne do generowania powtarzalnych luk bezkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek, zwiększając w ten sposób wiarygodność testów gojenia się ran w porównaniu z istniejącymi technikami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nowotwory charakteryzują się wyraźnymi cechami, takimi jak selektywny wzrost, przemiany metaboliczne i modulacja immunologiczna, z których wszystkie intrygująco przyczyniają się do zwiększonej migracji komórek, co jest krytycznym złośliwym zachowaniem komórek nowotworowych. Ta cecha bezpośrednio wpływa na odległe przerzuty guza pierwotnego, zagrażając długotrwałemu przeżyciu pacjentów1,2,3. Selektywne korzyści wzrostu umożliwiają komórkom rakowym konkurowanie z normalnymi komórkami, podczas gdy przemiana metaboliczna wspiera tę szybką proliferację poprzez zmianę szlaków energetycznych. Jednocześnie modulacja immunologiczna pozwala guzom uniknąć mechanizmów obronnych organizmu. Badania podkreślają powagę tego problemu, pokazując, że przerzuty do płuc, często będące wynikiem wzmożonej migracji komórek, są śmiertelnym zdarzeniem prowadzącym do śmierci pacjentów z różnymi nowotworami4. Na przykład rak piersi5, rak szyjki macicy4 i kostniakomięsak6 stanowią odpowiednio 20%, 9% i 30% takich przypadków. Dlatego ocena migracji komórek nowotworowych stała się integralną częścią obecnych badań onkologicznych, co jeszcze bardziej podkreśla wieloaspektowy charakter progresji guza.

Test gojenia ran komórkowych to łatwa w użyciu metoda pomiaru migracji komórek in vitro, często stosowana w badaniach onkologicznych7. Większość eksperymentatorów używa końcówek pipet do ręcznego tworzenia ran komórkowych8. Chociaż taka metoda może szybko i wygodnie tworzyć rany komórkowe, nadal ma wiele ograniczeń, które wpływają na odtwarzalność i dokładność oceny migracji komórek. Po pierwsze, ręczne używanie końcówek do pipet do tworzenia zadrapań ma duży wpływ na kąt działania, siłę i prędkość operatora, co wpływa na powtarzalność metody8. Po drugie, defekty komórek generowane przez końcówki mają zwykle postrzępione krawędzie, a nie proste, ponieważ końcówki pipet są produktami z tworzyw sztucznych o określonej elastyczności9. Niektóre badania generują rany poprzez umieszczenie prefabrykowanych wkładek hodowlanych bezpośrednio na płytce hodowli komórkowej, aby ograniczyć zakres proliferacji komórek10. Takie podejście pozwala obejść ograniczenia metody opartej na końcówkach, takie jak postrzępione krawędzie i odtwarzalność. Jednak nawet w przypadku materiałów biokompatybilnych, długotrwałe współistnienie osadzenia z komórkami nadal wpływa na wzrost komórek11. Co więcej, osadzenie może również powodować komórkowe zmiany epigenetyczne w strefie brzeżnej z powodu ograniczenia kontaktu12. Ponadto wkładki kontaktowe wykonane z materiałów biokompatybilnych są drogie i trudne do ponownego wykorzystania, co ogranicza ich wykonalność13. W związku z tym potrzebne jest nowatorskie, powtarzalne i praktyczne narzędzie, które pozwoli łatwo określić ilościowo migrację komórek in vitro.

Głównym celem tej metody jest wprowadzenie innowacyjnego narzędzia do ilościowego określania migracji komórek in vitro w badaniach onkologicznych, rozwiązanie ograniczeń istniejących technik oraz zwiększenie odtwarzalności i dokładności w ocenie migracji komórek.

Uzasadnieniem rozwoju tej techniki jest krytyczne znaczenie oceny migracji komórek nowotworowych w onkologii. Guzy wykazują charakterystyczne cechy charakterystyczne, w tym korzyści związane z selektywnym wzrostem, przeprogramowaniem metabolicznym i modulacją immunologiczną, co przyczynia się do zwiększonej migracji komórek, podstawowego aspektu złośliwości raka. Metoda ta ma na celu zapewnienie bardziej niezawodnego sposobu badania migracji komórek, przyczyniając się do głębszego zrozumienia zachowania guza.

Ta metoda oferuje znaczne przewagi nad istniejącymi technikami. Ręczne testy zarysowań mogą ucierpieć z powodu zakłóceń zależnych od operatora, podczas gdy wkładki hodowlane mogą wpływać na wzrost komórek i ekspresję genów. W przeciwieństwie do tego, metoda ta oferuje lepszą powtarzalność, dokładność i praktyczność, stanowiąc opłacalne rozwiązanie do pomiaru migracji komórek in vitro w badaniach onkologicznych. Jest to odpowiedź na kluczowe zapotrzebowanie na niezawodne i dostępne narzędzie do badania migracji komórek w różnych typach nowotworów, co czyni je cennym uzupełnieniem tej dziedziny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pełna pisemna świadoma zgoda została udzielona przez wszystkich uczestników. Zatwierdzenie etyki nie miało zastosowania, ponieważ do niniejszego badania nie włączono żadnych próbek tkanek zwierzęcych ani ludzkich.

1. Badanie wymagań społeczności użytkowników

  1. Dostarcz kwestionariusze do biologów/eksperymentatorów pracujących nad testami gojenia się ran komórkowych. Zbierz wypełnione kwestionariusze i wykorzystaj je w badaniu. W ramach tego badania od 12 października 2021 r. do 3 lutego 2022 r. 100 biologom dostarczono 100 kwestionariuszy. Odsetek odpowiedzi wyniósł 97%.
  2. Poproś respondentów, aby odpowiedzieli na pytania takie jak: który z eksperymentów z drapaniem komórek najbardziej Ci przeszkadzał? i jakie narzędzie zostało użyte do wykonania drapania komórek? Po tych pytaniach wraz z pytaniami podrzędnymi prześledź przyczyny.
  3. Zbadaj postrzeganie przez eksperymentatorów narzędzi, takich jak końcówki do pipet i wkładki do hodowli komórkowych w eksperymentach gojenia się ran komórkowych. Zrozum i zbierz powody, dla których wybrali jedno narzędzie, a nie drugie, korzystając z teorii łańcucha środków i końca opartej na technikach drabinkowych w sekcji kwestionariuszy14,15.
    UWAGA: Metoda drabinkowa dzieli się na dwa rodzaje: metodę miękkiej drabiny z wywiadami pogłębionymi i metodę twardej drabiny z kwestionariuszami lub quizami na papierze i ołówku16. Metoda twardej drabiny była podstawową techniką zastosowaną w tym badaniu. Teoria łańcucha środków sugeruje, że jawna wiedza posiadana przez docelowych użytkowników jest powierzchowna i konkretna, podczas gdy wiedza ukryta jest głęboka i abstrakcyjna17,18,19.

