Artykuł metodologiczny

Narzędzie do automatycznego tworzenia stabilnych i powtarzalnych przerw bezkomórkowych w celu poprawy wiarygodności testu gojenia się ran komórkowych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65794

⸱

4 października 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Poprzez włączenie projektowania doświadczeń interakcji i analizy wymagań użytkownika, wprowadzamy innowacyjny skrobak do komórek, który poprawia testy gojenia się ran komórkowych pod względem odtwarzalności, niezawodności, praktyczności, integralności komórkowej i doświadczenia użytkownika.

Streszczenie

Wiarygodność pomiaru migracji komórkowej w testach gojenia ran jest często podważana przez powszechną niestabilność metodologiczną, tj. metodę opartą na końcówkach. Wprowadzamy innowacyjny instrument, który ma na celu wyeliminowanie tych ograniczeń. Nasz nowatorski skrobak do komórek przewyższa obecne podejście, generując bardziej spójną i stabilną lukę wolną od komórek. Powtarzające się eksperymenty biologiczne ujawniają, że bezkomórkowa szczelina wytworzona przez skrobak komórkowy wykazuje prostsze krawędzie oraz jednolity rozmiar i kształt w porównaniu z techniką opartą na końcówce (p < 0,05). Jeśli chodzi o konstrukcję produktu, skrobak do komórek może pochwalić się wyrafinowaną kolorystyką dostosowaną do środowisk laboratoryjnych, usprawniającą monitorowanie wyników eksperymentów i umożliwia sterylizację poprzez autoklawowanie w celu ponownego użycia. Warto zauważyć, że po leczeniu skrobak do komórek wykazuje znikomy wpływ na żywotność i proliferację komórek (odpowiednio 97,31% i 24,41%). I odwrotnie, metoda oparta na końcówkach zapewnia niższą żywotność komórek (91,37%) i proliferację (18,79%). W niniejszym badaniu przedstawiono skrobak do komórek jako nowatorskie urządzenie wielokrotnego użytku, zdolne do generowania powtarzalnych luk bezkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek, zwiększając w ten sposób wiarygodność testów gojenia się ran w porównaniu z istniejącymi technikami.

Wprowadzenie

Nowotwory charakteryzują się wyraźnymi cechami, takimi jak selektywny wzrost, przemiany metaboliczne i modulacja immunologiczna, z których wszystkie intrygująco przyczyniają się do zwiększonej migracji komórek, co jest krytycznym złośliwym zachowaniem komórek nowotworowych. Ta cecha bezpośrednio wpływa na odległe przerzuty guza pierwotnego, zagrażając długotrwałemu przeżyciu pacjentów1,2,3. Selektywne korzyści wzrostu umożliwiają komórkom rakowym konkurowanie z normalnymi komórkami, podczas gdy przemiana metaboliczna wspiera tę szybką proliferację poprzez zmianę szlaków energetycznych. Jednocześnie modulacja immunologiczna pozwala guzom uniknąć mechanizmów obronnych organizmu. Badania podkreślają powagę tego problemu, pokazując, że przerzuty do płuc, często będące wynikiem wzmożonej migracji komórek, są śmiertelnym zdarzeniem prowadzącym do śmierci pacjentów z różnymi nowotworami4. Na przykład rak piersi5, rak szyjki macicy4 i kostniakomięsak6 stanowią odpowiednio 20%, 9% i 30% takich przypadków. Dlatego ocena migracji komórek nowotworowych stała się integralną częścią obecnych badań onkologicznych, co jeszcze bardziej podkreśla wieloaspektowy charakter progresji guza.

Test gojenia ran komórkowych to łatwa w użyciu metoda pomiaru migracji komórek in vitro, często stosowana w badaniach onkologicznych7. Większość eksperymentatorów używa końcówek pipet do ręcznego tworzenia ran komórkowych8. Chociaż taka metoda może szybko i wygodnie tworzyć rany komórkowe, nadal ma wiele ograniczeń, które wpływają na odtwarzalność i dokładność oceny migracji komórek. Po pierwsze, ręczne używanie końcówek do pipet do tworzenia zadrapań ma duży wpływ na kąt działania, siłę i prędkość operatora, co wpływa na powtarzalność metody8. Po drugie, defekty komórek generowane przez końcówki mają zwykle postrzępione krawędzie, a nie proste, ponieważ końcówki pipet są produktami z tworzyw sztucznych o określonej elastyczności9. Niektóre badania generują rany poprzez umieszczenie prefabrykowanych wkładek hodowlanych bezpośrednio na płytce hodowli komórkowej, aby ograniczyć zakres proliferacji komórek10. Takie podejście pozwala obejść ograniczenia metody opartej na końcówkach, takie jak postrzępione krawędzie i odtwarzalność. Jednak nawet w przypadku materiałów biokompatybilnych, długotrwałe współistnienie osadzenia z komórkami nadal wpływa na wzrost komórek11. Co więcej, osadzenie może również powodować komórkowe zmiany epigenetyczne w strefie brzeżnej z powodu ograniczenia kontaktu12. Ponadto wkładki kontaktowe wykonane z materiałów biokompatybilnych są drogie i trudne do ponownego wykorzystania, co ogranicza ich wykonalność13. W związku z tym potrzebne jest nowatorskie, powtarzalne i praktyczne narzędzie, które pozwoli łatwo określić ilościowo migrację komórek in vitro.

Głównym celem tej metody jest wprowadzenie innowacyjnego narzędzia do ilościowego określania migracji komórek in vitro w badaniach onkologicznych, rozwiązanie ograniczeń istniejących technik oraz zwiększenie odtwarzalności i dokładności w ocenie migracji komórek.

Uzasadnieniem rozwoju tej techniki jest krytyczne znaczenie oceny migracji komórek nowotworowych w onkologii. Guzy wykazują charakterystyczne cechy charakterystyczne, w tym korzyści związane z selektywnym wzrostem, przeprogramowaniem metabolicznym i modulacją immunologiczną, co przyczynia się do zwiększonej migracji komórek, podstawowego aspektu złośliwości raka. Metoda ta ma na celu zapewnienie bardziej niezawodnego sposobu badania migracji komórek, przyczyniając się do głębszego zrozumienia zachowania guza.

Ta metoda oferuje znaczne przewagi nad istniejącymi technikami. Ręczne testy zarysowań mogą ucierpieć z powodu zakłóceń zależnych od operatora, podczas gdy wkładki hodowlane mogą wpływać na wzrost komórek i ekspresję genów. W przeciwieństwie do tego, metoda ta oferuje lepszą powtarzalność, dokładność i praktyczność, stanowiąc opłacalne rozwiązanie do pomiaru migracji komórek in vitro w badaniach onkologicznych. Jest to odpowiedź na kluczowe zapotrzebowanie na niezawodne i dostępne narzędzie do badania migracji komórek w różnych typach nowotworów, co czyni je cennym uzupełnieniem tej dziedziny.

