Artykuł metodologiczny

Model wcześniaka do badań nad bólem

DOI:

10.3791/65800

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Neuroscience, Neuromodulation and Study of Pain (LANNED), UNIFAL-MG, 2SINPAIN Faculty

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zwięzły protokół tworzenia modelu wcześniaka, ułatwiający badania nad wczesnym leczeniem bólu poporodowego. Metoda polega na wykonaniu cesarskiego cięcia na trzy dni przed spodziewanym porodem, ekstrakcji wcześniaków poprzez histerektomię i zintegrowaniu ich z biologicznym potomstwem matki zastępczej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zagłębia się w konsekwencje konsekwentnej stymulacji szpilkami u wcześniaków, aby ustalić jej długoterminowe implikacje dla wrażliwości na ból. Głównym celem tego protokołu było zbadanie wpływu bodźców kłujących szpilkami u noworodków na próg bólu w późniejszych etapach życia przy użyciu modelu wcześniaka. Ustanawiając ten model, dążymy do postępu w badaniach nad zrozumieniem i radzeniem sobie z wczesnym bólem poporodowym związanym z wcześniactwem. Wyniki tego badania wskazują, że podczas gdy wyjściowe progi dla bodźców mechanicznych pozostały nienaruszone, nastąpił znaczny wzrost nadwrażliwości mechanicznej po całkowitym wstrzyknięciu adiuwanta Freunda (CFA) u dorosłych szczurów. Co ciekawe, w porównaniu z samcami szczurów, samice szczurów wykazywały zwiększoną nadwrażliwość zapalną. Warto zauważyć, że zachowanie matki, waga miotów i trajektoria wzrostu potomstwa pozostały niezmienione przez stymulację. Manifestacja zmienionych reakcji nocyceptywnych w wieku dorosłym po bolesnych bodźcach noworodkowych może wskazywać na zmiany w przetwarzaniu sensorycznym i funkcjonowaniu receptorów glikokortykosteroidowych. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska i opracować interwencje w zakresie konsekwencji wcześniactwa i bólu noworodków u dorosłych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas okresu noworodkowego, szlaki nocyceptywne ulegają znacznemu strukturalnemu i funkcjonalnemu dojrzewaniu, a obecność uszkodzeń tkanek i związanego z tym bólu ma głębokie implikacje dla rozwoju przetwarzania somatosensorycznego1.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych pozwala na kontrolowane eksperymentalne manipulowanie zwierzętami innymi niż ludzie, umożliwiając głębsze zrozumienie konsekwencji bólu noworodków na zachowanie w późniejszym życiu, jednocześnie łagodząc potencjalne zmienne zakłócające2,3. Często obserwowanym wynikiem jest wpływ bólu noworodka na zwiększoną wrażliwość na ból w wieku dorosłym2,4,5. Na oddziale intensywnej terapii noworodków (OIOM) ból noworodków jest bardzo powszechnym źródłem stresu, a wcześniaki zazwyczaj poddawane są średnio 10 inwazyjnym zabiegom dziennie6. Wcześniaki przebywające na OIOM-ie dla noworodków napotykają szereg czynników stresogennych, w tym ból, ograniczony kontakt z matką, bodźce słuchowe i nadmierne oświetlenie7,8,9.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest niezbędne do pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw tych procesów i ułatwienia nowych postępów w tej dziedzinie. W szczególności wykorzystanie w badaniach modeli zwierzęcych wcześniaków może znacznie przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat wcześniaków i dostarczyć cennych informacji na temat interwencji w zakresie leczenia bólu u wcześniaków10.

Obecnie istnieje ograniczona liczba modeli gryzoni, które dotyczą wcześniactwa, przy czym większość z tych badań dotyczy przede wszystkim wpływu wcześniactwa na mózg11, rozwój płuc12, martwicze zapalenie jelit13, lub badania żywieniowe układu odpornościowego14. Jednak żaden z tych modeli nie bada dojrzewania układu bólowego, który jest szczególnie wrażliwy w przypadku wcześniactwa.

Przedwczesny poród i jego konsekwencje dla wczesnego leczenia bólu poporodowego pozostają kluczowymi obszarami badań. W związku z tym niniejsza praca miała na celu wzbogacenie literatury poprzez ustanowienie modelu wcześniaka. Model ten dostarcza informacji na temat wpływu bodźców kłujących szpilkami u noworodków na progi bólu na późniejszych etapach życia, poszerzając naszą wiedzę na temat bólu związanego z wcześniactwem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne były zgodne z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przyjętym przez Komitet Etyczny ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Federalnego w Alfenas (protokół 32/2016).

1. Zwierzęta

  1. Pozyskaj dorosłe samce i nieródki szczurów Wistar (w wieku około ośmiu tygodni) z Centralnego Ośrodka dla Zwierząt Uniwersytetu Federalnego w Alfenas.
  2. Trzymaj szczury w kontrolowanych warunkach temperatury i wilgotności w cyklu światła i ciemności o godzinie 12:12 i karm je karmą i wodą ad libitum w obiektach dla zwierząt na Wydziale Fizjoterapii (Uniwersytet Federalny w Alfenas).

