Pasywny system do testowania zgięcia grzbietowego stawu skokowego dla modelu in vivo tendinopatii wywołanej przeciążeniem

Ponieważ ścięgna łączą mięśnie z kośćmi i doświadczają codziennych powtarzających się ruchów przez całe swoje życie, są bardzo podatne na urazy związane z nadużywaniem, które są bolesne i ograniczające oraz powodują upośledzenie funkcji mechanicznych, dotykając 30-50% populacji¹. Tendinopatie są przewlekłymi stanami uważanymi za urazy związane z przeciążeniem spowodowane powtarzającymi się ruchami zmęczenia i nieodpowiednim gojeniem do poziomu sprzed urazu. Często dotyczy to zarówno kończyn górnych, jak i dolnych, w tym stożka rotatorów, łokcia, ścięgna Achillesa i ścięgna rzepki^2,3,4,5. Tendinopatia Achillesa jest powszechna w czynnościach związanych z bieganiem i skakaniem, zwłaszcza sportowców uprawiających lekkoatletykę, biegi średnio- i długodystansowe, tenis i inne sporty z piłką, dotykając 7-9% biegaczy^6,7. Urazy spowodowane bieganiem i skakaniem mogą również powodować ograniczone zgięcie grzbietowe kostki, co jest czynnikiem ryzyka tendinopatii ścięgna Achillesa i rzepki^8,9,10. W związku z tym istnieje potrzeba lepszej oceny i charakterystyki tendinopatii, którą to badanie może dostarczyć jako szczurzy model pasywnego zgięcia grzbietowego kostki w przypadku nadmiernych urazów ścięgna Achillesa.

Poprzednia praca z wykorzystaniem małych modeli zwierzęcych miała na celu zbadanie rozwoju i markerów tendinopatii. Należą do nich ćwiczenia na bieżni, powtarzalne sięganie, bezpośrednie obciążanie ścięgien, zastrzyki z kolagenazy, chirurgia i badania in vitro^{11,12,13,14,15,16}. Chociaż literatura skorzystała na identyfikacji markerów uszkodzeń dzięki zastosowaniu tych modeli tendinopatii, ograniczenia obejmują obciążenie ścięgna w niefizjologicznie istotnych ruchach stawów, jak w przypadku bezpośredniego obciążenia ścięgna, brak bezpośredniego pomiaru przyłożonych obciążeń, takich jak w przypadku badań na bieżni, oraz niestosowanie fizjologicznego nadużywania, jak w przypadku zastrzyków kolagenazy, między innymi. W tym celu badanie to miało na celu opracowanie systemu, który nieinwazyjnie przykłada ilościowe obciążenia ścięgna Achillesa z zastosowaniem do badań tendinopatii wywołanych przeciążeniem, aby wypełnić luki we wcześniej opracowanych małych modelach zwierzęcych tendinopatii. Przeprowadziliśmy badanie pilotażowe, aby wykazać, że system wywołuje powtarzalne zmiany właściwości mechanicznych w całym zakresie cykli obciążenia. System ten umożliwia fizjologicznie istotny ruch i obciążenie w celu wywołania przeciążenia, jednocześnie określając ilościowo i mierząc siły przyłożone do ścięgna i doświadczane przez nie podczas schematu obciążenia.

To badanie zostało przeprowadzone za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Beth Israel Deaconess Medical Center. Zwierzęta znieczulono przy użyciu 5% izofluranu do indukcji i 2,5% do konserwacji, przy czym zachowano ostrożność, aby uniknąć hipotermii.

