Ten protokół przedstawia metodę eksplantacji okrągłej błony okiennej z kości skroniowych świnki morskiej, stanowiąc cenne źródło do badań ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Eksplantacja membrany z okrągłym oknem świnki morskiej do badań ex vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skuteczne i minimalnie inwazyjne dostarczanie leków do ucha wewnętrznego jest poważnym wyzwaniem. Błona okienka okrągłego (RWM), będąca jednym z niewielu punktów wejścia do ucha wewnętrznego, stała się istotnym przedmiotem badań. Jednak ze względu na złożoność izolowania RWM, nasza wiedza na temat jego farmakokinetyki pozostaje ograniczona. RWM składa się z trzech odrębnych warstw: nabłonka zewnętrznego, środkowej warstwy tkanki łącznej i wewnętrznej warstwy nabłonka, z których każda może mieć unikalne właściwości dostarczania.
Obecne modele do badania transportu przez RWM wykorzystują modele zwierzęce in vivo lub modele RWM ex vivo, które opierają się na hodowlach komórkowych lub fragmentach błony. Świnki morskie służą jako zwalidowany model przedkliniczny do badania farmakokinetyki leków w uchu wewnętrznym i są ważnym modelem zwierzęcym dla rozwoju translacyjnego nośników do ślimaka. W tym badaniu opisujemy podejście do eksplantacji RWM świnki morskiej z otaczającą kością ślimakową do eksperymentów z podawaniem leków na zewnątrz. Metoda ta pozwala na zachowanie natywnej architektury RWM i może zapewnić bardziej realistyczne odwzorowanie barier transportowych niż obecne modele laboratoryjne.
Wprowadzenie
Pojawiły się nowe klasy terapii w leczeniu odbiorczego ubytku słuchu. Przełożenie tych środków terapeutycznych na populacje kliniczne jest ograniczone przez bezpieczne i skuteczne drogi transportu do ucha wewnętrznego. Obecne metody dostarczania in vivo w badaniach na zwierzętach opierają się albo na fenestracji do ucha wewnętrznego, albo na dyfuzji przez błonę okrągłego okienka (RWM), barierę niekostną, która oddziela przestrzeń ucha środkowego od ślimaka1.
Chirurgiczne fenestracja i mikroiniekcja do ucha wewnętrznego są zarówno inwazyjne, jak i mogą stanowić zagrożenie dla resztkowej funkcji ucha wewnętrznego2. W związku z tym RWM jest ważną drogą lokalnego dostarczania leków, a świnki morskie są podstawowym przedklinicznym modelem zwierzęcym wykorzystywanym do badania lokalnej farmakokinetyki leków w RWM i w uchu wewnętrznym w celu opracowania farmaceutycznego3,4. Chociaż cieńszy niż ludzki RWM, świnka morska RWM ma identyczną trójwarstwową strukturę. Ma około 1 mm średnicy, 15-25 μm grubości i składa się z dwóch warstw komórek nabłonka umieszczonych w warstwie tkanki łącznej5. Warstwa nabłonkowa skierowana w stronę ucha środkowego jest gęsto upakowana i połączona ścisłymi połączeniami, podczas gdy warstwa skierowana w stronę ucha wewnętrznego i błony bębenkowej scala ma luźniejszą architekturę i nie ma znaczących zrostów międzykomórkowych.
Obecne badania przedkliniczne badające przepuszczalność leków u świnki morskiej RWM polegają na iniekcjach in vivo do ucha środkowego, a następnie pobieraniu próbek płynu perylimfatycznego w uchu wewnętrznym, co nie pozwala na konkretne badanie transportu RWM6,7. Fragmenty eksplantatów RWM były wykorzystywane w badaniach przedklinicznych, ale ze względu na ich kruchość i niewielkie rozmiary, nie nadają się do systematycznych, mikroprzepływowych badań transportu leków i pojazdów wymagających wodoszczelnego uszczelnienia w poprzek RWM2. Inne grupy zastosowały modele in vitro z hodowanymi ludzkimi komórkami nabłonkowymi, aby przybliżyć RWM8,9,10. Jednak większość tych konstruktów skupia się wyłącznie na zewnętrznej warstwie nabłonka i nie oddaje złożoności natywnej architektury tkankowej. Aby uzyskać bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów transportu w RWM, wymagane są ukierunkowane badania ex vivo.