2. Sprawdzanie, czy nie ma ciąży

  1. Przez 1 miesiąc, codziennie rano między 8:00 a 9:00 rano, transportuj każdą klatkę dla zwierząt do pomieszczenia doświadczalnego. Aby wykonać płukanie pochwy, ostrożnie wprowadź plastikową pipetę zawierającą 10 μl 0,9% roztworu NaCl do pochwy szczura. Upewnij się, że wkładka jest płytka, aby uniknąć głębokiej penetracji, a następnie delikatnie wycofaj, aby zebrać wydzielinę z pochwy.
  2. Umieść pobrany płyn dopochwowy na poszczególnych szkiełkach podstawowych, przypisując osobny szkiełko do każdej klatki ze zwierzętami.
    1. Uzyskaj pojedynczą kroplę niebarwionego materiału od każdego szczura za pomocą czystej końcówki pipety. Zbadaj materiał pod mikroskopem świetlnym za pomocą soczewek obiektywowych 10x i 40x, bez użycia soczewki kondensoracyjnej.
    2. Zidentyfikuj trzy różne typy komórek na podstawie ich cech: okrągłe i jądrzaste komórki nabłonkowe, nieregularne zrogowaciałe komórki bez jądra oraz małe i okrągłe leukocyty15.
  3. Wystaw samice szczurów rasy Wistar z intensywnym rogowaceniem i złuszczaniem pochwy, charakterystycznym dla cyklu rujowego i wskazującym na zwiększoną podatność samców, na krycie. Połącz szczury, umieszczając 2 samice i 1 samca w klatce. Określ dzień ciąży 0, sprawdzając obecność plemników i komórek fazy rujowej w rozmazach z pochwy.

3. Klasyfikacja i postępowanie z ciężarnymi matkami i ich potomstwem

  1. Pozbywaj się trzech rodzajów ciężarnych matek (po 2 matki każda) w zależności od ich etapu ciąży: wcześniaki, donoszone i zastępcze. Pozwól ciężarnym matkom urodzić w sposób naturalny w 22 dniu ciąży i wykorzystaj ich mioty do grupy donoszonej.
  2. W 19 dniu ciąży należy wykonać cesarskie cięcie u wcześniaków w ciąży, czyli 3 dni przed przewidywanym terminem porodu. Wykorzystaj te mioty dla grupy wcześniaków. Biorąc pod uwagę, że zabieg ten nie sprzyja przeżyciu matki, należy powierzyć wcześniaki matkom zastępczym, które urodziły w sposób naturalny 2 dni przed cesarskim cięciem u wcześniaków.
  3. Trzymaj młode matki zastępczej przy sobie przez kilka godzin, pozwalając ich zapachom mieszać się z miotami wcześniaków. Po tym okresie należy wprowadzić mioty wcześniaków i usunąć pierwotne młode surogatki, a następnie złożyć je w ofierze za pomocą dużych dawek wdychania izofluranu.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby upewnić się, że matki zastępcze już stymulowały produkcję mleka w swoich gruczołach mlecznych, ustawiając je do skutecznego karmienia wcześniaków16.

4. Cesarskie cięcie

  1. Częściowo znieczulić wcześniaki ciężarne 2% izofluranem i poddać je eutanazji na 3 dni przed spodziewanym terminem porodu za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Po eutanazji wydobywaj potomstwo jedno po drugim poprzez histerektomię.
  2. Wykonaj 3 cm nacięcie w linii środkowej dolnej części brzucha, a następnie 2 cm podłużne cięcie. Z tych nacięć wykonaj nacięcie wzdłuż granicy antykrezkowej w środkowej części każdego jajowodu.
  3. Delikatnie wyekstrahuj młode szczurów i łożysko za pomocą histerektomii17,18. Natychmiast wyekstrahuj potomstwo jeden po drugim.

5. Opieka pooperacyjna i przygotowanie szczeniąt do adopcji

  1. Skorzystaj z procedury adopcji, aby zapobiec niewłaściwemu zachowaniu operowanej matki z powodu zabiegu chirurgicznego i potencjalnego bólu, który może wpłynąć na dorosłe zachowanie szczeniąt.
  2. Po urodzeniu oczyść drogi oddechowe szczeniąt szczurów za pomocą ręczników papierowych. Oczyść młode szczurów, kąpiąc je, aby zapobiec kanibalizmowi przez zastępcze matki. Umyj młode szczura w wodzie o temperaturze 28 °C i wysusz je.
  3. Usunąć wszelkie ślady krwi i umieścić młode na szalkach Petriego w ogrzewanym świetle podczerwonym, utrzymując temperaturę około 28 °C do momentu, gdy ich oddech stanie się regularny.
  4. Przetnij ich pępowinę tuż poniżej łożyska i użyj bawełny nasączonejH2O2, aby zatrzymać krwawienie z pępowiny. Na koniec zaoferuj je matkom zastępczym do adopcji.