1. Konfiguracja systemu testowego

1. Kontroluj pasywną rotację kostki za pomocą silnika krokowego, aby zapewnić stały obrót i moment obrotowy. Steruj silnikiem krokowym za pomocą mikrokontrolera. Użyj danych wejściowych z systemu pozycji i orientacji 3D, aby oznaczyć stopnie obrotu. Użyj wyjść z czujnika momentu obrotowego, aby zapewnić kontrolę sprzężenia zwrotnego w celu zwiększenia kąta zgięcia grzbietowego, jeśli limit do progu nie zostanie osiągnięty.
2. Aby rozpocząć, podłącz mikrokontroler, czujnik momentu obrotowego, elektromagnetyczny system pozycjonowania i orientacji 3D do komputera i zasilacza. Kontroluj niestandardowy system za pomocą opracowanego przez nas kodu MATLAB (Rysunek 1). Pobierz pliki kodu MATLAB z usługi GitHub i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi uruchamiania kodu z instrukcji strony GitHub (https://github.com/Nazarian-Lab/PassiveAnkleDorsiflexionSystem).
3. Otwórz program MATLAB z plikami kodu. Otwórz oprogramowanie PDImfc, aby połączyć elektromagnetyczny system pozycjonowania i orientacji 3D z programem MATLAB. Kliknij przycisk Połącz | Ciągły rachunek zysków i strat | StartSockExport(). Pozostaw aplikację otwartą w tle.

2. Sekcja zwłok i ex-vivo

1. Eutanazja sześciu 13-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley poprzez wdychanie CO₂ i wtórną metodę eutanazji poprzez torakotomię. Wypreparuj prawe ścięgno Achillesa z nienaruszonym połączeniem piętowym i mięśniowo-ścięgnistym. Zamrozić w temperaturze -20°C, aby przeprowadzić testy mechaniczne w późniejszym czasie. Po rozmrożeniu ścięgna, dokładnym rozcięciu i przygotowaniu go do prób mechanicznych, należy wykonać obciążenie rozciągające do uszkodzenia, aby uzyskać ostateczną wytrzymałość na rozciąganie (UTS) ścięgna (Napięcie wstępne do 0,1 N, Kondycjonowanie wstępne przez 10 cykli od 0,1 - 1 N, Rampa do uszkodzenia przy stałym przemieszczeniu 0,1 mm/s). Użyj 15% UTS jako danych wejściowych dla systemu, aby przeprowadzić kondycjonowanie wstępne do późniejszego kroku, zgodnie z opisem w kroku 3.4.
2. Poddaj eutanazji inną grupę pięciu zwierząt za pomocą tej samej procedury pomiaru momentu ramienia i odkształcenia. Wykonaj zdjęcie rentgenowskie lewej nogi z kostką w zgięciu grzbietowym pod kątem 90° obok linijki jako odniesienia. Otwórz zdjęcie rentgenowskie na Fidżi, używając linijki na obrazie jako odniesienia, zmierz ramię momentu ścięgna od środka obrotu stawu skokowego do tyłu kostki, które zostanie wykorzystane jako dane wejściowe w kodzie MATLAB do konwersji wejściowej do kondycjonowania wstępnego opisanego w kroku 2.1 na odpowiednią wartość momentu obrotowego, a także konwersję między wyjściowym momentem obrotowym a siłą do analizy danych.