2. Projektowanie i modelowanie trójwymiarowe

  1. Narysuj szkic na podstawie spostrzeżeń zebranych z poprzedniego badania ankietowego i rozpocznij proces projektowania. Użyj tego wstępnego szkicu jako podstawowego planu.
    1. Opracuj wymiary i układ każdego komponentu, stosując funkcje Dim, DimRadius i DimDiameter w oprogramowaniu do modelowania.
    2. Pomiary suwmiarką z noniuszem należy wykonywać z dokładnością do 0,02 mm na rzeczywistych płytkach 6-dołkowych, aby ustalić ostateczne wymiary skrobaka do komórek. Upewnij się, że mają 42,1 mm długości, 42,1 mm szerokości i 18,5 mm wysokości. Zwróć uwagę na szczegóły w fazie projektowania, zwłaszcza na wysokość produktu i przydatność w studni, aby ułatwić płynniejszy montaż.
  2. Skonstruuj trójwymiarowy model i wyrenderuj go.
    1. Rozpocznij projektowanie 3D w oprogramowaniu od utworzenia podstawowego modelu. Kliknij przyciski, takie jak ExtrudeCrv do rozciągania i Loft do kształtowania projektu. Udoskonal model, a następnie kliknij przycisk Zaokrąglnijkrawędź, aby uzyskać gładkie krawędzie.
      UWAGA: Inne używane przyciski funkcyjne to: Linie - Rysowanie segmentów linii prostych, Polilinie - Tworzenie ciągłych linii złożonych z wielu segmentów, Prostokąty - Rysowanie kształtów prostokątnych, Koła - Rysowanie okrągłych kształtów, Łuki - Rysowanie kształtów łukowych lub eliptycznych, Punkty - Umieszczanie znaczników jednopunktowych, Tekst - Dodawanie etykiet tekstowych, Wymiary - Aby dodać zmierzone wymiary do modeli, Szyk - Aby utworzyć skopiowane wzory obiektów, Obróć - Aby obrócić obiekty pod żądanymi kątami, Przesuń - Aby przenieść obiekty w nowe lokalizacje, Skala - Aby zmienić rozmiar obiektów większych lub mniejszych, Przytnij/Rozszerz - Aby przyciąć lub wydłużyć obiekty tak, aby spełniały inną geometrię, Suma logiczna/Różnica/Przecięcie - Aby łączyć, odejmować lub znajdować przecięcie obiektów, Warstwy — aby organizować obiekty na różnych warstwach, Render — aby generować renderowane widoki z materiałami i oświetleniem oraz Eksport — aby eksportować geometrię modelu do innych formatów plików.
    2. Zaimportuj model do oprogramowania do renderowania 3D. Zastosuj materiały, takie jak plastik, gąbka i stal, a następnie dostosuj oświetlenie, aby uzyskać realistyczne renderowanie.
      UWAGA: Uogólniona lista przycisków funkcyjnych obejmuje: Przeciągnij i upuść - Aby zastosować materiały bezpośrednio do części lub modeli, przeciągając materiał z biblioteki i upuszczając go na żądany komponent w widoku w czasie rzeczywistym, Kliknij prawym przyciskiem myszy - Po kliknięciu prawym przyciskiem myszy materiału w bibliotece zazwyczaj zobaczysz opcje, aby: Zastosuj do zaznaczenia - Zastosuj materiał do wybranej części w widoku w czasie rzeczywistym. Edytuj materiał - Dostosuj właściwości materiału. Właściwości materiału (po wybraniu materiału) — umożliwia dostęp i modyfikację określonych właściwości materiału, takich jak kolor, chropowatość, współczynnik załamania światła i inne atrybuty. Pasek wyszukiwania — umożliwia szybkie znajdowanie materiału w bibliotece przez wpisanie jego nazwy lub powiązanych słów kluczowych. Kategorie/Foldery - Aby poruszać się po różnych kategoriach lub folderach materiałów, takich jak metale, tworzywa sztuczne, szkło itp. Dodaj do ulubionych - Aby oznaczyć określone materiały jako ulubione, aby mieć do nich łatwy dostęp podczas przyszłych sesji. Skróty klawiszowe — dostęp do niektórych operacji można uzyskać za pomocą skrótów klawiszowych. Na przykład M jest zwykle skrótu, który szybko wyświetla właściwości materiału wybranej części.
    3. Na koniec popraw kontrast (+56) i nasycenie obrazu (Jaskrawość +19, Nasycenie +7) w oprogramowaniu fotograficznym i projektowym, a także dodaj elementy tła (informacje tekstowe i kolor od białego do jasnoszarego tła gradientowego) dla kontekstu, aby zapewnić wysokiej jakości, realistyczne odwzorowanie produktu.
      1. Użyj opcji Image > Adjustment (Dopasowania obrazu), Jasność/Kontrast (Jasność/Kontrast), aby dostosować kontrast obrazu. Użyj opcji Obraz > Barwa/Nasycenie, aby zmodyfikować poziom nasycenia obrazu. Użyj narzędzia tekstowego (ikona T), aby dodać informacje tekstowe do obrazu .
        UWAGA: Uogólniona lista przycisków funkcyjnych obejmuje narzędzie Elipsa (U) - Do rysowania kropek/okręgów. Ustaw narzędzie tak, aby narysowało kształt, wybierz żądany kolor wypełnienia, a następnie kliknij i przeciągnij (przytrzymując Shift, aby zachować idealne koło), aby utworzyć kropkę. Narzędzie Linia (U) - Aby narysować linie proste na obrazie. Wybierz narzędzie, ustaw żądaną szerokość linii, a następnie kliknij i przeciągnij, aby narysować linię. Narzędzie Pędzel (B) - Alternatywny sposób rysowania kropek i linii. Wybierz rozmiar i kształt pędzla, a następnie kliknij (w przypadku kropek) lub kliknij i przeciągnij (w przypadku linii).
  3. Po ukończeniu modelu trójwymiarowego przystąp do produkcji skrobaka komórkowego metodą mielenia i montażu20,21,22.

