Naśladowanie metody Dinga na uszkodzeniu mięśni wywołanym nutoksyną u szczurów

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proste urządzenie, które naśladuje metodę rolki Dinga, ustanawia szczurzy model uszkodzenia mięśni szkieletowych i wykorzystuje barwienie hematoksyliną-eozyną do obserwacji patologii uszkodzonej tkanki oraz test immunoenzymatyczny do wykrywania zmian w markerach uszkodzenia surowicy.

Streszczenie

Metoda rolki Dinga jest jedną z najczęściej stosowanych manipulacji w tradycyjnych chińskich klinikach masażu (Tuina) i jedną z najbardziej wpływowych współczesnych manipulacji Tuina w Chinach. Opiera się na tradycyjnej metodzie toczenia powszechnie stosowanej w gatunku Zen jednym palcem i nazwanej metodą rolki Dinga. Ze względu na swoje działanie przeciwzapalne i wspomagające krążenie krwi, metoda rolowania Dinga ma solidne działanie terapeutyczne na miopatię. Ze względu na duży obszar siły przyłożony do ludzkiej skóry, metoda rolki Dinga jest trudna do wykonania na zwierzętach doświadczalnych z małymi obszarami skóry, takich jak szczury i króliki. Dodatkowo siła Tuiny zastosowana na organizm ludzki różni się od tej zastosowanej do zwierząt doświadczalnych, więc może się zdarzyć, że siła jest zbyt wysoka lub zbyt niska, aby osiągnąć efekt terapeutyczny Tuiny podczas eksperymentu. Ten eksperyment ma na celu stworzenie prostego masażera odpowiedniego dla szczurów w oparciu o parametry manipulacji toczeniem Dinga (siła, częstotliwość, czas trwania Tuina). Urządzenie może ustandaryzować manipulację w eksperymentach na zwierzętach i zmniejszyć zmienność siły Tuina stosowanej do różnych zwierząt z powodu czynników subiektywnych. Stworzono szczurzy model uszkodzenia mięśni szkieletowych wywołanego przez noteksynę, a markery uszkodzenia osocza, kinazę kreatynową (CK) i białko wiążące kwasy tłuszczowe 3 (FABP3), wykorzystano do oceny terapeutycznego wpływu Tuiny na uszkodzenie mięśni szkieletowych. Wyniki wykazały, że ten masażer Tuina może obniżyć poziom ekspresji CK i FABP3 oraz spowolnić stopień uszkodzenia mięśni szkieletowych. Dlatego opisywany tutaj masażer Tuina, naśladujący metodę rolki Dinga, przyczynia się do standaryzacji manipulacji Tuiną w badaniach eksperymentalnych i jest bardzo pomocny w późniejszych badaniach nad molekularnym mechanizmem Tuiny dla miopatii.

Wprowadzenie

Urazy mięśniowe są częstymi urazami w życiu klinicznym i codziennym, spowodowanymi zewnętrznymi uderzeniami (stłuczeniami) lub przewlekłym przeciążeniem włókien mięśniowych (nadwyrężeniami), itp., powodując dysfunkcję mięśni i ból, nawet poważnie wpływając na jakość życia pacjenta¹. Rozpoczęcie rehabilitacji tak wcześnie, jak to możliwe po kontuzji spowodowanej ostrym przeciążeniem, jest kluczem do skrócenia czasu powrotu do sportu² oraz do zmniejszenia bólu^3,4. We współczesnej medycynie zachodniej pierwsza pomoc kliniczna w przypadku urazów mięśni jest zgodna z zasadami odpoczynku, lodu, kompresji i uniesienia (RICE) w celu zatrzymania szkodliwego krwawienia do tkanki mięśniowej⁵ oraz niesteroidowych leków przeciwzapalnych w celu złagodzenia bólu⁶. Odkrycie nowych terapii, takich jak egzosomy⁷ i inżynieria tkankowa⁸ stały się potencjalnymi strategiami leczenia chorób mięśni szkieletowych, kompensując niedociągnięcia poprzednich terapii farmakologicznych. Może to jednak również zwiększyć koszty leczenia dla pacjentów, wywierając na nich ogromną presję finansową⁹. Dlatego w leczeniu problemów mięśniowo-szkieletowych zaleca się terapie alternatywne i uzupełniające¹⁰. Tuina jest szeroko stosowana klinicznie w Chinach jako tradycyjna metoda medyczna i jest popularna wśród pacjentów ze względu na swoją skuteczność i mniej skutków ubocznych. Terapia Tuina w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego może złagodzić ból i poprawić funkcjonowanie^11,12,13. Pan Ding Jifeng, słynny praktykujący Tuina z Szanghaju, założył metodę rolkową Dinga¹⁴. Jest to unikalna technika walcowania i kruszenia o dużym obszarze siły, jednolitej i delikatnej sile oraz intensywnej penetracji.