Protokół

Pełna pisemna świadoma zgoda została udzielona przez wszystkich uczestników. Zatwierdzenie etyki nie miało zastosowania, ponieważ do niniejszego badania nie włączono żadnych próbek tkanek zwierzęcych ani ludzkich.

1. Badanie wymagań społeczności użytkowników

  1. Dostarcz kwestionariusze do biologów/eksperymentatorów pracujących nad testami gojenia się ran komórkowych. Zbierz wypełnione kwestionariusze i wykorzystaj je w badaniu. W ramach tego badania od 12 października 2021 r. do 3 lutego 2022 r. 100 biologom dostarczono 100 kwestionariuszy. Odsetek odpowiedzi wyniósł 97%.
  2. Poproś respondentów, aby odpowiedzieli na pytania takie jak: który z eksperymentów z drapaniem komórek najbardziej Ci przeszkadzał? i jakie narzędzie zostało użyte do wykonania drapania komórek? Po tych pytaniach wraz z pytaniami podrzędnymi prześledź przyczyny.
  3. Zbadaj postrzeganie przez eksperymentatorów narzędzi, takich jak końcówki do pipet i wkładki do hodowli komórkowych w eksperymentach gojenia się ran komórkowych. Zrozum i zbierz powody, dla których wybrali jedno narzędzie, a nie drugie, korzystając z teorii łańcucha środków i końca opartej na technikach drabinkowych w sekcji kwestionariuszy14,15.
    UWAGA: Metoda drabinkowa dzieli się na dwa rodzaje: metodę miękkiej drabiny z wywiadami pogłębionymi i metodę twardej drabiny z kwestionariuszami lub quizami na papierze i ołówku16. Metoda twardej drabiny była podstawową techniką zastosowaną w tym badaniu. Teoria łańcucha środków sugeruje, że jawna wiedza posiadana przez docelowych użytkowników jest powierzchowna i konkretna, podczas gdy wiedza ukryta jest głęboka i abstrakcyjna17,18,19.

2. Projektowanie i modelowanie trójwymiarowe

  1. Narysuj szkic na podstawie spostrzeżeń zebranych z poprzedniego badania ankietowego i rozpocznij proces projektowania. Użyj tego wstępnego szkicu jako podstawowego planu.
    1. Opracuj wymiary i układ każdego komponentu, stosując funkcje Dim, DimRadius i DimDiameter w oprogramowaniu do modelowania.
    2. Pomiary suwmiarką z noniuszem należy wykonywać z dokładnością do 0,02 mm na rzeczywistych płytkach 6-dołkowych, aby ustalić ostateczne wymiary skrobaka do komórek. Upewnij się, że mają 42,1 mm długości, 42,1 mm szerokości i 18,5 mm wysokości. Zwróć uwagę na szczegóły w fazie projektowania, zwłaszcza na wysokość produktu i przydatność w studni, aby ułatwić płynniejszy montaż.
  2. Skonstruuj trójwymiarowy model i wyrenderuj go.
    1. Rozpocznij projektowanie 3D w oprogramowaniu od utworzenia podstawowego modelu. Kliknij przyciski, takie jak ExtrudeCrv do rozciągania i Loft do kształtowania projektu. Udoskonal model, a następnie kliknij przycisk Zaokrąglnijkrawędź, aby uzyskać gładkie krawędzie.
      UWAGA: Inne używane przyciski funkcyjne to: Linie - Rysowanie segmentów linii prostych, Polilinie - Tworzenie ciągłych linii złożonych z wielu segmentów, Prostokąty - Rysowanie kształtów prostokątnych, Koła - Rysowanie okrągłych kształtów, Łuki - Rysowanie kształtów łukowych lub eliptycznych, Punkty - Umieszczanie znaczników jednopunktowych, Tekst - Dodawanie etykiet tekstowych, Wymiary - Aby dodać zmierzone wymiary do modeli, Szyk - Aby utworzyć skopiowane wzory obiektów, Obróć - Aby obrócić obiekty pod żądanymi kątami, Przesuń - Aby przenieść obiekty w nowe lokalizacje, Skala - Aby zmienić rozmiar obiektów większych lub mniejszych, Przytnij/Rozszerz - Aby przyciąć lub wydłużyć obiekty tak, aby spełniały inną geometrię, Suma logiczna/Różnica/Przecięcie - Aby łączyć, odejmować lub znajdować przecięcie obiektów, Warstwy — aby organizować obiekty na różnych warstwach, Render — aby generować renderowane widoki z materiałami i oświetleniem oraz Eksport — aby eksportować geometrię modelu do innych formatów plików.
    2. Zaimportuj model do oprogramowania do renderowania 3D. Zastosuj materiały, takie jak plastik, gąbka i stal, a następnie dostosuj oświetlenie, aby uzyskać realistyczne renderowanie.
      UWAGA: Uogólniona lista przycisków funkcyjnych obejmuje: Przeciągnij i upuść - Aby zastosować materiały bezpośrednio do części lub modeli, przeciągając materiał z biblioteki i upuszczając go na żądany komponent w widoku w czasie rzeczywistym, Kliknij prawym przyciskiem myszy - Po kliknięciu prawym przyciskiem myszy materiału w bibliotece zazwyczaj zobaczysz opcje, aby: Zastosuj do zaznaczenia - Zastosuj materiał do wybranej części w widoku w czasie rzeczywistym. Edytuj materiał - Dostosuj właściwości materiału. Właściwości materiału (po wybraniu materiału) — umożliwia dostęp i modyfikację określonych właściwości materiału, takich jak kolor, chropowatość, współczynnik załamania światła i inne atrybuty. Pasek wyszukiwania — umożliwia szybkie znajdowanie materiału w bibliotece przez wpisanie jego nazwy lub powiązanych słów kluczowych. Kategorie/Foldery - Aby poruszać się po różnych kategoriach lub folderach materiałów, takich jak metale, tworzywa sztuczne, szkło itp. Dodaj do ulubionych - Aby oznaczyć określone materiały jako ulubione, aby mieć do nich łatwy dostęp podczas przyszłych sesji. Skróty klawiszowe — dostęp do niektórych operacji można uzyskać za pomocą skrótów klawiszowych. Na przykład M jest zwykle skrótu, który szybko wyświetla właściwości materiału wybranej części.
    3. Na koniec popraw kontrast (+56) i nasycenie obrazu (Jaskrawość +19, Nasycenie +7) w oprogramowaniu fotograficznym i projektowym, a także dodaj elementy tła (informacje tekstowe i kolor od białego do jasnoszarego tła gradientowego) dla kontekstu, aby zapewnić wysokiej jakości, realistyczne odwzorowanie produktu.
      1. Użyj opcji Image > Adjustment (Dopasowania obrazu), Jasność/Kontrast (Jasność/Kontrast), aby dostosować kontrast obrazu. Użyj opcji Obraz > Barwa/Nasycenie, aby zmodyfikować poziom nasycenia obrazu. Użyj narzędzia tekstowego (ikona T), aby dodać informacje tekstowe do obrazu .
        UWAGA: Uogólniona lista przycisków funkcyjnych obejmuje narzędzie Elipsa (U) - Do rysowania kropek/okręgów. Ustaw narzędzie tak, aby narysowało kształt, wybierz żądany kolor wypełnienia, a następnie kliknij i przeciągnij (przytrzymując Shift, aby zachować idealne koło), aby utworzyć kropkę. Narzędzie Linia (U) - Aby narysować linie proste na obrazie. Wybierz narzędzie, ustaw żądaną szerokość linii, a następnie kliknij i przeciągnij, aby narysować linię. Narzędzie Pędzel (B) - Alternatywny sposób rysowania kropek i linii. Wybierz rozmiar i kształt pędzla, a następnie kliknij (w przypadku kropek) lub kliknij i przeciągnij (w przypadku linii).
  3. Po ukończeniu modelu trójwymiarowego przystąp do produkcji skrobaka komórkowego metodą mielenia i montażu20,21,22.