3. Produkcja

  1. Wykorzystaj teorię koloru, materiałów i wykończenia (CMF) w obecnym badaniu, aby zaprojektować prototypy skrobaka komórkowego. Teoria CMF służy jako metodologia projektowania w badaniach naukowych. Zwiększa użyteczność produktu, kształtuje percepcję użytkownika i kieruje wyborem materiałów23,24,25.
    1. Wybierz kolory, które mają być używane w skrobaku komórkowym ze standardowego systemu kolorów, w tym 6 C, Chłodny szary 6 C i 11-0601TPG26,27.
    2. Aby zbudować skrobak do komórek, który spełnia standardy laboratoryjne, wybierz odpowiednie materiały, w tym polipropylen (PP), gąbkę i stal wysokowęglową. Aby wytworzyć fizyczne prototypy, zacznij od użycia drukarki 3D do wytworzenia szkieletu konstrukcyjnego. Następnie użyj złączy lub środków klejących, aby zakończyć montaż skrobaka.
      UWAGA: Aby przygotować fizyczny produkt skrobaka komórkowego, zmiel i zmontuj niezbędne materiały. Protokoły bezpieczeństwa muszą być przestrzegane przez cały proces, aby zapewnić bezpieczny i skuteczny produkt końcowy.
    3. Przejdź do procesu wykańczania, który może obejmować cięcie, szlifowanie, polerowanie, tłoczenie lub inne techniki. Zacznij od przeszlifowania modelu papierem ściernym o średniej ziarnistości i ziarnistości 120, aby usunąć wszelkie szorstkie krawędzie.
    4. Następnie użyj papieru ściernego o drobnej ziarnistości 220, aby uzyskać gładką powierzchnię.
    5. Szlifowanie końcowe w celu wygładzenia powierzchni, upewniając się, że złącza wtykowe lub wbudowane są prawidłowo dopasowane.
    6. Bezpiecznie połącz suwak I i II za pomocą łączników (prętów stałych), aby zapewnić solidny i trwały montaż skrobaka do komórek. Osiągnij ostateczny, stały kształt skrobaka komórkowego poprzez połączenie mocowania mechanicznego i klejenia. Użyj elementów złącznych, w szczególności konstrukcji wpustowej i czopowatej, aby połączyć części ze sobą za pomocą siły mechanicznej. Dodatkowo, aby zwiększyć wytrzymałość zespołu, nałóż klej (klej), aby jeszcze bardziej skleić elementy.
    7. Autoklawuj skrobak w temperaturze 121,3 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że zachowa swój pierwotny kształt i właściwości fizyczne.

4. Hodowla komórkowa

  1. Hoduj komórki HOS w minimalnej niezbędnej pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Hodować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Zmieniaj pożywkę co 2 dni.
  3. Gdy wzrost komórek przekroczy 80% konfluencji, dodaj 1 ml trypsyny z 0,25% EDTA i traw przez 60 sekund. Następnie odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut w celu uzyskania subkultury. Usunąć supernatant i dodać pożywkę hodowlaną, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 104 komórek na studzienkę. Użyj automatycznego licznika komórek do zliczania komórek.

5. Ocena potencjału zniszczeń komórek przez skrobak do komórek i metoda oparta na końcówkach

  1. Przygotuj wszystkie materiały do zranienia i wysterylizuj je promieniowaniem ultrafioletowym, naświetlając je na 30 minut.
  2. Po sterylizacji nawiń 100% zlewające się komórki HOS na płytki 6-dołkowe o stężeniu 5 x 104 komórki na studzienkę, stosując metodę skrobaka do komórek lub metodę opartą na końcówkach.
    1. W przypadku metody opartej na końcówce użyj końcówki o pojemności 100 μl i przeciągnij ją po komórce zawierającej podłoże 1 pociągnięciem w kierunku poziomym, a drugim w kierunku pionowym.
    2. W przypadku metody skrobaka komórkowego umieść prototyp skrobaka w jednym z dołków i za pomocą pęsety delikatnie naciśnij raz. Komórki są zranione. Przeprowadzaj każdy eksperyment z ranieniem w trzech egzemplarzach.
  3. Analizuj wszystkie rany komórkowe za pomocą mikroskopu cyfrowego i oprogramowania do obrazowania.

6. Pomiar żywotności i proliferacji komórek

  1. Wykonaj wszystkie testy żywotności komórek zgodnie z protokołem dostarczonym w zestawie CCK-8.
  2. Inkubować komórki z roztworem CCK-8 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zmierzyć ich absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia żywotności komórek.
  3. Zaprojektuj test inkorporacji 5-etynylo-20-deoksyurydyny (EdU), aby dokładnie określić ilościowo duplikację DNA i bezpośrednio określić ilościowo współczynnik proliferacji komórek. Określ wpływ różnych metod generowania ran komórkowych na proliferację komórek za pomocą testu EdU, postępując zgodnie z protokołem opisanym w poprzedniej publikacji28.
  4. Wybarwić komórki i zobrazować je za pomocą systemu mikroskopu cyfrowego. Upewnij się, że każdy eksperyment jest przeprowadzany w trzech egzemplarzach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizowanie żądań użytkowników dotyczących narzędzi do generowania ran komórkowych
Obecna eksperymentalna metoda generowania ran komórkowych wymaga dalszego ulepszenia w celu rozwiązania wielu problemów, które zagrażają odtwarzalności biologicznej, solidności, ekonomicznemu zużyciu i doświadczeniu użytkownika w zakresie gojenia się ran komórkowych. Wykorzystaliśmy metodę twardej drabiny do analizy wymagań użytkowników zaangażowanych w eksperymenty biologiczne za pomocą kwestionariuszy29 (Rysunek 1A). Informacje zawarte w kwestionariuszu, takie jak imiona i nazwiska, zostały zanonimizowane w celu ochrony ich prywatności. Szczegółowe informacje na temat kwestionariusza przedstawiono w tabeli 1. W ciągu 6 tygodni badania dla 100 osób otrzymano 97 w pełni wypełnionych kwestionariuszy, wykluczono 3 podejrzane i nieważne kwestionariusze; Wskaźnik odpowiedzi wyniósł 97,00%.