6. Interakcja z matką zastępczą i adopcja wcześniaka

  1. Umieść każdą matkę zastępczą ze swoim miotem w oddzielnych plastikowych klatkach. Przed przekazaniem oznacz każde szczenię z ręki opiekuna. To oznaczenie ma kluczowe znaczenie dla późniejszych analiz zachowań matek. Utrzymuj integralność klatek matek zastępczych przez cały proces adopcji.
  2. Początkowo umieść wcześniaki na zewnątrz gniazda. Ta strategia pozwala matce zastępczej rozpoznać i zapoznać się z zapachem nowych szczeniąt na neutralnym terytorium. Wybierz również jedno lub dwa młode matki zastępczej i umieść je na zewnątrz gniazda obok wcześniaków. Ta mieszanka skłania matkę zastępczą do zbierania zarówno własnych, jak i wcześniaków, sprzyjając w ten sposób akceptacji i integracji nowych szczeniąt w swoim gnieździe
    3. .
  3. Początkowo wymieszaj przybrane potomstwo z biologicznym potomstwem. Potwierdź skuteczną adopcję. Usuń szczenięta matki zastępczej z gniazda i złóż je w ofierze19.
    UWAGA: W tym badaniu żywotność wcześniaków wynosiła 100% i nie zostały one odrzucone przez matkę zastępczą.

7. Standaryzacja miotu

  1. Utrzymuj wielkość miotu wynoszącą 8 młodych w miocie we wszystkich grupach szczeniąt hodowanych przez surogatki, z 4 samcami i 4 samicami. Poświęć pozostałe szczenięta szczurów po standaryzacji.

8. Projekt eksperymentalny i implementacja protokołu

UWAGA: Celem tego protokołu było uzyskanie zdolnych do życia wcześniaków do opracowania następujących procedur eksperymentalnych.

  1. Do zabiegów wykorzystaj łącznie 20 ciężarnych matek. Podziel je na dwie grupy eksperymentalne, z których każda składa się z 10 zapór.
    1. Stymuluj młode w pierwszej grupie, grupie PP, bodźcami kłującymi od PND 2 do PND 15.
    2. Oznacz drugą grupę jako grupę CC, która służy jako grupa kontrolna, przy czym młode w tej grupie nie otrzymują stymulacji nakłucia.
    3. Przez cały ten okres należy pilnie monitorować zachowanie matczyne matek i wagę miotów.

9. Oceny po odsadzeniu i testy behawioralne

  1. Odstawienie potomstwa od piersi w dniu 22 PND. Sortuj je według płci i trzymaj w klatkach o maksymalnej pojemności 4 zwierząt każda, aż osiągną wiek około 8 tygodni.
  2. Następnie poddaj te zwierzęta ocenie wrażliwości na bolesne bodźce za pomocą elektronicznego testu von Freya. Skoncentruj się w szczególności na bólu wywołanym stanem zapalnym z powodu CFA.
  3. Aby złagodzić potencjalne wpływy związane z miotem, wybierz 1 samca i 1 samicę szczura z każdego miotu dla każdej grupy eksperymentalnej, aby przejść testy behawioralne w wieku dorosłym.
  4. Użyj każdego zwierzęcia w jednym eksperymencie, aby uniknąć interferencji czynników hormonalnych w odpowiedziach nocyceptywnych samic szczurów. W szczególności należy upewnić się, że testy są przeprowadzane na samicach w fazie diestrus ich cyklu rujowego.

10. Powtarzająca się indukcja bólu u noworodków

  1. Wywołaj powtarzający się ból u noworodka za pomocą techniki nakłucia szpilką podobną do tej opisanej w poprzednim badaniu20. Zainicjuj codzienne bodźce do nakłuwania szpilkami dla młodych szczurów, począwszy od 2 dnia po urodzeniu (PND 2) i kontynuuj tę praktykę do 15 PND.
  2. Ostrożnie wbić igłę 22 G na płytką głębokość w środkową część podeszwy prawej tylnej łapy.
    1. Upewnij się, że penetracja jest wystarczająca do stymulacji bez powodowania nadmiernych obrażeń. Skalibruj miernik, aby zapobiec głębszej penetracji, biorąc pod uwagę ryzyko, że w tym wieku przejdzie on całkowicie przez łapę.
    2. Jeśli wystąpi krwawienie, natychmiast je zatrzymaj za pomocą wacika z bawełnianą końcówką; zazwyczaj ta interwencja trwa tylko kilka sekund. Podawaj bodźce 4 razy, zachowując 2-minutową przerwę między nimi, w sumie 8 nakłuć dziennie.
  3. Aby zminimalizować potencjalne czynniki zakłócające związane z separacją matki i obchodzeniem się z noworodkiem, należy oddzielić młode szczurów od ich matek na maksymalnie 5 minut. Zastosuj ten sam czas separacji do grupy kontrolnej. Po każdym zestawie bodźców natychmiast zwróć młode szczurów do ich matek5,21,22.

11. Ocena zachowań matki

  1. Aby ocenić zachowanie matki, należy ocenić zachowanie matek w obu grupach eksperymentalnych (n = 10 na grupę) od PND 2 do PND 15. Przeprowadź ocenę w dwóch sesjach: jedną rano, przed bodźcami ukłutymi na młode szczurów (między 08:00 a 09:30), a drugą po południu, po bodźcach nakłutych na młodych szczurach (między 15:00 a 16:30).
  2. Podczas tych sesji pilnie obserwuj, rejestruj i oceniaj zachowanie każdej matki co 3 minuty podczas tych sesji, co prowadzi do 30 obserwacji na okres dziennie. Daje to w sumie 60 obserwacji na matkę dziennie.

