W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

Podsumowanie

W tym badaniu, w bambusie opracowano nowatorską metodę ekspresji genów planta i edycji genów, w której pośredniczy Agrobacterium. Metoda ta znacznie poprawiła skuteczność walidacji funkcji genów w bambusie, co ma znaczące implikacje dla przyspieszenia procesu hodowli bambusa.

Streszczenie

Nowatorska metoda transformacji genów planta została opracowana dla bambusa, co pozwala uniknąć konieczności czasochłonnych i pracochłonnych procesów indukcji i regeneracji kalusa. Metoda ta polega na ekspresji genów za pośrednictwem Agrobacterium poprzez zranienie i podciśnienie w przypadku sadzonek bambusa. Udało się zademonstrować ekspresję genów egzogennych, takich jak gen reporterowy RUBY i gen Cas9, w liściach bambusa. Najwyższą efektywność przemiany dla akumulacji betalainy w siewkach RUBY osiągnięto przy użyciu szczepu GV3101, z odsetkiem 85,2% po zakażeniu. Chociaż obce DNA nie zintegrowało się z genomem bambusa, metoda była skuteczna w ekspresji genów egzogennych. Co więcej, przy użyciu tej metody opracowano również system edycji genów z natywnym reporterem, z którego powstaje mutant in situ wygenerowany przez edytowany gen de-epoksydazy wiolaksantyny bambusa (PeVDE) w liściach bambusa, ze wskaźnikiem mutacji 17,33%. Mutacja PeVDE spowodowała zmniejszenie wartości niefotochemicznego wygaszania (NPQ) w silnym świetle, co można dokładnie wykryć za pomocą fluorometru. To sprawia, że edytowany PeVDE jest potencjalnym natywnym reporterem zarówno dla egzogennych, jak i endogennych genów bambusa. W przypadku reportera PeVDE udało się edytować gen reduktazy cynamonoilo-CoA ze wskaźnikiem mutacji 8,3%. Operacja ta pozwala uniknąć procesu hodowli tkankowej lub indukcji kalusa, który jest szybki i skuteczny w ekspresji genów egzogennych i endogennej edycji genów w bambusie. Metoda ta może poprawić skuteczność weryfikacji funkcji genów i pomoże ujawnić mechanizmy molekularne kluczowych szlaków metabolicznych w bambusie.

Wprowadzenie

Badanie funkcji genów w bambusie jest bardzo obiecujące dla zaawansowanego zrozumienia bambusa i uwolnienia jego potencjału do modyfikacji genetycznych. Skuteczny sposób na to można osiągnąć poprzez proces infekcji liści bambusa, w którym pośredniczy Agrobacterium, w którym fragment T-DNA zawierający egzogenne geny jest wprowadzany do komórek, co następnie prowadzi do ekspresji genów w komórkach liścia.

jest cennym i odnawialnym zasobem o szerokim zakresie zastosowań w produkcji, sztuce i badaniach. posiada doskonałe właściwości drewna, takie jak wysoka wytrzymałość mechaniczna, wytrzymałość, umiarkowana sztywność i elastyczność¹, który jest obecnie szeroko stosowany w różnych artykułach gospodarstwa domowego i przemysłowego, w tym szczoteczkach do zębów, słomkach, guzikach, jednorazowej zastawie stołowej, podziemnych rurociągach i wypełniaczach chłodni kominowych do wytwarzania energii cieplnej. Dlatego hodowla bambusa odgrywa kluczową rolę w uzyskiwaniu odmian bambusa o doskonałych właściwościach drewna w celu zastąpienia tworzyw sztucznych i zmniejszenia zużycia plastiku, ochrony środowiska i przeciwdziałania zmianom klimatycznym, a także generowania znacznej wartości ekonomicznej.

