Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.
Artykuł metodologiczny
Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Regeneracja gruczołów ślinowych to złożony proces obejmujący skomplikowane interakcje między różnymi typami komórek. Ostatnie badania rzuciły światło na kluczową rolę, jaką odgrywają makrofagi w napędzaniu odpowiedzi regeneracyjnej. Jednak nasze zrozumienie tej kluczowej roli opierało się przede wszystkim na widokach statycznych uzyskanych z biopsji tkanek stacjonarnych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie i uzyskać wgląd w te interakcje w czasie rzeczywistym, w badaniu przedstawiono kompleksowy protokół hodowli tkanki gruczołów ślinowych ex vivo i przechwytywania na żywo obrazów migracji komórek.
Protokół obejmuje kilka kluczowych kroków: Najpierw tkanka podżuchwowego gruczołu ślinowego myszy jest starannie krojona za pomocą wibratomu, a następnie hodowana na granicy powietrze-ciecz. Plastry te mogą zostać celowo uszkodzone, na przykład poprzez ekspozycję na promieniowanie, aby wywołać uszkodzenie komórek i wywołać reakcję regeneracyjną. Aby śledzić określone komórki będące przedmiotem zainteresowania, można je znakować endogennie, na przykład wykorzystując tkankę gruczołów ślinowych pobraną od genetycznie zmodyfikowanych myszy, w których określone białko jest oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Alternatywnie, przeciwciała sprzężone fluorescencyjnie mogą być stosowane do barwienia komórek wyrażających określone markery powierzchni komórek będące przedmiotem zainteresowania. Po przygotowaniu wycinki gruczołów ślinowych są poddawane obrazowaniu na żywo przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego o wysokiej zawartości przez 12 godzin, z obrazami rejestrowanymi w odstępach 15-minutowych. Powstałe obrazy są następnie kompilowane w celu utworzenia filmu, który można następnie przeanalizować w celu wyodrębnienia cennych parametrów zachowania komórki. Ta innowacyjna metoda zapewnia naukowcom potężne narzędzie do badania i lepszego zrozumienia interakcji makrofagów w gruczole ślinowym po urazie, pogłębiając w ten sposób naszą wiedzę na temat procesów regeneracyjnych zachodzących w tym dynamicznym kontekście biologicznym.
Wprowadzenie
Wykazano, że makrofagi odgrywają coraz ważniejszą rolę w procesach regeneracji i naprawy, wykraczając poza ich klasyczną funkcję immunologiczną1,2. Rzeczywiście, makrofagi biorą udział w wielu procesach związanych z regeneracją, wykazując krytyczną aktywność regulacyjną na wszystkich etapach naprawy, a także powstawania blizn i zwłóknienia3,4. Makrofagi rezydujące w tkankach są wysoce heterogenicznymi typami komórek o złożonych mechanizmach napędzających różne fenotypy komórkowe i odgrywają istotną rolę w rozwoju, funkcji i homeostazie narządów (jak sprawdzono w5). Makrofagi rezydujące w tkankach początkowo powstają z prekursorów w woreczku żółtkowym i wątrobie płodu, a następnie są zastępowane przez proliferację lub monocyty krwi pochodzące ze szpiku kostnego w różnym tempie, w zależności od długowieczności istniejących makrofagów i tkanki lub niszy, w której się znajdują6,7.
Co ważne, makrofagi rezydujące w tkankach są rozproszone we wszystkich tkankach i przyczyniają się do różnych funkcji narządów. Są one unikalnie zaprogramowane przez swoje mikrośrodowisko do wykonywania funkcji specyficznych dla niszy. Z tego powodu lokalizacja makrofagów w tkance daje wgląd w ich funkcję, z unikalnymi populacjami obserwowanymi w płucach, gruczole sutkowym, jelicie, skórze i mięśniach8,9,10. Podczas rozwoju gruczołu sutkowego makrofagi przewodowe są ściśle związane z drzewem przewodowym, a ich zubożenie powoduje znaczne zmniejszenie rozgałęzień11. Ponadto makrofagi są niezbędne do morfogenezy w okresie dojrzewania i alveologenezy w ciąży, gdzie aktywnie monitorują nabłonek. W przypadku uszkodzenia mięśni określona populacja makrofagów "mieszka" w miejscu urazu, zapewniając przejściową niszę, w której dostarczają one indukowanych proliferacją wskazówek wymaganych do proliferacji komórek macierzystych. W ten sposób wykazują wyspecjalizowaną rolę odrębnych populacji makrofagów w zarządzaniu procesem naprawy2. W płucach podobne zjawisko zachodzi, gdy makrofagi śródmiąższowe przygotowują komórki pęcherzykowe typu II (AT2) z ekspresją interleukiny (IL)-R1 do przekształcenia w przejściowe progenitory związane z uszkodzeniem poprzez uwolnienie IL-1B12. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że makrofagi są niezbędne do regeneracji ślinianki podżuchwowej myszy (SMG) po urazie popromiennym, a przy ich braku regeneracja nabłonka jest zakłócona13. Podsumowując, dane te podkreślają znaczenie aktywacji i funkcji makrofagów w przejściowych niszach zapalnych po uszkodzeniu tkanek, a także podczas homeostazy.