3. Produkcja

  1. Wykorzystaj teorię koloru, materiałów i wykończenia (CMF) w obecnym badaniu, aby zaprojektować prototypy skrobaka komórkowego. Teoria CMF służy jako metodologia projektowania w badaniach naukowych. Zwiększa użyteczność produktu, kształtuje percepcję użytkownika i kieruje wyborem materiałów23,24,25.
    1. Wybierz kolory, które mają być używane w skrobaku komórkowym ze standardowego systemu kolorów, w tym 6 C, Chłodny szary 6 C i 11-0601TPG26,27.
    2. Aby zbudować skrobak do komórek, który spełnia standardy laboratoryjne, wybierz odpowiednie materiały, w tym polipropylen (PP), gąbkę i stal wysokowęglową. Aby wytworzyć fizyczne prototypy, zacznij od użycia drukarki 3D do wytworzenia szkieletu konstrukcyjnego. Następnie użyj złączy lub środków klejących, aby zakończyć montaż skrobaka.
      UWAGA: Aby przygotować fizyczny produkt skrobaka komórkowego, zmiel i zmontuj niezbędne materiały. Protokoły bezpieczeństwa muszą być przestrzegane przez cały proces, aby zapewnić bezpieczny i skuteczny produkt końcowy.
    3. Przejdź do procesu wykańczania, który może obejmować cięcie, szlifowanie, polerowanie, tłoczenie lub inne techniki. Zacznij od przeszlifowania modelu papierem ściernym o średniej ziarnistości i ziarnistości 120, aby usunąć wszelkie szorstkie krawędzie.
    4. Następnie użyj papieru ściernego o drobnej ziarnistości 220, aby uzyskać gładką powierzchnię.
    5. Szlifowanie końcowe w celu wygładzenia powierzchni, upewniając się, że złącza wtykowe lub wbudowane są prawidłowo dopasowane.
    6. Bezpiecznie połącz suwak I i II za pomocą łączników (prętów stałych), aby zapewnić solidny i trwały montaż skrobaka do komórek. Osiągnij ostateczny, stały kształt skrobaka komórkowego poprzez połączenie mocowania mechanicznego i klejenia. Użyj elementów złącznych, w szczególności konstrukcji wpustowej i czopowatej, aby połączyć części ze sobą za pomocą siły mechanicznej. Dodatkowo, aby zwiększyć wytrzymałość zespołu, nałóż klej (klej), aby jeszcze bardziej skleić elementy.
    7. Autoklawuj skrobak w temperaturze 121,3 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że zachowa swój pierwotny kształt i właściwości fizyczne.

4. Hodowla komórkowa

  1. Hoduj komórki HOS w minimalnej niezbędnej pożywce uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Hodować je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Zmieniaj pożywkę co 2 dni.
  3. Gdy wzrost komórek przekroczy 80% konfluencji, dodaj 1 ml trypsyny z 0,25% EDTA i traw przez 60 sekund. Następnie odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 minut w celu uzyskania subkultury. Usunąć supernatant i dodać pożywkę hodowlaną, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 104 komórek na studzienkę. Użyj automatycznego licznika komórek do zliczania komórek.

5. Ocena potencjału zniszczeń komórek przez skrobak do komórek i metoda oparta na końcówkach

  1. Przygotuj wszystkie materiały do zranienia i wysterylizuj je promieniowaniem ultrafioletowym, naświetlając je na 30 minut.
  2. Po sterylizacji nawiń 100% zlewające się komórki HOS na płytki 6-dołkowe o stężeniu 5 x 104 komórki na studzienkę, stosując metodę skrobaka do komórek lub metodę opartą na końcówkach.
    1. W przypadku metody opartej na końcówce użyj końcówki o pojemności 100 μl i przeciągnij ją po komórce zawierającej podłoże 1 pociągnięciem w kierunku poziomym, a drugim w kierunku pionowym.
    2. W przypadku metody skrobaka komórkowego umieść prototyp skrobaka w jednym z dołków i za pomocą pęsety delikatnie naciśnij raz. Komórki są zranione. Przeprowadzaj każdy eksperyment z ranieniem w trzech egzemplarzach.
  3. Analizuj wszystkie rany komórkowe za pomocą mikroskopu cyfrowego i oprogramowania do obrazowania.

6. Pomiar żywotności i proliferacji komórek

  1. Wykonaj wszystkie testy żywotności komórek zgodnie z protokołem dostarczonym w zestawie CCK-8.
  2. Inkubować komórki z roztworem CCK-8 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zmierzyć ich absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek w celu ilościowego określenia żywotności komórek.
  3. Zaprojektuj test inkorporacji 5-etynylo-20-deoksyurydyny (EdU), aby dokładnie określić ilościowo duplikację DNA i bezpośrednio określić ilościowo współczynnik proliferacji komórek. Określ wpływ różnych metod generowania ran komórkowych na proliferację komórek za pomocą testu EdU, postępując zgodnie z protokołem opisanym w poprzedniej publikacji28.
  4. Wybarwić komórki i zobrazować je za pomocą systemu mikroskopu cyfrowego. Upewnij się, że każdy eksperyment jest przeprowadzany w trzech egzemplarzach.