Jednak tradycyjna hodowla bambusa napotyka wyzwania ze względu na długą fazę wzrostu wegetatywnego i niepewny okres kwitnienia. Chociaż techniki hodowli molekularnej zostały opracowane i zastosowane w hodowli bambusa, proces transformacji genów bambusa jest czasochłonny, pracochłonny i skomplikowany ze względu na procesy indukcji i regeneracji kalusa^2,3,4,5. Stabilna transformacja genetyczna często wymaga metod za pośrednictwem Agrobacterium, które obejmują procesy hodowli tkankowej, takie jak indukcja i regeneracja kalusa. ma jednak niską zdolność do regeneracji kalusa, co znacznie ogranicza zastosowanie stabilnej transformacji genetycznej w bambusie. Po tym, jak Agrobacterium zainfekuje komórki roślinne, fragment T-DNA dostaje się do komórek roślinnych, przy czym większość fragmentów T-DNA pozostaje niezintegrowana w komórkach, co powoduje przejściową ekspresję. Tylko niewielka część fragmentów T-DNA losowo integruje się z chromosomem, prowadząc do stabilnej ekspresji. Przejściowe poziomy ekspresji pokazują krzywą akumulacji, która może się różnić dla każdego genu wyrażonego z T-DNA dostarczonego przez Agrobacterium. W większości przypadków najwyższe poziomy ekspresji występują 3-4 dni po infiltracji i szybko spadają po 5-6 dniach^6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że ponad 1/3 mutacji w roślinach z edytowanymi genami uzyskanych bez presji selekcyjnej na odporność pochodzi z przejściowej ekspresji CRISPR/Cas9, podczas gdy pozostałe mniej niż 2/3 pochodzi ze stabilnej ekspresji po integracji DNA z genomem⁸. Wskazuje to, że integracja T-DNA z genomem rośliny nie jest konieczna do edycji genów. Co więcej, presja selekcyjna na odporność znacznie hamuje wzrost komórek nietransgenicznych, bezpośrednio wpływając na proces regeneracji zakażonych eksplantatów. W związku z tym, stosując przejściową ekspresję bez presji selekcyjnej na odporność w bambusie, możliwe jest osiągnięcie niezintegrowanej ekspresji genów egzogennych i badanie funkcji genów bezpośrednio w organach roślinnych. W związku z tym można opracować łatwą i oszczędzającą czas metodę egzogennej ekspresji genów i edycji w bamboo⁹.

Opracowana metoda egzogennej ekspresji genów i edycji genów charakteryzuje się prostotą, opłacalnością oraz brakiem drogiego sprzętu czy skomplikowanych procedur⁹. W tej metodzie endogenny gen deepoksydazy wiolaksantyny (PeVDE) bambusa został wykorzystany jako reporter do ekspresji egzogennego genu bez presji selekcyjnej. Dzieje się tak, ponieważ edytowany PeVDE w liściach bambusa zmniejsza zdolność fotoprotekcji w silnym świetle i wykazuje spadek wartości niefotochemicznego hartowania (NPQ), którą można wykryć za pomocą obrazowania fluorescencji chlorofilu. Aby zademonstrować skuteczność tej metody, inny endogenny gen bambusa, gen reduktazy cynamonoilo-CoA (PeCCR5)⁹, został znokautowany przy użyciu tego systemu i z powodzeniem wygenerował mutanty tego genu. Technika ta może być wykorzystana do funkcjonalnej charakterystyki genów, które pełnią funkcje w liściach bambusa. Poprzez nadekspresję tych genów przejściowo w liściach bambusa, ich poziom ekspresji może zostać zwiększony lub poprzez edycję genów, ich ekspresja może zostać zmniejszona, co pozwala na badanie dalszych poziomów ekspresji genów, fenotypów liści i zawartości produktu. Zapewnia to bardziej efektywne i wykonalne podejście do badań nad funkcjami genów w bambusie. Technikę tę można zastosować do funkcjonalnej charakterystyki genów funkcjonujących w liściach bambusa. Poprzez nadekspresję tych genów przejściowo w liściach bambusa, ich poziom ekspresji może zostać zwiększony lub poprzez edycję genów, ich ekspresja może zostać zmniejszona, co pozwala na badanie dalszych poziomów ekspresji genów, fenotypów liści i zawartości produktu. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że ze względu na rozległą poliploidyzację większość ważnych komercyjnie genów w genomach bambusa jest obecna w wielu kopiach, co skutkuje redundancją genetyczną. Stanowi to wyzwanie dla przeprowadzenia multipleksowej edycji genomu w bambusie. Przed zastosowaniem stabilnych technik transformacji genetycznej lub edycji genów kluczowe znaczenie ma szybka walidacja funkcji genów. Rozwiązując problem wielu kopii genów, jednym z podejść jest analiza profili ekspresji transkryptomu w celu zidentyfikowania genów, które są aktywnie wyrażane na określonych etapach. Co więcej, celowanie w konserwatywne domeny funkcjonalne tych kopii genów pozwala na projektowanie wspólnych sekwencji docelowych lub włączenie wielu miejsc docelowych do tego samego wektora CRISPR/Cas9, umożliwiając jednoczesny nokaut tych genów. Zapewnia to bardziej efektywne i wykonalne podejście do badań nad funkcjami genów w bambusie.

