Model wcześniaka do badań nad bólem

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zwięzły protokół tworzenia modelu wcześniaka, ułatwiający badania nad wczesnym leczeniem bólu poporodowego. Metoda polega na wykonaniu cesarskiego cięcia na trzy dni przed spodziewanym porodem, ekstrakcji wcześniaków poprzez histerektomię i zintegrowaniu ich z biologicznym potomstwem matki zastępczej.

Streszczenie

To badanie zagłębia się w konsekwencje konsekwentnej stymulacji szpilkami u wcześniaków, aby ustalić jej długoterminowe implikacje dla wrażliwości na ból. Głównym celem tego protokołu było zbadanie wpływu bodźców kłujących szpilkami u noworodków na próg bólu w późniejszych etapach życia przy użyciu modelu wcześniaka. Ustanawiając ten model, dążymy do postępu w badaniach nad zrozumieniem i radzeniem sobie z wczesnym bólem poporodowym związanym z wcześniactwem. Wyniki tego badania wskazują, że podczas gdy wyjściowe progi dla bodźców mechanicznych pozostały nienaruszone, nastąpił znaczny wzrost nadwrażliwości mechanicznej po całkowitym wstrzyknięciu adiuwanta Freunda (CFA) u dorosłych szczurów. Co ciekawe, w porównaniu z samcami szczurów, samice szczurów wykazywały zwiększoną nadwrażliwość zapalną. Warto zauważyć, że zachowanie matki, waga miotów i trajektoria wzrostu potomstwa pozostały niezmienione przez stymulację. Manifestacja zmienionych reakcji nocyceptywnych w wieku dorosłym po bolesnych bodźcach noworodkowych może wskazywać na zmiany w przetwarzaniu sensorycznym i funkcjonowaniu receptorów glikokortykosteroidowych. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska i opracować interwencje w zakresie konsekwencji wcześniactwa i bólu noworodków u dorosłych.

Wprowadzenie

Podczas okresu noworodkowego, szlaki nocyceptywne ulegają znacznemu strukturalnemu i funkcjonalnemu dojrzewaniu, a obecność uszkodzeń tkanek i związanego z tym bólu ma głębokie implikacje dla rozwoju przetwarzania somatosensorycznego¹.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwala na kontrolowane eksperymentalne manipulowanie zwierzętami innymi niż ludzie, umożliwiając głębsze zrozumienie konsekwencji bólu noworodków na zachowanie w późniejszym życiu, jednocześnie łagodząc potencjalne zmienne zakłócające^2,3. Często obserwowanym wynikiem jest wpływ bólu noworodka na zwiększoną wrażliwość na ból w wieku dorosłym^2,4,5. Na oddziale intensywnej terapii noworodków (OIOM) ból noworodków jest bardzo powszechnym źródłem stresu, a wcześniaki zazwyczaj poddawane są średnio 10 inwazyjnym zabiegom dziennie⁶. Wcześniaki przebywające na OIOM-ie dla noworodków napotykają szereg czynników stresogennych, w tym ból, ograniczony kontakt z matką, bodźce słuchowe i nadmierne oświetlenie^7,8,9.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest niezbędne do pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych procesów i ułatwienia nowych postępów w tej dziedzinie. W szczególności wykorzystanie w badaniach modeli zwierzęcych wcześniaków może znacznie przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat wcześniaków i dostarczyć cennych informacji na temat interwencji w zakresie leczenia bólu u wcześniaków¹⁰.

Obecnie istnieje ograniczona liczba modeli gryzoni, które dotyczą wcześniactwa, przy czym większość z tych badań dotyczy przede wszystkim wpływu wcześniactwa na mózg¹¹, rozwój płuc¹², martwicze zapalenie jelit¹³, lub badania żywieniowe układu odpornościowego¹⁴. Jednak żaden z tych modeli nie bada dojrzewania układu bólowego, który jest szczególnie wrażliwy w przypadku wcześniactwa.

Przedwczesny poród i jego konsekwencje dla wczesnego leczenia bólu poporodowego pozostają kluczowymi obszarami badań. W związku z tym niniejsza praca miała na celu wzbogacenie literatury poprzez ustanowienie modelu wcześniaka. Model ten dostarcza informacji na temat wpływu bodźców kłujących szpilkami u noworodków na progi bólu na późniejszych etapach życia, poszerzając naszą wiedzę na temat bólu związanego z wcześniactwem.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przyjętym przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Federalnego w Alfenas (protokół 32/2016).