Różne modele zwierzęce są oparte na różnych etiologiach. Mają one swoje wady i zalety, a dobór prawidłowych i odpowiednich modeli zwierzęcych ma ogromne znaczenie dla podstawowych eksperymentów, które pomagają zrozumieć komórkowe i molekularne szlaki sygnałowe regeneracji i naprawy po urazie mięśni szkieletowych w celu opracowania nowych terapii leczenia chorób mięśni szkieletowych. Chemicznie indukowane modele uszkodzeń mięśni są szeroko stosowane, z iniekcjami mięśni szkieletowych powodującymi martwicę włókien mięśniowych i wytwarzającymi zregenerowane obszary, które mogą się skutecznie zregenerować w ciągu 2 tygodni¹⁵. Zarówno notexin, jak i bupiwakaina mogą powodować uszkodzenie mięśni. Jednak notexin może powodować poważniejsze uszkodzenia miotoksyczne mięśni szkieletowych niż bupiwakaina, a naturalna regeneracja funkcjonalna jest stosunkowo wolniejsza¹⁶. Formowanie iniekcyjne leków domięśniowych nie tylko zajmuje mniej czasu, ale także ma kontrolowane efekty i zakres uszkodzenia mięśni szkieletowych. Ta wymierna kontrola sprawia, że udane formowanie jest mniej trudne^15,17.

Reakcja zapalna jest podstawową reakcją biologiczną, która została szeroko zbadana w kontekście miopatii^18,19. We wczesnych stadiach uszkodzenia mięśni szkieletowych martwica włókien mięśniowych zaburza miejscową homeostazę mięśni, a wiele komórek zapalnych nacieka miejsce urazu, wydzielając wiele cytokin prozapalnych¹⁹. Kinaza kreatynowa (CK) jest tradycyjnym biomarkerem surowicy do oceny uszkodzenia mięśni szkieletowych. Brakuje mu jednak specyficzności tkankowej²⁰ i sensitivity²¹, co ogranicza jego zdolność do oceny stopnia uszkodzenia mięśni wywołanego przez lek i pośredniego raportowania stopnia regeneracji mięśni po urazie. Nowe biomarkery, w tym białko wiążące kwasy tłuszczowe 3 (FABP3), wykazały ostatnio stosunkowo wysoką swoistość tkankową i czułość w modelach uszkodzeń mięśni szkieletowych u gryzoni. FABP3 to rodzina białek wiążących ulegających ekspresji głównie w komórkach serca i mięśni szkieletowych i biorących udział w metabolizmie, transporcie i sygnalizacji kwasów tłuszczowych²². Dlatego wybraliśmy kombinację dwóch biomarkerów, CK i FABP3, aby ocenić zakres uszkodzenia mięśni szkieletowych wywołanego przez noteksynę i powrót do zdrowia po leczeniu.