Protokół

1. Przygotowanie sadzonek bambusa

1. Przygotuj sadzonki bambusa moso (Phyllostachys edulis) z nasion zebranych w Guilin, Guangxi, Chiny. Zacznij od namoczenia nasion w wodzie przez 2-3 dni, pamiętając o codziennej wymianie wody. Następnie utwórz podłoże, mieszając glebę i wermikulit w stosunku 3:1.
2. Zasiej namoczone nasiona do podłoża w celu kiełkowania. Utrzymywać siewki w warunkach laboratoryjnych, utrzymując temperaturę w zakresie 18-25 °C. Zapewnić 16 godzin światła/8 godzin ciemnego fotoperiodu o natężeniu światła 250-350 μmol/^m2/s w fazie światła.
3. Utrzymuj wilgotność względną na poziomie około 60%. W przypadku zakażenia Agrobacterium należy używać sadzonek, które mają 15 dni i wysokość 2-10 cm, co jest najlepszym etapem transformacji.
   UWAGA: Ponieważ kwitnienie bambusa jest nieprzewidywalne, nasiona nie są dostępne co roku. Nasiona są zwykle przechowywane przez 2-3 lata w temperaturze 4 °C w suchym środowisku i mogą nadal utrzymywać żywotność na poziomie ponad 20%.

2. Przygotowanie plazmidów i Agrobacterium

1. Plazmidy: Aby zweryfikować efekt ekspresji przejściowej, należy zastosować konstrukt pHDE-35S::RUBY zawierający widoczny gen reporterowy sterowany przez promotor CaMV 35S¹⁰. Do edycji genów użyj konstruktu pCambia1300-Ubi::Cas9, który przenosi gen Cas9 sterowany przez promotor Ubi kukurydzy ¹¹. Wstaw sekwencje prowadzące sgRNA PeVDE i innych docelowych genów między dwoma miejscami AarI w pCambia1300-Ubi::Cas9 construct⁹.
2. Wstaw sekwencje RNA przewodnika CRISPR/Cas9 między dwoma miejscami endonukleazy restrykcyjnej AarI konstruktu pCambia1300-Ubi::Cas9, w tym genami docelowymi PeVDE i PeCCR5.
3. Dodaj GGCA do końca 5' sekwencji 20-nukleotydowej i zsyntetyzuj jednoniciową sekwencję DNA. Odwróć dopełnienie sekwencji 20-nukleotydowej i dodaj AAAC do końca 5', a następnie zsyntetyzuj kolejną jednoniciową sekwencję DNA.
4. Rozcieńczyć obie jednoniciowe sekwencje DNA do stężenia 10 nM/l w rozcieńczonej wodzie, dokładnie wymieszać i ogrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, co spowoduje powstanie dwuniciowych łączników.
5. Połącz adaptery z liniowym fragmentem pCambia1300-Ubi::Cas9 trawionym przez endonukleazę AarI przy użyciu ligazy DNA T4 i sekwencjonuj skonstruowany wektor CRISPR/Cas9, aby uzyskać pożądany konstrukt ukierunkowany na gen.
6. Aby przekształcić plazmidy w Agrobacterium, należy zastosować metodę zamrażania i rozmrażania w następujący sposób: Wymieszaj 1 μl plazmidów (stężenie: 10 - 1 000 ng/μL) ze 100 μl komórek kompetentnych dla Agrobacterium (wydajność translacji: > 1 x 10⁴ jednostki tworzące kolonie/μg) i delikatnie je wymieszaj. Umieść mieszaninę na lodzie na 5 minut. Przenieść mieszaninę do ciekłego azotu na 5 minut.
7. Rozmrażać mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 500 μl pożywki Luria-Bertani (LB) do mieszaniny i inkubować ją w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C przy 200 obr./min przez 2-3 godziny. W przypadku plazmidów pHDE-35S::RUBY wprowadź je pojedynczo do szczepów AGL1, GV3101, LBA4044 i EHA105 Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². W przypadku plazmidów CRISPR/Cas9 wprowadź je do szczepu GV3101 A. tumefaciens.
8. Hodować Agrobacterium w pożywce z peptonu z ekstraktem drożdżowym (YEP) (10 g ekstraktu z wołowiny, 10 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl na L) z odpowiednimi antybiotykami (spektynomycyna dla 35S::RUBY i kanamycyna dla CRISPR/Cas9) w temperaturze 28 °C. Pojedyncze rodziny obserwowano po 36-48 godzinach od uprawy.
9. Zbierz i przenieś kolonie do płynnej pożywki YEP (z odpowiednimi antybiotykami) w celu dalszego wzrostu. Po 24-36 godzinach użyj starterów RUBY-F i RUBY-R (Tabela 1) do wykonania PCR w celu potwierdzenia pomyślnego przeniesienia plazmidów do Agrobacterium.
10. Przenieść 1 ml pomyślnie przekształconego Agrobacterium do 100 ml świeżej płynnej pożywki YEP (z odpowiednimi antybiotykami), a następnie rosnąć przez noc w temperaturze 28 °C do OD₆₀₀ 0,8.
11. Zawiesinę bakteryjną odwirować w stężeniu 4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać osad bakteryjny raz pożywką do infiltracji zawiesin (10 mM MgCl₂ i 10 mM MES-KOH [pH 5,6]), a następnie ponownie odwirować. Zawiesić osad bakteryjny w podłożu infiltracyjnym zawiesiny do OD₆₀₀ 0,6 w celu przemiany bambusa.