12. Rejestrowanie zachowań matczynych i niematczynych

  1. Rejestruj parametry zachowania matki, które obejmują takie czynności, jak pielęgnacja lub lizanie (ciała lub okolicy odbytu i narządów płciowych), karmienie piersią, utrzymywanie wygiętych w łuk pleców w pozycji przypominającej "koc" poprzez leżenie nad młodymi, bierne leżenie na plecach lub boku podczas karmienia, angażowanie się w budowanie gniazd i samodzielna pielęgnacja matki (w tym stymulacja piersi poprzez samooczyszczanie).
  2. Udokumentuj parametry zachowania niezwiązane z matką, w tym takie działania, jak karmienie, eksploracja klatki, nieeksplorowanie i brak samodzielnej pielęgnacji matki.
  3. Przedstaw dane jako procent całkowitego zachowania matczynego i niematczynego. Podziel liczbę zarejestrowanych obserwacji zachowania celu przez całkowitą liczbę obserwacji i pomnóż wynik przez 1005,23,24.

13. Ocena wagi miotu

  1. Przez całą fazę stymulacji nakłucia szpilkami (PND 2-15) monitoruj masę miotów zarówno w grupie PP, jak i CC, z których każda składa się z 8 miotów.
  2. Podczas fazy stymulacji nakłucia (PND 2-15) należy stale kontrolować masę miotów zarówno w grupie PP, jak i CC, z których każda składa się z 8 miotów.

14. Test progu mechanicznego

  1. W tym eksperymencie należy podać zastrzyki soli fizjologicznej lub CFA, każde w objętości 100 μl, szczurom (w wieku 8 tygodni) z grup PP i CC. Następnie umieść je indywidualnie w akrylowych klatkach (42 cm × 24 cm × 15 cm) z podłogą z siatki drucianej 15-30 minut przed testem, aby ocenić hiperalgezję mechaniczną.
  2. W teście wywołaj odruch zgięcia tylnej łapy za pomocą ręcznego przetwornika siły wyposażonego w końcówkę polipropylenową o średnicy 0,5 mm2 (elektroniczny von Frey).
    1. Stopniowo nakładaj końcówkę między pięć dystalnych opuszków prawej tylnej łapy, zwiększając nacisk, aż do zaobserwowania reakcji.
      UWAGA: Kiedy następuje wycofanie łapy, bodziec automatycznie ustaje, a jego siła jest udokumentowana. Test kończy się wyraźną reakcją drgania, po której następuje wycofanie łapy. Podskórne podanie CFA wywołuje przedłużony stan zapalny, osiągający szczyt po 24 godzinach i utrzymujący się przez co najmniej 7 dni25.
  3. Przeprowadzić testy na zwierzętach przed i po 4 godzinach, 7 godzinach, 10 godzinach i 24 godzinach po podaniu soli fizjologicznej lub CFA4. Przedstaw wyniki pod względem progu wycofania, mierzonego w gramach (g), i oblicz go, uśredniając trzy pomiary.
  4. Aby zapobiec interferencji potencjalnych czynników hormonalnych w odpowiedziach nocyceptywnych wśród potomstwa płci żeńskiej, należy upewnić się, że testy są wykonywane wyłącznie w fazie diestrus ich cyklu rujowego.

15. Analiza danych

  1. Przetwarzaj dane za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej i przedstaw je jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM). Aby zidentyfikować statystycznie istotne różnice między grupami, należy zastosować dwukierunkową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzającymi się pomiarami, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak ocena parametrów matczynych i niematczynych oraz ocena masy miotu.
  2. W szczególności przeanalizuj bodźce PND i pinprick pod kątem parametrów matczynych oraz bodźce von Freya: CFA i pinprick do oceny masy miotu. W razie potrzeby przeprowadź analizę post hoc za pomocą testu Bonferroniego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu nie było różnic w zachowaniu matek i niematek, niezależnie od tego, czy ich potomstwo przeszło eksperymenty z nakłuciem szpilki w okresie noworodkowym, czy też było wcześniakiem lub urodzonym terminem (Rysunek 1). Jeśli chodzi o zachowania macierzyńskie matek adopcyjnych wcześniaków, dwukierunkowa ANOVA wykazała, że istnieje wpływ PND (dzień poporodowy), ale nie ma wpływu bodźców typu pinprick ani żadnej interakcji między tymi dwoma czynnikami na ocenę obserwowanego zachowania matki o godzinie 8 rano. [Czynnik PND: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; czynnik bodźca punktowego: F(1,140) = 1,04, p = 0,30; bodziec kłujący x oddziaływanie PND: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; Rysunek 1A]; lub o godz. 15.00 [współczynnik PND: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; czynnik bodźca punktowego: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07; bodziec kłujący x interakcja PND: F(13, 140) = 1,82, p = 0,04; Rysunek 1C]. Jeśli chodzi o zachowanie niematczyne, zauważalny był efekt spowodowany PND, ale nie było znaczącego wpływu bodźców kłujących lub interakcji między tymi dwoma czynnikami o godzinie 8 rano. [Czynnik PND: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; czynnik bodźca kłującego: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; interakcja między bodźcem ukłucia szpilki a PND: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; patrz Rysunek 1B]. Podobnie, podczas gdy efekt PND utrzymywał się, wpływ bodźców nakłucia szpilką i jego interakcja z PND nie były statystycznie istotne o godzinie 15:00. [czynnik PND: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; czynnik bodźca punktowego: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07. Dwukierunkowa ANOVA ujawniła godny uwagi wpływ PND i, co ważne, istotną interakcję między bodźcami kłującymi a PND o godzinie 15:00 (czynnik PND: F(13, 182) = 13,82, p < 0,001; czynnik bodźców punktowych: F(1, 182) = 3,78, p = 0,05; Oddziaływanie bodźców PND x nakłucia: F(13, 182) = 1,82, p = 0,04; patrz Rysunek 1D]. Ta interakcja podkreśla wyraźny wpływ bodźców kłujących na zachowania niematczyne, szczególnie widoczny w popołudniowej ocenie.