1. Zwierzęta

1. Pozyskaj dorosłe samce i nieródki szczurów Wistar (w wieku około ośmiu tygodni) z Centralnego Ośrodka dla Zwierząt Uniwersytetu Federalnego w Alfenas.
2. Trzymaj szczury w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności w cyklu światła i ciemności o godzinie 12:12 i karm je karmą i wodą ad libitum w obiektach dla zwierząt na Wydziale Fizjoterapii (Uniwersytet Federalny w Alfenas).

2. Sprawdzanie, czy nie ma ciąży

1. Przez 1 miesiąc, codziennie rano między 8:00 a 9:00 rano, transportuj każdą klatkę dla zwierząt do pomieszczenia doświadczalnego. Aby wykonać płukanie pochwy, ostrożnie wprowadź plastikową pipetę zawierającą 10 μl 0,9% roztworu NaCl do pochwy szczura. Upewnij się, że wkładka jest płytka, aby uniknąć głębokiej penetracji, a następnie delikatnie wycofaj, aby zebrać wydzielinę z pochwy.
2. Umieść pobrany płyn dopochwowy na poszczególnych szkiełkach podstawowych, przypisując osobny szkiełko do każdej klatki ze zwierzętami.
   1. Uzyskaj pojedynczą kroplę niebarwionego materiału od każdego szczura za pomocą czystej końcówki pipety. Zbadaj materiał pod mikroskopem świetlnym za pomocą soczewek obiektywowych 10x i 40x, bez użycia soczewki kondensoracyjnej.
   2. Zidentyfikuj trzy różne typy komórek na podstawie ich cech: okrągłe i jądrzaste komórki nabłonkowe, nieregularne zrogowaciałe komórki bez jądra oraz małe i okrągłe leukocyty¹⁵.
3. Wystaw samice szczurów rasy Wistar z intensywnym rogowaceniem i złuszczaniem pochwy, charakterystycznym dla cyklu rujowego i wskazującym na zwiększoną podatność samców, na krycie. Połącz szczury, umieszczając 2 samice i 1 samca w klatce. Określ dzień ciąży 0, sprawdzając obecność plemników i komórek fazy rujowej w rozmazach z pochwy.

3. Klasyfikacja i postępowanie z ciężarnymi matkami i ich potomstwem

1. Pozbywaj się trzech rodzajów ciężarnych matek (po 2 matki każda) w zależności od ich etapu ciąży: wcześniaki, donoszone i zastępcze. Pozwól ciężarnym matkom urodzić w sposób naturalny w 22 dniu ciąży i wykorzystaj ich mioty do grupy donoszonej.
2. W 19 dniu ciąży należy wykonać cesarskie cięcie u wcześniaków w ciąży, czyli 3 dni przed przewidywanym terminem porodu. Wykorzystaj te mioty dla grupy wcześniaków. Biorąc pod uwagę, że zabieg ten nie sprzyja przeżyciu matki, należy powierzyć wcześniaki matkom zastępczym, które urodziły w sposób naturalny 2 dni przed cesarskim cięciem u wcześniaków.
3. Trzymaj młode matki zastępczej przy sobie przez kilka godzin, pozwalając ich zapachom mieszać się z miotami wcześniaków. Po tym okresie należy wprowadzić mioty wcześniaków i usunąć pierwotne młode surogatki, a następnie złożyć je w ofierze za pomocą dużych dawek wdychania izofluranu.
   UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby upewnić się, że matki zastępcze już stymulowały produkcję mleka w swoich gruczołach mlecznych, ustawiając je do skutecznego karmienia wcześniaków¹⁶.

4. Cesarskie cięcie

1. Częściowo znieczulić wcześniaki ciężarne 2% izofluranem i poddać je eutanazji na 3 dni przed spodziewanym terminem porodu za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Po eutanazji wydobywaj potomstwo jedno po drugim poprzez histerektomię.
2. Wykonaj 3 cm nacięcie w linii środkowej dolnej części brzucha, a następnie 2 cm podłużne cięcie. Z tych nacięć wykonaj nacięcie wzdłuż granicy antykrezkowej w środkowej części każdego jajowodu.
3. Delikatnie wyekstrahuj młode szczurów i łożysko za pomocą histerektomii^17,18. Natychmiast wyekstrahuj potomstwo jeden po drugim.