Wyniki pokazują, że najbardziej kłopotliwymi problemami w testach gojenia się ran komórkowych były ząbkowane krawędzie (nie proste) oraz niestabilna szerokość lub obszary ran, stanowiące odpowiednio 55,67% i 29,90%. Były one znacznie wyższe niż w przypadku niższego tempa wzrostu komórek, zanieczyszczenia komórek i innych opcji (odpowiednio 3,09%, 5,15% i 6,19%) (p < 0,001, Rysunek 1B). Jeśli chodzi o dobór narzędzi do tworzenia ran, stosowanie końcówek do pipet było znacznie bardziej rozpowszechnione niż wkładek do hodowli komórkowych (Rysunek 1C). Wynikało to głównie z faktu, że wkładki do hodowli komórkowych są dość drogie i nie nadają się do ponownego użycia (Rysunek 1D), podczas gdy końcówki do pipet są tanie, wykazują eksperymentalną odtwarzalność (6,59%) i żywotność komórek (20,88%, Rysunek 1E). Co ważne, aż 69,23% użytkowników twierdziło, że cena wkładek do hodowli komórkowych przekraczała ich budżet (Rysunek 1D). Dla porównania, tylko 6 osób wybrało wkładki do hodowli komórkowych, z których tylko 16,67% uznało, że ich cena jest akceptowalna (Ryc. 1F). Wreszcie, jeśli chodzi o innowacyjne narzędzie do generowania ran komórkowych, 86,60% z nich było optymistycznie nastawionych, podczas gdy tylko mniej użytkowników było niechętnych (4,12%, Rysunek 1G).

Następnie przeanalizowano funkcje produktu, których użytkownicy pilnie potrzebowali30,31,32. Cechy te obejmowały proste rany, stabilną szerokość i obszar ran, wysoką powtarzalność i akceptowalną cenę. W związku z tym przeprowadzono kolejne działania projektowe.

Decyzja o zaprojektowaniu elementów i materiałów użytych do opracowania skrobaka komórkowego
Powyższe dane pokazują, że materiały laboratoryjne stosowane w rutynowych badaniach biologicznych muszą być ściśle sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek33. Dlatego proponowany skrobak do komórek powinien być sterylny. Chociaż narzędzia jednorazowego użytku mogą być sterylizowane tlenkiem etylenu, koszt eksperymentu nieuchronnie wzrośnie34,35,36. Dlatego zamiast materiałów jednorazowych proponujemy zaprojektowanie skrobaka komórkowego z materiału wielokrotnego użytku o dużej tolerancji na sterylizację parą wodną pod wysokim ciśnieniem (121,3 °C), aby obniżyć koszty i zwiększyć elastyczność w przypadku zastosowania w różnych przypadkach37. Aby spełnić te wymagania, materiał użyty do budowy skrobaka komórkowego musi mieć określone cechy fizyczne i chemiczne, w tym odporność na ciepło, wysokie ciśnienie i korozję parą wodną.

Dla zamierzonego zastosowania skrobaka komórkowego, oprócz spełniania podstawowych funkcji, takich jak wykonywanie prostych krawędzi ran, powinien on również mieć atrakcyjny wygląd i kolor. Jeśli chodzi o modelowanie, biorąc pod uwagę obszary docelowe i zastosowania, ogólny styl powinien być odpowiedni dla laboratoriów. Wygląd nie powinien być zbyt ostentacyjny, aby utrudnić personelowi obserwowanie postępów w eksperymentowaniu. Co więcej, jego rozmiar powinien być odpowiedni dla płytek sześciodołkowych, a powierzchnia powinna mieć występ, aby pęseta mogła go stabilnie podnieść.

CMF w projektowaniu jest krytycznym aspektem projektowania produktu, wpływającym na estetykę i doświadczenie użytkownika. Wybór koloru wpływa na reakcję emocjonalną, wybór materiałów wpływa na funkcjonalność i zrównoważony rozwój, a wykończenie decyduje o odczuciach dotykowych i atrakcyjności wizualnej. Projektanci CMF harmonizują te elementy, biorąc pod uwagę trendy rynkowe i tożsamość marki, aby tworzyć produkty, które rezonują z użytkownikami.

Zgodnie z teorią CMF, trzy kluczowe czynniki, w tym kolor, materiał i proces wykończenia, zostały wzięte pod uwagę w celu określenia ich wpływu na funkcję i efekt wizualny24. W pierwszej kolejności przeprowadzono dobór kolorów. W tym kontekście kolor odnosi się do koloru wewnętrznego, który jest nieodłącznym kolorem przedmiotu lub substancji w standardowych warunkach oświetleniowych, pozbawionym wpływu zewnętrznych źródeł światła lub odbić. Biorąc pod uwagę, że płytka sześciodołkowa jest wykonana z PP o przezroczystej powierzchni, jako kolor wewnętrzny wybrano ciemnoszary. Ten wybór został dokonany z myślą o łatwej identyfikacji i obsłudze, ponieważ ciemnoszary zapewnia optymalny kontrast i widoczność po nałożeniu na inne kolory. Poza tym ciemnoszary jest mniej podatny na zniekształcenia kolorów w połączeniu z innymi kolorami, co również ma kluczowe znaczenie dla obserwacji. Podstawowe komponenty funkcjonalne zostały dodatkowo wyróżnione kolorem czarnym (Rysunek 2A).

Komercyjny system dopasowywania kolorów został wybrany jako standard wyboru kolorów ze względu na jego powszechną akceptację i zastosowanie w różnych branżach. Opierając się na zdolności firmy do odwzorowania spójnych kolorów na różnych nośnikach, wybrano ją do badania, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnego i spójnego odwzorowania kolorów.

Wybór materiału został przeprowadzony na podstawie wyżej wymienionych wyników kwestionariuszy. Obudowa i elementy skrobaka zostały wykonane z żaroodpornego tworzywa sztucznego, polipropylenu (PP), aby spełnić wymóg sterylizacji przez autoklawowanie, jak pokazano na Rysunek 2B. Stal wysokowęglowa nadaje się do produkcji sprężyn, ponieważ jest odporna na wysokie i niskie temperatury, odporna na korozję w środowisku laboratoryjnym. Do buforowania użyto gąbek o dużej gęstości i umieszczono je na końcu szkiełka.

Wreszcie, proces wykańczania został opracowany. Ponieważ skrobak do komórek jest często używany i łatwo ulega zanieczyszczeniu, a jakość powierzchni wpływa na sterylizację, gładka i błyszcząca powierzchnia jest preferowana dla skrobaka do komórek, ponieważ pomaga użytkownikowi szybko zidentyfikować źródło zanieczyszczenia i poradzić sobie z nim, dając poczucie czystości. Końcówki są częściowo szlifowane, aby uniknąć uszkodzenia dna szalki hodowlanej, co może wpłynąć na środowisko hodowli i spowodować ograniczenie proliferacji komórek38.