Wyniki

Analiza wymagań użytkowników w zakresie narzędzi do tworzenia ran komórkowych
Obecna metoda doświadczalna tworzenia ran komórkowych wymaga dalszego udoskonalenia, aby rozwiązać liczne problemy ograniczające biologiczną powtarzalność, odporność, ekonomię oraz komfort użytkowania testu gojenia ran komórkowych. Wykorzystaliśmy metodę drabinkową (hard laddering) do analizy potrzeb użytkowników zaangażowanych w eksperymenty biologiczne za pomocą kwestionariuszy29 (Rycina 1A). Informacje zawarte w kwestionariuszu, takie jak nazwiska, zostały zanonimizowane w celu ochrony prywatności respondentów. Szczegóły kwestionariusza przedstawiono w Tabeli 1. W ciągu 6 tygodni badania objętego grupą 100 osób otrzymano 97 w pełni wypełnionych kwestionariuszy, wykluczając 3 kwestionariusze budzące wątpliwości lub nieprawidłowe; wskaźnik odpowiedzi wyniósł 97,00%.

Wyniki pokazują, że najpoważniejszymi problemami w teście gojenia ran komórkowych były poszarpane krawędzie (brak linii prostej) oraz niestabilna szerokość lub powierzchnia ran, co stanowiło odpowiednio 55,67% i 29,90%. Wartości te były istotnie wyższe niż w przypadku niskiego tempa wzrostu komórek, kontaminacji komórek oraz innych opcji, które wyniosły odpowiednio 3,09%, 5,15% i 6,19% (p < 0,001, Rysunek 1B). W odniesieniu do wyboru narzędzi do tworzenia ran, znacznie częściej stosowano końcówki do pipet niż inserty do hodowli komórkowej (Rysunek 1C). Wynikało to głównie z faktu, że inserty do hodowli komórkowej są dość kosztowne i jednorazowe (Rysunek 1D), podczas gdy końcówki do pipet są tanie, wykazują powtarzalność eksperymentalną (6,59%) i zapewniają żywotność komórek (20,88%, Rysunek 1E). Co istotne, aż 69,23% użytkowników stwierdziło, że cena insertów do hodowli komórkowej przekraczała ich budżet (Rysunek 1D). W przeciwieństwie do tego, tylko 6 osób wybrało inserty do hodowli komórkowej, z czego jedynie 16,67% uznało ich cenę za akceptowalną (Rysunek 1F). Wreszcie, w kwestii innowacyjnego narzędzia do generowania ran komórkowych, 86,60% respondentów wyraziło optymizm, podczas gdy jedynie niewielka liczba użytkowników była niechętna (4,12%, Rysunek 1G).

Następnie przeanalizowano funkcje produktu, których użytkownicy potrzebowali najpilniej30,31,32. Funkcje te obejmowały proste krawędzie ran, stabilną szerokość i powierzchnię ran, wysoką powtarzalność oraz przystępną cenę. W związku z tym podjęto kolejne działania projektowe.

Decyzja dotycząca projektowania elementów i materiałów użytych do opracowania skrobaka do komórek
Powyższe dane wskazują, że materiały laboratoryjne stosowane w rutynowych badaniach biologicznych muszą być ściśle sterylne, aby uniknąć kontaminacji komórek33. Z tego względu proponowany skrobak do komórek powinien być sterylny. Chociaż narzędzia jednorazowe mogłyby zostać wysterylizowane tlenkiem etylenu, koszty eksperymentu nieuchronnie by wzrosły34,35,36. Dlatego zamiast materiałów jednorazowych proponujemy zaprojektowanie skrobaka do komórek z materiału wielokrotnego użytku, wykazującego wysoką tolerancję na sterylizację parową pod wysokim ciśnieniem (121.3 °C), aby obniżyć koszty i zwiększyć elastyczność zastosowania w różnych przypadkach37. Aby spełnić te wymagania, materiał użyty do konstrukcji skrobaka do komórek musi posiadać określone cechy fizyczne i chemiczne, w tym odporność na wysoką temperaturę, wysokie ciśnienie oraz korozję wywołaną parą wodną.

W przypadku planowanego zastosowania skrobaka do komórek, poza spełnieniem podstawowych funkcji, takich jak tworzenie ran o prostych krawędziach, urządzenie powinno posiadać atrakcyjny design i kolorystykę. Pod względem modelowania, biorąc pod uwagę cele i obszary zastosowań, ogólny styl powinien być dostosowany do warunków laboratoryjnych. Wygląd nie może być zbyt krzykliwy, aby nie utrudniać personelowi obserwacji przebiegu eksperymentu. Ponadto rozmiar skrobaka powinien być odpowiedni do płytek 6-dołkowych, a jego powierzchnia powinna posiadać wypustkę umożliwiającą stabilne chwytanie pęsetą.

CMF w projektowaniu jest krytycznym aspektem projektowania produktów, wpływającym na estetykę i doświadczenia użytkownika. Wybór kolorystyki oddziałuje na reakcje emocjonalne, dobór materiałów wpływa na funkcjonalność i zrównoważony rozwój, a wykończenie determinuje odczucia dotykowe oraz atrakcyjność wizualną. Projektanci CMF harmonizują te elementy, biorąc pod uwagę trendy rynkowe i tożsamość marki, aby tworzyć produkty, które trafiają do użytkowników.

Zgodnie z teorią CMF, w celu określenia ich wpływu na funkcjonalność i efekt wizualny, rozważono trzy krytyczne czynniki: kolor, materiał oraz proces wykańczania24. W pierwszej kolejności dokonano wyboru koloru. W tym kontekście kolor odnosi się do koloru wewnętrznego, czyli naturalnego koloru obiektu lub substancji w standardowych warunkach oświetleniowych, bez wpływu zewnętrznych źródeł światła lub odbić. Biorąc pod uwagę, że płytka sześciodołkowa jest wykonana z PP z przezroczystą powierzchnią, jako kolor wewnętrzny wybrano ciemnoszary. Wybór ten podyktowano łatwością identyfikacji i obsługi, ponieważ ciemnoszary zapewnia optymalny kontrast i widoczność przy nałożeniu innych kolorów. Ponadto ciemnoszary rzadziej powoduje zniekształcenie kolorów przy połączeniu z innymi barwami, co jest również kluczowe dla obserwacji. Istotne elementy funkcjonalne dodatkowo wyróżniono kolorem czarnym (Rycina 2A).

Komercyjny system dopasowania kolorów wybrano jako standard do wyboru barw ze względu na jego powszechną akceptację i zastosowanie w różnych branżach. Opierając się na zdolności firmy do reprodukowania spójnych kolorów w różnych mediach, system ten został wybrany do badania, ponieważ jest to kluczowe dla zapewnienia dokładnej i jednolitej reprezentacji kolorystycznej.

Wybór materiałów został dokonany na podstawie wspomnianych wyników ankiet. Obudowa i elementy skrobaka zostały wykonane z tworzywa termoodpornego, polipropylenu (PP), aby spełnić wymóg sterylizacji w autoklawie, jak pokazano na przykładzie na Rysunku 2B. Stal wysokowęglowa jest odpowiednia do produkcji sprężyn, ponieważ jest stabilna w warunkach wysokich i niskich temperatur oraz odporna na korozję w środowisku laboratoryjnym. Do amortyzacji wykorzystano gąbki o wysokiej gęstości, które umieszczono na końcu prowadnicy.