3. Unieruchomić lewą kończynę tylną, przyklejając dwie szyny, aby ustawić kolano w pełnym wyprostu. Lekko zegnij kostkę grzbietowo, naciskając na palce, aby upewnić się, że rotacja kostki następuje z powodu izolowanego ścięgna, a nie z powodu otaczających tkanek miękkich i jest napięta. Jeśli nie jest napięty lub jeśli występuje ruch w kolanie, przyklej szynę.
4. Odsłoń ścięgno, usuwając skórę wokół ścięgna Achillesa. Umieść klej na aluminiowym koraliku 1/32 cala, umieść go na wolnym ścięgnie najbliżej połączenia mięśniowo-ścięgnistego ścięgna Achillesa i użyj bawełnianego wacika z solą fizjologiczną, aby usunąć nadmiar kleju. Wielokrotnie nakładaj sól fizjologiczną na ścięgno Achillesa przez cały pozostały zabieg, aby zapewnić wilgotność tkanki.
5. Zmierz pole przekroju poprzecznego ścięgna za pomocą suwmiarki cyfrowej przed przyłożeniem jakiegokolwiek obciążenia. Załóżmy, że ścięgno jest elipsą i zmierz szerokość i grubość w trzech egzemplarzach.
6. Umieść szczura na platformie całego ciała w pozycji leżącej. Przymocuj kostkę do siłownika stawu za pomocą opaski zaciskowej wokół kostki i drugiej wokół palców, a następnie zabezpiecz rozcięcie kolana za pomocą dwóch opasek zaciskowych. Obróć oś tak, aby kostka była w pełnym zgięciu podeszwowym.
7. Podłącz pióro digitalizujące elektromagnetycznego systemu położenia i orientacji 3D do komputera i włącz zasilanie.
8. Uruchom kod systemowy (opisany bardziej szczegółowo w kroku 3) dla określonej liczby cykli (w tym badaniu sześć szczurów poddanych eutanazji otrzymało 7200 cykli).
9. Po 0, 500, 1 000, 2 000, 3 600 i 7 200 cyklach dla pomiarów odkształceń ex vivo, wstrzymaj cykliczny schemat obciążenia i zmierz długość ścięgna od kości piętowej do aluminiowego koralika w krokach co 5° od 0 do 40 ° zgięcia grzbietowego (granica aktywacji spowodowana fizycznymi ograniczeniami systemu) za pomocą pisaka do digitalizacji 3D w trzech egzemplarzach na przemian.
10. Oblicz naprężenie ścięgna pod różnymi kątami, korzystając z długości uzyskanych z kroku 2.9, gdzie początkowa długość wynosi 0° zgięcia grzbietowego dla każdego numeru cyklu. Wykonaj pasowanie liniowe, aby uzyskać zależność między kątem zgięcia grzbietowego a odkształceniem przy każdym numerze cyklu. Ta zależność służy do konwertowania surowych danych kąta na odkształcenie na potrzeby analizy danych.
11. Oblicz pole przekroju poprzecznego ścięgna za pomocą suwmiarki cyfrowej przy zgięciu grzbietowym 40° przy założeniu nieściśliwości (stała objętość) przy pomiarach długości ścięgna pod kątem 0° i 40° oraz zmierzonym polu przekroju poprzecznego pod kątem 0°. Użyj tego pola przekroju poprzecznego przy każdej liczbie cykli, aby przekształcić siłę na naprężenie do analizy danych (naprężenie = siła / pole przekroju).