Makrofagi są aktywnymi komórkami, a ich funkcje obejmują interakcje z różnymi typami komórek, w tym bezpośredni kontakt komórka-komórka14,15, a także bardziej pośrednie metody, takie jak wydzielanie czynników rozpuszczalnych2,16, które mają zasadnicze znaczenie dla regulacji nisz owych. Podczas gdy klasyczne obrazowanie immunofluorescencyjne jest przydatne do rozpoczęcia odkrywania tych interakcji, jest ono ograniczone przez przedstawienie tylko jednej migawki w czasie, pomijając w ten sposób wiele punktów czasowych krytycznych dla wysoce dynamicznego procesu regeneracyjnego17,18. W związku z tym, że coraz wyraźniej zwraca się uwagę na czas i pojawianie się różnych fal regeneracji, konieczne jest bardziej szczegółowe przeanalizowanie tych procesów.
Radioterapia jest leczeniem ratującym życie wielu osobom, u których zdiagnozowano raka. Chociaż radioterapia jest często skuteczna w zmniejszaniu lub eliminowaniu guza (guzów), może również uszkodzić zdrowe tkanki leżące w polu promieniowania i wywołać odpowiedź immunologiczną. Uszkodzenie popromienne może wywołać szybką rekrutację makrofagów oraz bezpośrednie i pośrednie odpowiedzi immunomodulacyjne19,20. Gruczoły ślinowe są często przypadkowo napromieniane podczas leczenia raka głowy i szyi21,22, co prowadzi do uszkodzenia nabłonka, atrofii komórek i zwłóknienia23,24, co skutkuje kserostomią lub przewlekłą suchością w ustach25.
Gruczoł ślinowy składa się z mnóstwa typów komórek i struktur, w tym, ale nie ograniczając się do komórek nabłonkowych (zarówno komórek groniastych produkujących ślinę, jak i komórek przewodowych transportujących ślinę), komórek mioepitelialnych, komórek progenitorowych nabłonka, nerwów, naczyń krwionośnych, komórek odpornościowych, fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Rola i odpowiedź wielu z tych typów komórek w odpowiedzi regeneracyjnej została wcześniej opisana26,27,28,29,30. Jednak to, w jaki sposób te różne komórki oddziałują na siebie podczas homeostazy i regeneracji, a zwłaszcza jak zachowują się komórki odpornościowe, takie jak makrofagi, jest mniej dobrze zbadane. Manuskrypt ten opisuje nowo opracowaną metodę badania żywych interakcji między makrofagami SMG a innymi komórkami będącymi przedmiotem zainteresowania w tkance ex vivo. Pistolet maszynowy jest cięty na wibratomie, barwiony na markery powierzchniowe i obrazowany przez maksymalnie 12 godzin. Za pomocą tej metody można zaobserwować fagocytozę otaczających komórek przez makrofagi, badać kinetykę migracji makrofagów oraz wykazywać bezpośrednie interakcje komórka-komórka między makrofagami a komórkami nabłonkowymi.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych i przeprowadzone na podstawie PB5FC9BD2 i PP0330540 PPL. Wszystkie eksperymenty są zgodne z wytycznymi ARRIVE i wytycznymi Uniwersytetu w Edynburgu.
Myszy typu dzikiego zostały pozyskane komercyjnie (zobacz Tabelę Materiałów). Krt14CreER; Myszy R26mTmG zostały wyhodowane w domu, krzyżując myszy Krt14CreER/+ 31 z myszami R26mTmG/ mTmG32. We wszystkich eksperymentach wykorzystano samice myszy w wieku 8-10 tygodni
.1. Zbieranie i osadzanie SMG
- Poddaj myszy/myszy eutanazji, wystawiając je na rosnące stężenie dwutlenku węgla (CO2 ). Następnie spryskaj obszar nacięcia 70% etanolem (EtOH) i użyj nożyczek i kleszczy, aby ostrożnie wypreparować SMG (s) z otaczającej tkanki (Rysunek 1A). Usuń tłuszcz i tkankę łączną za pomocą kleszczy i umieść gruczoł w probówce zbiorczej zawierającej lodowaty roztwór soli Hanksa (HBSS, patrz tabela materiałów).
- Podziel gruczoł na kawałki o długości około 1cm2 każdy za pomocą kleszczy.
- Podgrzej 4% agarozy do temperatury 50 °C, a następnie przelej ją bezpośrednio do naczynia o średnicy 35 mm.
- Wlej niewielką ilość roztopionej agarozy o temperaturze 50 °C do osobnego naczynia i dokładnie wypłucz gruczoł, przesuwając go w nadmiarze agarozy.
UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby usunąć nadmiar płynu z gruczołów. Nadmiar płynów może uniemożliwić prawidłowe przyleganie gruczołów do agarozy. - Umieść 4-6 kawałków gruczołu w agarozie, upewniając się, że leżą płasko i znajdują się w tej samej płaszczyźnie (Rysunek 1A).
UWAGA: Upewnij się, że gruczoły nie dotykają powierzchni agaru ani dna płytki. - Przykryj pokrywką naczynie o średnicy 35 mm i przenieś je do zamrażalnika, przykrywając talerz lodem.
- Odczekaj 5-10 minut, aż agaroza stężeje.