U gryzoni mięśnie są płytkie, a obszar skóry jest mały, co również decyduje o tym, że różne parametry masażu u gryzoni nie będą takie same jak u ludzi, np. w terapii zwierząt, masażysta powinien traktować je z mniejszą siłą za pomocą metody rolkowej Dinga, i może nie sprzyjać działaniu tej techniki ze względu na mały rozmiar zranionego obszaru, co ostatecznie może prowadzić do zmniejszenia skuteczności masażu. W związku z tym w eksperymencie wykorzystano masażer rolkowy wykonany we własnym zakresie, który jest zgodny z charakterystyką metody rolkowej Dinga, do interwencji i oceny efektu terapeutycznego modelu uszkodzenia mięśni szkieletowych wywołanego przez noteksynę u szczurów, co pomaga ustandaryzować parametry Tuiny w eksperymentalnych badaniach na zwierzętach w celu dogłębnego zbadania molekularnego mechanizmu działania Tuiny, tradycyjna metoda leczenia chorób układu mięśniowo-szkieletowego, w medycynie układu mięśniowo-szkieletowego.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Hunan University of Chinese Medicine.

1. Montaż masażera rolkowego

1. Wybierz masażer składający się z gumowego rolki, uchwytu w kształcie widelca, sprężyny, ogranicznika, szyny regulacyjnej, śruby oraz akrylowego uchwytu (Rysunek 1). Upewnij się, że gumowa rolka ma długość 3 cm i średnicę 1,6 cm, sprężyna ma długość 3 cm i średnicę 0,9 cm, ogranicznik ma długość 3 cm i szerokość 2 cm, a uchwyt ma długość 12 cm i średnicę 0,9 cm.
2. Kontrola siły: Zgodnie z wynikami literatury²³, ustalono, że nacisk w dół w metodzie rolowania Dinga wynosi około 10% masy ciała, zatem nacisk stosowany podczas projektowania rolowania do przodu wynosi około 10% masy ciała szczura (0,2-0,3 N). Przetestuj maksymalny nacisk masażera na kontrolerze wagowym, aby wyniósł on około 0,3 N, regulując kąt ogranicznika. Wymaganie dotyczące tego nacisku odpowiada potrzebom szczura.
3. Upewnij się, że minimalny nacisk podczas rolowania wstecz wynosi około 0,08 N (Rysunek 2). Upewnij się, że nacisk jest ściśle zgodny z wymogami metody rolowania Dinga, zgodnie z którymi stosunek siły do przodu i do tyłu wynosi 3:1.
4. Przed rozpoczęciem zabiegu operator powinien pracować z oprogramowaniem metronomu, aby kontrolować częstotliwość rolowania na poziomie 140 rolls/min; należy przećwiczyć tę czynność ponad 3 razy w fazie wstępnej eksperymentu, aby zapewnić standaryzację operacji.