3. Protokół obciążenia mechanicznego

1. W tej części badania wykorzystaliśmy 25 samic 11-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley, z których każdy miał po 5 losowo przydzielonych do otrzymania 500, 1000, 2000, 3600 lub 7200 cykli obciążenia zmęczeniowego.
   UWAGA: Kondycjonowanie wstępne, wstępna kalibracja oraz pomiar wstępny i końcowy trwają około 15 minut, a schemat cyklicznego obciążenia zmęczeniowego trwa 1 sekundę na cykl. Tak więc najdłuższy czas, w którym szczur znajduje się pod narkozą, wynosi około 2 godzin, co zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC.
2. Podłącz mikrokontroler, czujnik momentu obrotowego, elektromagnetyczny system pozycjonowania i orientacji 3D do komputera i zasilacza. Kontroluj niestandardowy system za pomocą opracowanego przez nas kodu MATLAB (Rysunek 1).
3. Włącz komputer i otwórz program MATLAB z plikami kodu. Otwórz oprogramowanie PDImfc, aby połączyć elektromagnetyczny system pozycjonowania i orientacji 3D z programem MATLAB. Kliknij przycisk Połącz | Ciągły rachunek zysków i strat | StartSockExport(). Pozostaw aplikację otwartą w tle.
4. Wywołać znieczulenie 5% izofluranem poprzez inhalację w komorze indukcyjnej. Po indukcji przymocuj zwierzę do platformy całego ciała za pomocą dołączonego elementu grzejnego na bazie wody, aby utrzymać temperaturę i podtrzymać znieczulenie 2,5% izofluranem za pomocą stożka nosowego. Użyj mokrej maści na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
5. Umieść szczura na platformie całego ciała w pozycji leżącej. Przymocuj kostkę do siłownika stawu za pomocą opaski zaciskowej wokół kostki i drugiej wokół palców, a następnie zabezpiecz rozcięcie kolana za pomocą dwóch opasek zaciskowych. Obróć oś tak, aby kostka była w pełnym zgięciu podeszwowym.
   UWAGA: Upewnij się, że opaski zaciskowe nie powodują zwężenia ani uszkodzeń, zachowaj ostrożność podczas zaciskania i, jeśli to konieczne, umieść gazę między opaską zaciskową a skórą, aby uzyskać warstwę ochronną.
6. Aby wykonać kolejne kroki związane z uruchomieniem kodu systemu, kliknij opcję Uruchom w programie MATLAB dla każdej sekcji kodu odpowiadającej określonemu testowi obciążeniowemu.
7. Wykonaj cykl kostki 50 razy do 15% ostatecznego naprężenia rozciągającego w oparciu o wartość ostatecznego naprężenia rozciągającego ścięgna Achillesa z testów ex vivo rozciągania do uszkodzenia, mierzonych na podstawie kroku 2.1.
8. Wykonaj wstępną kalibrację ścięgna, zginając je grzbietowo trzykrotnie do 12°. Użyj nachylenia obszaru liniowego obszaru obciążenia krzywej histerezy, aby obliczyć obszar wykładniczy krzywej.
9. Stopniowo zginaj kostkę grzbietowo pod coraz większymi kątami, aż do uzyskania wykładniczego obszaru krzywej poprzez obliczenie nachylenia piku obszaru obciążenia krzywej (obliczonego przy użyciu opracowanego przez nas kodu MATLAB) lub do momentu, gdy zostanie obrócona do 40°, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
10. Przy końcowym uzyskanym kącie wykonaj pięć cyklicznych pomiarów mechanicznych jako linię bazową napięcia wstępnego.
11. Wykonaj schemat cyklicznego obciążenia zmęczeniowego przez określoną liczbę cykli (w tym badaniu dla 500, 1,000, 2,000, 3,600 lub 7,200 cykli).
12. Co 50 cykli obliczaj nachylenie części obciążenia krzywej histerezy (obliczonej za pomocą opracowanego przez nas kodu MATLAB), aby upewnić się, że nadal znajduje się w obszarze wykładniczym. Zwiększ kąt zgięcia grzbietowego o 1°, chyba że jest już na 40°, aż do osiągnięcia tego obszaru wykładniczego.
13. Po zakończeniu schematu cyklicznego obciążenia wykonaj pięć cyklicznych pomiarów mechanicznych jako pomiary po obciążeniu pod początkowo wybranym kątem, aby zmierzyć właściwości mechaniczne ścięgien.
14. Zdejmij opaski zaciskowe i szynę. Zwróć zwierzę do komory rekonwalescencyjnej. Zwierzę nie jest pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, po czym wraca do klatki. Należy codziennie monitorować zwierzęta pod kątem jakichkolwiek niepożądanych objawów klinicznych i jeśli takie występują, podawać buprenorfinę w dawce 1,2 mg/kg podskórnie raz na 72 godziny lub przeprowadzić wczesną eutanazję. Poddać eutanazji zwierzęta po 7 dniach przebywania w klatce poprzez wdychanie CO₂ i wtórny sposób eutanazji za pomocą torakotomii.
    UWAGA: Aplikacja do cyklicznego obciążenia i pomiary mechaniczne zostały uzyskane za pomocą niestandardowego przyrządu składającego się z czujnika momentu obrotowego, wydrukowanego w 3D siłownika stawu skokowego i łóżka dla zwierząt, elektromagnetycznego systemu położenia i orientacji 3D oraz silnika krokowego obracającego wałek w celu uzyskania zgięcia grzbietowego, jak wcześniej zgłaszała nasza grupa¹⁷. Ten system jest kontrolowany przez skrypt MATLAB wspomniany w kroku 1.2. Czujnik momentu obrotowego oraz system położenia i orientacji rejestrują dane dotyczące momentu obrotowego i pozycji w całym protokole obciążenia systemu.