2. Podział na sekcje
- Za pomocą skalpela ostrożnie przeciąć blok agarozy osadzony w gruczole, usuwając blok zawierający tkankę z naczynia. Pozostaw obramowanie o grubości około 5 mm.
- Przymocuj blok agarozy do stolika wibratomu (patrz Tabela materiałów), nakładając kroplę kleju superglue, upewniając się, że cała dolna powierzchnia bloku styka się z klejem superglue.
- Pozostaw superglue do stwardnienia na około 5 minut. Następnie napełnij komorę wibratomu lodowatą solą fizjologiczną 1x buforowaną fosforanem (PBS) zawierającą 1% penicyliny-streptomycyny (P / S).
- Dodaj lód zarówno z boku, jak i na dno komory wibratomowej.
UWAGA: Utrzymuj bardzo zimne środowisko i w razie potrzeby wymień lód. - Odetnij nadmiar agarozy i utwórz 5 mm odstępy między każdym kawałkiem gruczołu, wykonując nacięcia skalpelem. W ten sposób uzyskasz pojedyncze plasterki.
- Dopasuj ostrze wibratomu do powierzchni bloku agarozy i ustaw punkt początkowy i końcowy sekcji, aby uzyskać żądaną grubość plastru.
- Przed rozpoczęciem procesu cięcia upewnij się, że ostrze nie styka się z blokiem. Ten środek ostrożności zapobiegnie przypadkowemu przecięciu dużych kawałków agarozy i utracie części próbki.
- Wycinaj sekcje o grubości 150 μm z niską prędkością i wysokimi wibracjami (np. prędkość 3 i ustawienie drgań 8-10 w skali 1-10 dla każdego parametru) (Rysunek 1A).
- Po pocięciu sekcji i wypuszczeniu jej do otaczającego PBS, zbierz je za pomocą pędzla i umieść je w naczyniu zawierającym wstępnie podgrzane podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z P/S.
3. Hodowla i barwienie plastrów SMG
- Hodowla
- Dodaj 1,5 ml pożywki RPMI do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, która zawiera filtr 0,4 μm. Upewnij się, że pod filtrem nie ma pęcherzyków powietrza uwięzionych.
- Przenieś 1-6 plasterków na każdy filtr za pomocą pędzla, uważając, aby nie połamać plasterków.
UWAGA: Upewnij się, że plasterki nie są zanurzone w nośniku, ale zamiast tego unoszą się na filtrze. Jeśli są całkowicie zanurzone, mogą się udusić podczas hodowli. - Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniać pożywkę co 3 dni (Rysunek 1A).
- Napromieniować płytki doświadczalne pojedynczą dawką promieniowania gamma 10 Gy za pomocą dostępnego w handlu napromieniacza (patrz Tabela Materiałów). Następnie włóż je z powrotem do inkubatora.
- Barwienie do obrazowania na żywo
- Za pomocą pędzla delikatnie wyjmij plastry z filtra i umieść je na 24-dołkowej płytce zawierającej 500 μl pożywki hodowlanej na dołek, gdzie plastry zostaną zanurzone.
- Dodać odpowiednie sprzężone przeciwciała i barwienie jądrowe (patrz tabela materiałów) do pożywki w odpowiednich stężeniach27.
- Inkubować plastry z przeciwciałami przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając.
- Umyj plastry, zanurzając je w pożywce hodowlanej i myjąc przez 3 rundy po 10 minut prania w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem.
4. Montaż i obrazowanie na żywo
- Za pomocą kleszczyków usuń taśmę z jednej strony dwustronnej przekładki do obrazowania i przyklej ją samoprzylepną stroną do dołu do dna 6-dołkowej płytki ze szklanym dnem.
- Odpipetować 50 μl pożywki do szczeliny w środku przekładki.
- Umieść plasterek w podłożu za pomocą pędzla, upewniając się, że leży płasko bez uwięzionych pęcherzyków powietrza.
- Za pomocą pipety ostrożnie usuń 20 μl pożywki ze szczeliny.
- Usuń taśmę z górnej strony przekładki za pomocą kleszczy i umieść na niej okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm. Naciśnij krawędź przekładki, aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest mocno przymocowane, uważając, aby nie złamać szkiełka nakrywkowego przez przyłożenie zbyt dużej siły (Rysunek 1A).
- Zobrazuj wycinek pod mikroskopem konfokalnym dla żądanego okresu lub interwałów czasowych (np. co 15 minut przez 12 godzin za pomocą obiektywu wodnego 20x).
Wyniki
Reakcja makrofagów na uszkodzenie w obrębie ślinianki podżuchwowej pozostaje nieznana. Dotyczy to kwestii ich lokalizacji i migracji do konkretnych struktur wewnątrz gruczołu, a także dystansu i prędkości, z jaką migrują. Trudno było to określić za pomocą statycznych metod obrazowania.