2. Ustanowienie szczurzego modelu uszkodzenia mięśni szkieletowych

1. Losowo podziel 24 samce szczurów rasy Sprague-Dawley (o masie 200-250 g) na trzy grupy po osiem szczurów każda: kontrolną (C), grupę noteksyny (NTX) oraz grupę noteksyny z Tuina (NTX + Tuina) i karm je standardową dietą. Utrzymuj cykl oświetlenia 12 h światła/12 h ciemności, w temperaturze 20-25 °C i wilgotności 50%-70%.
2. Znieczul zwierzęta 1% roztworem pentobarbitalu sodowego (40 mg/kg) poprzez wtryskiwanie doszpikowe, a następnie usuń sierść z prawej kończyny dolnej za pomocą kremu do depilacji. Po usunięciu sierści przemyj pozostałości kremu roztworem soli fizjologicznej. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia za pomocą testu uszczypnięcia palca. Nałóż maść okulistyczną w celu nawilżenia oczu podczas znieczulenia. Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania procedury.
3. Przed iniekcją wykonaj naprzemienną dezynfekcję skóry prawej kończyny dolnej roztworem odkażającym na bazie jodoforu oraz 75% alkoholem. Dotknij patyczkiem nasączonym roztworem odkażającym na bazie jodoforu środka skóry kończyny dolnej i przecieraj ruchem okrężnym na zewnątrz. Powtórz czynność, używając patyczka nasączonego etanolem.
4. Utwórz modele uszkodzenia mięśni szkieletowych zgodnie z metodą referencyjną²⁴. Wstrzyknij noteksynę tylko do jednej nogi (aby zapobiec podwójnej iniekcji noteksyny). Pobierz 200 µL roztworu noteksyny (roztwór noteksyny 10 µg/mL przygotowany przez dodanie 100 µg noteksyny do 10 mL soli fizjologicznej w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL) do strzykawki 1 mL z igłą 30G i wstrzyknij roztwór noteksyny domięśniowo w mięsień brzuchaty łydki, aby wywołać uszkodzenie mięśnia.
5. Wstrzykuj noteksynę powoli i odczekaj 3 s przed wyjęciem igły (aby zapewnić pełne podanie leku).
   UWAGA: Noteksyna jest substancją toksyczną, która w przypadku kontaktu z otwartą raną wymaga natychmiastowego przemycia dużą ilością wody i bezzwłocznej pomocy medycznej w razie potrzeby.
6. Szczurom z grupy kontrolnej wstrzyknij 200 µL roztworu soli fizjologicznej. Przenieś znieczulone szczury do pustych klatek z czystą ściółką. Zadbaj o usunięcie wyściółki z okolic nosa i pyska szczurów, aby utrzymać drożność dróg oddechowych. Obserwuj wizualnie kolor tkanek i częstość oddechów po zakończeniu iniekcji, aż szczury odzyskają wystarczającą świadomość.
7. Przenieś szczury do klatek macierzystych i utrzymuj je w typowych warunkach przez 24 h.

3. Terapia Tuina

1. Umieść szczura szczepu SD w pozycji brzusznej na platformie eksperymentalnej zdezynfekowanej 75% alkoholem, z głową przykrytą czarną tkaniną, aby odsłonić mięsień brzuchaty łydki. Nie owijaj tkaniny zbyt ciasno.
2. W przypadku grupy NTX+Tuina, używając masażera Tuina: trzymając masażer, przyłóż wałek do mięśnia brzuchatego łydki szczura i przetaczaj go do przodu, aż sprężyna dotknie ogranicznika. Następnie zwolnij nacisk i wróć do pozycji wyjściowej, wykonując ruch posuwisto-zwrotny (Rycina 3).
3. Przetaczać masażer z prędkością 140 obrotów na minutę, wykonując każdą operację przez 3 min. Masaże należy przeprowadzać raz rano i raz po południu przez 3 kolejne dni.
4. Po każdym zabiegu przenieś szczury z powrotem do klatki macierzystej, a po ostatnim zabiegu zastosuj 8 h głodówki.

4. Pobieranie krwi i tkanek od szczurów po zakończeniu eksperymentu

1. Zgodnie z wymogami właściwej komisji etyki eksperymentów zwierzęcych, znieczulić szczury poprzez domięśniowy zastrzyk 1% pentobarbitalu sodowego (40 mg/kg, iniekcja dosytroniczna). Odpowiednią głębokość znieczulenia potwierdzić testem odruchowym (ściśnięcie palca u nogi). Po pobraniu krwi poddać szczury eutanazji poprzez upuszczenie krwi z aorty brzusznej.
2. Przed iniekcją przeprowadzić naprzemienną dezynfekcję skóry roztworem jodoforu i 75% alkoholem. Nasączonym povidonem jodowym patyczkiem watnym przemyć środek skóry brzucha, wykonując ruchy okrężne od centrum na zewnątrz. Powtórzyć czynność za pomocą patyczka nasączonego etanolem. Dezynfekcję powtórzyć 3 razy.
3. Asystent powinien użyć dwóch kleszczyków hemostatycznych do uniesienia skóry w połowie brzucha. Operator za pomocą skalpela przecina skórę i mięśnie brzucha od szwu białego do spojenia łonowego.
4. Po otwarciu jamy brzusznej odsunąć jelita za pomocą sterylnych kulek waty, aby odsłonić aortę brzuszną w tylnej ścianie brzucha.
5. Zlokalizować aortę brzuszną, pobrać 5 mL krwi szczura do probówek do pobierania krwi, a następnie po odstawieniu krwi na 1 h uzyskać osocze do mikrop probówek 1,5 mL poprzez wirowanie przy 3000 x g przez 10 min. Osocze przechowywać w temperaturze -80 °C.
6. Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozciąć skórę wzdłuż otworu w dolnej części brzucha w kierunku bocznej strony prawej kończyny dolnej, odsłaniając mięśnie kończyny; po ostrożnym oddzieleniu powięzi pęsetą, wyciąć skalpelem nienaruszony mięsień brzuchaty łydki.
7. Przemyć mięsień brzuchaty łydki w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby usunąć przylegające włosy i krew.
8. Wyjęty mięsień brzuchaty łydki umieścić w probówce wirówkowej 15 mL zawierającej 4% paraformaldehyd.