Na koniec opracowano proces wykańczania. Ponieważ skrobacz do komórek jest często używany i łatwo ulega zanieczyszczeniu, a jakość powierzchni wpływa na sterylizację, w przypadku skrobacza preferowana jest powierzchnia gładka i błyszcząca, co pomaga użytkownikowi w szybkim zidentyfikowaniu źródła zanieczyszczenia i wyeliminowaniu go, dając poczucie czystości. Końcówki są częściowo szlifowane, aby uniknąć uszkodzenia dna naczynia hodowlanego, co mogłoby wpłynąć na środowisko hodowli i doprowadzić do ograniczenia proliferacji komórek38.

Projekt i prototyp skrobaka do komórek
Na podstawie wspomnianych powyżej wyników zaprojektowano trzy prototypy skrobaka do komórek (Rysunek 3A). Badania wykazują, że najczęściej stosowane rany komórkowe w płytkach hodowlanych miały kształt krzyża39, co znacząco różni się od prototypu I, w którym tworzono rany prostokątne; w związku z tym prototyp I został odrzucony (Rysunek 3A). Chociaż prototypy II i III mogły tworzyć obszary wolne od komórek w kształcie krzyża, prowadnica prototypu II była trudna do zamocowania w naczyniach hodowlanych, a jego konstrukcja była dość skomplikowana (Rysunek 3A). Po wnikliwych dyskusjach prototyp III został wybrany jako model końcowy do produkcji skrobaka do komórek.

Warto zauważyć, że ze względu na to, iż kształt końcówek mógł bezpośrednio wpływać na obszar wolny od komórek pod kątem krawędzi i rozmiarów, zaprojektowano trzy szkice do wyboru. Szkic I posiadał ostrą końcówkę, która mogłaby zapewnić bardzo proste krawędzie; jednakże interfejs hodowlany umożliwiający proliferację komórek mógłby zostać uszkodzony, gdyby końcówki były zbyt ostre (Rysunek 3B). Szkic II oferował kwadratową końcówkę, co mogłoby zapobiec uszkodzeniu płytek do hodowli komórek. Jednakże, ponieważ powierzchnia styku między końcówką a dnem płytki hodowlanej jest kwadratowa, jest ona niestabilna podczas użytkowania (Rysunek 3B). Szkic III zapewnił tępo zaokrągloną końcówkę, skutecznie unikając powyższych problemów (Rysunek 3C). W związku z tym został on wybrany jako ostateczny projekt.

Konstrukcja została zoptymalizowana pod trzema aspektami: metodą mocowania uchwytu, wbudowaną gąbką amortyzującą oraz łatwością chwytania. Po pierwsze, rozważane metody mocowania produktu obejmowały zatrzaski40, połączenia czopowe41 oraz połączenia obrotowe42. Biorąc pod uwagę rzeczywiste koszty produkcji i możliwość wykonania, pod uchwytem w kształcie krzyża zaprojektowano zacisk, który ułatwia mocowanie do krawędzi studzienki. Ponadto podczas testu gojenia ran w warstwie komórek zaobserwowaliśmy, że końcówki odbijały się po dotknięciu ścianki w pobliżu końca z powodu stałej długości i twardości prowadnic, co wpływało na stan zadrapania. Dlatego na końcu prowadnicy dodano gąbkę amortyzującą, aby ustabilizować ruch końcówek (Rysunek 3A,C). Na koniec, na wypustce wykonano wgłębienie powierzchniowe, aby ułatwić chwytanie pęsetą.

Następnie za pomocą oprogramowania do projektowania 3D skonstruowano model trójwymiarowy. Jego wizualizacja przedstawiona jest na Rysunku 4A. Rysunek rozstrzelony szczegółowo obrazuje wewnętrzną strukturę skrobaka do komórek, wykazując jego niezbędne cechy omówione powyżej (Rysunek 4B). Ponadto, aby zapewnić gładkie przesuwanie się końcówek i prostych krawędzi, zastosowano wewnętrzną strukturę przekazywania mocy mechanicznej. Cała jednostka funkcjonalna skrobaka do komórek składa się z części sterującej. W praktyce dźwignia łącząca wewnątrz skrobaka połączona jest z górnym przyciskiem, a jej koniec przesuwa się w dół po przyłożeniu nacisku, co powoduje zablokowanie końcówki. Sprężyna wewnątrz suwaka zostaje zwolniona, co wymusza ruch końcówek. Ostatecznie zatrzymują się one na gąbce z wąską szczeliną, kończąc proces skrobania, a następnie przełączają się w celu zresetowania przy ponownym użyciu (Rysunek 5A). Co więcej, łatwość nauki i wygoda obsługi są kryteriami, według których biolog ocenia jakość produktu. Dlatego w projekcie wyglądu produktu układ powierzchni oparto na zasadzie symetrii i przejrzystości43,44, wyróżniając i podkreślając poszczególne komponenty za pomocą różnych odcieni kolorów czarnego, białego i szarego (Rysunek 5A).

Skrobacz do komórek jest lepszy od metody drapania końcówkami w zastosowaniu praktycznym
Fizyczny produkt w postaci skrobacza do komórek został przygotowany przy użyciu metody szlifowania i montażu (Rysunek 5B). Zgodnie z oczekiwaniami, skrobacz do komórek doskonale zintegrował się z płytką sześciodołkową, przy czym górny uchwyt w kształcie krzyża ściśle przylegał do krawędzi płytki, zapewniając silną stabilizację (Rysunek 5C). Co więcej, końcówki precyzyjnie przylegały do dna płytki sześciodołkowej, co ułatwiło sprawne tworzenie obszarów wolnych od komórek. Na koniec skrobacz do komórek poddano autoklawowaniu, aby sprawdzić, czy może on być używany wielokrotnie. Jak pokazują wyniki na Rysunku 5D, obecny skrobacz do komórek zachował pierwotny kształt i właściwości fizyczne nawet po autoklawowaniu w temperaturze 121.3 °C przez 30 min.

Skrobak do komórek okazał się wydajniejszy od dotychczasowej metody tworzenia ran komórkowych w teście porównawczym. Po wielokrotnych próbach skrobak do komórek wykazał wysoką stabilność i powtarzalność w przygotowywaniu rany, prezentując niskie wahania powierzchni każdej rany oraz niemal proste krawędzie, przy odchyleniu standardowym powierzchni wolnej od komórek wynoszącym 483,73 i odchyleniu od prostej krawędzi 5041,33 ± 2420,00. W przeciwieństwie do tego, powierzchnia każdej rany przygotowanej za pomocą końcówek pipet wykazywała większe wahania, z odchyleniem standardowym powierzchni wolnej od komórek wynoszącym 3905,80 i odchyleniem od prostej krawędzi 19562,33 ± 1068,39 (Rysunek 6A-C).