Aby rozwiązać ten problem, opracowano metodę obrazowania na żywo w celu badania interakcji między makrofagami a komórkami nabłonkowymi w czasie rzeczywistym. Barwienie immunofluorescencyjne przekrojów połączono z endogennie znakowanym mysim modelem śledzenia linii komórkowych (Rysunek 1A oraz Rysunek 2A). W tym modelu przekroje poddano działaniu 10 Gy promieniowania gamma w celu wywołania uszkodzeń popromiennych, a następnie obrazowano je po 2 h, 3 dniach i 4 dniach od napromieniowania (IR), przy czym przekroje nienapromieniowane służyły jako kontrola. Dane pozyskiwano z czterech kanałów: Hoechst (przy użyciu lasera 425 w celu zminimalizowania fototoksyczności), GFP (488), dTomato (561) oraz Alexa 647 (640). Wykonano stos obrazów z (z-stack), przechwytując obraz co 2-3 µm i zbierając łącznie od 30 do 40 płaszczyzn, co dało całkowitą wysokość 80-90 µm.
Wykorzystując tę technikę i analizując sygnał białka Tomato (mT) związanego z błoną oraz aktywność kaspazy 3/7, wykazano, że skrawki organotypowe zachowały strukturę nabłonkową, przetrwały w kulturze i wykazywały minimalną śmierć komórek. Dane wykazały, że nienaświetlone skrawki gruczołu podżuchwowego z R26mTmG myszy32, hodowane przez 7 dni, zachowały sygnał mT oraz architekturę nabłonkową (Rysunek 1B). Jednakże w 3. dniu po ex vivo naświetlanie, widoczny był zanik komórek acynarnych i przewodowych (Rycina 1B; struktury acinarne i przewodowe zaznaczone odpowiednio przerywanymi liniami białymi i zielonymi), co jest zgodne z in vivo uszkodzenie radiacyjne13Apoptoza w nienaświetlonych skrawkach była pomijalna, jednak stwierdzono obecność kaspazy 3/7+ komórki w napromieniowanych skrawkach 4 dni po napromieniowaniu (Rycina 1C; zielone strzałki), podobnie jak in vivo uraz33,34Co więcej, napromieniowane skrawki odtworzyły in vivo Uszkodzenia DNA34,35,36,37, o czym świadczy podwyższony poziom γH2AX38 w porównaniu z nienaświetlanymi kontrolami (Rysunek 1D,E). W związku z tym organotypowe skrawki ślinianek wykazały dobrą żywotność w kulturze i reagowały w sposób podobny do in vivo tkanka do naświetlania.
Następnie zbadano interakcje międzykomórkowe w czasie rzeczywistym. Makrofagi bezpośrednio oddziałujące z komórkami progenitorowymi nabłonka znakowanymi GFP (Krt14CreER-GFP) obserwowano przez 12 h w 3. dobie po napromieniowaniu (IR) (Rysunek 2A oraz Wideo 1). Co zdumiewające, ewidentne było, że makrofagi pozostawały w bliskim sąsiedztwie komórek progenitorowych nabłonka przez wiele godzin, często utrzymując kontakt przez cały 12-godzinny okres obrazowania. Ponadto zaobserwowano fagocytozę komórek nabłonka przez makrofagi w czasie rzeczywistym, co potwierdza, że makrofagi pełnią swoją tradycyjną funkcję w modelu hodowli plastrów tkankowych (Rysunek 2B, Wideo 2 i Wideo 3). Technika ta pozwoliła również stwierdzić, że makrofagi są stosunkowo stacjonarne zarówno podczas homeostazy, jak i po urazie popromiennym, co prawdopodobnie wynika z ich wysokiej gęstości w obrębie tkanki. Dowodzi to po raz pierwszy, że makrofagi ślinianek nie migrują w znacznym stopniu podczas homeostazy ani po urazie popromiennym. Jednak podczas gdy makrofagi nie wykazywały istotnej migracji, w otaczającej tkance odnotowano zwiększoną dynamikę po napromieniowaniu, przy czym wiele makrofagów aktywnie oddziaływało wokół skupisk znakowanych komórek nabłonka. Dodatkowo, opierając się wyłącznie na barwieniu jąder, technika ta pozwoliła zwizualizować ruch komórek wewnątrz plastra w czasie, przy czym często całe przewody zdawały się „migrować” w tkance (Wideo 4). W czasie trwania procesu hodowli stało się oczywiste, że plastry zmieniały morfologię z płaskiej na sferoidalną, co sugeruje, że ruch komórek wewnątrz plastra wynika prawdopodobnie z ich reorganizacji w strukturę przypominającą sferę, co przypomina potencjalny proces przebudowy.
Wreszcie dane z obrazowania na żywo, uzyskane w tym teście, mogą być wykorzystane do ilościowego pomiaru zachowania komórek, takiego jak migracja. Pojedyncze komórki można wykryć i wysegmentować (Rysunek 3A), a migrację można zmierzyć przy użyciu dostępnego komercyjnie oprogramowania do obrazowania i analizy (patrz Tabela materiałów i Wideo 5). Ponadto można przeprowadzić analizę najbliższego obiektu (nearest object analysis), aby ustalić, czy komórki, w tym przypadku makrofagi, migrują bliżej innych wybranych komórek, w tym przypadku Krt14CreER-GFP+ komórkach oraz w jaki sposób ta dynamika zmienia się w czasie (Rycina 3B).