figure-results-1
Rysunek 1: Wpływ nakłuwania w okresie noworodkowym (PND 2-15) na zachowanie matki adopcyjnej wcześniaków. (A) Liczba zarejestrowanych zachowań matki ocenionych o godzinie 8:00 (B) Liczba zarejestrowanych zachowań niematczynych ocenionych o godzinie 8:00 (C) Liczba zarejestrowanych zachowań matki ocenionych o godzinie 15:00 (D) Liczba zarejestrowanych zachowań pozamatczynych oceniono o godz. 15:00. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 przedstawia przyrost masy ciała wcześniaków w okresie, w którym zastosowano bodziec kłujący (PND 2-15). Nie zaobserwowano zmian w masie miotu między grupą CC (kontrolną) a grupą PP (pinprick). Dwukierunkowa ANOVA ujawniła istotny wpływ PND, ale nie wykazała znaczącego wpływu bodźca kłującego lub interakcji między tymi dwoma czynnikami na masę miotu [czynnik PND: F(13, 140) = 247,5, p < 0,001; czynnik bodźca punktowego: F(1, 140) = 0,89, p = 0,34; bodziec kłujący × interakcji PND: F(13, 140) = 0,05, p = 1,00].

figure-results-2
Rysunek 2 - Wpływ nakłucia w okresie noworodkowym (PND 2-15) na wagę wcześniaka w gramach. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SEM 8 zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zaobserwowano znaczący główny wpływ bodźców do ukłucia szpilkami i CFA na próg wycofania łapy, ze znacznym spadkiem (p < 0,001) widocznym u samców z grup CC/CFA i PP/CFA we wszystkich punktach czasowych w porównaniu do tych w grupach CC/Sal i PP/Sal (Rysunek 3A). Podkreśla to silny wpływ zarówno bodźców kłujących, jak i CFA na reakcje nocyceptywne u młodych samców. Warto zauważyć, że 4 godziny po wstrzyknięciu CFA zaobserwowano znaczne zmniejszenie PWT (p < 0,001) w grupie PP/CFA w porównaniu z grupą CC/CFA [czynnik CFA: F(4,112) = 13,12, p < 0,001; czynnik bodźca kłującego: F(3,112) = 14,45, p < 0,05; Interakcja CFA x bodziec szpilkowy: F(12,112) = 5,14, p < 0,05]. W odniesieniu do młodych płci żeńskiej (Rysunek 3B), w grupach CC/CFA i PP/CFA we wszystkich punktach czasowych odnotowano spadek progu wycofania (p < 0,001) we wszystkich punktach czasowych w porównaniu z tymi w grupach CC/Sal i PP/Sal. W szczególności 4 godziny po wstrzyknięciu CFA zaobserwowano znaczne obniżenie progu wycofania (p < 0,05) w grupie PP/CFA w porównaniu z grupą CC/CFA [współczynnik CFA: F(4,112) = 31,16, p < 0,001; czynnik bodźca punktowego: F(3,112) = 18,22, p < 0,01; Interakcja CFA x bodziec szpilkowy: F(12,112) = 58,13, p < 0,01]. Zarówno dorosłe samce, jak i samice wykazywały obniżony próg wycofania łapy między grupą PP / CFA a grupą CC / CFA we wszystkich punktach czasowych, począwszy od znaku 4 godzin.

figure-results-3
Rysunek 3 - Wpływ nakłuwania w okresie noworodkowym (PND 2-15) u wcześniaków na nocycepcję według testu von Freya przed i po wstrzyknięciu dopodeszwowego CFA lub soli fizjologicznej. Próg wycofania łapy, w gramach, u (A) samców szczurów lub (B) samic szczurów. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SEM 8 zwierząt. * p < 0,05 i *** p < 0,001 w porównaniu z grupami kontrolnymi i PP/sól fizjologiczna w porównaniu z grupami kontrolnymi i PP/CFA; # p < 0,01 porównując grupę kontrolną CFA z grupą PP/CFA. BASAL reprezentuje próg nocyceptywny mierzony przed wstrzyknięciem doplantacyjnym CFA lub soli fizjologicznej. Strzałka wskazuje czas doplantacyjnego wstrzyknięcia CFA lub soli fizjologicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu zaobserwowaliśmy, że eksperymenty z nakłuciami szpilkowymi noworodków nie miały wpływu na zachowania matczyne i niematczyne. Tendencja ta rozciągała się również na zachowania niematczyne. Co więcej, przyrost masy ciała wcześniaków w okresie bodźca szpilkowego nie różnił się istotnie między grupą kontrolną a grupą nakłuwającą. Analizy progu wycofania łap wykazały godną uwagi redukcję zarówno samców, jak i samic szczeniąt z grup pinprick i CFA w porównaniu z młodymi z grup kontrolnych. Szczególnie uderzająca była obserwacja dalszego obniżenia progu wycofania łapy 4 godziny po wstrzyknięciu CFA w grupie nakłucia szpilką/CFA w porównaniu z grupą kontrolną/CFA. Te zniuansowane wyniki podkreślają wieloaspektowy wpływ stymulacji ukłucia szpilkami u noworodków na zachowanie matki, przyrost masy ciała ściółki i reakcje nocyceptywne u potomstwa, podkreślając znaczenie uwzględnienia zarówno stanu wcześniaka, jak i terminu podczas interpretacji wyników.