5. Wykrywanie poziomów CK i FABP 3 w osoczu metodą ELISA

1. Obliczyć i określić liczbę prefabrykowanych płytek wymaganych do jednego eksperymentu. Wyjąć niezbędne płytki, umieścić je w ramce do płytek 96-dołkowych, pozostałe mikropłytki umieścić z powrotem w worku z folii aluminiowej, szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Równoważyć zestawy i próbki w temperaturze pokojowej (25-28 °C) przez 120 min, aż do osiągnięcia pełnej równowagi termicznej.
   UWAGA: Równoważenie zestawu i próbki jest krytyczne i musi zostać przeprowadzone w odpowiednim czasie.
3. Wyznaczyć dołki dla standardów, próbek i wzorca pustego. Dodać 50 µL standardu CK lub FABP3 o różnych stężeniach (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 ng/mL) do dołków standardowych. Każdy standard powtórzyć raz, zajmując łącznie 12 dołków.
4. Napełnić dołki dla próbek 40 µL rozcieńczalnika do próbek (0,8 g NaCl, 0,02 g KH₂PO₄, 0,29 g Na₂HPO₄12H₂O, 0,02 g KCl, 0,01 g NaN₃ w 100 mL wody dwukrotnie destylowanej, pH 7,4), a następnie dodać 10 µL próbki przeznaczonej do analizy. Każdą próbkę powtórzyć raz, zajmując łącznie 48 dołków.
5. Z wyjątkiem dołków pustych znajdujących się dwa miejsca za ostatnim dołkiem dla próbki, dodać 100 µL przeciwciała anty-ludzkiego CK lub FABP3 znakowanego HRP (przeciwciała znakowane enzymem) do każdego dołka standardowego i próbkowego.
6. Uszczelnić dołki folią uszczelniającą i inkubować w kąpieli wodnej lub termostacie w temperaturze 37 °C przez 60 min.
7. Wylać ciecz, osuszyć dołki papierem chłonnym, napełnić każdy dołek płynem myjącym, pozostawić na 20 s, usunąć płyn myjący, osuszyć papierem filtracyjnym i powtórzyć mycie płytki 5x (lub użyć myjki do płytek).
8. Dodać 50 µL roztworu chromogenu A (20 mg tetrametylobenzydyn i 10 mL etanolu w 100 mL wody dwukrotnie destylowanej) oraz 50 µL roztworu chromogenu B (bufor: 0,1 M/L kwasu cytrynowego, 0,2 M/L fosforanu sodu dwuwodornawego, pH 5,0-5,4) do każdego dołka. Przechowywać w ciemności przez 15 min w temperaturze 37 °C.
9. Do dołków standardowych, próbek i dołków pustych dodać po 50 µL roztworu stopującego i zmierzyć wartość gęstości optycznej każdego dołka przy 450 nm w ciągu 15 min.

6. Analiza histologiczna uszkodzenia mięśnia brzuchatego szczurów indukowanego noteksyną

1. Przygotować utrwalone w parafinie przekroje o grubości 5 µm, barwione hematoksyliną i eosiną, do badania pod mikroskopem świetlnym zgodnie z opisem w²⁵.

7. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

1. Odczytaj i przeanalizuj obrazy zarejestrowane przez system obrazowania za pomocą oprogramowania analitycznego. Przesuń myszą wybrany obszar widzenia obrazu na środek ekranu, kliknij 40x, a następnie kliknij Zrób zdjęcie.
2. Zapisz wartości OD uzyskane z testu ELISA w arkuszu kalkulacyjnym i oblicz poziomy CK i FABP3 szczura w próbkach, korzystając z krzywej standardowej.
3. Do analiz statystycznych należy wykorzystać oprogramowanie do analizy statystycznej. Pomiary należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe (), a porównania między grupami przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), stosując test LSD w przypadku jednorodności wariancji oraz metodę T2 Tamhane'a w przypadku niejednorodności wariancji. Różnicę uznano za istotną statystycznie przy p pwartość p mniejsza niż 0,05.

Wyniki

W celu zaobserwowania właściwości morfologicznych szkieletowych mięśni szczura po urazie, mięsień brzuchaty łydki barwiono hematoksyliną i eozyną, a przetworzone obrazy analizowano za pomocą oprogramowania analitycznego zgodnie z protokołem dla 8 szczurów w grupie. U szczurów z urazem mięśnia brzuchatego łydki wywołanym przez noteksynę (grupa NTX) wiele komórek mięśniowych było rozerwanych, zanikowych, martwiczych i rozmieszczonych nieregularnie. W obszarze objętym zmianami stwierdzono również wysoką infiltrację neutrofi...

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy protokół leczenia Tuina uszkodzeń mięśni szkieletowych u szczurów, a następnie przeanalizowaliśmy stopień uszkodzenia mięśni szkieletowych po leczeniu, aby zweryfikować skuteczność metody. Warto zauważyć, że modele uszkodzeń mięśni szkieletowych szczurów, w tym między innymi indukcja leków (noteksyna, bupiwakaina)¹⁶, stłuczenie²⁶, zgniatanie²⁷ i niedokrwienie-reperfuzja²⁸, mogą być interweniowane za pomocą Tui...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 1 ml	JIANGXI FENGLIN	20220521
1,5 mikroprobówki	Servicebio	EP-150X-J
15 ml probówka wirówkowa	Servicebio	EP-1501-J
30G igła	CONPUVON	220318
5 ml probówka do pobierania krwi	Servicebio	QX0023
Uchwyt akrylowy	Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd	65643645
Szyna regulacyjna	CREROMEM
Wacik bawełniany	INOHV	22080215
Instrument znakowany enzymem	Rayto	RT-6100
Etanol	INOHV	211106
Uchwyt widelca	Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd	JL001
Krem do depilacji	Veet, Francja	LOTC190922002
Zestaw roztworów do barwienia hematoksyliny	Wuhan Google Biotech	G1005
System obrazowania	Nikon, Japonia	Nikon DS-U3
IODOPHOR rozwiązanie dysfekcyjne	Hale& Obfity	mikroskop 20221205
Light	Nikon, Japonia	Nikon Eclipse E100
Przegroda graniczna	CREROMEM	20220724
Notexin	Latoxan S.A.S.	L8104-100UG
Pentobarbital sodowy	Merck KGaA	P3761
Zestaw ELISA kinazy kreatynowej szczura (CK)	LunChangShuoBiotech	YD-35237
Białko wiążące kwasy tłuszczowe szczura 3 (FABP3) Zestaw ELISA	LunChangShuoBiotech	YD-35730
Wałek gumowy	Hebei Mgkui Chemical Technology Co., Ltd	202207
Śruba	Weiyan Hardware	B05Z122
Sprague Dawley szczury	Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co.	SYXK2019-0009
Sprężyna	Bingzhang Hardware	TH001
Ostrze chirurgiczne	Covetrus	#23
Kontroler wagi	Iyoys	HY-XSQ

20220729