5. Opieka pooperacyjna i przygotowanie szczeniąt do adopcji

1. Skorzystaj z procedury adopcji, aby zapobiec niewłaściwemu zachowaniu operowanej matki z powodu zabiegu chirurgicznego i potencjalnego bólu, który może wpłynąć na dorosłe zachowanie szczeniąt.
2. Po urodzeniu oczyść drogi oddechowe szczeniąt szczurów za pomocą ręczników papierowych. Oczyść młode szczurów, kąpiąc je, aby zapobiec kanibalizmowi przez zastępcze matki. Umyj młode szczura w wodzie o temperaturze 28 °C i wysusz je.
3. Usunąć wszelkie ślady krwi i umieścić młode na szalkach Petriego w ogrzewanym świetle podczerwonym, utrzymując temperaturę około 28 °C do momentu, gdy ich oddech stanie się regularny.
4. Przetnij ich pępowinę tuż poniżej łożyska i użyj bawełny nasączonej_H2O₂, aby zatrzymać krwawienie z pępowiny. Na koniec zaoferuj je matkom zastępczym do adopcji.

6. Interakcja z matką zastępczą i adopcja wcześniaka

1. Umieść każdą matkę zastępczą ze swoim miotem w oddzielnych plastikowych klatkach. Przed przekazaniem oznacz każde szczenię z ręki opiekuna. To oznaczenie ma kluczowe znaczenie dla późniejszych analiz zachowań matek. Utrzymuj integralność klatek matek zastępczych przez cały proces adopcji.
2. Początkowo umieść wcześniaki na zewnątrz gniazda. Ta strategia pozwala matce zastępczej rozpoznać i zapoznać się z zapachem nowych szczeniąt na neutralnym terytorium. Wybierz również jedno lub dwa młode matki zastępczej i umieść je na zewnątrz gniazda obok wcześniaków. Ta mieszanka skłania matkę zastępczą do zbierania zarówno własnych, jak i wcześniaków, sprzyjając w ten sposób akceptacji i integracji nowych szczeniąt w swoim gnieździe
.
3. Początkowo wymieszaj przybrane potomstwo z biologicznym potomstwem. Potwierdź skuteczną adopcję. Usuń szczenięta matki zastępczej z gniazda i złóż je w ofierze¹⁹.
   UWAGA: W tym badaniu żywotność wcześniaków wynosiła 100% i nie zostały one odrzucone przez matkę zastępczą.

7. Standaryzacja miotu

1. Utrzymuj wielkość miotu wynoszącą 8 młodych w miocie we wszystkich grupach szczeniąt hodowanych przez surogatki, z 4 samcami i 4 samicami. Poświęć pozostałe szczenięta szczurów po standaryzacji.

8. Projekt eksperymentalny i implementacja protokołu

UWAGA: Celem tego protokołu było uzyskanie zdolnych do życia wcześniaków do opracowania następujących procedur eksperymentalnych.

1. Do zabiegów wykorzystaj łącznie 20 ciężarnych matek. Podziel je na dwie grupy eksperymentalne, z których każda składa się z 10 zapór.
   1. Stymuluj młode w pierwszej grupie, grupie PP, bodźcami kłującymi od PND 2 do PND 15.
   2. Oznacz drugą grupę jako grupę CC, która służy jako grupa kontrolna, przy czym młode w tej grupie nie otrzymują stymulacji nakłucia.
   3. Przez cały ten okres należy pilnie monitorować zachowanie matczyne matek i wagę miotów.