Nasze badania nad reakcjami nocyceptywnymi są zgodne i rozszerzają wyniki de Carvalho i wsp.26, którzy zgłosili zmiany w odpowiedziach nocyceptywnych i nadwrażliwości zapalnej w wieku dorosłym wynikające z powtarzającej się stymulacji nakłucia szpilkami u wcześniaków. Ta zbieżność wyników podkreśla trwały wpływ doświadczeń noworodkowych na szlaki nocyceptywne, podkreślając solidność tych wyników w różnych badaniach. Zaobserwowana zwiększona wrażliwość na szkodliwe bodźce zarówno u samców, jak i samic szczeniąt poddanych stymulacji noworodków sugeruje stały trend w modulacji reakcji nocyceptywnych, co dodatkowo przyczynia się do naszego zrozumienia długoterminowych konsekwencji stresorów we wczesnym okresie życia.

Wyniki tego badania są również zgodne z pracami Gieré i wsp.27, którzy badali nadwrażliwość nocyceptywną u dorosłych szczurów po separacji noworodków. Ich badanie sugeruje główne pochodzenie nadwrażliwości nocyceptywnej, wzmacniając pogląd, że stresory we wczesnym okresie życia mogą wywoływać trwałe zmiany w mechanizmach przetwarzania bólu. Zbieżność wyników podkreśla złożone zależności między zdarzeniami we wczesnym okresie życia a reakcjami nocyceptywnymi, co dodatkowo podkreśla potrzebę kompleksowego zrozumienia głównych mechanizmów przyczyniających się do długoterminowych zmian wrażliwości na ból.

Wpływ doświadczeń we wczesnym okresie życia na szlaki nocyceptywne jest dodatkowo wspierany przez odkrycia Changa i wsp.28, którzy badali zmiany w funkcjonalnej łączności bólu w somatosensorycznej i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura po doświadczeniach bólowych we wczesnym okresie życia. Ich praca zwróciła uwagę na długoterminowe zmiany w mechanizmach przetwarzania bólu wywołane przez stresory we wczesnym okresie życia, podkreślając znaczenie zrozumienia neuronalnych korelatów reakcji nocyceptywnych. Połączenie tych wyników z obserwacjami zwiększonej wrażliwości na szkodliwe bodźce u wcześniaków poddanych stymulacji noworodków przyczynia się do bardziej wszechstronnego zrozumienia trwałych konsekwencji doświadczeń bólowych we wczesnym okresie życia dla obwodów bólu u dorosłych.

Ponadto van den Hoogen i wsp.29 wykazali, że powtarzający się dotyk i stymulacja igłą w okresie noworodkowym zwiększały wyjściową wrażliwość mechaniczną i nadwrażliwość pourazową w rdzeniowych neuronach czuciowych u dorosłych. Obecne odkrycia, zgodne z wcześniejszymi badaniami, podkreślają trwałe konsekwencje doświadczeń bólowych u noworodków na szlaki nocyceptywne. Łącznie badania te podkreślają znaczenie rozpoznania długoterminowego wpływu doświadczeń we wczesnym okresie życia na wrażliwość na ból w wieku dorosłym, przyczyniając się do kompleksowego zrozumienia złożonej zależności między bodźcami noworodkowymi a reakcjami nocyceptywnymi.

Łącząc przedwczesny poród z ekspozycją na bolesne bodźce w okresie noworodkowym, opracowaliśmy model, który ściśle naśladuje wczesne doświadczenia życiowe wcześniaków, uwzględniając pilną potrzebę intensywnej opieki medycznej wymaganą przez wcześniactwo. Niemniej jednak znaczenie translacyjne tego modelu, szczególnie w odniesieniu do doświadczeń wcześniaków na OIOM-ie dla noworodków, wymaga dalszych wyjaśnień. Warto zauważyć, że nie zidentyfikowano żadnych badań wykorzystujących podobny model wcześniactwa do modelu zastosowanego w niniejszym badaniu. Jednakże, jeśli weźmiemy pod uwagę pierwsze dni życia (1-2) jako reprezentację wcześniactwa, wcześniejsze badania wykazały, że mężczyźni wykazują większą podatność na bodźce nocyceptywne niż samice w tym krytycznym okresie. Podatność ta została potwierdzona za pomocą testów nocyceptywnych stosowanych w wieku dorosłym, co częściowo uzasadnia zaobserwowane wyniki tego badania30.