4. Analiza danych

1. Załaduj dane przed i po pomiarze oddzielnie do MATLAB.
2. Przelicz moment obrotowy na naprężenie w oparciu o zmierzone ramię momentu z kroku 2.2 i pole przekroju poprzecznego zmierzone przy określonej liczbie przyłożonych obciążeń uzyskanej z kroku 2.11, korzystając z równań (1) i (2):
   (1)
   (2)
3. Przekształć kąt na odkształcenie na podstawie konwersji uzyskanej w kroku 2.10.
4. Obliczyć średnią histerezę (obszar między krzywymi obciążenia i rozładunku), naprężenie szczytowe (maksymalna wartość naprężenia w cyklu) oraz moduły obciążenia i odciążenia (dopasowanie liniowe ostatnich 50% krzywych obciążenia i pierwszych 60% krzywych rozładunku) dla cykli przed i po pomiarze.
5. Obliczyć procentową zmianę właściwości mechanicznych od kroku 4.4 między cyklami przed i po pomiarze.

Wraz ze wzrostem liczby stosowanych cykli, nastąpiła większa redukcja właściwości mechanicznych ścięgien in vivo. Stwierdzono znacznie mniejsze zmniejszenie histerezy oraz modułów obciążenia i rozładowania dla grupy 500 cykli w porównaniu z grupami 3 600 i 7 200 cykli (p < 0,05) (Rysunek 2). Podczas gdy nastąpiła znaczna redukcja stresu szczytowego na cykl z grupy 500 cykli do grupy 3,600 cykli, nie było znaczącej redukcji między grupami 500 i 7,200 cykli. Nastąpił stały procentowy spadek histerezy, naprężeń szczytowych oraz modułów obciążenia i odciążenia dla grup 3,600 i 7,200 cykli. Obrazy próbek ścięgien wybarwione hematoksyną i eozyną oraz trichromem Massona potwierdziły wyższy poziom uszkodzeń mikrostrukturalnych z wyższymi cyklami zgięcia grzbietowego z bardziej zaokrąglonymi komórkami, hiperkomórkowością, rozerwaniem włókien i zaciskaniem włókien (Ryc. 3). Wyniki przedstawione w tym artykule pokazują, że wyższe cykle zgięcia grzbietowego powodują zwiększony poziom uszkodzenia ścięgna Achillesa.

Rysunek 1: Pasywny system testowania zgięcia grzbietowego stawu skokowego. (A) Zasilanie, (B) mikrokontroler, (C) silnik krokowy, (D) czujnik momentu obrotowego, (E) elektromagnetyczny czujnik pozycjonowania i orientacji 3D, (F) wydrukowane w 3D mocowanie kostki, (G) wydrukowane w 3D legowisko dla zwierząt, (H) wydrukowany w 3D uchwyt na stożek nosowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne krzywe obciążenia cyklicznego naprężenie-odkształcenie. Histereza zakrzywia się przy 0, 500, 1,000, 2,000, 3,600 i 7,200 cyklach. Strzałka wskazuje malejące naprężenie szczytowe wraz ze wzrostem liczby cykli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne histologicznie barwione obrazy próbek ścięgien. Hematoksylina i eozyna (po lewej) oraz Trichrom Massona (po prawej) barwione obrazy ścięgien dla 500, 1000, 2000, 3600 i 7200 grup cykli w tym badaniu wykazały, że zwiększenie liczby zastosowanych cykli skutkuje bardziej zaokrąglonymi komórkami, hiperkomórkowością (gwiazdy), rozerwaniem włókien i zaciskaniem włókien (strzałki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.