W tym badaniu demonstrujemy eksplantację RWM świnki morskiej z otaczającym ją podparciem kostnym w celu zachowania integralności błony i ilustrujemy ich użycie w eksperymentalnym paradygmacie zaprojektowanym dla konkretnego badania transportu RWM pojazdów dostarczających leki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (GP18M226). W niniejszej pracy wykorzystano świnki morskie albinosy Hartley (zarówno samce, jak i samice, o masie 500-700 g).
1. Przygotowanie i przygotowanie procedury
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia tlenkiem etylenu przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Poddaj zwierzęta eutanazji zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem.
UWAGA: W obecnym badaniu zastosowano nienapełnioną komorę do uwolnienia 100% dwutlenku węgla (CO2) z komercyjnej butli. Do regulacji przepływu gazu zastosowano wbudowany ogranicznik, utrzymujący go w zakresie od 30% do 70% objętości komory na minutę zgodnie z wytycznymi AVMA 202011. - Umieść zwierzę w komorze i dozuj dwutlenek węgla przez 5 minut. Przepływ CO2 utrzymuje się przez 1 minutę po zatrzymaniu oddechu.
- Wykonaj dekapitację po zatrzymaniu oddechu, aby zapewnić eutanazję.
2. Podejście chirurgiczne i eksplantacja
- Wyciągnij kość skroniową z czaszki świnki morskiej w zwykły sposób12. Usuń nadmiar tkanki miękkiej za pomocą rongeur. Zidentyfikuj zewnętrzny przewód akustyczny, pęcherz skroniowy i kanał twarzowy13 (Rysunek 1).
- Wywiercić brzuszne aspekty pęcherza skroniowego za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 6 mm (patrz tabela materiałów), odsłaniając obwodowo przestrzeń ucha środkowego i zewnętrzny przewód słuchowy.
- Za pomocą rongeurs delikatnie usunąć zewnętrzny przewód słuchowy i pierścień bębenkowy, jednocześnie oddzielając staw inkudomalleolarny. Zidentyfikuj kowadełko, staw wklęsły, ślimak, poziomy kanał półkolisty i kanał twarzowy13 (Rysunek 2A).
- Oddziel staw inkubpedowy i usuń kowadełko za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj kostną niszę okrągłego okna.
- Użyj wiertła diamentowego o średnicy 6 mm, aby wywiercić blaszkę kostną łączącą ślimak ze ścianą przyśrodkową jamy bębenkowej w kierunku kanału napinacza błony bębenkowej. Ostrożnie zdekompresować kanał kostny napinacza błony bębenkowej i usunąć mięsień napinacza błony bębenkowej za pomocą igły 28 G.
UWAGA: Przyśrodkowa ściana dołu tensora błony bębenkowej łączy się bezpośrednio z kością ślimaka wokół RWM i należy uważać, aby nie spowodować złamań, które mogą rozciągać się do okrągłego okienka. - Wywierć blaszkę kostną łączącą ślimak z dolną ścianą jamy bębenkowej, aż pozostanie 1 mm kostnej półki przylegającej do ślimaka (Ryc. 2B).
- Za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 2 mm (patrz Tabela materiałów) wykonaj ślimakotomię w zwoju podstawowym ślimaka, pozostawiając około 2 mm kości do okrągłego okienka. Kontynuuj cochleostomię niżej w płaszczyźnie równoległej do okrągłej błony okiennej, aby oddzielić podstawę od wierzchołka ślimaka.
- Przedłuż ślimakotomię przeciąć przez podstawę czaszki, która jest znacznie gęstsza, co daje widok przekrojowy podstawnego zwoju ślimaka.