Rysunek 1: Rekapitulacja odpowiedzi in vivo w precyzyjnie ciętych plastrach tkanki gruczołów ślinowych. (A) Schemat protokołu eksperymentalnego. (B) Reprezentatywne obrazy białka Tomato związanego z błoną, uzyskane z tkanki świeżego gruczołu podżuchwowego (SMG), niepoddanych manipulacji plastrów SMG hodowanych przez 7 dni lub plastrów SMG naświetlonych pojedynczą dawką 10 Gy promieniowania gamma 3 lub 7 dni wcześniej. Białe przerywane linie wskazują przykładowe struktury cewkowe, a zielone przerywane linie wskazują przykładowe struktury przewodowe. Pasek skali = 50 µm. (C) Reprezentatywne obrazy ekspresji kaspazy-3/7 uzyskane z niepoddanych manipulacji plastrów SMG lub plastrów SMG naświetlonych pojedynczą dawką 10 Gy promieniowania gamma 2 h lub 4 dni wcześniej. Zielone groty strzałek wskazują dodatnie jądra. Pasek skali = 50 µm. (D) Reprezentatywne obrazy ekspresji γH2AX uzyskane z niepoddanych manipulacji plastrów SMG lub plastrów SMG naświetlonych pojedynczą dawką 10 Gy promieniowania gamma 3 dni wcześniej. Pasek skali = 20 µm. (E) Reprezentatywna ekspresja γH2AX w komórkach nabłonkowych EpCAM+ z niepoddanych manipulacji plastrów SMG lub plastrów SMG naświetlonych pojedynczą dawką 10 Gy promieniowania gamma 2 h i 3 dni wcześniej. SSA = side scatter area. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Obrazowanie na żywo interakcji makrofagów z komórkami nabłonkowymi oraz fagocytozy. (A) Sekwencja nieruchomych obrazów interakcji między komórkami progenitorowymi KRT14+ a ich potomstwem (komórki Krt14CreER-GFP+ ) i makrofagami po napromieniowaniu. Obrazowanie żywych komórek rejestruje dynamikę komórkową w okresie 90 min. Pasek skali = 20 µm. Powiązane wideo to Wideo 1. (B) Sekwencja nieruchomych obrazów makrofaga fagocytującego komórkę nabłonkową. Obrazowanie żywych komórek pokazuje ten proces w okresie 60 min. Białe strzałki wskazują makrofaga, a żółte strzałki wskazują jądro komórki poddawanej fagocytozie. Pasek skali = 50 µm. Powiązane wideo to Wideo 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Obrazowanie na żywo w analizie dynamiki komórkowej. (A) Obraz ilustrujący identyfikację i segmentację pojedynczych komórek w celu analizy parametrów zachowania komórek, takich jak migracja (patrz Wideo 5). Komórki zostały randomly zabarwione w pseudokolorach w celu rozróżnienia poszczególnych komórek i ich torów ruchu. Pasek skali = 100 µm. (B) Ilościowe określenie odległości (w µm) najbliższego obiektu od pojedynczych komórek Krt14CreER-GFP+ przedstawione w 10 punktach czasowych (obrazy rejestrowane co 5 min). Dane przedstawiono jako wartość średnią na studzienkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wideo 1: Obrazowanie na żywo ujawniające dynamiczne interakcje między progenitorami/potomkami KRT14+ a makrofagami po napromieniowaniu. Przetoki zostały poddane pojedynczej dawce promieniowania gamma 10 Gy przed obrazowaniem na żywo. Komórki Krt14CreER-GFP+ są przedstawione na zielono, makrofagi (F4/80+) na czerwono, a jądra komórkowe na cyjanowo. Wideo składa się z pojedynczego stosu z-stack, obejmującego 12 h okresu hodowli z obrazami rejestrowanymi co 15 min. Kliknij tutaj, aby pobrać wideo.
Wideo 2: Obrazowanie na żywo przedstawiające makrofag pochłaniający komórkę nabłonkową. Makrofagi (F4/80+) są przedstawione na czerwono, a jądra komórkowe na cyjanowo. Wideo składa się z pojedynczego stosu z-stack i obejmuje 12 h okresu hodowli, przy obrazowaniu co 15 min.Kliknij tutaj, aby pobrać wideo.
Wideo 3: Obrazowanie na żywo z maksymalną projekcją przedstawiające makrofag pochłaniający komórkę nabłonkową. Makrofagi (F4/80+) są wyświetlone na czerwono, a jądra komórkowe na cyjanowo. Wideo przedstawia maksymalną projekcję serii obrazów z osi z o łącznej grubości 80 µm (pojedyncza płaszczyzna jest pokazana w Wideo 2) i obejmuje 12 h okresu hodowli, przy obrazowaniu co 15 min.Kliknij tutaj, aby pobrać wideo.
Wideo 4: Obrazowanie na żywo ilustrujące dynamiczne zachowanie nabłonka ślinianek w hodowli po napromieniowaniu. Przekroje poddano pojedynczej dawce promieniowania gamma 10 Gy przed obrazowaniem na żywo. Makrofagi (F4/80+) przedstawiono na czerwono, jądra komórkowe na cyjanowo. Wideo składa się z pojedynczego stosu z (z-stack), obejmującego 12 h okresu hodowli, z obrazami rejestrowanymi co 15 min.Kliknij tutaj, aby pobrać wideo.