W niniejszym badaniu po raz pierwszy wykorzystano wcześniaki urodzone przez cesarskie cięcie w 19 dniu ciąży do oceny progu nocyceptywnego w wieku dorosłym. Ten nowatorski model badania bólu u wcześniaków zapewnia unikalną perspektywę na tę populację. Model ten rodzi nowe pytania dotyczące testów nocyceptywnych, takich jak test von Freya, u dorosłych zwierząt obu płci, a także wszystkich aspektów związanych z progami nocyceptywnymi tych zwierząt, zarówno w okresie noworodkowym, jak i dorosłym.

Podczas gdy obecne badanie koncentrowało się przede wszystkim na wpływie bodźców kłujących szpilkami noworodków na progi bólu w późniejszych etapach życia, istnieje obiecująca droga do rozszerzenia tych badań na interwencje i poporodowe strategie przeciwbólowe. Przyszłe badania mogą ocenić skuteczność różnych interwencji w zakresie leczenia bólu w modelu wcześniaka szczura, badając potencjalne sposoby łagodzenia długoterminowych skutków bólu u noworodków. Może to obejmować badanie nowych podejść przeciwbólowych, ocenę czasu trwania i intensywności potrzebnych interwencji oraz badanie podstawowych mechanizmów wpływających na skuteczność tych interwencji.

Podsumowując, kompleksowe badanie przeprowadzone w tym badaniu miało na celu przeanalizowanie skomplikowanej zależności między stymulacją szpilek u noworodków, zachowaniem matki i warunkami przedwczesnego porodu na reakcje nocyceptywne u potomstwa. Skrupulatna analiza zachowań matek, w połączeniu z wykluczeniem potencjalnych czynników zakłócających, takich jak przedwczesny poród i opieka adopcyjna, potwierdziła odporność zachowania matki na podawany bodziec nocyceptywny. Przyrost masy ciała wcześniaków pozostał niezmieniony, co wskazuje, że obserwowane zmiany w reakcjach nocyceptywnych w wieku dorosłym były bardziej prawdopodobne związane ze stymulacją nakłucia we wczesnym okresie życia niż opieką nad matką lub rozwojem potomstwa. Wyniki tego badania są zgodne z literaturą na temat trwałych konsekwencji doświadczeń bólowych u noworodków, podkreślając zwiększoną wrażliwość na szkodliwe bodźce w wieku dorosłym. Co więcej, badanie potencjalnych teorii mechanistycznych, w tym zmian w przetwarzaniu neuronalnym i funkcji receptorów glikokortykosteroidowych, dostarcza cennych informacji na temat podstawowych szlaków przyczyniających się do zmian nocyceptywnych. Przedstawione tutaj wyniki oraz wyniki poprzednich badań podkreślają złożoność doświadczeń we wczesnym okresie życia w szlakach nocyceptywnych, rzucając światło na trwałe konsekwencje bodźców noworodkowych dla obwodów bólu u dorosłych. Chociaż uzasadnione są dalsze badania w celu wyjaśnienia niuansów leżących u podstaw tego zjawiska, badanie to przyczynia się do rosnącego zasobu wiedzy mającej na celu ujawnienie długoterminowego wpływu wydarzeń we wczesnym okresie życia na reakcje nocyceptywne u dorosłego potomstwa.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Federalny w Alfenas - UNIFAL-MG i Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (Stypendium CAPES, Laura Pereira Generoso; Natalie Lange Candido i Maria Gabriela Maziero Capello) - Kod finansowy 001.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór NaClConcare, Brazylia
Klatki akrylowe (42 cm i razy 24 cm & razy 15 cm) z podłogą z siatki drucianejInsight Equipamentos, Brazylia
Kompletny adiuwant Freunda (CFA) Sigma Aldrich, Brazylia
Electronic von Frey,InsightEquipamentos, Brazylia
H2O2 (nadtlenek wodoru)ACS Cientifica, Brazylia
Oświetlenie podczerwoneCarci, Brazylia
Izofluran (2%)Crist&aaostry; lia, Brazylia
Mikroskop pionowyNikon, BrazyliaMikroskop ECLIPSE Eiz soczewkami obiektywowymi 10x i 40x