Na koniec oceniono wpływ na żywotność komórek po powstaniu ran komórkowych (Ryc. 6D). Wyniki wykazały, że 12 h po zakończeniu tworzenia ran komórkowych żywotność komórek była nieco, ale istotnie wyższa w grupie z użyciem skrobaka komórkowego niż w grupie z użyciem końcówek. W celu dalszego potwierdzenia tych wyników oraz wyjaśnienia wpływu różnych metod przygotowania ran komórkowych na proliferację komórek, tj. replikację DNA, przeprowadzono analizę EdU. Wyniki analizy EdU wykazały, że po 12 h odsetek proliferujących komórek w grupie ze skrobakiem komórkowym (24,41% ± 0,48) był istotnie wyższy niż w metodzie z użyciem końcówek (18,79% ± 1,46) (Ryc. 6E,F).

Dane te jednoznacznie potwierdziły, że opracowany generator ran komórkowych przewyższa obecną metodę tworzenia ran komórkowych pod względem stabilności i powtarzalności biologicznej. Wykazał on niewielki wpływ na żywotność i proliferację komórek. Wszystkie te istotne zalety generatora ran komórkowych potwierdziły jego potencjał do usprawnienia obecnych testów ran komórkowych poprzez zapewnienie niezawodności i powtarzalności uzyskanych danych.

Wykresy Sankeya i radarowe analizujące ankietę dotyczącą końcówek do pipet i problemów z kulturą komórkową, wskazujące na obawy dotyczące kosztów.
Rycina 1: Analizy wymagań użytkowników. (A) Wykres Sankeya przedstawia schemat badania opartego na kwestionariuszach dla eksperymentatorów. (B) do (G) prezentują wyniki kwestionariuszy, obejmujące pytania od 1 do 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Testy kolorystyczne mikropłytek, różne kolory Pantone, sprzęt: spektrofotometr, zastosowanie laboratoryjne.
Rycina 2: Projekt produktu z wykorzystanymi kolorami i materiałami. (A) Wybór kolorów. (B) Autoklaw użyty w eksperymentach biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat projektu prototypu: struktury 3D, użycie pipety, precyzyjna inżynieria, widoki techniczne.
Rysunek 3: Projekt produktu i szczegółowe struktury. (A) Trzy prototypowe warianty skrobaka do komórek. (B) Trzy szkice projektu końcówki. (C) Rysunek trójwidokowy wybranego prototypu III przedstawiający jego ogólny projekt oraz parametry fizyczne i przestrzenne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat mechanizmu przegubowego z opisanymi komponentami, klipsem chwytającym i przyciskiem sterującym.
Rysunek 4: Renderowany model trójwymiarowy i widok struktur wewnętrznych. (A) Render modelu trójwymiarowego. (B) Rysunek rozstrzelony przedstawiający struktury wewnętrzne proponowanego skrobaka do komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu autoklawowania i wyniki; regulacja urządzenia przed i po sterylizacji; konfiguracja laboratoryjna.
Rycina 5: Mechanizmy działania skrobaka do komórek. (A) Szkice przedstawiają sposób działania skrobaka do komórek. (B) Produkt fizyczny skrobaka do komórek. (C) Skrobak do komórek pasuje do płytki 6-dołkowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza żywotności komórek; mikroskopia i wykresy słupkowe porównują metodę skrobania komórek i metodę z użyciem końcówek, replikacja biologiczna.
Rysunek 6: Eksperymentalna walidacja skrobaka do komórek. (A) Rany komórkowe powstałe w wyniku zastosowania różnych metod oraz wyniki ich porównania grupowego przedstawiono na (B) i (C), pasek skali wynosi 100 µm. (D) Wyniki żywotności komórek. (E) i (F) Wyniki testu Edu, pasek skali wynosi 50 µm. Do oceny statystycznej zastosowano test t dla porównań grupowych, a oryginalną wartość p skorygowano testem Holm-Bonferroni, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

I) Która z poniższych kwestii jest dla Państwa najbardziej problematyczna w eksperymencie z zadawaniem zranień komórek (cell scratching)?
A) Brak prostych krawędzi
B) Niestabilna szerokość
C) Powolna proliferacja
D) Kontaminacja komórek
E) Inne
II) Jakich narzędzi używasz do generowania ran w warstwie komórkowej? 
A) końcówki do pipet (przejdź do pytania III)
B) Wkładki do hodowli komórkowych (przejdź do pytań IV-V)
III) Dlaczego nie wybrać insertów do hodowli komórkowych?
A) Żywotność komórek
B) Niewielokrotnego użytku
C) Koszt
D) Inne
IV) Dlaczego zdecydowano się na zastosowanie wkładów do hodowli komórkowych?
A) Koszt
B) Powtarzalność
C) Inne
V) Jakie są Państwa zdaniem najpoważniejsze problemy związane z wkładkami do hodowli komórkowych?
A) Stan komórek
B) Jednorazowego użytku
C) Kosztowna
D) Inne 
E) Zadowolony
VI) Gdyby dostępne było niedrogie, wielorazowe (autoklawowalne) i wysoce powtarzalne narzędzie do zadawania zarysowań, w jakim stopniu byliby Państwo skłonni je kupić i stosować?
A) Bardzo chętny
B) Chętne
C) Nie jestem pewien/pewna
D) Niechętny

Tabela 1: Kwestionariusz użyty w niniejszym badaniu składa się z sześciu pytań mających na celu zrozumienie sytuacji, z jakimi biolodzy spotykają się podczas przeprowadzania testów gojenia ran komórkowych.

Dyskusja

Niniejsze badanie miało na celu opracowanie automatycznego, zmechanizowanego narzędzia do oznaczania gojenia się ran komórkowych. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsza próba zastosowania zmechanizowanej struktury napędzanej do automatycznego tworzenia ran komórkowych za pomocą jednego kliknięcia. W ten sposób staramy się wyeliminować wady tradycyjnej metody opartej na końcówkach, takie jak niska odtwarzalność i niestabilny stan zarysowania. Korzystając z pozytywnych wyników i zachęcających informacji zwrotnych od społeczności użytkowników, oczekuje się, że skrobak do komórek zapewni eksperymentatorom wydajną i stabilną alternatywę do tworzenia ran komórkowych, znacznie poprawiając w ten sposób poziom pewności wyników analizy eksperymentalnej.

W celu korzystania z obecnego skrobaka do komórek, użytkownik powinien 1) przygotować komórki w oczekiwaniu na utworzenie wolnej od komórek szczeliny, podobnie jak w przypadku tradycyjnych metod, takich jak metoda oparta na końcówce, tj. Wysiewanie komórek na płytce sześciodołkowej o określonej gęstości; 2) poczekaj, aż współczynnik konwergencji komórkowej osiągnie > 90%; 3) umieść sterylny skrobak do komórek w dołku płytki, kliknij przycisk, jak pokazano na rysunku 5, a wolna od komórek szczelina zostanie automatycznie utworzona w ciągu 1-2 sekund.