9. Oceny po odsadzeniu i testy behawioralne

1. Odstawienie potomstwa od piersi w dniu 22 PND. Sortuj je według płci i trzymaj w klatkach o maksymalnej pojemności 4 zwierząt każda, aż osiągną wiek około 8 tygodni.
2. Następnie poddaj te zwierzęta ocenie wrażliwości na bolesne bodźce za pomocą elektronicznego testu von Freya. Skoncentruj się w szczególności na bólu wywołanym stanem zapalnym z powodu CFA.
3. Aby złagodzić potencjalne wpływy związane z miotem, wybierz 1 samca i 1 samicę szczura z każdego miotu dla każdej grupy eksperymentalnej, aby przejść testy behawioralne w wieku dorosłym.
4. Użyj każdego zwierzęcia w jednym eksperymencie, aby uniknąć interferencji czynników hormonalnych w odpowiedziach nocyceptywnych samic szczurów. W szczególności należy upewnić się, że testy są przeprowadzane na samicach w fazie diestrus ich cyklu rujowego.

10. Powtarzająca się indukcja bólu u noworodków

1. Wywołaj powtarzający się ból u noworodka za pomocą techniki nakłucia szpilką podobną do tej opisanej w poprzednim badaniu²⁰. Zainicjuj codzienne bodźce do nakłuwania szpilkami dla młodych szczurów, począwszy od 2 dnia po urodzeniu (PND 2) i kontynuuj tę praktykę do 15 PND.
2. Ostrożnie wbić igłę 22 G na płytką głębokość w środkową część podeszwy prawej tylnej łapy.
   1. Upewnij się, że penetracja jest wystarczająca do stymulacji bez powodowania nadmiernych obrażeń. Skalibruj miernik, aby zapobiec głębszej penetracji, biorąc pod uwagę ryzyko, że w tym wieku przejdzie on całkowicie przez łapę.
   2. Jeśli wystąpi krwawienie, natychmiast je zatrzymaj za pomocą wacika z bawełnianą końcówką; zazwyczaj ta interwencja trwa tylko kilka sekund. Podawaj bodźce 4 razy, zachowując 2-minutową przerwę między nimi, w sumie 8 nakłuć dziennie.
3. Aby zminimalizować potencjalne czynniki zakłócające związane z separacją matki i obchodzeniem się z noworodkiem, należy oddzielić młode szczurów od ich matek na maksymalnie 5 minut. Zastosuj ten sam czas separacji do grupy kontrolnej. Po każdym zestawie bodźców natychmiast zwróć młode szczurów do ich matek^5,21,22.

11. Ocena zachowań matki

1. Aby ocenić zachowanie matki, należy ocenić zachowanie matek w obu grupach eksperymentalnych (n = 10 na grupę) od PND 2 do PND 15. Przeprowadź ocenę w dwóch sesjach: jedną rano, przed bodźcami ukłutymi na młode szczurów (między 08:00 a 09:30), a drugą po południu, po bodźcach nakłutych na młodych szczurach (między 15:00 a 16:30).
2. Podczas tych sesji pilnie obserwuj, rejestruj i oceniaj zachowanie każdej matki co 3 minuty podczas tych sesji, co prowadzi do 30 obserwacji na okres dziennie. Daje to w sumie 60 obserwacji na matkę dziennie.

12. Rejestrowanie zachowań matczynych i niematczynych

1. Rejestruj parametry zachowania matki, które obejmują takie czynności, jak pielęgnacja lub lizanie (ciała lub okolicy odbytu i narządów płciowych), karmienie piersią, utrzymywanie wygiętych w łuk pleców w pozycji przypominającej "koc" poprzez leżenie nad młodymi, bierne leżenie na plecach lub boku podczas karmienia, angażowanie się w budowanie gniazd i samodzielna pielęgnacja matki (w tym stymulacja piersi poprzez samooczyszczanie).
2. Udokumentuj parametry zachowania niezwiązane z matką, w tym takie działania, jak karmienie, eksploracja klatki, nieeksplorowanie i brak samodzielnej pielęgnacji matki.
3. Przedstaw dane jako procent całkowitego zachowania matczynego i niematczynego. Podziel liczbę zarejestrowanych obserwacji zachowania celu przez całkowitą liczbę obserwacji i pomnóż wynik przez 100^5,23,24.

13. Ocena wagi miotu

1. Przez całą fazę stymulacji nakłucia szpilkami (PND 2-15) monitoruj masę miotów zarówno w grupie PP, jak i CC, z których każda składa się z 8 miotów.
2. Podczas fazy stymulacji nakłucia (PND 2-15) należy stale kontrolować masę miotów zarówno w grupie PP, jak i CC, z których każda składa się z 8 miotów.