Projekt i prototyp skrobaka komórkowego
Na podstawie powyższych wyników zaprojektowano trzy prototypy skrobaka komórkowego (Rysunek 3A). Badania pokazują, że najczęściej używanymi ranami komórkowymi na płytkach hodowli komórkowych były rany w kształcie krzyża39, co znacznie różni się od prototypu I, w którym zastosowano rany prostokątne; w ten sposób prototyp I został uchylony (Rysunek 3A). Chociaż prototyp II i III mogły tworzyć obszary wolne od komórek w kształcie krzyża, szyna ślizgowa prototypu II była trudna do zamocowania w dyskach hodowli komórkowych, a jej infrastruktura była dość skomplikowana (Rysunek 3A). Po wnikliwych dyskusjach prototyp III został wyróżniony jako ostateczny model do produkcji skrobaka do komórek.

Zwłaszcza, że kształt końcówek może bezpośrednio wpływać na obszar wolny od komórek pod względem krawędzi i rozmiarów, zaprojektowano trzy szkice do wyboru. Szkic I miał ostrą górę, która mogła zapewnić bardzo proste krawędzie; jednak interfejs hodowli umożliwiający proliferację komórek może być osłabiony, jeśli końcówki są zbyt ostre (Rysunek 3B). Szkic II oferował kwadratową górę, która mogła uniknąć uszkodzenia płytek kultur komórkowych. Ponieważ jednak powierzchnia styku między końcówką a dnem płytki hodowlanej jest kwadratowa, jest ona niestabilna podczas jej używania (Rysunek 3B). Szkic III zawierał, zaokrągloną końcówkę, skutecznie unikającą powyższych problemów (Rysunek 3C). Dlatego został wybrany jako ostateczny projekt.

Projekt został zoptymalizowany pod trzema względami: odpowiednio metodą mocowania fixera, wbudowaną gąbką amortyzującą i łatwością chwytania. Po pierwsze, oczekiwane metody mocowania produktu obejmowały wyboczenie40, wpuszczanie i czop41 oraz pivoting42. Biorąc pod uwagę rzeczywisty koszt produkcji i operatywność, pod utrwalaczem w kształcie krzyża zaprojektowano pazur, aby ułatwić zaciskanie krawędzi studni. Dodatkowo w teście gojenia się zadrapań komórek zaobserwowaliśmy, że końcówki odbijały się od niego po dotknięciu ściany w pobliżu końca ze względu na stałą długość i twardość szkiełek, co wpływało na stan zarysowania. Dlatego na końcu zjeżdżalni dodaliśmy amortyzującą gąbkę, aby ustabilizować ruch końcówek. (Rysunek 3A,C). Na koniec do występu dodano wgłębienie powierzchniowe, aby ułatwić chwytanie pęsety.

Trójwymiarowy model został następnie skonstruowany przy użyciu oprogramowania do projektowania 3D. Jego renderowanie jest pokazane w Rysunek 4A. Wykres wybuchowy szczegółowo opisuje wewnętrzne struktury skrobaka komórkowego, który pokazuje jego niezbędne cechy omówione powyżej (Rysunek 4B). Dodatkowo, aby osiągnąć cel, jakim jest płynne przesuwanie końcówek i prostych krawędzi, przyjęto wewnętrzną mechaniczną strukturę przenoszenia mocy. Cała jednostka funkcjonalna skrobaka komórkowego składa się z części kontrolnej. W rzeczywistej pracy dźwignia łącząca wewnątrz skrobaka komórkowego jest połączona z górnym przyciskiem, a koniec przesuwa się w dół po przyłożeniu nacisku, aby wygiąć końcówkę. Sprężyna wewnątrz zamka jest zwalniana, aby popchnąć końcówki do ruchu. Na koniec zatrzymuje się na gąbce z wąską szczeliną, aby zakończyć skrobanie, a następnie przełącza się, aby zresetować po ponownym użyciu (Rysunek 5A). Co więcej, łatwość nauki i wygodna obsługa są kryteriami, które biolog musi mierzyć jakością produktu. W związku z tym, jeśli chodzi o wygląd produktu, układ powierzchni był zgodny z zasadą symetrii i schludności43,44, rozróżniając i podkreślając różne elementy za pomocą różnych odcieni czerni, bieli i szarości (Rysunek 5A).

Skrobak komórkowy jest lepszy od metody drapania końcówek w praktycznym zastosowaniu
Fizyczny produkt skrobaka komórkowego został przygotowany przy użyciu metody mielenia i montażu (Rysunek 5B). Zgodnie z oczekiwaniami, skrobak do komórek doskonale zintegrował się z płytką sześciodołkową, z górnym uchwytem w kształcie krzyża ściśle przylegającym do krawędzi płytki, zapewniając mocne mocowanie (Rysunek 5C). Co więcej, końcówki precyzyjnie przylegały do dna sześciodołkowej płytki, ułatwiając płynne tworzenie obszarów wolnych od komórek. Na koniec skrobak do komórek został poddany autoklawowaniu, aby sprawdzić, czy może być wielokrotnego użytku. Jak pokazano w Rysunek 5D, obecny skrobak komórkowy zachował oryginalny kształt i wydajność fizyczną nawet po autoklawowaniu w temperaturze poniżej 121,3 °C przez 30 minut.

Skrobak do komórek przewyższył istniejącą metodę tworzenia ran komórkowych w teście porównawczym. Po wielokrotnych testach drapak komórek wykazał wysoką stabilność i odtwarzalność w przygotowaniu rany, wykazywał niskie wahania w obszarze każdej rany i prawie proste krawędzie, z odchyleniem standardowym obszaru wolnego od komórek wynoszącym 483,73 i odchyleniem do prostej krawędzi 5041,33 ± 2420,00. W przeciwieństwie do tego, obszar każdej rany przygotowany przez końcówki pipet wykazywał większą fluktuację, z odchyleniem standardowym obszaru wolnego od komórek wynoszącym 3905,80 i odchyleniem do prostej krawędzi wynoszącym 19562,33 ± 1068,39 (Rysunek 6A-C).