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, A. H., Hanmer, J. M., Chapman, V., Hathway, G. J. Neonatal complete Freund's adjuvant-induced inflammation does not induce or alter hyperalgesic priming or alter adult distributions of C-fibre dorsal horn innervation. Pain Reports. 5 (6), e872(2020).
  2. Davis, S. M., Rice, M., Burman, M. A. Inflammatory neonatal pain disrupts maternal behavior and subsequent fear conditioning in a rodent model. Developmental Psychobiology. 62 (1), 88-98 (2020).
  3. Mooney-Leber, S. M., Brummelte, S. Neonatal pain and reduced maternal care alter adult behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal axis reactivity in a sex-specific manner. Developmental Psychobiology. 62 (5), 631-643 (2020).
  4. Vilela, F. C., Vieira, J. S., Giusti-Paiva, A., Silva, M. L. D. Experiencing early life maternal separation increases pain sensitivity in adult offspring. International Journal of Developmental Neuroscience. 62, 8-14 (2017).
  5. de Carvalho, R. C., et al. Repeated neonatal needle-prick stimulation increases inflammatory mechanical hypersensitivity in adult rats. International Journal of Developmental Neuroscience. 78, 191-197 (2019).
  6. Carbajal, R., et al. Epidemiology and treatment of painful procedures in neonates in intensive care units. JAMA. 300 (1), 60-70 (2008).
  7. Cong, X., et al. The impact of cumulative pain/stress on neurobehavioral development of preterm infants in the NICU. Early Human Development. 108, 9-16 (2017).
  8. König, K., Stock, E. L., Jarvis, M. Noise levels of neonatal high-flow nasal cannula devices - An in-vitro study. Neonatology. 103 (4), 264-267 (2013).
  9. Newnham, C. A., Inder, T. E., Milgrom, J. Measuring preterm cumulative stressors within the NICU: the Neonatal Infant Stressor Scale. Early Human Development. 85 (9), 549-555 (2009).
  10. De Clifford-Faugère, G., Aita, M., Arbour, C., Colson, S. Development, evaluation and adaptation of a critical realism informed theory of procedural pain management in preterm infants: The PAIN-Neo theory. Journal of Advanced Nursing. 79 (6), 2155-2166 (2023).
  11. Barkhuizen, M., et al. Nitric oxide production in the striatum and cerebellum of a rat model of preterm global perinatal asphyxia. Neurotoxicity Research. 31 (3), 400-409 (2017).
  12. Remesal, A., et al. Effect of prenatal steroidal inhibition of sPLA2 in a rat model of preterm lung. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 36, 31-36 (2016).
  13. Corsini, I., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ agonist pioglitazone reduces the development of necrotizing enterocolitis in a neonatal preterm rat model. Pediatric Research. 81 (2), 364-368 (2017).
  14. Grases-Pintó, B., et al. A preterm rat model for immunonutritional studies. Nutrients. 11 (5), 999(2019).
  15. Marcondes, F. K., Bianchi, F. J., Tanno, A. P. Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations. Brazilian Journal of Biology. 62 (4), 609-614 (2002).
  16. Zhu, M. -R., Liu, H. -Y., Liu, P. -P., Wu, H. Establishment of the patent ductus arteriosus model in preterm rats. Chinese Journal of Contemporary Pediatrics. 18, 372-375 (2016).
  17. Bowers, D., McKenzie, D., Dutta, D., Wheeless, C. R., Cohen, W. R. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 185 (3), 614-617 (2001).
  18. Wang, J., et al. Whey peptides improve wound healing following caesarean section in rats. The British Journal of Nutrition. 104 (11), 1621-1627 (2010).
  19. Appleby, C. J., Towner, R. A. Magnetic resonance imaging of pulmonary damage in the term and premature rat neonate exposed to hyperoxia. Pediatric Research. 50 (4), 502-507 (2001).
  20. Anand, K. J., Coskun, V., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term behavioral effects of repetitive pain in neonatal rat pups. Physiology & Behavior. 66 (4), 627-637 (1999).
  21. Tal, M., Bennett, G. J. Extra-territorial pain in rats with a peripheral mononeuropathy: mechano-hyperalgesia and mechano-allodynia in the territory of an uninjured nerve. Pain. 57 (3), 375-382 (1994).
  22. Chen, M., et al. Neonatal repetitive pain in rats leads to impaired spatial learning and dysregulated hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in later life. Scientific Reports. 6 (1), 39159(2016).
  23. Costa, H. H., Vilela, F. C., Giusti-Paiva, A. Continuous central infusion of cannabinoid receptor agonist WIN 55,212-2 decreases maternal care in lactating rats: consequences for fear conditioning in adulthood males. Behavioural Brain Research. 257, 31-38 (2013).
  24. Vilela, F. C., Ruginsk, S. G., de Melo, C. M., Giusti-Paiva, A. The CB1 cannabinoid receptor mediates glucocorticoid-induced effects on behavioural and neuronal responses during lactation. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (8), 1197-1207 (2013).
  25. Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).
  26. de Carvalho, R. C., et al. Effects of repetitive pinprick stimulation on preterm offspring: Alterations in nociceptive responses and inflammatory hypersensitivity in adulthood. Behavioural Brain Research. 454, 114633(2023).
  27. Gieré, C., et al. Towards a central origin of nociceptive hypersensitivity in adult rats after a neonatal maternal separation. The European Journal of Neuroscience. 58 (10), 4155-4165 (2023).
  28. Chang, P., Fabrizi, L., Fitzgerald, M. Early life pain experience changes adult functional pain connectivity in the rat somatosensory and the medial prefrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 42 (44), 8284-8296 (2022).
  29. vanden Hoogen, N. J., et al. Repeated touch and needle-prick stimulation in the neonatal period increases the baseline mechanical sensitivity and postinjury hypersensitivity of adult spinal sensory neurons. Pain. 159 (6), 1166-1175 (2018).
  30. Butkevich, I. P., Mikhailenko, V. A. Long-term effects of neonatal pain and stress on reactivity of the nociceptive system. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 161 (6), 755-758 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Preterm Rat ModelPain SensitivityNeonatal PainPinprick StimulationMechanical HypersensitivityInflammatory HypersensitivityMaternal BehaviorGlucocorticoid ReceptorsHysterectomy ProcedureFoster Adoption

Powiązane artykuły