Wideo 5: Ilościowe śledzenie migracji komórek w czasie. W tym filmie zaprezentowano indywidualne śledzenie torów ruchu komórek na podstawie filmów z obrazowania na żywo. Strzałki wskazują tory ruchu komórek, a poszczególne komórki zostały zabarwione kolorami pseudobarwnymi. Materiał wideo składa się z pojedynczego stosu z-stack i obejmuje 1 h okresu hodowli z obrazami rejestrowanymi co 15 min.Kliknij tutaj, aby pobrać wideo.
Dyskusja
Możliwość hodowli tkanki gruczołów ślinowych ex vivo stanowi doskonałą okazję do badania interakcji komórka-komórka w kontekście zarówno homeostazy, jak i odpowiedzi na uszkodzenie. Chociaż obrazowanie przyżyciowe mysiego gruczołu podżuchwowego jest wykonalne39,40, technika ta polega na użyciu fluorescencyjnych modeli myszy reporterowych do endogennego znakowania komórek będących przedmiotem zainteresowania i musi być wykonywana w znieczuleniu końcowym. W tym miejscu opisano metodę hodowli wycinków gruczołów podżuchwowych ex vivo, z zachowaniem architektury komórkowej i interakcji komórka-komórka. Podejście to udoskonala obecne techniki obrazowania na żywo i stanowi alternatywę dla obrazowania przyżyciowego.
Długotrwałe utrzymanie tkanki przy użyciu tej techniki opiera się na hodowli plastrów na granicy faz powietrze-ciecz. Poprzednie modele eksplantatów 26,41 prawdopodobnie osiągnęły udany posiew tylko przez kilka dni, ponieważ były zanurzone w pożywce i zasadniczo "uduszone". W przeciwieństwie do tego, zastosowanie systemu hodowli na granicy faz powietrze-ciecz utrzymuje zdrowie i strukturę tkanek przez dłuższy czas, zapewniając wysoką jakość obrazowania. Metoda montażu plastrów SMG przed obrazowaniem, z niewielką ilością podłoża i w komorze o ograniczonej przestrzeni, aby utrzymać plasterek płasko, jest integralną częścią sukcesu tej techniki. Wizualizacja komórek w tym teście zależy od endogennie znakowanych myszy reporterowych lub przeciwciał sprzężonych fluorescencyjnie. Obfitość transgenicznych fluorescencyjnych modeli myszy reporterowych i sprzężonych przeciwciał ukierunkowanych na określone typy i podzbiory komórek sprawia, że metoda ta nadaje się do badania różnych interakcji specyficznych dla komórek.
Chociaż metoda ta zapewnia dobry model uszkodzenia tkanek in situ i napromieniania ex vivo, które powoduje zanik struktury zrazikowej i przewodowej, podobnie jak ma to miejsce in vivo13, niektórych elementów nie można podsumować ex vivo. Należą do nich brak funkcjonującego układu krwionośnego i bodźców neuronalnych, a także brak naciekających komórek zapalnych. Biorąc pod uwagę dobrze udokumentowaną rolę naczyń krwionośnych i nerwów w homeostazie i regeneracji gruczołów ślinowych26,42 oraz znaczenie migrujących komórek odpornościowych43, takich jak limfocyty T i B, w funkcjonowaniu gruczołów ślinowych, odpowiedzi na urazy, infekcji i patogenezie zespołu Sjögrena (SS) (jak omówiono w44), test ten może pomijać niektóre ważne interakcje komórkowe. Dodatkowo, bardzo szybkie zdarzenia migracyjne, takie jak ruch komórki45 NK (Natural Killer) i komórki dendrytycznej (DC)46, mogą zostać pominięte przez obrazowanie co 15 minut. Jednak interwały obrazowania można zoptymalizować w celu zbadania konkretnych interakcji komórka-komórka, a możliwość obrazowania w 3 wymiarach za pomocą z-stacków pozwala na ocenę ruchu komórek 3D. Bezpieczne mocowanie tkanki podczas obrazowania ma kluczowe znaczenie dla kwantyfikacji, takiej jak pomiary śledzenia komórek. Ponadto, chociaż w badaniu tym wykorzystano tkankę myszą, protokół zapewnia realną metodę badania interakcji komórka-komórka w ludzkich gruczołach ślinowych, generując cenne informacje translacyjne nieosiągalne innymi metodami.