Na koniec, oceniono wpływ na żywotność komórek po zranieniu komórek (Rysunek 6D). Wyniki wykazały, że 12 godzin po zakończeniu rany komórkowej żywotność komórek była nieznacznie, ale znacznie wyższa w grupie skrobaków komórkowych niż w grupie końcówek. Przeprowadzono test EdU w celu dalszego potwierdzenia tych wyników i wyjaśnienia wpływu różnych metod przygotowania ran komórkowych na proliferację komórek, tj. replikację DNA. Wyniki testu EdU wykazały, że odsetek proliferujących komórek w grupie skrobaków komórkowych (24,41% ± 0,48) był znacznie wyższy niż w metodzie końcówek (18,79% ± 1,46) po 12 godzinach (Rysunek 6E,F).

Te dane zdecydowanie potwierdziły, że obecny generator ran komórkowych przewyższa obecną metodę tworzenia ran komórkowych pod względem stabilności i biologicznej odtwarzalności. Miało to niewielki wpływ na żywotność i proliferację komórek. Wszystkie te niezwykłe zalety generatora uzwojeń komórek potwierdziły jego potencjał w zakresie poprawy obecnych testów ran komórkowych poprzez zapewnienie wiarygodności i powtarzalności uzyskanych danych.

figure-results-1
Rysunek 1: Użytkownik domaga się analiz. (A) Wykres Sankeya przedstawia przebieg badań opartych na kwestionariuszach dla eksperymentatorów. (B) do (G) przedstawić wyniki kwestionariuszy, w tym odpowiedzi na pytania od 1 do 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Projekt produktu z użytymi kolorami i materiałami. (A) Wybór kolorów. (B) Autoklaw używany w doświadczeniach biologicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Projektowanie produktów o szczegółowych strukturach. (A) Trzy prototypowe kandydatury skrobaka komórkowego. (B) Trzy szkice projektu końcówki. (C) Rysunek trójwidokowy wybranego prototypu III przedstawiający jego ogólny projekt oraz parametry fizyko-przestrzenne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Renderowany trójwymiarowy model i wyświetlanie wewnętrznych struktur. (A) Render trójwymiarowego modelu. (B) Wykres wybuchowy przedstawiający wewnętrzne struktury proponowanej zgarniarki do komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Mechanizmy działania skrobaka komórkowego. (A) Szkice pokazują, jak działa skrobak do komórek. (B) Produkt fizyczny zgarniacza komórek. (C) Skrobak do komórek mieści się w płytce 6-dołkowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Eksperymentalna walidacja skrobaka komórkowego. (A) Rany komórkowe wygenerowane różnymi metodami i ich pogrupowane wyniki porównania zostały pokazane w (B) i (C), podziałka wynosi 100 μm. (D) Wyniki żywotności komórek. (E) i (F) wyniki testu Edu, podziałka wynosi 50 μm. Do oceny statystycznej przeprowadzono test t dla porównania grupowego, a pierwotną wartość p dostosowano za pomocą testu Holma-Bonferroniego, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

I) Który z poniższych jest dla ciebie najbardziej kłopotliwy w eksperymencie z drapaniem komórek?
A) Brak prostych krawędzi
B) Niestabilna szerokość
C) Powolna proliferacja
D) Zanieczyszczenie komórek
e) Inne
II) Jakich narzędzi używasz do generowania ran komórkowych
A) Końcówki do pipet (przejdź do pytania III)
B) Wkładki do hodowli komórkowych (przejdź do pytania IV-V)
III) Dlaczego nie wybierasz wkładek do hodowli komórkowych?
A) Żywotność komórek
B) Nie nadaje się do wielokrotnego użytku
C) Koszt
d) Inne
IV) Dlaczego zdecydowaliście się Państwo na wkładki do hodowli komórkowych?
a) Koszt
B) Powtarzalność
C) Inne
V) Jakie są Twoim zdaniem najpoważniejsze problemy związane z wkładkami do hodowli komórkowych?
A) Stan komórki
B) Nie nadaje się do wielokrotnego użytku
C) Drogie
d) Inne
e) Zadowolony
VI) Gdyby istniało niedrogie, wielokrotnego użytku (autoklawowalne), wysoce powtarzalne narzędzie do drapania, jak chętnie byś je kupił i używał?
A) Bardzo chętny
b) Chętny
C) Nie jestem pewien
d) Niechętny

Tabela 1: Kwestionariusz użyty w tym badaniu składa się z sześciu pytań, które mają na celu zrozumienie sytuacji, z jakimi spotykają się biolodzy podczas testów gojenia się ran komórkowych.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie miało na celu opracowanie automatycznego, zmechanizowanego narzędzia do oznaczania gojenia się ran komórkowych. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsza próba zastosowania zmechanizowanej struktury napędzanej do automatycznego tworzenia ran komórkowych za pomocą jednego kliknięcia. W ten sposób staramy się wyeliminować wady tradycyjnej metody opartej na końcówkach, takie jak niska odtwarzalność i niestabilny stan zarysowania. Korzystając z pozytywnych wyników i zachęcających informacji zwrotnych od społeczności użytkowników, oczekuje się, że skrobak do komórek zapewni eksperymentatorom wydajną i stabilną alternatywę do tworzenia ran komórkowych, znacznie poprawiając w ten sposób poziom pewności wyników analizy eksperymentalnej.

W celu korzystania z obecnego skrobaka do komórek, użytkownik powinien 1) przygotować komórki w oczekiwaniu na utworzenie wolnej od komórek szczeliny, podobnie jak w przypadku tradycyjnych metod, takich jak metoda oparta na końcówce, tj. Wysiewanie komórek na płytce sześciodołkowej o określonej gęstości; 2) poczekaj, aż współczynnik konwergencji komórkowej osiągnie > 90%; 3) umieść sterylny skrobak do komórek w dołku płytki, kliknij przycisk, jak pokazano na rysunku 5, a wolna od komórek szczelina zostanie automatycznie utworzona w ciągu 1-2 sekund.

Test gojenia się ran komórkowych jest szeroko stosowany do pomiaru zdolności migracji komórek. Zazwyczaj eksperymentatorzy używają końcówek pipet do tworzenia ran komórkowych. Na przykład Tariq i wsp. użyli końcówki pipety do stworzenia ran komórkowych w celu oceny zdolności migracji komórek45; nieprzypadkowo Rahimi i wsp. użyli końcówki pipety w teście, aby obserwować zdolność migracyjną komórek PC346; w teście migracji komórek mezenchymalnych myszy Cormier i wsp. użyli również pistoletu do pipetowania47; demonstrując wpływ arsenu na migrację komórek skóry, Pinto i wsp. użyli końcówki pipety do pionowego skrobania48, między innymi.