3. Agrobacterium -pośredniczy w systemie transformacji planta

1. Przygotuj się do transformacji; ostrożnie usuń sadzonki z korzeniami przyczepionymi do gleby z podłoża, upewniając się, że korzenie pozostają nienaruszone. Owiń sadzonki folią aluminiową, aby utrzymać wilgoć i zapobiec oderwaniu gleby (Rysunek 1A).
2. Przenieś owinięte sadzonki do środowiska o wyższej wilgotności (wilgotność względna powietrza >90%) i niższym oświetleniu (intensywność mniejsza niż 50 μmol/^m2/s) przez 2 godziny.
3. Za pomocą ostrej igły ze strzykawki nawiń górną część zwiniętych niedojrzałych liści (około 1-2 cm od góry) sadzonek bambusa raz lub dwa razy (jak wskazują czerwone trójkąty w Rysunek 1A).
4. Następnie zanurz zranioną górną część sadzonek w zawiesinach Agrobacterium. Cały proces, od zranienia do zanurzenia w Agrobacterium, należy szybko przeprowadzić, ponieważ świeża rana zwiększy skuteczność inokulacji.
5. Natychmiast przenieś sadzonki do komory próżniowej o ciśnieniu 25-27 mmHg na 2 minuty (Rysunek 1B).
6. Po odkurzeniu ostrożnie rozpakuj sadzonki i przesadź je do podłoża. Sadzonki należy umieścić w słabym świetle lub ciemności (<50 μmol/^m2/s) o wysokiej wilgotności (RH>90%) w temperaturze pokojowej (18-25 °C) na 2 dni. Następnie hoduj sadzonki w normalnych warunkach wzrostu, podlewając je co 5-7 dni. Obserwuj ich fenotypy, aby dostarczyć materiału do kolejnych eksperymentów.

4. Projektowanie jednoprzewodnikowych RNA (sgRNA) do edycji genów

1. Zidentyfikuj miejsce motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) znajdujące się w pobliżu określonej i konserwatywnej domeny docelowej sekwencji genu. Upewnij się, że określona sekwencja PAM to NGG w tym systemie CRISPR/Cas9. Sprawdź swoistość wybranej sekwencji w miejscu docelowym, przeprowadzając wyszukiwanie BlastN w bazie danych genomu bambusa. Upewnij się, że sgRNA jest unikalny, szczególnie w regionie upstream i blisko PAM^9,11.
   UWAGA: To porównanie skutecznie zmniejszy potencjalne miejsca poza celem w genomie, na które wpływa proces edycji genów.
2. Zaprojektuj dwa sgRNA (sgRNA-1 i sgRNA-2) na pierwszym eksonie genu PeVDE ¹³. Uwzględnij miejsca ograniczenia wiekuI przed PAM w sgRNA-1 i miejsca restrykcyjne XbaI przed PAM w sgRNA-2. Zaprojektuj jedno sgRNA na czwartym eksonie genu PeCCR5, który koduje konserwatywny motyw KNWYCYGK. Ten motyw ma kluczowe znaczenie dla katalizy CCRs¹⁴.
3. Zaprojektuj sekwencję dystansową 20 nukleotydów przylegającą do miejsca PAM. Ta sekwencja dystansowa poprowadzi enzym Cas9 do miejsca docelowego w celu rozszczepienia DNA i późniejszej edycji genów.
   UWAGA: Wskazane jest wybranie regionu docelowego przed miejscem rozszczepienia enzymu endonukleazy w miejscu PAM. Ułatwi to walidację efektywności edycji genów.