Test gojenia się ran komórkowych jest szeroko stosowany do pomiaru zdolności migracji komórek. Zazwyczaj eksperymentatorzy używają końcówek pipet do tworzenia ran komórkowych. Na przykład Tariq i wsp. użyli końcówki pipety do stworzenia ran komórkowych w celu oceny zdolności migracji komórek45; nieprzypadkowo Rahimi i wsp. użyli końcówki pipety w teście, aby obserwować zdolność migracyjną komórek PC346; w teście migracji komórek mezenchymalnych myszy Cormier i wsp. użyli również pistoletu do pipetowania47; demonstrując wpływ arsenu na migrację komórek skóry, Pinto i wsp. użyli końcówki pipety do pionowego skrobania48, między innymi.

Jednak, jak wspomniano wcześniej, używanie końcówki do tworzenia ran komórkowych wiąże się z kilkoma problemami, takimi jak zmienna powierzchnia wolna od komórek, postrzępione krawędzie oraz zależność od siły operatora i kąta zadrapania, co skutkuje niską odtwarzalnością49. Przedstawione wyniki ankiet dowiodły również, że metoda oparta na końcówkach ma bardziej widoczną przewagę nad wkładkami do hodowli komórkowych, szczególnie pod względem ceny, przeżywalności komórek i możliwości ponownego użycia narzędzia. Alternatywnie, wkładki ogniwowe są zbyt kosztowne i trudne do ponownego użycia, a każde narzędzie ma wady. Dlatego społeczność użytkowników jest na ogół optymistycznie nastawiona i chętna do wypróbowania innowacyjnych narzędzi. W ramach tego badania zaprojektowano i opracowano nowe narzędzie do przygotowywania obszarów wolnych od komórek, aby ułatwić i ustabilizować tworzenie się ran komórkowych.

Najważniejszym wkładem niniejszego badania jest opracowanie i eksperymentalna walidacja skrobaka komórkowego. W porównaniu z poprzednimi badaniami, ulepszenia obecnego skrobaka komórkowego obejmują następujące trzy główne punkty. 1) stabilne i wygodne wytwarzanie ran komórkowych. Badanie to wykazało, że w porównaniu z tradycyjną metodą opartą na końcówkach, rany komórkowe wytwarzane przez obecny skrobak do komórek miały proste krawędzie i mogły tworzyć podobne rany w powtarzających się eksperymentach, co znacznie poprawiło odtwarzalność i wiarygodność eksperymentów gojenia się ran komórkowych. 2) Obecny skrobak do komórek miał mniejszy wpływ na stan komórki. Nie wpłynęło to na żywotność i proliferację komórek (amplifikację DNA), co było znacznie lepsze niż metoda oparta na końcówce. Dlatego oczekuje się, że ten skrobak do komórek jeszcze bardziej zmniejszy wpływ czynników zewnętrznych na test gojenia się ran komórkowych w rutynowych eksperymentach. 3) Ten skrobak do komórek jest w dobrej zgodzie z wymaganiami społeczności użytkowników. Wyniki poprzedniego badania ankietowego wykazały, że wymagania użytkowników dotyczące nowego narzędzia do badania ran komórkowych obejmują głównie jednolitą szerokość pociągnięcia, wysoką powtarzalność, prostą procedurę obsługi i umiarkowaną cenę, które zostały osiągnięte w obecnym skrobaku do komórek. Ponadto skrobak do komórek został zaprojektowany w neutralnych kolorach, aby przekazać prostą i praktyczną koncepcję projektową tego produktu. Jednocześnie mocny kontrast czerni i bieli skutecznie podkreśla jego obszary funkcjonalne. Ogólny styl to kształt krzyża utworzony przez zaokrągloną artykulację zakrzywionej powierzchni, nawiązujący do konwencjonalnego kształtu rany i sugerujący rolę produktu. Trudność operacji jest zmniejszona dzięki uproszczeniu obsługi i funkcji ręcznego resetowania. Podsumowując, wyniki wskazują na obiecujące alternatywne narzędzie dla eksperymentatorów do przygotowywania zadrapań komórek w sposób zautomatyzowany i niezawodny za pomocą jednego kliknięcia, poprawiając w ten sposób odtwarzalność wyników naukowych.

Należy przyznać się do ograniczeń tego badania. Liczebność próby ankietowanych ogranicza możliwość uogólnienia tego badania; Dlatego będziemy dalej zwiększać wielkość próby w badaniu uzupełniającym, aby ulepszyć skrobak do komórek. Po drugie, drapak do komórek musi zostać włączony do dobrze zaplanowanego badania z większą populacją użytkowników, aby można było bardziej kompleksowo ocenić wydajność tego skrobaka do komórek.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez grant National Social Science Foundation (22FYSB023), Hubei Industrial Design Center Research Foundation (08hqt201412046) oraz Humanities and Social Science Foundation of Hubei Provincial Education Department (15Y054).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw CCK-8Beyotime Company, ChinyC0037
cyfrowy system mikroskopowyOlympusIX81
płodowa surowica bydlęcaGibco, USA16000044
HOS Procell Nauki przyrodnicze & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticswersja 6.0
KeyShotLuxionwersja 11.0oprogramowanie do renderowania 3D
czytnik mikropłytekBioTek, niemieckiELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
System dopasowaniaPantone PantoneKomercyjne dopasowywanie kolorów
penicylina-streptomycynaBeyotime Company, ChinyST488
PhotoshopAdobeoprogramowanie do zdjęć i projektowania
Rhinoceros 3D RobertMcNeel & Associateswersja 7.0Oprogramowanie do projektowania 3D
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-RadTC20
TrypsynaCytiva  HyClone, Stany ZjednoczoneSH30042.01