Jednak, jak wspomniano wcześniej, używanie końcówki do tworzenia ran komórkowych wiąże się z kilkoma problemami, takimi jak zmienna powierzchnia wolna od komórek, postrzępione krawędzie oraz zależność od siły operatora i kąta zadrapania, co skutkuje niską odtwarzalnością49. Przedstawione wyniki ankiet dowiodły również, że metoda oparta na końcówkach ma bardziej widoczną przewagę nad wkładkami do hodowli komórkowych, szczególnie pod względem ceny, przeżywalności komórek i możliwości ponownego użycia narzędzia. Alternatywnie, wkładki ogniwowe są zbyt kosztowne i trudne do ponownego użycia, a każde narzędzie ma wady. Dlatego społeczność użytkowników jest na ogół optymistycznie nastawiona i chętna do wypróbowania innowacyjnych narzędzi. W ramach tego badania zaprojektowano i opracowano nowe narzędzie do przygotowywania obszarów wolnych od komórek, aby ułatwić i ustabilizować tworzenie się ran komórkowych.

Najważniejszym wkładem niniejszego badania jest opracowanie i eksperymentalna walidacja skrobaka komórkowego. W porównaniu z poprzednimi badaniami, ulepszenia obecnego skrobaka komórkowego obejmują następujące trzy główne punkty. 1) stabilne i wygodne wytwarzanie ran komórkowych. Badanie to wykazało, że w porównaniu z tradycyjną metodą opartą na końcówkach, rany komórkowe wytwarzane przez obecny skrobak do komórek miały proste krawędzie i mogły tworzyć podobne rany w powtarzających się eksperymentach, co znacznie poprawiło odtwarzalność i wiarygodność eksperymentów gojenia się ran komórkowych. 2) Obecny skrobak do komórek miał mniejszy wpływ na stan komórki. Nie wpłynęło to na żywotność i proliferację komórek (amplifikację DNA), co było znacznie lepsze niż metoda oparta na końcówce. Dlatego oczekuje się, że ten skrobak do komórek jeszcze bardziej zmniejszy wpływ czynników zewnętrznych na test gojenia się ran komórkowych w rutynowych eksperymentach. 3) Ten skrobak do komórek jest w dobrej zgodzie z wymaganiami społeczności użytkowników. Wyniki poprzedniego badania ankietowego wykazały, że wymagania użytkowników dotyczące nowego narzędzia do badania ran komórkowych obejmują głównie jednolitą szerokość pociągnięcia, wysoką powtarzalność, prostą procedurę obsługi i umiarkowaną cenę, które zostały osiągnięte w obecnym skrobaku do komórek. Ponadto skrobak do komórek został zaprojektowany w neutralnych kolorach, aby przekazać prostą i praktyczną koncepcję projektową tego produktu. Jednocześnie mocny kontrast czerni i bieli skutecznie podkreśla jego obszary funkcjonalne. Ogólny styl to kształt krzyża utworzony przez zaokrągloną artykulację zakrzywionej powierzchni, nawiązujący do konwencjonalnego kształtu rany i sugerujący rolę produktu. Trudność operacji jest zmniejszona dzięki uproszczeniu obsługi i funkcji ręcznego resetowania. Podsumowując, wyniki wskazują na obiecujące alternatywne narzędzie dla eksperymentatorów do przygotowywania zadrapań komórek w sposób zautomatyzowany i niezawodny za pomocą jednego kliknięcia, poprawiając w ten sposób odtwarzalność wyników naukowych.

Należy przyznać się do ograniczeń tego badania. Liczebność próby ankietowanych ogranicza możliwość uogólnienia tego badania; Dlatego będziemy dalej zwiększać wielkość próby w badaniu uzupełniającym, aby ulepszyć skrobak do komórek. Po drugie, drapak do komórek musi zostać włączony do dobrze zaplanowanego badania z większą populacją użytkowników, aby można było bardziej kompleksowo ocenić wydajność tego skrobaka do komórek.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie jest wspierane przez grant National Social Science Foundation (22FYSB023), Hubei Industrial Design Center Research Foundation (08hqt201412046) oraz Humanities and Social Science Foundation of Hubei Provincial Education Department (15Y054).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw CCK-8Beyotime Company, ChinyC0037
cyfrowy system mikroskopowyOlympusIX81
płodowa surowica bydlęcaGibco, USA16000044
HOS Procell Nauki przyrodnicze & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticswersja 6.0
KeyShotLuxionwersja 11.0oprogramowanie do renderowania 3D
czytnik mikropłytekBioTek, niemieckiELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
System dopasowaniaPantone PantoneKomercyjne dopasowywanie kolorów
penicylina-streptomycynaBeyotime Company, ChinyST488
PhotoshopAdobeoprogramowanie do zdjęć i projektowania
Rhinoceros 3D RobertMcNeel & Associateswersja 7.0Oprogramowanie do projektowania 3D
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-RadTC20
TrypsynaCytiva  HyClone, Stany ZjednoczoneSH30042.01