5. Projekt startera i PCR

1. Ręczne projektowanie specjalnych starterów do amplifikacji fragmentów PeVDE i PeCCR5. Startery przed i za nimi należy zaprojektować tak, aby znajdowały się co najmniej 100 pz poza miejscem docelowym, z różnicą długości ponad 100 pz, aby umożliwić wyraźną separację pasm podczas elektroforezy. Zaprojektuj startery do amplifikacji RUBY w ciągu pierwszych 500 pz genu. Wykaz wszystkich użytych starterów znajduje się w tabeli 1.
2. Użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności do PCR. W takim przypadku wykorzystaj polimerazę DNA o wysokiej wierności i wydajnej amplifikacji w klonowaniu genów.
3. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR w następujący sposób: 5x bufor (Mg²⁺ Plus): 4 μL; mieszanina dNTP (po 2,5 mM): 1,6 μL; Startery do przodu i do tyłu (po 10 pmol): po 1 μL; DNA genomu bambusa (około 50 ng); Polimeraza DNA (2,5 U/μL): 0,2 μL; Rozcieńczyć wodę do całkowitej objętości 20 μl.
4. Postępuj zgodnie z warunkami pracy PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 5 minut; denaturacja w temperaturze 98 °C przez 10 s; Wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 5 s; Przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s; Powtórz denaturację do wydłużenia przez 32 cykle; Końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min; Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.
   UWAGA: Warunki PCR są podane jako przykład i mogą wymagać optymalizacji pod kątem określonych zastosowań lub celów.

6. Ekstrakcja DNA, trawienie enzymów endonukleazy i sekwencjonowanie

1. Oddziel obszar o niższych wartościach NPQ od świeżych blaszek liściowych bambusa za pomocą nożyczek, zgodnie z identyfikacją fluorometru obrazowania PAM (patrz krok 7.4). Próbki liści należy zamrozić ciekłym azotem i przenieść zamrożone próbki liści do moździerza. Zmiel próbki na drobny proszek za pomocą tłuczka, dodając wystarczającą ilość ciekłego azotu podczas procesu mielenia. Ten krok pomaga w uwalnianiu zawartości komórkowej, w tym DNA.
2. Ekstrahować genomowe DNA ze sproszkowanego liścia przy użyciu metody bromku amonu cetyltrimetyloamoniowego (CTAB). Dodać 50 mg próbek proszku z liści do 800 μl 2% roztworu CCAB. Dokładnie wymieszać próbkę i inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut, delikatnie wstrząsając co 5 minut.
3. Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1, v/v) i energicznie wstrząsnąć mieszaniną. Po odwirowaniu w stężeniu 8 000 g przez 8 minut, przenieść supernatant do nowej probówki.
4. Dodać równą objętość chloroformu/alkoholu izoamylowego i powtórzyć krok 6.3. Dodać równą objętość lodowatego izopropanolu i kilkakrotnie odwrócić probówkę przed umieszczeniem jej w temperaturze -20 °C na 30 minut. Po odwirowaniu przy 8 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant.
5. Przemyć osad DNA 2x 75% etanolem w temperaturze 4 °C, a następnie rozpuścić w 50 μl wody.
6. Amplifikować genomowe DNA zawierające miejsce docelowe genów zarówno z liści bambusa typu dzikiego, jak i zakażonych Agrobacterium, za pomocą protokołu opisanego w kroku 5.4.
7. Przeprowadzić trawienie enzymatyczne endonukleazy produktów PCR. Wybierz konkretny enzym, który rozpoznaje pożądane miejsca restrykcyjne w amplifikowanych fragmentach DNA. Do trawienia używaj endonukleaz wiekuI i XbaI.
8. Przygotować mieszaninę reakcyjną składającą się z AgeI lub XbaI (20 jednostek/μL)-1 μL, 1 μg produktów PCR, 10x buforu - 5 μL, i dodać wodę do całkowitej objętości 50 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
9. Przeanalizuj proporcję strawionych fragmentów DNA za pomocą elektroforezy żelowej. Porównaj strawione fragmenty z próbek typu dzikiego i zakażonych Agrobacterium, aby ocenić skuteczność edycji genów.
10. Oznacz sekwencje adaptera transpozazy TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG i GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG do końca 5' starterów do przodu i do tyłu, odpowiednio, w celu amplifikacji fragmentów PeVDE i PeCCR5^9,15. Użyj protokołu opisanego w kroku 5.4 w celu wzmocnienia. Przygotuj produkty PCR (przed trawieniem) do głębokiego sekwencjonowania.