UWAGA: Skierowanie wiertła w stronę przewodu słuchowego wewnętrznego powoduje trajektorię, która maksymalizuje usuwanie kości, unikając jednocześnie przechodzenia zbyt blisko okrągłego okienka. - Zbadaj próbkę od strony podstawy czaszki i, jeśli jeszcze tego nie zrobiono, zidentyfikuj wewnętrzny przewód słuchowy i wywierć do otworu ślimakowego. Usunąć nerw ślimakowy za pomocą igły 28 G.
- Zbadaj próbkę od strony wewnątrzślimakowej. Zidentyfikuj i usuń kostną blaszkę spiralną w zwoju podstawowym oraz pozostały modiolus za pomocą kleszczy lub igły 28 G.
- Obficie przepłukać zunifikowaną jamę przedsionkową scala tympani-scala, aby usunąć zanieczyszczenia. Okrągłe okienko powinno być wyraźnie widoczne z miejsca kokektomii, bez żadnych leżących nad nim odłamków (Rysunek 2C).
- Następnie zbadaj próbkę od strony ucha środkowego. Wywierć boczny kanał półkolisty i kanał twarzowy do poziomu okienka owalnego. Delikatnie usuń strzemiączko za pomocą kleszczy, odsłaniając owalną wnękę okienną. Warto zauważyć, że między skorupą strzemiączka znajduje się kostny mostek znany jako krista strzemiączko.
- Za pomocą wiertła diamentowego o średnicy 1 mm (patrz Tabela materiałów) otwórz przedsionek jeszcze bardziej, przedłużając owalne okienko wzdłuż powierzchni okrągłego okna, uważając, aby 1-2 mm kości ślimakowej przylegało do okrągłej niszy okiennej (Rysunek 2D).
- Uzupełnij nacięcia kości skroniowej, łącząc nacięcia okienka owalnego z nacięciami po kokchlektomii po obu stronach okrągłego okienka.
UWAGA: Ze względu na kruchość kości ślimaka, zachowanie dołu tensora błony bębenkowej w próbce i unikanie jej przecięć pomoże zapobiec złamaniom kości ślimaka, które rozciągają się do RWM i zagrażają jego integralności. - Wykonaj ostatnie mocowania do gęstej kości podstawy czaszki przylegającej do wewnętrznego kanału słuchowego i delikatnie ogol się, aby uzyskać wyciętą próbkę RWM (Ryc. 3A).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak pokazano na Rysunku 3A, metoda ta umożliwia eksplantację nienaruszonej błony okna owalnego świnki morskiej wraz z otaczającym ją pierścieniem twardej kości. Błona okna owalnego powinna być w pełni połączona z kostnym pierścieniem w całym obwodzie. Nie powinno być widocznych żadnych złamań kości ślimaka. W porównaniu z ludzkimi preparatami okna owalnego, błona okna owalnego świnki morskiej nie posiada nakładającej się pseudobłony. Ponadto, w przeciwieństwie do ludzi, między ramionami strz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W miejscowym dostarczaniu leków do ucha, RWM jest główną drogą przejścia, aby leki docierały do ucha wewnętrznego. Potrzebny jest dokładny i niezawodny model laboratoryjny, aby lepiej zrozumieć mechanizmy transportu i przepuszczalność w nowych pojazdach dostawczych oraz opracowywać leki. W tym badaniu wykazaliśmy, że eksplantacja RWM świnki morskiej jest wykonalną i niezawodną procedurą, która pozwala na systematyczne badanie interakcji lek-błona. Lundman i wsp. oraz Kelso i wsp. opisali wcześniej użycie podobnego modelu...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIDCD nr 1K08DC020780 i 5T32DC000027-33 oraz Rubenstein Hearing Research Fund.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wiertło diamentowe kulkowe 1 mm | Anspach | 1SD-G1 | |
| Wiertło diamentowe kulowe 2 mm | Anspach | 2SD-G1 | |
| Wiertło diamentowe kulkowe 6 mm | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Będzie działał każdy system wiercenia do cięcia kości |
| Igła BD Eclipse 27 G x 1/2 cala z odłączaną strzykawką BD Luer-Lok o pojemności 1 ml | Becton, Dickinson i spółka | 382903057894 | Dowolna igła 27-28 G |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Instrumenty precyzyjne | KWIK-CAST |
Bibliografia
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789(2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032(2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