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Compr Physiol. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: a review. Crit Rev Oncol Hematol. 92 (2), 133-142 (2014).
  3. Verbeek, B. S., Adriaansen-Slot, S. S., Vroom, T. M., Beckers, T., Rijksen, G. J. F. I. Overexpression of EGFR and c-erbB2 causes enhanced cell migration in human breast cancer cells and NIH3T3 fibroblasts. FEBS Lett. 425 (1), 145-150 (1998).
  4. Vaideeswar, P., Aswani, Y., Damani, S., Singaravel, S. Pulmonary microvascular metastases in cervical carcinoma: A case series. J Postgrad Med. 66 (3), 155-158 (2020).
  5. Liang, Y., Zhang, H., Song, X., Yang, Q. Metastatic heterogeneity of breast cancer: Molecular mechanism and potential therapeutic targets. Semin Cancer Biol. 60, 14-27 (2020).
  6. Sasaki, R., Osaki, M., Okada, F. MicroRNA-based diagnosis and treatment of metastatic human osteosarcoma. Cancers (Basel). 11 (4), 553(2019).
  7. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene Ther. 15 (10), 730-738 (2008).
  8. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  9. Yue, P. Y., Leung, E. P., Mak, N., Wong, R. N. A simplified method for quantifying cell migration/wound healing in 96-well plates. J Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
  10. Roch, T., et al. Immunological evaluation of polystyrene and poly (ether imide) cell culture inserts with different roughness. Clin Hemorheol Microcirc. 52 (2-4), 375-389 (2012).
  11. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
  12. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons, Inc. (2015).
  13. Kato, T., et al. Reuse of cell culture inserts for in vitro human primary airway epithelial cell studies. Am J Respir Cell. 64 (6), 760-764 (2021).
  14. Veludo-de-Oliveira, T. M., Ikeda, A. A., Campomar, M. C. Discussing laddering application by the means-end chain theory. Qualit Rep. 11 (4), 626-642 (2006).
  15. Yang, T., Yang, F., Men, J. Recommendation content matters! Exploring the impact of the recommendation content on consumer decisions from the means-end chain perspective. Int J Info Manage. 68, 102589(2023).
  16. Sadeghlou, S., Emami, A. Residential preferences and satisfaction: a qualitative study using means-end chain theory. J Housing Built Env. 38, 1711-1734 (2023).
  17. Pieters, R., Baumgartner, H., Allen, D. A means-end chain approach to consumer goal structures. Int J Res Market. 12 (3), 227-244 (1995).
  18. Valette-Florence, P., Rapacchi, B. J. J. Improvements in means-end chain analysis: using graph theory and correspondence analysis. J Advert Res. 31, 30-45 (1991).
  19. Nunkoo, R., Ramkissoon, H. Applying the means-end chain theory and the laddering technique to the study of host attitudes to tourism. J Sustain Tourism. 17 (3), 337-355 (2009).
  20. Development of an automatic mold polishing system. Tsai, M. J., Chang, J. L., Haung, J. F. IEEE Int Conf Robot Auto, 3, 3517-3522 (2005).
  21. Altan, T., et al. Advanced techniques for die and mold manufacturing. CIRP Annals. 42 (2), 707-716 (1993).
  22. Kalt, E., Monfared, R., Jackson, M. Towards an automated polishing system: Capturing manual polishing operations. Int J Res Eng Tech. 5 (7), 182-192 (2016).
  23. Becerra, L. CMF design: the fundamental principles of colour, material and finish design. , Frame Publishers, UK. (2016).
  24. Pan, C., et al. Next-generation immuno-oncology agents: current momentum shifts in cancer immunotherapy. J Hematol Oncol. 13 (1), 29(2020).
  25. Kim, S., Nah, K. The development direction of emotional materials by increasing sensorial experiences-Focusing on the case study of CMF design. Arch Des Res. 27 (2), 121-135 (2014).
  26. Eiseman, L. The complete color harmony, pantone edition: expert color information for professional results. , Rockport Publishers. (2017).
  27. Eiseman, L., Recker, K. Pantone: The twentieth century in color:(coffee table books, design books, best books about color). , Chronicle Books. (2011).
  28. Deng, P., Jin, W., Liu, Z., Gao, M., Zhou, J. Novel multifunctional adenine-modified chitosan dressings for promoting wound healing. Carbohydr Polym. 260, 117767(2021).
  29. Ares, G., Giménez, A., Gámbaro, A. Understanding consumers' perception of conventional and functional yogurts using word association and hard laddering. Food Quality Prefer. 19 (7), 636-643 (2008).
  30. Lee, W. J. A study on word cloud techniques for analysis of unstructured text data. J Converg Culture Tech. 6 (4), 715-720 (2020).
  31. Word Cloud Explorer: Text Analytics Based on Word Clouds. Heimerl, F., Lohmann, S., Lange, S., Ertl, T. 47th Hawaii international conference on system sciences, , IEEE. (2014).
  32. Kulevicz, R. A., et al. Influence of sustainability reports on social and environmental issues: bibliometric analysis and the word cloud approach. Env Rev. 28 (4), 380-386 (2020).
  33. Rubbo, S. D., Gardner, J. F. A review of sterilization and disinfection. Lloyd-Luke. , (1965).
  34. Kelsey, J. C. Sterilization by ethylene oxide. J Clin Pathol. 14 (1), 59-61 (1961).
  35. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Sci. 22 (1), 1-16 (2017).
  36. Rutala, W. A., Gergen, M. F., Weber, D. J. Comparative evaluation of the sporicidal activity of new low-temperature sterilization technologies: ethylene oxide, 2 plasma sterilization systems, and liquid peracetic acid. Am J Infect Control. 26 (4), 393-398 (1998).
  37. Dion, M., Parker, W. Steam sterilization principles. Pharm Eng. 33 (6), 1-8 (2013).
  38. Környei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Sci Rep. 3, 1088(2013).
  39. Hsu, J. T., et al. Chronic wound assessment and infection detection method. BMC Med Inform Decis Mak. 19 (1), 99(2019).
  40. Katoh, M. Test-retest reliability of isometric ankle plantar flexion strength measurement performed by a hand-held dynamometer considering fixation: examination of healthy young participants. J Phys Ther Sci. 34 (6), 463-466 (2022).
  41. Li, X., Zhao, J., Ma, G., Huang, S. Experimental study on the traditional timber mortise-tenon joints. Adv Str Eng. 18 (12), 2089-2102 (2016).
  42. Cottle, R. W. The principal pivoting method revisited. Mathematical Prog. 48, 369-385 (1990).
  43. Cross, N. Engineering design methods: strategies for product design. , John Wiley & Sons. (2021).
  44. Otto, K., Wood, K. Product design: techniques in reverse engineering and new product development. , Pearson. (2001).
  45. Tariq, M., et al. Gefitinib inhibits M2-like polarization of tumor-associated macrophages in Lewis lung cancer by targeting the STAT6 signaling pathway. Acta Pharmacol Sin. 38 (11), 1501-1511 (2017).
  46. Rahimi, S., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of Lcn2 effectively enhanced CDDP-induced apoptosis and reduced cell migration capacity of PC3 cells. Life Sci. 231, 116586(2019).
  47. Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino, E., Paxson, J. Optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract. J Vis Exp. (106), e53414(2015).
  48. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (144), e58838(2019).
  49. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound healing assay. Methods Mol Biol. 294, 23-29 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

skrobaczka do kom rekstrefa wolna od kom rekmigracja kom rekywotno kom rekproliferacja kom rekpowtarzalny testmetoda oparta na ko c wcetest EdU

Powiązane artykuły