14. Test progu mechanicznego

1. W tym eksperymencie należy podać zastrzyki soli fizjologicznej lub CFA, każde w objętości 100 μl, szczurom (w wieku 8 tygodni) z grup PP i CC. Następnie umieść je indywidualnie w akrylowych klatkach (42 cm × 24 cm × 15 cm) z podłogą z siatki drucianej 15-30 minut przed testem, aby ocenić hiperalgezję mechaniczną.
2. W teście wywołaj odruch zgięcia tylnej łapy za pomocą ręcznego przetwornika siły wyposażonego w końcówkę polipropylenową o średnicy 0,5 mm² (elektroniczny von Frey).
   1. Stopniowo nakładaj końcówkę między pięć dystalnych opuszków prawej tylnej łapy, zwiększając nacisk, aż do zaobserwowania reakcji.
      UWAGA: Kiedy następuje wycofanie łapy, bodziec automatycznie ustaje, a jego siła jest udokumentowana. Test kończy się wyraźną reakcją drgania, po której następuje wycofanie łapy. Podskórne podanie CFA wywołuje przedłużony stan zapalny, osiągający szczyt po 24 godzinach i utrzymujący się przez co najmniej 7 dni²⁵.
3. Przeprowadzić testy na zwierzętach przed i po 4 godzinach, 7 godzinach, 10 godzinach i 24 godzinach po podaniu soli fizjologicznej lub CFA⁴. Przedstaw wyniki pod względem progu wycofania, mierzonego w gramach (g), i oblicz go, uśredniając trzy pomiary.
4. Aby zapobiec interferencji potencjalnych czynników hormonalnych w odpowiedziach nocyceptywnych wśród potomstwa płci żeńskiej, należy upewnić się, że testy są wykonywane wyłącznie w fazie diestrus ich cyklu rujowego.

15. Analiza danych

1. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej i przedstaw je jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM). Aby zidentyfikować statystycznie istotne różnice między grupami, należy zastosować dwukierunkową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzającymi się pomiarami, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak ocena parametrów matczynych i niematczynych oraz ocena masy miotu.
2. W szczególności przeanalizuj bodźce PND i pinprick pod kątem parametrów matczynych oraz bodźce von Freya: CFA i pinprick do oceny masy miotu. W razie potrzeby przeprowadź analizę post hoc za pomocą testu Bonferroniego.

Wyniki

W niniejszym badaniu nie stwierdzono różnic w zachowaniach macierzyńskich ani pozamacierzyńskich między matkami, niezależnie od tego, czy ich potomstwo było poddawane eksperymentom z nakłuciami w okresie noworodkowym, oraz czy potomstwo urodziło się przedwcześnie, czy w terminie (Rycina 1). W odniesieniu do zachowania macierzyńskiego adopcyjnych matek przedwcześnie urodzonego potomstwa, dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) wykazała wpływ PND (dzień postnatalny), ale brak wpływu bodźców w ...

Dyskusja

W tym badaniu zaobserwowaliśmy, że eksperymenty z nakłuciami szpilkowymi noworodków nie miały wpływu na zachowania matczyne i niematczyne. Tendencja ta rozciągała się również na zachowania niematczyne. Co więcej, przyrost masy ciała wcześniaków w okresie bodźca szpilkowego nie różnił się istotnie między grupą kontrolną a grupą nakłuwającą. Analizy progu wycofania łap wykazały godną uwagi redukcję zarówno samców, jak i samic szczeniąt z grup pinprick i CFA w porównaniu z młodymi z grup kontrolnych. Szczególnie uderzająca ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,9% roztwór NaCl	Concare, Brazylia
Klatki akrylowe (42 cm i razy 24 cm & razy 15 cm) z podłogą z siatki drucianej	Insight Equipamentos, Brazylia
Kompletny adiuwant Freunda (CFA)	Sigma Aldrich, Brazylia
Electronic von Frey,Insight	Equipamentos, Brazylia
H2O2 (nadtlenek wodoru)	ACS Cientifica, Brazylia
Oświetlenie podczerwone	Carci, Brazylia
Izofluran (2%)	Crist&aaostry; lia, Brazylia
Mikroskop pionowy	Nikon, Brazylia	Mikroskop ECLIPSE Ei	z soczewkami obiektywowymi 10x i 40x