Podczas gdy rola makrofagów rezydujących w tkankach w homeostazie i regeneracji została wykazana w kilku tkankach 2,10,11,12, ich rola w gruczołach ślinowych pozostaje w dużej mierze bez odpowiedzi. Chociaż wiadomo, że makrofagi są niezbędne do regeneracji nabłonka po urazie napromiennym13, dokładne mechanizmy leżące u podstaw tego efektu pozostają nieznane. Obrazowanie na żywo wycinków gruczołów ślinowych umożliwia wizualizację i analizę złożonej dynamiki tkanek w czasie rzeczywistym, które często są pomijane w tradycyjnym obrazowaniu konfokalnym. Ponadto oczywiste jest, że makrofagi ulegają dynamicznym zmianom kształtu podczas wykonywania różnych funkcji in vivo 47,48,49, a ten protokół prawdopodobnie zapewnia lepszą reprezentację tych zmian niż typowy widok statyczny w tkance utrwalonej. Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do zbadania, jak zmienia się komunikacja komórka-komórka w przebiegu homeostazy, uszkodzenia i regeneracji/ustąpienia. Takie podejście będzie przydatne do wyjaśnienia kluczowych szlaków sygnałowych i zdarzeń, które ostatecznie mogą przynieść korzyści terapeutyczne.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
SE jest finansowany z grantu Wellcome Trust 108906/Z/15/Z; EE jest finansowany z grantu UKRI/MRC MR/S005544/1 oraz ze stypendium kanclerza Uniwersytetu w Edynburgu. Rysunek 1A jest tworzony za pomocą BioRender.com.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,4 &mikro; m Wkłady do hodowli komórek filtracyjnych (Nunc) | Avantor/VWR | 734-2240 | Wkłady pakowane w 6-dołkowe naczynia wielofunkcyjne, 20 mm i razy 25 mm |
| Płytka 24-dołkowa | Corning | 3524 | |
| 35 mm | Falcon | 353001 | |
| 6-dołkowa | Corning | 3516 | |
| Szkiełka nakrywkowe | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111650 | Deckglaser Okulary nakrywkowe 25 mm średnica |
| Dwustronna | naklejka Grace Bio-Labs | 654004 | SecureSeal Imaging Spacers SS1 x 13, średnica 13 mm x głębokość 0,12 mm, średnica zewnętrzna 25 mm x 25 mm |
| EtOH | Scientific Laboratories dostarcza | CHE1924 | Etanol absolutny (EtOH) AR, przeciwciało 99,7% |
| F4/80 | Invitrogen | 17-4801-82 | F4/80 Przeciwciało monoklonalne (BM8), APC, kleszcze eBioscience |
| Narzędzia do nauki o wysokiej | 91113-10 | Kleszcze studenckie Proste szerokie trzpienie | |
| Szklane dno 6-dołkowa płytka | Cellvis | P06-1.5H-N | 6-dołkowa szklana płyta dolna o wysokiej wydajności #1,5 szkła nakrywkowego Hanks |
| Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Life Technologies | 14025050 | + wapń + magnez, bez czerwieni fenolowej |
| Hoechst | Sigma Aldrich | 14533 | Alternatywna nazwa: bisBenzimide H 33342 trichlorowodorek |
| Pojemnik na lód | Fisher Scientific | 11339623 | Poliuretanowe wiaderka na lód Azlon z pokrywą |
| Oprogramowanie do obrazowania i analizy | Harmony | ||
| Niskotopliwa agaroza | Merck | A9414-25G | |
| Pędzel | akwarelowy, końcówka 10 mm x 2 mm | ||
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma Aldrich | P4333 | 10 000 jednostek penicylina i 10 mg streptomycyny/ml, 0,1 μ m |
| filtrowany sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Life Technologies | 20012027 | |
| RPMI | ThermoFisher | 12634010 | Gibco DMEM/F-12 |
| Swann-Morton | Skalpele jednorazowe, nożyczki z ostrzem nr 11 | ||
| Fine Science Tools | 14088-10 | Bardzo wąskie nożyczki 10,5 cm | |
| Shepherd Mark-I-68A 137Cs napromieniacz | JL Shepherd & Associates | ||
| Superglue | Bostik | Wielofunkcyjny superglue, szybkowiążący, bardzo mocny | |
| Vibratome | Leica | Leica VT 1000 S | |
| Ostrza wibratowe | Ostrze Astra | Superior Platinum Double Edge | |
| Myszy typu dzikiego (C57BL/BJ) | River |
Bibliografia
- Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
- Ratnayake, D., et al. Macrophages provide a transient muscle stem cell niche via NAMPT secretion. Nature. 591 (7849), 281-287 (2021).
- Lucas, T., et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J Immunol. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Duffield, J. S., et al. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J Clin Invest. 115 (1), 56-65 (2005).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Mass, E., Nimmerjahn, F., Kierdorf, K., Schlitzer, A. Tissue-specific macrophages: how they develop and choreograph tissue biology. Nat Rev Immunol. 23 (9), 563-579 (2023).
- Dick, S. A., et al. Three tissue resident macrophage subsets coexist across organs with conserved origins and life cycles. Sci Immunol. 7 (67), (2022).
- Hassel, C., Gausserès, B., Guzylack-Piriou, L., Foucras, G. Ductal macrophages predominate in the immune landscape of the lactating mammary gland. Front Immunol. 12, 754661(2021).
- Kolter, J., et al. A subset of skin macrophages contributes to the surveillance and regeneration of local nerves. Immunity. 50 (6), 1482-1497 (2019).
- Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nat Cell Biol. 22 (5), 546-558 (2020).
- Choi, J., et al. Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration. Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).
- McKendrick, J. G., et al. CSF1R-dependent macrophages in the salivary gland are essential for epithelial regeneration after radiation-induced injury. Sci Immunol. 8 (89), doi:10.1126/sciimmunol.add4374 eadd4374(2023).
- Muntjewerff, E. M., Meesters, L. D., vanden Bogaart, G. Antigen cross-presentation by macrophages. Front Immunol. 11, 1276(2020).