7. Pomiar fluorescencji chlorofilu wartości NPQ w liściach

1. Przed pomiarami należy wystawić sadzonki bambusa na działanie warunków dużego natężenia światła 1200 μmol/^m2/s przez 2 godziny. Ekspozycja ta zwiększa ilość pochłoniętego kwantu światła i aktywuje system fotoprotekcji w liściach.
2. Użyj fluorometru obrazowania PAM, aby zmierzyć fluorescencję chlorofilu PS II in vivo liści bambusa. Ustaw natężenie światła aktynicznego na 800 μmol/^m2/s dla 6 minut pomiarów fluorescencji. W tym okresie należy stosować impuls nasycający co 30 s, aby uzyskać krzywe fluorescencji chlorofilu. Stabilne wartości krzywych zostaną użyte do obliczeń¹³.
3. Obliczyć hartowanie niefotochemiczne (NPQ) za pomocą wzoru:
   NPQ = (F_m - F_m') / F_m'
   gdzie F_m oznacza maksymalną fluorescencję w stanie przystosowanym do ciemności, a F_m' oznacza maksymalną fluorescencję w dowolnym stanie przystosowanym do światła.
4. Monitoruj wartości NPQ za pomocą interfejsu wizualnego oprogramowania do obrazowania. Oprogramowanie umożliwia analizę w czasie rzeczywistym i wyświetlanie danych fluorescencji, w tym wartości NPQ.

Wyniki

Agrobacterium-pośrednia ekspresja genów in planta w liściach bambusa
Wykazano, że gen reporterowy RUBY jest skuteczny w wizualizacji przejściowej ekspresji genów dzięki zdolności do produkcji intensywnie czerwonej betalainy z tyrozyny¹⁰. W niniejszym badaniu wykorzystano transformację za pośrednictwem Agrobacterium do przejściowej ekspresji egzogennego genu RUBY w liściach bambusa (Rysunek 1). W 3^c...

Dyskusja

Metoda ta znacznie skraca wymagany czas w porównaniu z tradycyjnymi metodami transformacji genetycznej, które zwykle trwają 1-2 lata, i pozwala osiągnąć przejściową ekspresję genów egzogennych i edycję genów endogennych w ciągu 5 dni. Jednak ta metoda ma ograniczenia, ponieważ może przekształcić tylko niewielką część komórek, a liście edytowane genami są chimeryczne i nie mają zdolności do regeneracji w kompletne rośliny. Niemniej jednak, ta technologia ekspresji genów i edycji genów w roślinie zapewnia potężne ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
35S::RUBY	Addgene, Stany Zjednoczone	160908	Plamid construct
Agrobacterium kompetentne komórki GV3101, EHA105,LBA4404 i AGL1	Biomed, Chiny	BC304-01, BC303-01, BC301-01 i BC302-01	Do zakażenia Agrobacterium
CTAB	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	57-09-0	Ekstrakcja DNA
Obrazowanie-PAM fluorometr	Walz, Effeltrich, Niemcy		Wykrywanie fluorescencji chlorofilu liści bambusa
ObrazowanieWin	Walz, Effeltrich, Niemcy		Oprogramowanie do obrazowania - PAM fluorometr
Paq CI lub Aar I	NEB, Stany Zjednoczone	R0745S	Włącz sekwencję docelową do wektora CRISPR/Cas9.
Polimeraza DNA PrimeSTAR Max	Takara, Japonia	R045Q	Do klonowania genów
Ligaza DNA T4	NEB, Stany Zjednoczone	M0202V	Włącz sekwencję docelową do wektora CRISPR/Cas9.