Bibliografia

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Compr Physiol. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: a review. Crit Rev Oncol Hematol. 92 (2), 133-142 (2014).
  3. Verbeek, B. S., Adriaansen-Slot, S. S., Vroom, T. M., Beckers, T., Rijksen, G. J. F. I. Overexpression of EGFR and c-erbB2 causes enhanced cell migration in human breast cancer cells and NIH3T3 fibroblasts. FEBS Lett. 425 (1), 145-150 (1998).
  4. Vaideeswar, P., Aswani, Y., Damani, S., Singaravel, S. Pulmonary microvascular metastases in cervical carcinoma: A case series. J Postgrad Med. 66 (3), 155-158 (2020).
  5. Liang, Y., Zhang, H., Song, X., Yang, Q. Metastatic heterogeneity of breast cancer: Molecular mechanism and potential therapeutic targets. Semin Cancer Biol. 60, 14-27 (2020).
  6. Sasaki, R., Osaki, M., Okada, F. MicroRNA-based diagnosis and treatment of metastatic human osteosarcoma. Cancers (Basel). 11 (4), 553(2019).
  7. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene Ther. 15 (10), 730-738 (2008).
  8. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  9. Yue, P. Y., Leung, E. P., Mak, N., Wong, R. N. A simplified method for quantifying cell migration/wound healing in 96-well plates. J Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
  10. Roch, T., et al. Immunological evaluation of polystyrene and poly (ether imide) cell culture inserts with different roughness. Clin Hemorheol Microcirc. 52 (2-4), 375-389 (2012).
  11. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
  12. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. , John Wiley & Sons, Inc. (2015).
  13. Kato, T., et al. Reuse of cell culture inserts for in vitro human primary airway epithelial cell studies. Am J Respir Cell. 64 (6), 760-764 (2021).
  14. Veludo-de-Oliveira, T. M., Ikeda, A. A., Campomar, M. C. Discussing laddering application by the means-end chain theory. Qualit Rep. 11 (4), 626-642 (2006).
  15. Yang, T., Yang, F., Men, J. Recommendation content matters! Exploring the impact of the recommendation content on consumer decisions from the means-end chain perspective. Int J Info Manage. 68, 102589(2023).
  16. Sadeghlou, S., Emami, A. Residential preferences and satisfaction: a qualitative study using means-end chain theory. J Housing Built Env. 38, 1711-1734 (2023).
  17. Pieters, R., Baumgartner, H., Allen, D. A means-end chain approach to consumer goal structures. Int J Res Market. 12 (3), 227-244 (1995).
  18. Valette-Florence, P., Rapacchi, B. J. J. Improvements in means-end chain analysis: using graph theory and correspondence analysis. J Advert Res. 31, 30-45 (1991).
  19. Nunkoo, R., Ramkissoon, H. Applying the means-end chain theory and the laddering technique to the study of host attitudes to tourism. J Sustain Tourism. 17 (3), 337-355 (2009).
  20. Development of an automatic mold polishing system. Tsai, M. J., Chang, J. L., Haung, J. F. IEEE Int Conf Robot Auto, 3, 3517-3522 (2005).
  21. Altan, T., et al. Advanced techniques for die and mold manufacturing. CIRP Annals. 42 (2), 707-716 (1993).
  22. Kalt, E., Monfared, R., Jackson, M. Towards an automated polishing system: Capturing manual polishing operations. Int J Res Eng Tech. 5 (7), 182-192 (2016).
  23. Becerra, L. CMF design: the fundamental principles of colour, material and finish design. , Frame Publishers, UK. (2016).
  24. Pan, C., et al. Next-generation immuno-oncology agents: current momentum shifts in cancer immunotherapy. J Hematol Oncol. 13 (1), 29(2020).
  25. Kim, S., Nah, K. The development direction of emotional materials by increasing sensorial experiences-Focusing on the case study of CMF design. Arch Des Res. 27 (2), 121-135 (2014).
  26. Eiseman, L. The complete color harmony, pantone edition: expert color information for professional results. , Rockport Publishers. (2017).
  27. Eiseman, L., Recker, K. Pantone: The twentieth century in color:(coffee table books, design books, best books about color). , Chronicle Books. (2011).
  28. Deng, P., Jin, W., Liu, Z., Gao, M., Zhou, J. Novel multifunctional adenine-modified chitosan dressings for promoting wound healing. Carbohydr Polym. 260, 117767(2021).
  29. Ares, G., Giménez, A., Gámbaro, A. Understanding consumers' perception of conventional and functional yogurts using word association and hard laddering. Food Quality Prefer. 19 (7), 636-643 (2008).
  30. Lee, W. J. A study on word cloud techniques for analysis of unstructured text data. J Converg Culture Tech. 6 (4), 715-720 (2020).
  31. Word Cloud Explorer: Text Analytics Based on Word Clouds. Heimerl, F., Lohmann, S., Lange, S., Ertl, T. 47th Hawaii international conference on system sciences, , IEEE. (2014).
  32. Kulevicz, R. A., et al. Influence of sustainability reports on social and environmental issues: bibliometric analysis and the word cloud approach. Env Rev. 28 (4), 380-386 (2020).
  33. Rubbo, S. D., Gardner, J. F. A review of sterilization and disinfection. Lloyd-Luke. , (1965).
  34. Kelsey, J. C. Sterilization by ethylene oxide. J Clin Pathol. 14 (1), 59-61 (1961).
  35. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Sci. 22 (1), 1-16 (2017).
  36. Rutala, W. A., Gergen, M. F., Weber, D. J. Comparative evaluation of the sporicidal activity of new low-temperature sterilization technologies: ethylene oxide, 2 plasma sterilization systems, and liquid peracetic acid. Am J Infect Control. 26 (4), 393-398 (1998).
  37. Dion, M., Parker, W. Steam sterilization principles. Pharm Eng. 33 (6), 1-8 (2013).
  38. Környei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Sci Rep. 3, 1088(2013).
  39. Hsu, J. T., et al. Chronic wound assessment and infection detection method. BMC Med Inform Decis Mak. 19 (1), 99(2019).
  40. Katoh, M. Test-retest reliability of isometric ankle plantar flexion strength measurement performed by a hand-held dynamometer considering fixation: examination of healthy young participants. J Phys Ther Sci. 34 (6), 463-466 (2022).
  41. Li, X., Zhao, J., Ma, G., Huang, S. Experimental study on the traditional timber mortise-tenon joints. Adv Str Eng. 18 (12), 2089-2102 (2016).
  42. Cottle, R. W. The principal pivoting method revisited. Mathematical Prog. 48, 369-385 (1990).
  43. Cross, N. Engineering design methods: strategies for product design. , John Wiley & Sons. (2021).
  44. Otto, K., Wood, K. Product design: techniques in reverse engineering and new product development. , Pearson. (2001).
  45. Tariq, M., et al. Gefitinib inhibits M2-like polarization of tumor-associated macrophages in Lewis lung cancer by targeting the STAT6 signaling pathway. Acta Pharmacol Sin. 38 (11), 1501-1511 (2017).
  46. Rahimi, S., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of Lcn2 effectively enhanced CDDP-induced apoptosis and reduced cell migration capacity of PC3 cells. Life Sci. 231, 116586(2019).
  47. Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino, E., Paxson, J. Optimization of the wound scratch assay to detect changes in murine mesenchymal stromal cell migration after damage by soluble cigarette smoke extract. J Vis Exp. (106), e53414(2015).
  48. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (144), e58838(2019).
  49. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound healing assay. Methods Mol Biol. 294, 23-29 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

skrobaczka do komórekstrefa wolna od komórekmigracja komórekżywotność komórekproliferacja komórekpowtarzalny testmetoda oparta na końcówcetest EdU
Narzędzie do automatycznego tworzenia stabilnych i powtarzalnych przerw bezkomórkowych w celu poprawy wiarygodności testu gojenia się ran komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.