- Bissonnette, E. Y., Lauzon-Joset, J. F., Debley, J. S., Ziegler, S. F. Cross-talk between alveolar macrophages and lung epithelial cells is essential to maintain lung homeostasis. Front Immunol. 11, 583042(2020).
- Xue, Q., et al. Analysis of single-cell cytokine secretion reveals a role for paracrine signaling in coordinating macrophage responses to TLR4 stimulation. Sci Signal. 8 (381), (2015).
- McArdle, S., Mikulski, Z., Ley, K. Live cell imaging to understand monocyte, macrophage, and dendritic cell function in atherosclerosis. J Exp Med. 213 (7), 1117-1131 (2016).
- Gurevich, D. B., et al. Live imaging of wound angiogenesis reveals macrophage orchestrated vessel sprouting and regression. Embo j. 37 (13), (2018).
- Meziani, L., et al. CSF1R inhibition prevents radiation pulmonary fibrosis by depletion of interstitial macrophages. Eur Respir J. 51 (3), (2018).
- Bickelhaupt, S., et al. Effects of CTGF blockade on attenuation and reversal of radiation-induced pulmonary fibrosis. J Natl Cancer Inst. 109 (8), (2017).
- Formenti, S. C., Demaria, S. Systemic effects of local radiotherapy. Lancet Oncol. 10 (7), 718-726 (2009).
- Chambers, M. S., Garden, A. S., Kies, M. S., Martin, J. W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: pathogenesis, impact on quality of life, and management. Head Neck. 26 (9), 796-807 (2004).
- Radfar, L., Sirois, D. A. Structural and functional injury in minipig salivary glands following fractionated exposure to 70 Gy of ionizing radiation: an animal model for human radiation-induced salivary gland injury. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 96 (3), 267-274 (2003).
- Grehn, A. L., Gustafsson, H., Franzén, L., Thornell, L. E., Henriksson, R. Ultrastructural morphometry of parotid acinar cells following fractionated irradiation. Oral Oncol. 33 (1), 23-28 (1997).
- Rocchi, C., Emmerson, E. Mouth-watering results: clinical need, current approaches, and future directions for salivary gland regeneration. Trends Mol Med. 26 (7), 649-669 (2020).
- Emmerson, E., et al. Salivary glands regenerate after radiation injury through SOX2-mediated secretory cell replacement. EMBO Mol Med. 10 (3), 8051(2018).
- May, A. J., et al. Diverse progenitor cells preserve salivary gland ductal architecture after radiation-induced damage. Development. 145 (21), (2018).
- Knox, S. M., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nat Commun. 4, 1494(2013).
- Mizrachi, A., et al. Radiation-induced microvascular injury as a mechanism of salivary gland hypofunction and potential target for radioprotectors. Radiat Res. 186 (2), 189-195 (2016).
- Friedrich, R. E., Bartel-Friedrich, S., Holzhausen, H. J., Lautenschläger, C. The effect of external fractionated irradiation on the distribution pattern of extracellular matrix proteins in submandibular salivary glands of the rat. J Craniomaxillofac Surg. 30 (4), 246-254 (2002).
- Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B., Fuchs, E. The magical touch: genome targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to mouse skin. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8551-8556 (1999).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Gilman, K. E., et al. P2X7 receptor deletion suppresses γ-radiation-induced hyposalivation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 316 (5), R687-R696 (2019).
- Ren, J., et al. Radioprotective effects and mechanism of HL-003 on radiation-induced salivary gland damage in mice. Sci Rep. 12 (1), 8419(2022).
- Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL6 modulation. Cancer Res. 76 (5), 1170-1180 (2016).
- Chang, S., et al. Inorganic nitrate alleviates total body irradiation-induced systemic damage by decreasing reactive oxygen species levels. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 103 (4), 945-957 (2019).
- Varghese, J. J., et al. Localized delivery of amifostine enhances salivary gland radioprotection. J Dent Res. 97 (11), 1252-1259 (2018).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. gammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair. Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).
- Takano, T., et al. Highly localized intracellular Ca(2+) signals promote optimal salivary gland fluid secretion. Elife. 10, (2021).
- Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy. J Vis Exp. 135, (2018).
- O'Dell, N. L., Sharawy, M. H., Schuster, G. S. Effects of in vivo single and multiple isoproterenol injections on subsequently explanted submandibular glands. Acta Anat (Basel. 105 (4), 431-438 (1979).
- Lombaert, I. M., et al. Cytokine treatment improves parenchymal and vascular damage of salivary glands after irradiation). Clin Cancer Res. 14 (23), 7741-7750 (2008).
- Stolp, B., et al. Salivary gland macrophages and tissue-resident CD8(+) T cells cooperate for homeostatic organ surveillance. Sci Immunol. 5 (46), 4371(2020).
- Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
- Vanherberghen, B., et al. Microwell-based live cell imaging of NK cell dynamics to assess heterogeneity in motility and cytotoxic response. Methods Mol Biol. 1441, 87-106 (2016).
- de Winde, C. M., Munday, C., Acton, S. E. Molecular mechanisms of dendritic cell migration in immunity and cancer. Med Microbiol Immunol. 209 (4), 515-529 (2020).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Paterson, N., Lämmermann, T. Macrophage network dynamics depend on haptokinesis for optimal local surveillance. Elife. 11, (2022).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
Przedruki i uprawnienia
